CN107941928A - 一种液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法，其特征在于，具体包含以下步骤：步骤1、从实验器皿上降低背景干扰：步骤2、样品制备：步骤3、样品保存稳定：步骤4、固相萃取富集水相中待测物：步骤5、样品净化洗脱；步骤6、浓缩再富集；步骤7、利用高效液相色谱串联质谱同步上机测定。本发明吸收了固相萃取良好的富集能力与液相良好分离能力，以及加入标准内标物精确定量特点，使得检测不同类型的环境水体中痕量抗生素效果显著。本发明通过对固相萃取洗脱溶剂、液相分离流动相、质谱条件等重要方面均进行了探索和试验。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗生素检测方法，尤其涉及一种高效液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法，该方法能够实现对不同类型的环境水体中痕量抗生素的高效，准确检测方法，特别提供一种以固相萃取方式对样品预处理，基于高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)同时检测环境水体中大环内酯类、磺胺类、甲氧苄啶、喹诺酮类、四环素类5类17种抗生素的方法。
背景技术
抗生素作为治疗各类疾病的有效药物,被人类广泛使用。在中国,抗生素每年的使用量约为21万吨,其中80％以上的抗生素以其初始形式通过工业废水、医疗废物、动物排泄物和生活污水等输送到环境中。虽然大多数抗生素的半衰期不长，但由于其被频发地使用并进入水体环境，导致水中细菌抗药性增强，水生生物致畸突变，对人体健康和当地生态环境产生不可预测的危害。目前，已经从地表水、地下水、城市污水等多种水环境中检出抗生素类药物。随着抗生素的环境危害受到越来越多的重视，以及我国在2016年9月《遏制细菌耐药国家行动计划》的出台。因此，有必要建立一种能实现对不同类型的环境水体中痕量抗生素的高效，准确检测方法。为抗生素管理提供技术支撑
目前，国内和国际有关抗生素的标准检测方法十分有限，在我国现行的2个标准中(GB/T5009.95-2003以及GB/T4789.27-2008)，对目标化合物(抗生素)分析仍采用传统的微生物检测方法定性，此法利用抗菌药物敏感的菌株作为指示生物体，将提取液和标准溶液对照，再根据最低抑菌浓度推算出提取液中的药物浓度，过程比较繁琐。而另外一种检测技术，高效液相色谱紫外/荧光检测方法则选择性不强，对于有些抗生素灵敏度低，检出限较高，在一定程度上影响了结果的准确性，不能实现快速准确分析的目的。
由于抗生素在环境中分布复杂，环境含量很低，水环境中通常是(纳克)级的浓度水平。这就要求抗生素类物质的检测方法不仅要有良好的抗干扰性，同时对于低浓度的监测还需要有较强的灵敏性与可量化性。随着科技的发展，近几年高效液相色谱串联质谱(HPLCMS/MS)以及衍生化后接气相色谱(GC MS/MS)等新技术的开发与应用，更使精确定性定量环境中抗生素类药物变为可能，但是这些方法大都是针对某几种或某一类化合物，不适用于复杂基质的分析检测。
近年来，国内外许多研究人员针对环境水体中抗生素检测技术方法开展了多方面探索试验。
中国专利公开号CN10448327A公开了一种分离富集检测饮用水源中12种抗生素方法，所述方法中包括用酸将水样调至3-4，过滤；依次用甲醇、超纯水和稀盐酸活化HLB柱，水样过柱富集后用甲醇溶液洗脱，收集洗脱液在氮气流下吹至近干，采用高效液相色谱-串联质谱仪检测饮用水水源中抗生素的浓度。该法分析快速准确、富集倍数高、在饮用水安全研究领域做出了贡献。然而，随着越来越多的抗生素残留药物向各类环境水体污染渗透，以及紧急出台的《遏制细菌耐药国家行动计划》表明，不仅在检测饮用水源上，还应建立一套能实现对不同类型的环境水体中痕量抗生素的高效，准确检测方法。
中国专利公开号CN103940925A公开了一种用高效液相色谱检测磺胺类抗生素的方法及应用。该发明利用磺胺类药物在高效液相色谱仪紫外检测器270nm波长下、荧光检测器激发波长405nm，发射波长495nm下检测参数，通过对流动相几个组分分配比、流速、温度等条件的优化组合，确定目标药物的最佳检测条件。建立了水、土壤及植物样品中残留磺胺类抗生素的检测方法。该法虽具有检测效率高、分析速度快等特点，由于紫外、荧光等检测技术灵敏度低、检出限较高，在一定程度上影响了结果的准确性和重线性。
中国专利公开号CN102798689A公开了一种分离富集检测水环境中氟喹诺酮类抗生素的方法。所述方法是将2.0-4.0L水样通过固相萃取后，用磷酸、超纯水依次淋洗小柱，甲醇洗脱并用氮气吹至1ml以下，再用液质联用仪器进行分析定量检测。该方法具有低检测限、高回收率、高灵敏度、选择性好且操作简便等优点。然而，随着近年来抗生素排入水环境的种类数量越来越多，只针对某几种或某一类化合物，不太适用于复杂基质的分析检测。
因此，亟需提供一种检测类型以及政策符合性更优越，检测方法选用上更灵活，在检测种类数量上更丰富萃取回收率更高的检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的欠缺，目的在于提供一种以固相萃取方式对样品预处理，基于高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)同步检测环境水体中大环内酯类、磺胺类、甲氧苄啶、喹诺酮类、四环素类5类17种抗生素的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：
一种液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法，具体包含以下步骤:
步骤1、从实验器皿上降低背景干扰：实验开始前，让非定量的玻璃器皿经过马弗炉高温持续烘烧；定量的玻璃器皿经过超声清洁，有机溶剂冲洗干净后取用。
步骤2、样品制备：对悬浮物较多的环境样品进行预处理，用玻璃纤维滤膜过滤，将滤液盛放至干净非定量棕色的玻璃器皿中。
步骤3、样品保存稳定：水样预处理之后加入一定量硫酸，调节Ph3-4以抑制微生物对待测化合物的降解；同时加入5％甲醇，以增大水中待测物的溶解度，冷藏保存。
步骤4、固相萃取富集水相中待测物：准确量取200～1000mL过滤后的水样，加入0.5g乙二胺四乙酸四(Na4EDTA)，再加入浓度为50ng/ml的7种混合内标液，充分摇匀。(连接检查整个固相萃取系统)按顺序分次加入甲醇和超纯水以此活化固相萃取Oasis HLB柱，最后加入2mL稀硫酸对柱子进行酸化，以5～10mL/min流速加载水样通过Oasis HLB柱。为了防止回收效率降低，整个过程应始终保持液面高于小柱填料上端，待水样全部通过Oasis HLB柱后，用超纯水清洗柱子，以去除残留在柱里的乙二胺四乙酸四(Na4EDTA)以及部分疏松的杂质。
步骤5、样品净化洗脱：在抽真空条件下，干燥1.5～3小时去除残留的水分。接着用12mL甲醇以0.4～1.0mL/min的流速洗脱待测物。洗脱液收集在15mL具塞玻璃刻度离心管中。
步骤6、浓缩再富集：保持氮吹系统气源充足，随后将洗脱液缓慢浓缩至近干，用1mL甲醇准确定容后，涡旋混匀，最后取0.22微米有机相滤膜过滤与2mL棕色进样小瓶中，在-18℃下避光保存待检。
步骤7、利用液相色谱串联质谱上机同步测定。
与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：
1.在检测技术上，本发明所采用的检测技术具有分离效率高、灵敏度高、选择性和特异性较好等优点，能够有效地去除基质干扰，准确定量水体环境中抗生素含量，达到多组分快速分析同步检测的目的。
2.在检测的种类上，随着近年来抗生素排入水环境的种类数量越来越多，只针对某几种或某一类化合物，不太适用于复杂基质的分析检测。本发明根据研究报道，针对我国水体中抗生素污染严重的特点，从中筛选出水环境中常见大部分抗生素为研究对象，建立了能够同步检测5类17种抗生素方法。
3.在检测过程耗时上,本发明经过方法优化，实现一次色谱分离在15min内完成，可满足日常快速检测的需要。
4.在检测效果上，本发明吸收了固相萃取良好的富集能力与液相良好分离能力，以及加入标准内标物精确定量特点，使得检测不同类型的环境水体中痕量抗生素效果显著。本发明通过对固相萃取洗脱溶剂、液相分离流动相、质谱条件等重要方面均进行了探索和试验，优化后大部分回收率可达80％以上。
附图说明
图1为不同填料3种固相萃取柱对17种抗生素的萃取回收率；
图2为相同浓度下17种抗生素混合标准样品总离子流图，横坐标为保留时间，纵坐标为信号强度；
图3为相同浓度下环境水体中几类主要抗生素罗美沙星、三乙酸朱桃霉素、氧四环素、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、四环素、甲氧苄啶的选择离子谱图；
具体实施方式
为了更好阐明本发明内容，下面结合实例作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
该实施例提供了一种液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法，具体包含以下步骤:
步骤1、从实验器皿上降低背景干扰：实验开始前，让非定量的玻璃器皿经过马弗炉高温持续烘烧；定量的玻璃器皿经过超声清洁，有机溶剂冲洗干净后取用。
该步骤中，非定量玻璃器皿在使用前经过马弗炉450℃高温持续烘烧4小时，充分除去残留在玻璃器皿上有机物；对定量的玻璃器皿需先用有机洗涤液超声清洁1～2小时，用超纯水洗净后，接着依次用甲醇、用甲醇和丙酮等有机溶剂分别冲洗3～5次，确保去除背景有机物的干扰。
步骤2、样品制备：对含有悬浮物的环境样品进行预处理，用玻璃纤维滤膜过滤，将滤液盛放至干净非定量棕色的玻璃器皿中。
该步骤中，对不同类型的水环境样品可根据实际情况量取不同体积水样进行浓缩富集，地下水量取2L、地表水量取1L，废水量取0.1L。装好水质过滤器并放入直径为200mm玻璃纤维滤膜过滤，接着将滤液盛放至干净非定量棕色的玻璃器皿中。
步骤3、样品保存稳定：预处理之后的水样加入一定量硫酸，调节PH值至3-4，以抑制微生物对待测化合物的降解；同时加入5％甲醇，以增大水中待测物的溶解度，冷藏保存。
该步骤中,预处理之后的水样加入4mol/L硫酸，调节PH值为3-4左右，以抑制微生物对待测化合物的降解；同时加入5％甲醇，以增大水中待测物的溶解度，冷藏保存。根据以往的检测结果表明，绝大部分目标化合物2天内可保持稳定，因此水样需在采样后48小时内处理完成。
步骤4、固相萃取富集水相中待测物：准确量取200～1000mLl预处理之后的水样，加入0.1-0.5g乙二胺四乙酸四(Na4EDTA)，再加入浓度为50ug/ml的7种混合内标，其中包括红霉素13C-D3、磺胺甲恶唑D4、磺胺甲嘧啶、甲氧苄啶-D3、赛本咪唑-D4、磺基水杨酸甲氯环素、环丙沙星-D8，充分摇匀，连接检查整个固相萃取系统，按顺序分次加入甲醇和超纯水，以此活化固相萃取Oasis HLB柱，最后加入2mL稀硫酸对柱子进行酸化，以5～10mL/min流速加载水样通过Oasis HLB柱。为了防止回收效率降低，整个过程应始终保持液面高于小柱填料上端，待水样全部通过Oasis HLB柱后，用超纯水清洗柱子，以去除残留在柱里的乙二胺四乙酸四(Na4EDTA)以及部分疏松的杂质。
步骤5、样品净化洗脱：在抽真空条件下，干燥1.5～3小时去除残留的水分。接着用12mL甲醇以0.4～1.0mL/min的流速洗脱待测物。洗脱液收集在15mL具塞玻璃刻度离心管中。
步骤6、浓缩再富集：保持氮吹系统气源充足，随后将洗脱液缓慢浓缩至近干，用1mL甲醇准确定容后，涡旋混匀，最后取0.22微米有机相滤膜过滤与2mL棕色进样小瓶中，在-18℃下避光保存待检。
该步骤中，保持氮吹系统气源充足，将装有洗脱液的离心管放置在氮吹仪上，在温和的气流下缓慢浓缩至近干，约0.2mL时停止吹气，用1mL甲醇准确定容后，涡旋混匀。
步骤7、利用液相色谱串联质谱同步测定环境水体中抗生素，
为了提高离子的信号强度，获得较好的峰型、线性和重现性，本发明尝试对各种仪器参数做了优化，检测条件如下所示：
色谱条件
(1)色谱柱：CORTECSTM C18,2.7um；4.6×100mm
(2)流动相：A：0.2％甲酸-2mmol/L乙酸铵水溶液0.01％甲酸水溶液，
B：乙腈
(3)梯度洗脱：见表1。
(4)流速0.6ml/min；进样体积10μL；柱温：45℃。
(6)碰撞气为氮气。
表1 高效液相色谱梯度洗脱
| 时间 | 流速(μL/min) | A相(％) | B相(％) |
| 0.0 | 500 | 90 | 10 |
| 6.0 | 500 | 32 | 68 |
| 7.5 | 500 | 5 | 95 |
| 7.6 | 500 | 90 | 10 |
| 12.0 | 500 | 90 | 10 |
质谱条件
(1)电离方式：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；三重四级杆质谱检测；
(2)喷雾电压：5500V；
(3)质谱扫描方式：多反应离子监测(MRM)；入口电压EP＝10.00V，碰撞室出口电压CXP＝9.5V,各化合物优化的保留时间，MRM离子对，碎裂电压，碰撞能量见表2。
表2 17种抗生素化合物定性定量离子
以下通过一个实例对本发明的技术方案进行补充说明。采用本发明建立的方法对广州市某河流上下游两段各采6份水样进行测定，由表3可见，除ODM、CTC、LFX、EFX在上游段未检测出，在下游段微量检测出外，其余13种抗生素均有不同浓度的检出。其中，检出大环内酯类抗生素为3.39～32.5ng/L，磺胺类抗生素为193.9～335ng/L，四环素类抗生素的质量浓度为ND～560ng/L，氟喹诺酮抗生素ND～151ng/L。本文研究结果与目前这些文献报道结果相近，如唐才明等在海水和城市污水中检出多种磺胺和大环内酯类抗生素，海水中磺胺甲恶唑为16.5ng/L，污水中磺胺类为29.2～468ng/L；徐维海等在珠江广州河段水体中检出氟喹诺酮和大环内酯类抗生素，其质量浓度分别为70.0～489ng/L和13.0～69.0ng/L。叶计朋等在珠江三角洲主要水体深圳湾中检出磺胺类抗生素为23.0～248ng/L，维港中检出氧氟沙星为10.0～16.0ng/L。说明所建立的方法能够满足实际需求。
表3 水样中抗生素的浓度
Table 3 Concentrations of antibioties in water sample
虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。
Claims (3)
1.一种高效液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法，其特征在于，其特征在于，具体包含以下步骤：
步骤1、从实验器皿上降低背景干扰：实验开始前，让非定量棕色的玻璃器皿经过马弗炉高温持续烘烧；定量的玻璃器皿经过超声清洁，有机溶剂冲洗干净后取用；
步骤2、样品制备：对悬浮物较多的环境样品进行预处理，用玻璃纤维滤膜过滤，将滤液盛放至干净非定量棕色的玻璃器皿中；
步骤3、样品保存稳定：水样预处理之后加入一定量硫酸，调节至Ph3-4，以抑制微生物对待测化合物的降解；同时加入5％甲醇，以增大水中待测物的溶解度，冷藏保存；
步骤4、固相萃取富集水相中待测物：准确量取200～1000mL过滤后的水样，加入0.1-0.5g乙二胺四乙酸四(Na4EDTA)，再加入浓度为50ug/ml的7种混合内标，包括有红霉素13C-D3、磺胺甲恶唑D4、磺胺甲嘧啶、甲氧苄啶-D3、赛本咪唑-D4、磺基水杨酸甲氯环素、环丙沙星-D8充分摇匀；
连接检查固相萃取系统，按顺序分次加入甲醇和超纯水以此活化固相萃取Oasis HLB柱，最后加入2mL稀硫酸对柱子进行酸化，以5～10mL/min流速加载水样通过Oasis HLB柱；待水样全部通过Oasis HLB柱后，用超纯水清洗柱子，以去除残留在柱里的乙二胺四乙酸四(Na4EDTA)以及部分疏松的杂质；
步骤5、样品净化洗脱：在抽真空条件下，干燥1.5～3小时去除残留的水分。接着用12mL甲醇以0.4～1.0mL/min的流速洗脱待测物；洗脱液收集在15mL具塞玻璃刻度离心管中；
步骤6、浓缩再富集：保持氮吹系统气源充足，随后将洗脱液缓慢浓缩至近干，用1mL甲醇准确定容后，涡旋混匀，最后取0.22微米有机相滤膜过滤与2mL棕色进样小瓶中，在-18℃下避光保存待检；
步骤7、利用高效液相色谱串联质谱同步上机测定环境水体中抗生素。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法，其特征在于，步骤1中，非定量玻璃器皿在使用前经过马弗炉450℃高温持续烘烧4小时，充分除去残留在玻璃器皿上有机物；对定量的玻璃器皿需先用有机洗涤液超声清洁1～2小时，用超纯水洗净后，接着依次用甲醇、用甲醇和丙酮等有机溶剂分别冲洗3～5次。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱同步测定环境水体中抗生素的方法，其特征在于，步骤7中，检测条件如下所示：
色谱条件
(1)色谱柱：CORTECSTM C18,2.7um；4.6×100mm
(2)流动相：A：0.2％甲酸-2mmol/L，乙酸铵水溶液0.01％甲酸水溶液，
B：乙腈；
(3)流速0.6ml/min；进样体积10μL；柱温：45℃。
(4)碰撞气为氮气；
质谱条件
(1)电离方式：电喷雾离子源，正离子模式；采用三重四级杆质谱检测；
(2)喷雾电压：5500V；
(3)质谱扫描方式：采用多反应离子监测；入口电压EP＝10.00V，碰撞室出口电压CXP＝9.5V。
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180420 |