CN107881187A - 将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用。本发明通过将具有融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵，诱导，提取含有融合蛋白的包涵体或者融合蛋白，用变性溶液将其充分溶解变性，并加入有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物，使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接，再加入工具酶进行酶切，得到利拉鲁肽；其中，融合基因具有形如A‑B‑C结构的基因序列，其中A为伴侣蛋白编码基因，B为连接肽编码基因，C为Arg34‑GLP‑1(7‑37)片段编码基因。本发明直接将修饰、酶切融合于一个工段，无需专门纯化富集融合蛋白就可以得到利拉鲁肽分子，工艺简单，成本低，更适合工业化放大生产利拉鲁肽。

Description

将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及 应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用。

背景技术

据IDF统计，2015年全球糖尿病的患病率达到4.15亿人，每11个人中就有1人患糖尿病，其中90％以上的糖尿病患者为2型糖尿病。胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide，GLP-1)及其类似物是近年来治疗2型糖尿病的一类新型药物，能够促进葡萄糖浓度依赖性的胰岛素分泌，实现胰岛β细胞的保护和α细胞的调节作用，从而达到稳定的降糖效果，不易诱发低血糖。

由于GLP-1及其类似物在治疗2型糖尿病的优良效果，使其近年来在糖尿病治疗药物市场中逐渐占据重要地位。人体内具有生物活性的GLP-1主要是GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)，天然的GLP-1容易被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)迅速水解失活，不具有临床使用价值。因此对GLP-1结构修饰，形成具有同样药理活性的GLP-1类似物，并掩盖DPP-Ⅳ的结合位点，延长半衰期是该类药物研发的主要课题。如今已有多个GLP-1类似物上市，如：利拉鲁肽、艾塞那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽等，该类药物在未来10年里将会是抗糖尿病药物的重要增长点。

利拉鲁肽属于长效GLP-1类似物，是一类具有显著降低血糖水平及修复胰岛细胞功能的肠促降糖激素，能模仿人GLP-1葡萄糖浓度依赖性的降糖活性，抑制患者胃肠运动和排空，避免口服类降糖药和胰岛素类降糖药的不足，如体重增加、长期血糖浓度及HbA1c水平控制不佳、严重低血糖等不良反应，显著提高患者的生活质量，是治疗2型糖尿病的理想药物。

利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司研制，其序列为：

H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

由上述利拉鲁肽结构可以看出，利拉鲁肽分子是在Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白片段的基础上，在Lys²⁶侧链上连接一个十六碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))而得。目前对于利拉鲁肽的生产制备工艺上，可以分为化学与生物两大途径。

化学方面，主要是采用化学合成多肽的方法。中国专利CN102875665、CN103275208、CN103304660等公开了利拉鲁肽的化学制备方法，但这些化学合成方法需要用到大量的有机溶剂，对环境造成严重污染，并且化学合成副反应较多，产率低，所使用的氨基酸原料成本高，整体生产成本较高。

与化学合成法相比，生物法在环境友好性、工艺简单以及成本低廉等方面的优势而受到人们的重视。目前主要是采用基因重组工程菌发酵得到含Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白片段之后，再对其进行酰化修饰，即在Lys²⁶侧链上连接上十六碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))。这种制备思路的难点在于Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白的制备及修饰。

目前来说，大肠杆菌比较多地被用于GLP-1衍生物的发酵生产。这是因为利用大肠杆菌作为宿主表达Arg³⁴-GLP-1片段，相较酵母具有更容易融合表达，产量高，无糖基化及酶干扰的优势。因而，大肠杆菌也逐渐成为GLP-1衍生物的主要生物生产途径。目前在大肠杆菌生产利拉鲁肽方面，普遍是将Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侣和连接肽进行表达，然后将分子伴侣及连接肽用特异性工具酶切除，得到Arg³⁴-GLP-1(7-37)后再对其进行修饰得到利拉鲁肽。例如中国专利CN104745597A公开了一种高效表达重组利拉鲁肽蛋白的方法，该方法是将Arg³⁴-GLP-1(7-37)通过肠激酶酶切位点连接HIS标签形成基因片段HIS-EK-(Arg³⁴-GLP-1(7-37))，然后将基因片段载入大肠杆菌中进行该融合蛋白的表达。利用HIS标签亲和吸附得到融合蛋白后，再利用肠激酶特异性酶切肠激酶位点得到Arg³⁴-GLP-1

(7-37)。又例如中国专利CN106434717A披露了一种利用大肠杆菌表达带有GLP-1片段的融合蛋白的制备方法。该蛋白含有可溶性分子伴侣、肠激酶识别位点及GLP-1片段，其以可溶性蛋白形式表达后再被肠激酶特异性酶切得到相应的Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段。再例如文章《利拉鲁肽在大肠杆菌中的表达、制备工艺研究及活性分析》所披露的制备方法。其系采用大肠杆菌表达具有KSI分子伴侣、肠激酶识别位点及Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段的融合蛋白，通过收集包涵体进行变复性及纯化操作得到融合蛋白，再加入肠激酶进行特异性酶切并纯化得到Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段，最后加入脂肪酸活化物修饰得到利拉鲁肽。

上述披露的大肠杆菌生产工艺中存在两方面问题：一、上述工艺均采用了肠激酶作为工具酶，这是因为Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段中含有Lys²⁶、Arg³⁴和Arg³⁶等能够被常见消化酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰内切酶等)所识别的酶切位点，容易误切GLP-1片段；虽然肠激酶能够特异性识别DDDDK连接肽，不会误切GLP-1片段，但其酶活低，商业化的肠激酶一般每一单位酶活仅可酶切50μg-500μg融合蛋白，且酶切时间长达12-24h，对于酶切温度(一般要求4℃-25℃)和缓冲液限制多(不能含高于200mM盐，或者2M以上的尿素、200mM咪唑)，使用中还经常需要对酶切缓冲体系进行透析或置换；并且其价格高昂，使用量大，存在酶残留风险，并不利于工业化生产和成本的降低；二、上述工艺均需要通过各种纯化手段先获得融合蛋白前体，再进行酶切以获得Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段，然后再对Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段进行修饰得到利拉鲁肽分子，步骤繁琐。在方式上，要么是通过加入HIS标签亲和吸附融合蛋白，或者包涵体破碎溶解后再层析富集融合蛋白，又或者包涵体收集后变复性再层析富集融合蛋白。这样无形中增加了下游纯化步骤和成本。

发明内容

本发明的目的在于：根据上述存在的问题，本发明提供一种利用大肠杆菌表达含有分子伴侣、连接肽及Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段的融合蛋白，并将其直接修饰酶切转化为利拉鲁肽的制备方法。该方法可以将大肠杆菌高效表达获得的融合蛋白直接经过变性溶解后加入脂肪酸活化物进行修饰，再利用赖氨酰内切酶直接将融合蛋白酶切为利拉鲁肽。该方法无需纯化富集获得融合蛋白或者Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段，并且无需应用肠激酶，工艺步骤简单快捷，成本低。

一般来说，Lys的侧链氨基在碱性pH条件下极易去质子化，因而很容易被亲电子基团进攻，形成酰胺键。发明人经过大量的研究发现：如果将含有分子伴侣、连接肽及Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段的融合蛋白在利用变性剂溶解后，加入一定量的有机碱和有机溶剂使溶液pH达到8.0～12.0，再加入特定脂肪酸活化物进行酰化反应，连接肽中的Lys并不会被脂肪酸活化物修饰。而Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段中的Lys²⁶和伴侣蛋白中的Lys却会被优先修饰上。这样的话，被修饰的Lys未能被赖氨酰内切酶识别，而连接肽中的Lys由于侧链未被修饰而能够被赖氨酰内切酶所识别酶切，从而得到Lys²⁶已被修饰的Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段(即利拉鲁肽分子)。

这种选择性地不修饰连接肽中的Lys，很可能是由于连接肽中大量带负电荷的D(Asp)或E(Glu)基团的存在，遮蔽了亲水区域连接肽中的Lys；同时由于修饰环境中一定量的变性剂及有机溶剂的存在，融合蛋白分子的空间结构被破坏，疏水区域溶解暴露，增大了疏水区Lys发生酰化反应的几率。有机溶剂的加入又使亲水区域中的Lys内包，减少了其发生反应的几率；另外高pH环境及特定脂肪酸活化物的加入则提升了特定Lys侧链氨基的亲核能力与反应效率。以上这些因素的综合作用实现了连接肽中Lys不被修饰的效果，进而保留了连接肽中的Lys能够被相应的工具酶识别酶切的功能。

正是由于保留了连接肽中Lys残基的自由性，也就增加了赖氨酰内切酶的应用可能。赖氨酰内切酶作为专门识别酶切Lys的工具酶，酶活高且稳定，一般每一单位酶活可酶切50至500mg融合蛋白(相同融合蛋白，酶用量仅相当于肠激酶的千分之一)，可耐受高浓度的变性剂(4M尿素或0.1％SDS)、高pH(8～11)、较高温度(不高于50℃)。保留了连接肽中Lys的侧链自由度，也就克服其他工艺中对于肠激酶的依赖，可以选择酶活更好，性价比更高的赖氨酰内切酶；这样的话，也避免了需要先收获纯化融合蛋白，再酶切纯化得到Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段，最后再修饰得到利拉鲁肽分子的繁琐步骤。实现了集修饰酶切于一步的工艺构思，有效地提高了生产效率，大大降低了生产成本。

本发明的目的通过以下所述技术方案实现：一种将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，是利用大肠杆菌表达含有分子伴侣、连接肽及Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段的融合蛋白，并将其直接修饰酶切转化为利拉鲁肽，其包括如下步骤：

(1)将具有融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵，诱导，提取含有融合蛋白的包涵体或者融合蛋白；其中，融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为伴侣蛋白编码基因，B为连接肽编码基因，C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因；

(2)将步骤(1)中获得的融合蛋白或者含有融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物，得到反应体系，反应，使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接；

(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶，得到酶切体系；酶切，得到利拉鲁肽。

步骤(1)中所述的具有融合基因的大肠杆菌工程菌株优选通过如下步骤得到：将形如A-B-C结构的融合基因克隆入原核表达载体中，得到的重组表达载体再转入大肠杆菌工程菌中，得到具有融合基因的大肠杆菌工程菌。

所述的原核表达载体优选pET系列载体；更优选为pET31b(+)。

所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述的诱导优选为通过IPTG诱导。

步骤(1)中所述的融合蛋白具有如下结构，即从N端到C端，伴侣蛋白、连接肽及Arg³⁴-GLP-1(7-37)三个片段连接而成：

所述的伴侣蛋白优选为KSI、PagP或TrxA蛋白。

所述的连接肽优选为如X₁…X_nK所示的肽序列，X为D或者E，n表示氨基酸X的数目，为2至4的整数，优选为3-4；更优选为EEEEK、EDK或DDDDK。

所述的伴侣蛋白、连接肽及Arg³⁴-GLP-1(7-37)各片段之间通过酰胺键相连。

所述的融合基因及具有融合基因的大肠杆菌工程菌株的构建方法可参考自本领域实验指南(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995年)。

所述的伴侣蛋白编码基因优选为如SEQ ID NO.2所示的PagP编码基因、如SEQ IDNO.6所示的TrxA编码基因。

步骤(1)中所述的提取是粗蛋白提取，可通过常规的提取步骤进行提取：

当融合蛋白为包涵体表达形式时，例如PagP-EEEEK-Arg34GLP-1(7-37)融合蛋白或KSI-DDDDK-Arg34GLP-1(7-37)融合蛋白，包涵体提取优选包含如下步骤：将具有融合基因的大肠杆菌工程菌株发酵液进行固液分离，将获得的菌体用碱性缓冲液重悬，破碎菌体，再用洗涤液洗涤；接着离心得到包涵体。

所述的固液分离的方式优选为离心。

所述的碱性缓冲液优选为50mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲液。

所述的洗涤液为50mM Tris-HCl、1％tritonX-100、50mM NaCl、pH8.5的缓冲液。

当融合蛋白为可溶性表达形式时，例如TrxA-EDK-Arg34GLP-1(7-37)融合蛋白，硫酸铵沉淀优选包含如下步骤：将重组大肠杆菌发酵液进行固液分离，将获得的菌体用碱性缓冲液重悬，破碎菌体，离心收集上清液；再在上清液中加入硫酸铵沉淀蛋白，离心收集蛋白沉淀。

所述的固液分离的方式优选为离心。

所述的碱性缓冲液为100mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲液。

步骤(1)中所述的融合蛋白的包涵体为混悬液或半固体状态，而融合蛋白为蛋白沉淀。

步骤(2)中所述的变性溶液选自本领域技术人员所熟知的变性剂，如尿素、盐酸胍及SDS等。更进一步地，优选的变性剂为尿素及盐酸胍。

步骤(2)中所述的变性溶液的用量以使得蛋白充分溶解变性为准，变性溶液的浓度越高，体积用量就较小，变性溶液的浓度越低，体积用量就相对大。

所述的变性溶液的浓度为4～8M

步骤(2)中所述的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或至少两种。

所述的有机溶剂的用量按其在反应体系中的浓度为体积百分比为5～50％计算。

步骤(2)中所述的缚酸剂选自本领域技术人员所熟知的有机碱，如三乙胺，N,N-二异丙基乙胺和吡啶等中的一种；更进一步地，优选的缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺。

所述的缚酸剂的加入量应能够使反应体系的pH值达到8.0～12.0计算；优选为8.5～11.5。

步骤(2)中所述的脂肪酸活化物选自N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t或N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH，其用量按融合蛋白量进行计算，蛋白：脂肪酸活化物的摩尔比例为1：1～10，优选1：3～5。

步骤(2)中所述的脂肪酸活化物应在有机溶剂溶解的前提条件下加入，并且有机溶剂的选择与前面所述的一致。更进一步地，脂肪酸活化物在有机溶剂中的浓度为10～100g/L，优选30～50g/L。

所述的N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t和N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH的结构如下：

步骤(2)中所述的反应的条件优选为搅拌状态下反应3小时。

步骤(3)中所述的工具酶为具有切割连接肽中赖氨酸残基功能的酶，优选为赖氨酰内切酶。

所述的赖氨酰特异性内切酶的加入按包涵体中融合蛋白总量计算，1g融合蛋白加入2.5～20IU赖氨酰特异性内切酶，优选10～20IU。

步骤(3)中所述的酶切的条件为pH8.0～10.5，优选pH8.5～9.5,其pH值调节选自盐酸或氢氧化钠。

步骤(3)中所述的酶切的时间优选为8h。

步骤(3)中所述的酶切体系还可包含缓冲物质，这有利于酶切过程中pH的稳定。

所述的缓冲物质优选为三羟甲基氨基甲烷溶液。

所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法在工业化制备利拉鲁肽中的应用。

本发明对于现有技术具有如下的优点和效果：

本发明提供的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法可以将融合蛋白包涵体变性溶解后，直接通过修饰和酶切获得利拉鲁肽。该工艺步骤简便，省去了对所表达融合蛋白及Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段的纯化富集步骤，可以在一定的变性剂、有机溶剂和缚酸剂溶液体系中酰化修饰融合蛋白中的Arg³⁴-GLP-1(7-37)，之后再利用工具酶切断连接肽，即可得到利拉鲁肽分子。这样直接将修饰、酶切融合于一个工段，无需专门纯化富集融合蛋白、Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段就可以得到利拉鲁肽分子；另外该方法也解决了对肠激酶的依赖，并且使得赖氨酰内切酶的使用不再受限。由于使用了酶活更高，价格更加便宜的赖氨酰内切酶作为工具酶，既减少了肠激酶使用的各种条件限制，减少了不必要的酶切缓冲液置换步骤，同时也减少了外源工具酶的用量，降低了产品生产成本和酶残留的风险。本发明避免了对融合蛋白和Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段的收集步骤，并且可选用酶活更高，价格更低的工具酶，工艺简便，更适合工业化放大生产。

附图说明

图1是实施例1的pET31b-PagP载体的构建图。

图2是实施例1pET31b(+)-PagP-GLP-1载体的构建图。

图3是实施例1制备的融合蛋白的电泳图谱图。

图4是实施例2的pET-31b(+)-TrxA-GLP-1载体的构建图。

图5是实施例2制备的融合蛋白的电泳图谱图。

图6是实施例3制备的融合蛋白的电泳图谱图。

图7是实施例4的HPLC图谱图。

图8是实施例5的HPLC图谱图。

图9是实施例6的HPLC图谱图。

图10是对照品(诺和力注射液)的HPLC图谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

1、说明：本文中的缩写含义如下：

HPLC：高压液相分析色谱仪

TFA：三氟乙酸

DCM：二氯甲烷

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

LC-MS：液相质谱。

2、HPLC检测方法

仪器，Agilent 1260；柱子，Kromasil C4 4.6×250mm 5μm 100埃。流速，1.0ml/min；柱温35℃；检测波长，210nm。

A相：0.1％(v/v)TFA的水溶液；B相：0.1％(v/v)TFA的乙腈溶液。

3、LC-MS检测

仪器，Agilent 6120单四极杆LC/MS；检测器，ESI(+)扫描模式。液相色谱条件参考HPLC检测方法。

4、N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t的合成

参考中国专利CN1232470A(名称为“GLP-1衍生物”)例35合成得到N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t。

5、N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH的合成

取上述得到的N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t粉末1g，将其溶解于10ml TFA中，室温反应1至2小时。再将溶液真空旋蒸浓缩，之后在浓缩液中加入冷乙醚10ml，过滤收集沉淀。再将沉淀用5ml DCM溶解，并往其中加入15ml冷石油醚使其结晶析出，最后真空干燥得到N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH粉末约0.68g。

实施例1

含PagP-EEEEK-Arg³⁴GLP-1(7-37)基因工程菌的构建

(1)PagP分子伴侣重组载体pET31b-PagP的构建

PagP是革兰氏阴性菌膜蛋白，其在大肠杆菌中作为分子伴侣可促进外源蛋白形成包涵体，PagP氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。优化后的的PagP分子伴侣基因序列如SEQ IDNO:2所示。PagP分子伴侣基因序列委托基因合成服务公司合成，基因合成服务公司全基因合成好分子伴侣PagP后，TA克隆至pUC57载体上，经常规的转化大肠杆菌DH5α，筛选，测序验证获得重组载体pUC57-PagP。

使用TaKaRa公司的限制性内切酶AlwNI和NdeI对质粒pET-31b(+)(购自Invitrogen公司)进行双酶切，同样用AlwNI和NdeI对重组载体pUC57-PagP进行双酶切。将酶切后的DNA片段连接至经同样酶双酶切的pET-31b(+)，经常规的转化大肠杆菌DH5α，筛选，测序验证正确后，命名为pET31b-PagP(如图1所示)。

(2)人工合成含N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体(Arg³⁴GLP-1(7-37))基因序列

N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合基因片段，依据密码子表将这些氨基酸序列转换

为核苷酸序列，在转换过程中根据大肠杆菌的密码子使用偏好性，选用使用频率较高的密码子，调整其GC含量，去掉影响基因转录的顺式作用元件和重复序列而优化得到，同时在基因序列的3’端引入双终止密码子TAATGA，为了便于基因操作，在N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合基因序列的5’端引入AlwNI酶切位点序列CAGATGCTG，在3’端引入XhoI酶切位点CTCGAG，优化后的的N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:3，基因序列如SEQ ID NO:4所示(即如下的N端延伸肽序列+GLP-1(7-37)中间体基因片段)，基因序列委托基因合成服务公司合成。

(3)GLP-1(7-37)重组表达载体pET31b(+)-PagP-GLP-1的构建

使用TaKaRa公司的限制性内切酶AlwNI和XhoI对质粒pET-31b(+)-PagP进行双酶切，同样用AlwNI和XhoI对N端延伸肽序列+GLP-1(7-37)中间体基因片段进行双酶切，使用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit(DNA连接试剂盒)将基因片段和质粒片段进行连接，经常规的转化大肠杆菌DH5α，筛选，测序验证后，命名为pET31b(+)-PagP-GLP-1(如图2所示)。

(4)PagP-EEEEK-Arg³⁴GLP-1(7-37)表达菌株的构建

按照美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版提供的氯化钙法，制备大肠杆菌BL21(DE3)(均购自Life Technologies公司)感受态细胞。取1μL重组表达载体pET31b(+)-PagP-GLP-1转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化方法同样按照《分子克隆实验指南》第三版的氯化钙法进行。将转化液分别涂布至添加了氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)的LB固体培养基，37℃倒置培养直到出现单菌落，即获得了

PagP-EEEEK-Arg³⁴GLP-1(7-37)表达菌种库，命名为BL21(DE3)/pET31b(+)-PagP-GLP-1。用牙签挑取单菌落BL21(DE3)/pET31b(+)-PagP-GLP-1，接种至50ml LB液体培养基，37℃、250rpm振荡培养，当菌液OD600＝0.5～1.0时，取3～6ml菌液接种至100ml LB液体培养基，37℃、250rpm振荡培养至OD600＝0.6～0.8时添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，终浓度为1mmol/L)开始诱导，并取诱导2h菌液1ml，12000rpm离心1分钟，去掉上清液，将菌体保存在-20℃备用。

取出-20℃冻存的菌体，加入5ml 8M的尿素溶液重悬菌体，在冰水混合物中超声波破碎10分钟(超声3秒，停5秒，如此循环)。取15μl破碎液，加入15μl上样缓冲液，充分混匀后取10μl进行SDS-PAGE(其中浓缩胶含体积百分比5％的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29:1)、分离胶含体积百分比15％的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29:1))。电泳条件为：浓缩胶设定电流为11mA，分离胶设定电流为22mA。电泳结束后，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液(每升含0.6g考马斯亮蓝R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，余量为纯化水)染色过夜，用脱色液(每升含250ml乙醇，80ml冰醋酸，余量为纯化水)脱色直到背景透明。将凝胶在透明背景下拍照提取图像(如图3所示)，BL21(DE3)/pET31b(+)-PagP-GLP-1经IPTG诱导后可表达大小约为23kDa的蛋白质，这与GLP-1(7-37)前体的理论分子量23493.20Da相符。

实施例2

含TrxA-EDK-Arg³⁴GLP-1(7-37)基因工程菌的构建

(1)TrxA分子伴侣重组载体pET-31b(+)-TrxA的构建

硫氧还蛋白TrxA在大肠杆菌中作为分子伴侣可促进外源蛋白以可溶性形式表达，TrxA氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。优化后的的TrxA分子伴侣基因序列如SEQ ID NO:6所示。TrxA分子伴侣基因序列委托基因合成服务公司合成。基因合成服务公司全基因合成分子伴侣TrxA基因片段后，TA克隆至pUC57载体上，经常规的转化大肠杆菌DH5α，筛选，测序验证获得重组载体pUC57-TrxA。

使用TaKaRa公司的限制性内切酶AlwNI和NdeI对质粒pET-31b(+)进行双酶切，同样用AlwNI和NdeI对重组载体pUC57-TrxA进行双酶切，将酶切后的DNA片段连接至经同样酶双酶切的pET-31b(+)，经常规的转化大肠杆菌DH5α，筛选，测序验证正确后，命名为pET-31b(+)-TrxA。

(2)人工合成含N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体(Arg³⁴GLP-1(7-37))基因序列

N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合基因片段，依据密码子表将这些氨基酸序列转换为核苷酸序列，在转换过程中根据大肠杆菌的密码子使用偏好性，选用使用频率较高的密码子，调整其GC含量，去掉影响基因转录的顺式作用元件和重复序列而优化得到，同时在基因序列的3’端引入双终止密码子TAATGA，为了便于基因操作，在N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合基因序列的5’端引入AlwNI酶切位点序列CAGATGCTG，在3’端引入XhoI酶切位点CTCGAG，优化后的的N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:7，基因序列如SEQ ID NO:8所示(即如下的N端延伸肽序列+GLP-1(7-37)中间体基因片段)，基因序列委托基因合成服务公司合成。

(3)GLP-1(7-37)重组表达载体pET-31b(+)-TrxA-GLP-1的构建

使用TaKaRa公司的限制性内切酶AlwNI和XhoI对质粒pET-31b(+)-TrxA进行双酶切，同样用AlwNI和XhoI对N端延伸肽序列+GLP-1(7-37)中间体基因片段进行双酶切，使用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit将基因片段和质粒片段进行连接，经常规的转化大肠杆菌DH5α，筛选，测序验证后，命名为pET-31b(+)-TrxA-GLP-1(如图4所示)。

(4)TrxA-EDK-Arg³⁴GLP-1(7-37)表达菌株的构建

按照美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版提供的氯化钙法，制备大肠杆菌BL21(DE3)(均购自Life Technologies公司)感受态细胞。取1μL重组表达载体pET-31b(+)-TrxA-GLP-1转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化方法同样按照《分子克隆实验指南》第三版的氯化钙法进行。将转化液分别涂布至添加了卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB固体培养基，37℃倒置培养直到出现单菌落，即获得了TrxA-EDK-Arg³⁴GLP-1(7-37)表达菌种库，命名为BL21(DE3)/pET-31b(+)-TrxA-GLP-1。用牙签挑取单菌落BL21(DE3)/pET-31b(+)-TrxA-GLP-1，接种至50ml LB液体培养基，37℃，250rpm振荡培养，当菌液OD600＝0.5～1.0时，取3～6ml菌液接种至100ml LB液体培养基，37℃，250rpm振荡培养至OD600＝0.6～0.8时添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，终浓度为1mmol/L)开始诱导，并取诱导2h菌液1ml，12000rpm离心1分钟，去掉上清液，将菌体保存在-20℃备用。

取出-20℃冻存的菌体，加入5ml 8M的尿素溶液重悬菌体，在冰水混合物中超声波破碎10分钟(超声3秒，停5秒，如此循环)。取15μl破碎液上清，加入15μl上样缓冲液，充分混匀后取10μl进行SDS-PAGE(其中浓缩胶含体积百分比5％的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29:1)、分离胶含体积百分比15％的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29:1))。电泳条件为：浓缩胶设定电流为11mA，分离胶设定电流为22mA。电泳结束后，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液(每升含0.6g考马斯亮蓝R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，余量为纯化水)染色过夜，用脱色液(每升含250ml乙醇，80ml冰醋酸，余量为纯化水)脱色直到背景透明。将凝胶在透明背景下拍照提取图像(如图5所示)，BL21(DE3)/pET-31b(+)-TrxA-GLP-1经IPTG诱导后可表达大小约为16kDa的蛋白质，这与GLP-1(7-37)前体的理论分子量15917Da相符。

实施例3：

含KSI-DDDDK-Arg³⁴GLP-1(7-37)基因工程菌的构建

该工程菌的构建过程参考自论文《利拉鲁肽在大肠杆菌中的表达、制备工艺研究及活性分析》(王雪娜，《遵义医学院》，2014)。构建后所表达的融合蛋白KSI-DDDDK-Arg³⁴GLP-1(7-37)氨基酸序列SEQ ID NO:9，相应的核苷酸序列SEQ ID NO:10，融合蛋白电泳图片如图6所示，理论分子量为17670.85Da。

实施例4：

PagP-EEEEK-Arg³⁴GLP-1(7-37)融合蛋白的修饰酶切

取实施例1所构建的工程菌，进行发酵，离心后获得菌体。将菌体按照重量体积比1：10比例重悬于50mM Tris-HCl、pH8.5的缓冲液中，匀浆破碎菌体，离心收集沉淀。再将沉淀以重量体积比1：10比例用50mM Tris-HCl、1％tritonX-100、50mM NaCl，pH8.5的缓冲液洗涤，离心收集包涵体沉淀。最终10L发酵液得到970g包涵体，Folin-酚法检测得出每1g包涵体中蛋白含量为0.26g。

取上述融合蛋白包涵体100g，溶于660ml浓度为8M的尿素溶液中，再加入600ml乙腈和2ml DIEA，混合均匀，pH值为8.7；再往其中加入含有50mg/ml N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t的乙腈溶液50ml，室温搅拌反应3小时；然后用水将反应液稀释5倍，再加入260IU赖氨酰特异性内切酶，用稀盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值为9.5，酶切8h后调pH至4.8使蛋白沉淀。沉淀蛋白离心冻干得到粉末，再将其溶解于TFA中反应1～2h，最后旋蒸除去TFA，并将蛋白溶解于2.0L磷酸盐缓冲液pH7.5，取样进行HPLC检测(如图7)，共计1.52g利拉鲁肽，MS结果为3751.9，理论值为3751.2。

实施例5：

TrxA-EDK-Arg³⁴GLP-1(7-37)融合蛋白的修饰酶切

取实施例2所构建的基因工程菌，进行发酵，离心后获得菌体。10L发酵液可获得1.5kg菌体，将菌体按照重量体积比1：10比例重悬于100mM Tris-HCl、pH 8.5缓冲液中，匀浆破碎菌体，离心收集上清液。上清液加入硫酸铵沉淀蛋白，离心收集蛋白沉淀。并用5L4mol/L、pH 8.5的尿素溶液溶解沉淀蛋白，Folin-酚法检测蛋白含量，溶液中蛋白浓度为32.4g/L。

取上述蛋白溶液500ml，往其中加入50ml N-甲基吡咯烷酮，再加入5ml三乙胺溶液，pH为10.6；最后加入含有50mg/ml N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH的N-甲基吡咯烷酮溶液50ml，搅拌反应3小时；之后再加入400IU赖氨酰特异性内切酶，稀盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值9.0，反应8小时后取样进行HPLC检测(如图8所示)，溶液中利拉鲁肽共0.89g，MS检测结果为3751.7，理论值为3751.2。

实施例6：

KSI-DDDDK-Arg³⁴GLP-1(7-37)融合蛋白的修饰酶切

取实施例3所构建的基因工程菌，参考论文《利拉鲁肽在大肠杆菌中的表达、制备工艺研究及活性分析》(王雪娜，《遵义医学院》，2014)进行发酵，菌体破碎和包涵体洗涤。10L发酵液最终获得1.08kg包涵体，Folin-酚法检测得出每1g包涵体蛋白量为0.31g。

取上述融合蛋白包涵体200g溶于1500ml 6mol/L盐酸胍溶液中，加入80mlDMSO和15mlN,N-二异丙基乙胺，混合均匀，pH为11.2；再加入含有50mg/ml N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH的DMSO溶液110ml，搅拌反应3小时；之后往其中加入1700ml 20mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液，并加入900IU赖氨酰特异性内切酶，稀盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值9.3，反应8小时后取样进行HPLC检测(如图9所示)，溶液中含利拉鲁肽1.74g，MS检测结果为3751.2，理论值为3751.2。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海联邦制药股份有限公司

<120> 将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PagP的氨基酸序列

<400> 1

Met Asn Ala Asp Glu Trp Met Thr Thr Phe Arg Glu Asn Ile Ala Gln

1 5 10 15

Thr Trp Gln Gln Pro Glu His Tyr Asp Leu Tyr Ile Pro Ala Ile Thr

20 25 30

Trp His Ala Arg Phe Ala Tyr Asp Lys Glu Lys Thr Asp Arg Tyr Asn

35 40 45

Glu Arg Pro Trp Gly Gly Gly Phe Gly Leu Ser Arg Trp Asp Glu Lys

50 55 60

Gly Asn Trp His Gly Leu Tyr Ala Met Ala Phe Lys Asp Ser Trp Asn

65 70 75 80

Lys Trp Glu Pro Ile Ala Gly Tyr Gly Trp Glu Ser Thr Trp Arg Pro

85 90 95

Leu Ala Asp Glu Asn Phe His Leu Gly Leu Gly Phe Thr Ala Gly Val

100 105 110

Thr Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr Ile Pro Leu Pro Val Leu Leu Pro

115 120 125

Leu Ala Ser Val Gly Tyr Gly Pro Val Thr Phe Gln Met Thr Tyr Ile

130 135 140

Pro Gly Thr Tyr Asn Asn Gly Asn Val Tyr Phe Ala Trp Met Arg Phe

145 150 155 160

Gln Phe Gln Met Leu

165

<210> 2

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PagP的编码核苷酸

<400> 2

catatgaacg cggacgagtg gatgaccacc tttcgtgaaa acatcgcgca gacctggcag 60

caaccggagc actacgatct gtatatcccg gcgattacct ggcacgcgcg tttcgcgtac 120

gacaaggaga aaaccgatcg ttataacgaa cgtccgtggg gtggcggttt tggtctgagc 180

cgttgggacg agaagggcaa ctggcacggt ctgtacgcga tggcgttcaa ggatagctgg 240

aacaaatggg agccgattgc gggctatggt tgggaaagca cctggcgtcc gctggcggac 300

gaaaacttcc acctgggcct gggttttacc gcgggtgtga ccgcgcgtga taactggaac 360

tacatcccgc tgccggttct gctgccgctg gcgagcgtgg gttatggtcc ggttaccttc 420

cagatgacct acattccggg tacctataac aacggtaacg tgtactttgc gtggatgcgt 480

ttccagtttc agatgctg 498

<210> 3

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合蛋白氨基酸序列

<400> 3

Glu Glu Glu Glu Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser

1 5 10 15

Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val

20 25 30

Arg Gly Arg Gly

35

<210> 4

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合蛋白的编码核苷酸序列

<400> 4

gaagaagaag aaaagcacgc tgaaggtact ttcacttctg acgtttcttc ttacttggaa 60

ggtcaagctg ctaaggaatt catcgcttgg ttggttagag gtagaggt 108

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TrxA的氨基酸序列

<400> 5

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gln Met Leu

100 105 110

<210> 6

<211> 339

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TrxA的编码核苷酸序列

<400> 6

cacatgtctg acaaaatcat ccacctgacc gacgactctt tcgacaccga cgttctgaaa 60

gctgacggtg ctatcctggt tgacttctgg gctgaatggt gcggtccgtg caaaatgatc 120

gctccgatcc tggacgaaat cgctgacgaa taccagggta aactgaccgt tgctaaactg 180

aacatcgacc agaacccggg taccgctccg aaatacggta tccgtggtat cccgaccctg 240

ctgctgttca aaaacggtga agttgctgct accaaagttg gtgctctgtc taaaggtcag 300

ctgaaagaat tcctggacgc taacctggct cagatgctg 339

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合蛋白氨基酸序列

<400> 7

Glu Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly

20 25 30

Arg Gly

<210> 8

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端延伸肽和GLP-1(7-37)中间体的融合蛋白的编码核苷酸序列

<400> 8

gaagacaagc acgctgaagg tactttcact tctgacgttt cttcttactt ggaaggtcaa 60

gctgctaagg aattcatcgc ttggttggtt agaggtagag gt 102

<210> 9

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白KSI-DDDDK-Arg34GLP-1(7-37)的氨基酸序列

<400> 9

Met His Thr Pro Glu His Ile Thr Ala Val Val Gln Arg Phe Val Ala

1 5 10 15

Ala Leu Asn Ala Gly Asp Leu Asp Gly Ile Val Ala Leu Phe Ala Asp

20 25 30

Asp Ala Thr Val Glu Asp Pro Val Gly Ser Glu Pro Arg Ser Gly Thr

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Lys Leu Pro Leu Ala

50 55 60

Val Glu Leu Thr Gln Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe

65 70 75 80

Ala Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gln Gly Arg Lys Thr Val Val Ala

85 90 95

Pro Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Ser Ile

100 105 110

Arg Ala Leu Phe Gly Glu Lys Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Asp

115 120 125

Asp Asp Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser

130 135 140

Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg

145 150 155 160

Gly Arg Gly

<210> 10

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白KSI-DDDDK-Arg34GLP-1(7-37)的编码核苷酸序列

<400> 10

atgcataccc cagaacacat caccgccgtg gtacagcgct ttgtggctgc gctcaatgcc 60

ggcgatctgg acggcatcgt cgcgctgttt gccgatgacg ccacggtgga agaccccgtg 120

ggttccgagc ccaggtccgg tacggctgcg attcgtgagt tttacgccaa ctcgctcaaa 180

ctgcctttgg cggtggagct gacgcaggag gtacgcgcgg tcgccaacga agcggccttc 240

gctttcaccg tcagcttcga gtatcagggc cgcaagaccg tagttgcgcc catcgatcac 300

tttcgcttca atggcgccgg caaggtggtg agcatccgcg ccttgtttgg cgagaagaat 360

attcacgcat gccagatgct ggatgacgat gacaaacatg cagaaggcac ctttacgagt 420

gatgtgagct cttatctgga aggccaggcg gccaaggaat tcattgcgtg gctggttcgt 480

ggccgcggtt aatga 495

Claims (9)

1.一种将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将具有融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵，诱导，提取含有融合蛋白的包涵体或者融合蛋白；其中，融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为伴侣蛋白编码基因，B为连接肽编码基因，C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因；

(2)将步骤(1)中获得的融合蛋白或者含有融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物，得到反应体系，反应，使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接；

(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶，得到酶切体系；酶切，得到利拉鲁肽。

2.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

所述的伴侣蛋白为KSI、PagP或TrxA蛋白；

所述的连接肽为如X₁…X_nK所示的肽序列，X为D或者E，n表示氨基酸X的数目，为2至4的整数。

3.根据权利要求2所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的连接肽为EEEEK、EDK或DDDDK。

4.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

所述的有机溶剂的用量按其在反应体系中的浓度为体积百分比为5～50％计算；

所述的缚酸剂的加入量按能够使反应体系的pH值达到8.0～12.0计算；

步骤(2)中所述的脂肪酸活化物的用量按融合蛋白：脂肪酸活化物的摩尔比例为1：1～10计算。

5.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的变性溶液为尿素、盐酸胍和SDS中的至少一种；

步骤(2)中所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或至少两种；

步骤(2)中所述的缚酸剂为三乙胺，N,N-二异丙基乙胺和吡啶中的一种或至少两种；

步骤(2)中所述的脂肪酸活化物选自N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t或N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH；

步骤(3)中所述的工具酶为具有切割连接肽中赖氨酸残基功能的酶。

6.根据权利要求5所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的工具酶为赖氨酰内切酶。

7.根据权利要求6所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的赖氨酰特异性内切酶的加入按包涵体中融合蛋白总量计算，1g融合蛋白加入2.5～20IU赖氨酰特异性内切酶。

8.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的反应的条件为搅拌状态下反应3小时；

步骤(3)中所述的酶切的条件为pH8.0～10.5酶切8h。

9.权利要求1～8任一项所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法在工业化制备利拉鲁肽中的应用。