CN107988070A - 一种微量细胞电转微流控芯片、电转分选仪及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微量细胞电转微流控芯片、电转分选仪及应用。微量细胞电转分选仪包括电转单元、显示屏、外箱体、电源单元、微控制单元和主传感器，电转单元中包括所述芯片。显示屏用于向微控制单元发送指令，接收微控制单元和主传感器反馈的信息并显示；微控制单元用于接收显示屏发送的指令，并对电转单元和电源单元进行控制；电转单元用于完成细胞转染过程；主传感器用于接收电转单元反馈的信息，并发送给显示屏和微控制单元。微量细胞电转微流控芯片包括进样口、出样口、负压孔道、正压孔道和主通道，出样口后设置96孔板。本发明能够保证转染过程中主通道内的转染状态相同，保证了转染的效率。通过96孔板保证了细胞品质，便于后期的细胞培养。

Description

一种微量细胞电转微流控芯片、电转分选仪及应用

技术领域

本发明涉及IPS诱导多能干细胞领域，干细胞诱导分化，具体是一种微量细胞电转微流控芯片、电转分选仪及应用。

背景技术

通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞(iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。iPS技术的诞生将干细胞研究推进到了一个新的高度，极大地丰富了干细胞的研究内容。在过去3年里，iPS技术发展迅速，先后已在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中取得了成功。特别是在小鼠和人上的iPS研究日益深入，诱导的方法也不断得到优化，动物机体组织的各种细胞均可被诱导为iPS细胞。由于iPS细胞具有与ES细胞相类似的特性和功能，尽管还不能完全代替ES细胞，但是其成功地绕开了免疫排斥问题和伦理道德问题的困扰，是再生医学理想的种子细胞，也可作为临床药物筛选细胞模型和人类疾病治疗细胞模型。此外，由于iPS细胞可在体外长期稳定地传代培养，是转基因技术中理想的种子细胞，用作基因打靶受体细胞，在转基因动物的生产上有着广阔的应用前景。

当然，目前iPS技术还不是十分完善，遇到的难题和困扰，如转染方式、致瘤基因、诱导效率、iPS全能性等，以及诱导过程中产生的大量类iPS细胞或不完全重编程细胞的干扰，使得真正具有全能性的iPS细胞难以被很快筛选得到。但是相信随着研究的不断深入，iPS技术将会更加成熟，iPS细胞将会在生命科学领域发挥更大的作用。在现阶段的IPS诱导多能干细胞制备过程中，所使用的转染方式中，采用的转染载体主要为病毒，RNA，质粒等，采用的转染方式主要为电穿孔转染法，传统的电穿孔转染方式存在转染效率低的弊端，在转染过程中由于电压不均匀导致大部分细胞无法被转染造成浪费，并且转染后的细胞和未转染细胞同时存在，细胞的纯化造成困难；为了保证转染后细胞的基数需要极大数量的细胞(超过100万个)，所需要使用的质粒数量极大，造成了大量质粒被浪费，不可避免造成成本上升，因此需要一种全新的IPS细胞转染培养方式来进行细胞转染。

现有技术中存在的主要问题有：1、采用现有电穿透转染方式存在转染电压频率不统一的问题，使细胞转染时的条件存在差异，造成转染细胞质量差异；2、现有转染方式的电转电压控制麻烦，电转效率低；3、现有电转中细胞为了保证最后获得足够的转染成体细胞，需要使用至少100万以上成体细胞，以及消耗大量的质粒，成本不可避免升高；4、成体细胞转染完毕后需要进行纯化分离，克隆培养，现有方法中转染细胞和未转染细胞同时存在，对于细胞纯化存在困难，对于后期细胞培养消耗大量人力物力。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种微量细胞电转微流控芯片、电转分选仪及应用。本发明采用了微流控芯片技术来进行细胞转染，纯化分离，通过控制微流控芯片的电压，能够使细胞在统一的环境下进行电转，能够良好的控制转染过程中的环境，保证转染的进度相同，极大地提高了转染的细胞数量。同时所采用的芯片能够保证细胞均匀分布，降低了传统方式中成体细胞的数量和转染质粒的数量要求。在微流控芯片中待转染细胞会固定于微流控芯片中凹槽中，这种设置能够保证在孔板中的细胞都是被转染的细胞，无需在转染后再进行分离纯化，简化了试验步骤，对于后期细胞培养提供方便，并保证了诱导细胞的品质。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种微量细胞电转微流控芯片，包括：用于添加待转染细胞及电转缓冲液等的进样口，最终流出已转染细胞的出样口，可施加负压(Negative pressure)用于吸附固定细胞的负压孔道，可施加正压(Positive pressure)用于输入转染载体质粒的正压孔道，和用于细胞正常流动并完成电转过程的主通道；

所述微量细胞电转微流控芯片包括上、下两层，微量细胞电转微流控芯片上、下两层之间为主通道：所述微量细胞电转微流控芯片的上层为平板，用于接通电极，可施加电压；微量细胞电转微流控芯片的下层为存在96个凹槽的孔板，每个凹槽中央均设有用于连通负压孔道和正压孔道的微孔道，同时每个凹槽底部均铺设电极接片用于施加电压。

在上述方案的基础上，所述主通道的高度为50um。

在上述方案的基础上，所述孔板的每个凹槽均为内径为100um、圆心角为60°的球形凹槽；所述微孔道的内径为1.5um。

在上述方案的基础上，在所述出样口设置96孔板，用于将转染后细胞经分形后转移到96孔板中进行细胞培养。

在上述方案的基础上，所述的微量细胞电转微流控芯片的使用方法，包括如下步骤：

步骤1、通过进样口添加待转染细胞和电转缓冲液，使待转染细胞和电转缓冲液充满主通道；

步骤2、通过芯片上、下两层施加电压，以及通过负压孔道施加负压，将待转染细胞推动并固定于芯片下层凹槽中；

步骤3、通过正压通道，施加正压，将转染载体质粒输送到芯片下层凹槽中，与待转染细胞相混合；

步骤4、通过芯片上下层电极施加电压，形成脉冲电场，使待转染细胞的细胞膜通透性改变，使电转缓冲液中的转染载体质粒能够通过细胞膜进入待转染细胞，完成转染；

步骤5、转染完成后，通过控制负压孔道，施加负压，将转染完成细胞推出凹槽，通过出样口转移至96孔板进行培养。

一种微量细胞电转分选仪，所述电转分选仪包括电转单元、显示屏、外箱体、电源单元、微控制单元和主传感器；

所述显示屏位于外箱体的前端上部，电转单元、电源单元、微控制单元和主传感器位于外箱体的内部；显示屏分别与主传感器和微控制单元相连，电源单元分别与电转单元和微控制单元相连，电转单元还与主传感器和微控制单元相连，主传感器还与微控制单元相连；

电转单元包括电转单元外壳、固定座、电转传感器、可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ，固定座位于电转单元外壳内部，并与电转单元外壳的内壁紧密连接，电转传感器、可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ位于电转单元外壳的内部；可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ之间配套放置微量细胞电转微流控芯片。

在上述方案的基础上，所述显示屏用于向微控制单元发送控制指令，并接收微控制单元和主传感器反馈的信息并显示操作界面和实验状态信息；

所述微控制单元用于接收显示屏发送的控制指令，并对电转单元和电源单元进行控制；

所述电转单元用于完成细胞转染过程，所述电转传感器用于跟踪细胞的转染过程并传送给主传感器；

所述主传感器用于接收电转单元反馈的信息，并将信息发送给显示屏和微控制单元。

在上述方案的基础上，可控电极Ⅰ位于微量细胞电转微流控芯片的上方，可控电极Ⅱ位于微量细胞电转微流控芯片的下方，电转传感器位于可控电极Ⅱ的下方；

电转单元外壳的顶部一端设有注样口Ⅰ和注样口Ⅱ，所述注样口Ⅰ与微量细胞电转微流控芯片的进样口相对应，注样口Ⅱ与微量细胞电转微流控芯片的正压孔道相对应。

一种微量细胞电转分选仪的应用方法，包括以下步骤：

步骤1，通过电转单元外壳顶部的注样口Ⅰ向进样口注入含待转染细胞的电转缓冲液，通过注样口Ⅱ向正压孔道注入包含转染载体质粒的电转缓冲液；通过显示屏设置参数，微控制单元根据设置的参数对电转单元和电源单元进行控制；

步骤2，根据步骤1中设置的参数，控制注样口Ⅰ中待转染细胞电转缓冲液进入微量细胞电转微流控芯片主通道，使待转染细胞均匀的充斥于整个主通道中；

步骤3，根据步骤1中设置的参数，通过可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ施加微电压将游离的待转染细胞推入凹槽中，同时负压孔道施加适当强度的负压，将待转染细胞集中吸附在每个凹槽中央，每个凹槽内吸附一个待转染细胞；

步骤4，根据步骤1中设置的参数，控制注样口Ⅱ中含转染载体质粒电转缓冲液通过正压孔道通过微孔道注入芯片下层凹槽中；

步骤5，控制微量细胞电转微流控芯片上、下两层的电压和频率，形成脉冲电场，使待转染细胞的细胞膜通透性改变，使电转缓冲液中的转染载体质粒能够通过细胞膜进入待转染细胞，完成转染；

转染过程中，所述主传感器接收电转单元反馈的信息，并将信息发送给显示屏和微控制单元，并在显示屏中显示实时操作界面和状态信息；

步骤6，转染结束后，通过可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ施加微电压将转染后细胞推入主通道中，并通过进样口持续加注电转缓冲液，使转染后细胞随电转缓冲液通过出样口流出，将转染后细胞经分选形成单细胞，转移到96孔板内进行细胞培养。

在上述方案的基础上，所述参数包括待转染细胞进样量、电转缓冲液进样量、电转电压、频率、进样流量和流速等。

本发明的优点在于，能够保证在整个转染过程中主通道内的条件完全一致，保证了在转染时的转染状态相同，同时也保证了转染的效率。在此过程中使用的耗材以及细胞等都是微量的，节省了耗材成本。在微流控状态下能够控制转染的过程保证了转染的效率，能够极大的提高转染细胞的含量。并且在细胞分选过程中，通过孔板的留存作用，可以保证分选过程中转染细胞含量极高，可以使转染细胞的纯化度较高，便于后期的细胞培养。芯片内部存在96个凹槽，可以将转染后的细胞经过分形后直接转移至培养细胞的96孔板，简化操作流程，保证了细胞品质。

附图说明

本发明有如下附图：

图1微量细胞电转微流控芯片的结构图；

图2微量细胞电转微流控芯片使用示意图一；

图3微量细胞电转微流控芯片使用示意图二；

图4微量细胞电转微流控芯片使用示意图三；

图5微量细胞电转分选仪的外部结构示意图；

图6微量细胞电转分选仪的内部结构示意图；

图7电转单元的内部结构示意图；

图8微量细胞电转分选仪的连接结构示意图。

附图标记：

1-外箱体，2-显示屏，3-主传感器，4-电转单元，5-电源单元，6-微控制单元，7-微量细胞电转微流控芯片，8-电转单元外壳，9-固定座，10-可控电极Ⅰ，11-可控电极Ⅱ，12-电转传感器。

具体实施方式

以下结合附图1～8对本发明作进一步详细说明。

本发明所述的一种微量细胞电转微流控芯片，包括：用于添加待转染细胞和电转缓冲液的进样口A，最终流出已转染细胞的出样口B，可施加负压(Negative pressure)用于吸附固定细胞的负压孔道C，可施加正压(Positive pressure)用于输入转染载体质粒的正压孔道D，和用于细胞正常流动并完成电转过程的主通道E；

所述微量细胞电转微流控芯片7包括上、下两层，上、下两层之间为主通道E：所述微量细胞电转微流控芯片7的上层为平板，用于接通电极，可施加电压；微量细胞电转微流控芯片7的下层存在96个凹槽，每个凹槽中央均设有用于连通负压孔道C和正压孔道D的微孔道，同时每个凹槽底部均铺设电极接片用于施加电压。

在上述方案的基础上，所述主通道E的高度为50um。

在上述方案的基础上，所述孔板的每个凹槽均为内径为100um、圆心角为60°的球形凹槽；所述微孔道的内径为1.5um。

在上述方案的基础上，在所述出样口B设置96孔板，用于将转染后细胞经过分形后转移到96孔板中进行细胞培养。

在上述方案的基础上，所述的微量细胞电转微流控芯片的使用方法，包括如下步骤：

步骤1，通过进样口添加待转染细胞和电转缓冲液，使待转染细胞和电转缓冲液充满主通道；

步骤2，通过芯片上、下两层施加电压，以及通过负压孔道施加负压，将待转染细胞推动并固定于芯片下层凹槽中；

步骤3，通过正压通道，施加正压，将转染载体质粒输送到芯片下层凹槽中，与待转染细胞相混合；

步骤4，通过芯片上下层电极施加电压，形成脉冲电场，使待转染细胞的细胞膜通透性改变，使电转缓冲液中的转染载体质粒能够通过细胞膜进入待转染细胞，完成转染；

步骤5，转染完成后，通过控制负压孔道，施加负压，将转染完成细胞推出凹槽，通过出样口转移至96孔板进行培养。

一种微量细胞电转分选仪，所述电转分选仪包括电转单元4、显示屏2、外箱体1、电源单元5、微控制单元6和主传感器3；

所述显示屏2位于外箱体1的前端上部，电转单元4、电源单元5、微控制单元6和主传感器3位于外箱体1的内部；显示屏2分别与主传感器3和微控制单元6相连，电源单元5分别与电转单元4和微控制单元6相连，电转单元4还与主传感器3和微控制单元6相连，主传感器3还与微控制单元6相连；

电转单元4包括电转单元外壳8、固定座9、电转传感器12、可控电极Ⅰ10和可控电极Ⅱ11，固定座9位于电转单元外壳8内部，并与电转单元外壳8的内壁紧密连接，电转传感器12、可控电极Ⅰ10和可控电极Ⅱ11位于电转单元外壳8的内部；可控电极Ⅰ10和可控电极Ⅱ11之间配套放置微量细胞电转微流控芯片7和96孔板。

在上述方案的基础上，所述显示屏2用于向微控制单元6发送控制指令，并接收微控制单元6和主传感器3反馈的信息并显示操作界面和实验状态信息；

所述微控制单元6用于接收显示屏2发送的控制指令，并对电转单元4和电源单元5进行控制；

所述电转单元4用于完成细胞转染过程，所述电转传感器12用于跟踪细胞的转染过程并传送给主传感器3；

所述主传感器3用于接收电转单元4反馈的信息，并将信息发送给显示屏2和微控制单元6。

在上述方案的基础上，可控电极Ⅰ10位于微量细胞电转微流控芯片7的上方，可控电极Ⅱ11位于微量细胞电转微流控芯片7的下方，电转传感器12位于可控电极Ⅱ11的下方；

电转单元外壳8的顶部一端设有注样口Ⅰ和注样口Ⅱ，所述注样口Ⅰ与微量细胞电转微流控芯片7的进样口A相对应，注样口Ⅱ与微量细胞电转微流控芯片7的正压孔道D相对应。

一种微量细胞电转分选仪的应用方法，包括以下步骤：

步骤1，通过电转单元外壳8顶部的注样口Ⅰ向进样口A注入含待转染细胞的电转缓冲液，通过注样口Ⅱ向正压孔道注入包含转染载体质粒的电转缓冲液；通过显示屏2设置参数，微控制单元6根据设置的参数对电转单元4和电源单元5进行控制；

步骤2，根据步骤1中设置的参数，控制注样口Ⅰ中待转染细胞电转缓冲液进入微量细胞电转微流控芯片主通道E，使待转染细胞均匀的充斥于整个主通道E中；

步骤3，根据步骤1中设置的参数，通过可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ施加微电压将游离的待转染细胞推入凹槽中，同时负压孔道C施加适当强度的负压，将游离的待转染细胞吸附在每个凹槽中央，每个凹槽内吸附一个待转染细胞；

步骤4，根据步骤1中设置的参数，通过注样口Ⅱ向正压孔道D注入包含转染载体质粒的电转缓冲液并施加适当强度的正压，使包含转染载体质粒的电转缓冲液通过微孔道注入芯片下层的凹槽中；

步骤5，控制微量细胞电转微流控芯片7上、下两层的电压和频率，形成脉冲电场，使待转染细胞的细胞膜通透性改变，使电转缓冲液中的转染载体质粒能够通过细胞膜进入待转染细胞，完成转染；

转染过程中，所述主传感器3接收电转单元4反馈的信息，并将信息发送给显示屏2和微控制单元6，并在显示屏2中显示实时操作界面和状态信息；

步骤6，转染结束后，通过可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ施加微电压将转染后细胞推入主通道E中，通过进样口A持续加注电转缓冲液，使转染后细胞随电转缓冲液通过出样口B流出，将转染后细胞经分选转移到96孔板内进行细胞培养。

在上述方案的基础上，所述参数包括待转染细胞进样量、电转缓冲液进样量、电转电压、频率、进样流量和流速等。

本发明所述的微量细胞电转微流控芯片产品，该芯片由上、下两层组成，上层为平板，接通电极，下层为孔板，含有96个球形凹槽，凹槽中央均有微孔道，微孔道连通正、负压孔道，该芯片同时包括进样口、主通道和出样口。

在电转过程中，电转的电压和频率等都可以根据不同的细胞进行调整。所述微量细胞电转微流控芯片连接微控制单元，通过该微控制单元来控制调整所需的电压和频率等。利用本申请所述的微量细胞电转微流控芯片可以电转所有细胞种类。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种微量细胞电转微流控芯片，其特征在于：包括用于添加待转染细胞和电转缓冲液的进样口，可施加负压用于吸附固定细胞的负压孔道，可施加正压用于输入转染载体质粒的正压孔道，和用于细胞流动并完成电转过程的主通道，最终流出转染后细胞的出样口；

所述微量细胞电转微流控芯片包括上、下两层，微量细胞电转微流控芯片上、下两层之间为主通道：所述微量细胞电转微流控芯片的上层为平板，可接通电极施加电压；微量细胞电转微流控芯片的下层为存在96个凹槽的孔板，每个凹槽中央均设有用于连通负压孔道和正压孔道的微孔道，每个凹槽底部均铺设微电极接片可施加电压。

2.如权利要求1所述的微量细胞电转微流控芯片，其特征在于：所述主通道的高度为50um。

3.如权利要求1所述的微量细胞电转微流控芯片，其特征在于：所述孔板的每个凹槽均为内径为100um、圆心角为60°的球形凹槽；所述微孔道的内径为1.5um。

4.如权利要求1所述的微量细胞电转微流控芯片，其特征在于：在所述出样口设置96孔板，用于将转染细胞分选后直接转移到96孔板中进行细胞培养。

5.如权利要求1所述的微量细胞电转微流控芯片的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，通过进样口添加待转染细胞和电转缓冲液，使待转染细胞和电转缓冲液充满主通道；

步骤2，通过芯片上、下两层施加电压，以及通过负压孔道施加负压，将待转染细胞推动并固定于芯片下层凹槽中；

步骤3，通过正压通道，施加正压，将转染载体质粒输送到芯片下层凹槽中，与待转染细胞相混合；

步骤4，通过芯片上下层电极施加电压，形成脉冲电场，使待转染细胞的细胞膜通透性改变，使电转缓冲液中的转染载体质粒能够通过细胞膜进入待转染细胞，完成转染；

步骤5，转染完成后，通过控制负压孔道，施加负压，将转染完成细胞推出凹槽，通过出样口转移至96孔板进行培养。

6.一种微量细胞电转分选仪，应用权利要求1所述的微量细胞电转微流控芯片，其特征在于：包括电转单元、显示屏、外箱体、电源单元、微控制单元和主传感器；

所述显示屏位于外箱体的前端上部，电转单元、电源单元、微控制单元和主传感器位于外箱体的内部；显示屏分别与主传感器和微控制单元相连，电源单元分别与电转单元和微控制单元相连，电转单元还与主传感器和微控制单元相连，主传感器还与微控制单元相连；

电转单元包括电转单元外壳、固定座、电转传感器、可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ，固定座位于电转单元外壳内部，并与电转单元外壳的内壁紧密连接，电转传感器、可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ位于电转单元外壳的内部；可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ之间配套放置微量细胞电转微流控芯片和96孔板。

7.如权利要求6所述的微量细胞电转分选仪，其特征在于：所述显示屏用于向微控制单元发送控制指令，接收微控制单元和主传感器反馈的信息并显示操作界面和实验状态信息；

所述微控制单元用于接收显示屏发送的控制指令，并对电转单元和电源单元进行控制；

所述电转单元用于完成细胞转染过程，所述电转传感器用于跟踪细胞的转染过程并传送给主传感器；

所述主传感器用于接收电转单元反馈的信息，并将信息发送给显示屏和微控制单元。

8.如权利要求6所述的微量细胞电转分选仪，其特征在于：可控电极Ⅰ位于微量细胞电转微流控芯片的上方，可控电极Ⅱ位于微量细胞电转微流控芯片的下方，电转传感器位于可控电极Ⅱ的下方；

电转单元外壳的顶部一端设有注样口Ⅰ和注样口Ⅱ，所述注样口Ⅰ与微量细胞电转微流控芯片的进样口相对应，注样口Ⅱ与微量细胞电转微流控芯片的正压孔道相对应。

9.如权利要求6～8任一权利要求所述的微量细胞电转分选仪的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，通过电转单元外壳顶部的注样口Ⅰ向进样口注入含待转染细胞的电转缓冲液，通过注样口Ⅱ向正压孔道注入包含转染载体质粒的电转缓冲液；通过显示屏设置参数，微控制单元根据设置的参数对电转单元和电源单元进行控制；

步骤2，根据步骤1中设置的参数，控制注样口Ⅰ中待转染细胞电转缓冲液进入微量细胞电转微流控芯片主通道，使待转染细胞均匀的充斥于整个主通道中；

步骤3，根据步骤1中设置的参数，通过可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ施加微电压将游离的待转染细胞推入凹槽中，同时负压孔道施加适当强度的负压，将待转染细胞集中吸附在每个凹槽中央，每个凹槽内吸附一个待转染细胞；

步骤4，根据步骤1中设置的参数，控制注样口Ⅱ中含转染载体质粒电转缓冲液通过正压孔道通过微孔道注入芯片下层凹槽中；

步骤5，控制微量细胞电转微流控芯片上、下两层的电压和频率，形成脉冲电场，使待转染细胞的细胞膜通透性改变，使电转缓冲液中的转染载体质粒能够通过细胞膜进入待转染细胞，完成转染；

转染过程中，所述主传感器接收电转单元反馈的信息，并将信息发送给显示屏和微控制单元，并在显示屏中显示实时操作界面和状态信息；

步骤6，转染结束后，通过可控电极Ⅰ和可控电极Ⅱ施加微电压将转染后细胞推入主通道中，并通过进样口持续加注电转缓冲液，使转染后细胞随电转缓冲液通过出样口流出，将转染后细胞经分选形成单细胞，转移到96孔板内进行细胞培养。

10.如权利要求9所述的微量细胞电转分选仪的应用方法，其特征在于：所述参数包括待转染细胞进样量、电转缓冲液进样量、电转电压、频率、进样流量和流速。