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CN107858337B - 一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用 - Google Patents

一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用 Download PDF

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CN107858337B CN201711220144.8A CN201711220144A CN107858337B CN 107858337 B CN107858337 B CN 107858337B CN 201711220144 A CN201711220144 A CN 201711220144A CN 107858337 B CN107858337 B CN 107858337B
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South China Agricultural University
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Abstract

本发明公开了一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用。该耐热突变脂肪酶是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变，获得的富含多对二硫键突变的脂肪酶4s，脂肪酶5s和脂肪酶6s，其中，脂肪酶4s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；脂肪酶5s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；脂肪酶6s的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明采用迭代组合多对二硫键突变的策略，提高了脂肪酶的热稳定性，与传统引入二硫键的策略相比，通过进一步增加了引入二硫键的数目大幅度提高了中温脂肪酶的热稳定性，特别适合在工业上应用。

Description

一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，特别涉及一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用。
背景技术
传统化学反应需要在高温高压的条件下进行，但催化剂价格昂贵，不易回收，且反应过程伴随大量副反应；与化学法相比，生物酶制剂催化反应条件温和、种类繁多、价格低廉。并且生物酶制剂具有底物专一性等特点，大大减少了反应生成的副产物。因此，生物酶制剂被广泛应用于工业领域。作为一类重要的生物酶制剂，耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是一种性能优良的脂肪酶，具备很高的酯化、水解和转酯化活性，目前已被广泛应用到酯水解和合成，生物柴油制备等领域。但该脂肪酶热耐热性能较差，不利于生产加工、储存和运输，是生产应用的重要瓶颈，改造其耐热性能的意义重大。
二硫键是2个巯基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的共价键。肽链上的2个半胱氨酸残基的巯基基团，可发生氧化反应形成二硫键；伴随二硫键的形成，半胱氨酸残基转变为胱氨酸残基。二硫键的形成对于保持蛋白质活性功能具有极其重要的影响，它的配对正确与否是影响蛋白质多肽链折叠的重要原因。同时，许多蛋白质需要二硫键维持其特定的高级结构。当二硫键被打断还原为巯基基团时，蛋白质结构将很可能发生改变，部分或完全失去原有的生物功能。已有大量研究通过引入二硫键的策略获得了耐热的蛋白突变体，如脂肪酶，淀粉酶和甘露聚糖酶等。但通常人为引入的二硫键数目较少，并没探究多对二硫键对蛋白质耐热性能的影响。
目前，文献中对二硫键迭代进化来提高其热稳定性的研究相对较少，因此很有必要对其进行富含二硫键的迭代进化，探讨其对热稳定性的影响。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，在耶氏解脂酵母脂肪酶2中引入多对二硫键，以提高其耐热性能，并提供3种耐热脂肪酶。
本发明的另一目的在于提供所述耐热突变脂肪酶的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述耐热突变脂肪酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种耐热突变脂肪酶，是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变，获得富含多对二硫键突变的耐热脂肪酶。
所述的二硫键包括二硫键S2-210(突变第2位和第210位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S8-214(突变第8位和第214位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S14-216(突变第14位和第216位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S60-69(突变第60位和第69位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S122-196(突变第122位和第196位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)和S118-177(突变第118位和第177位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)。
所述的引入多对二硫键优选为引入4～6对二硫键。
所述的耐热突变脂肪酶优选为脂肪酶4s、脂肪酶5s或脂肪酶6s；
所述的迭代组合的方法为组合二硫键S8-214、S60-69、S122-196和S118-177(4s)，组合二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196和S118-177(5s)，或组合二硫键S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和S118-177(6s)。
所述的耐热突变脂肪酶的氨基酸序列，如下所示：
脂肪酶4s的氨基酸序列如下：
VYTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTCTCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKCNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQENPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；
脂肪酶5s的氨基酸序列如下：
VCTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTCTCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKCNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQECPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；
脂肪酶6s的氨基酸序列如下：
VCTSTETCHIDQECYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTCTCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKCNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQECPDVCKCSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI。
编码所述耐热突变脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：
脂肪酶4s的核苷酸序列如下：
gtgtacacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagaaccccgatgtctgtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
脂肪酶5s的核苷酸序列如下：
gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctgtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
脂肪酶6s的核苷酸序列如下：
gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtgttacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctgtaagtgttccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa。
所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)以pPICZαA-Lip2为模板，通过反向PCR突变，将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序，获得引入四对、五对或六对二硫键的突变脂肪酶重组质粒；
(2)将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母X33中，进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选，得到对应的突变工程菌；
(3)将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；
(4)利用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶，即耐热突变脂肪酶。
步骤(1)中所述的引入的四对、五对和六对二硫键分别为二硫键S8-214、S60-69、S122-196和S118-177，二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196和S118-177，二硫键S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和S118-177。
步骤(1)中所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌TOP10。
步骤(2)中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度优选为100μg/mL。
步骤(3)中所述的发酵的时间优选为96h。
步骤(4)中所述的超滤管优选为10kDa超滤管。
步骤(4)中所述的突变脂肪酶为脂肪酶4s、脂肪酶5s或脂肪酶6s。
所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，还包括如下步骤：
(5)通过DSF荧光检测测定脂肪酶的熔解温度(Tm)，p-NPP比色法测定15min半失活温度(T50)，55或70℃下的半衰期(t1/2)，最适反应温度(Topt)，最适反应pH(pHopt)和/或pH稳定性。
所述的耐热脂突变肪酶热稳定性强，耐酸碱，特别适合在工业上进行应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明在筛选出能提高Lip2耐热性能的单对二硫键，二硫键S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和S118-177(使脂肪酶的Tm值分别提高10.48、7.50、5.70、5.97、4.55和3.33℃)基础上，采用迭代组合多对二硫键突变的策略，提高了脂肪酶的热稳定性。与传统引入二硫键的策略相比，通过进一步增加了引入二硫键的数目大幅度提高了中温脂肪酶的热稳定性。
2、本发明通过在Lip2中迭代组合四对、五对和六对二硫键，获得耐热脂肪酶4s、脂肪酶5s和脂肪酶6s。相对于亲本脂肪酶(Lip2)，脂肪酶4s、脂肪酶5s和脂肪酶6s的Tm值分别提升了16.45、20.23和22.53℃，其T50值分别提升27.49、29.83和31.23℃，在70℃下其半衰期分别长达11.95、24.76和101.93min，极大提高了脂肪酶4s、脂肪酶5s和脂肪酶6s的耐热性能。
附图说明
图1是Lip2、脂肪酶4s、脂肪酶5s和脂肪酶6s的最适反应pH曲线图。
图2是Lip2、脂肪酶4s、脂肪酶5s和脂肪酶6s的pH稳定性曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
材料与试剂：pPICZαA-Lip2毕赤酵母表达载体由上海金斯瑞生物公司全基因合成与构建；质粒提取试剂盒购自Omega贸易有限公司；KOD-PLUS突变试剂盒购自东洋纺公司；Protein Thermal Shift筛选试剂盒购自Thermo公司；TOP10大肠杆菌感受态细胞购自天根生物公司；突变引物由上海生工生物工程公司合成；PmeⅠ限制性内切酶购自New EnglandBiolabs公司；PCR产物纯化回收试剂盒购自大连宝生物公司；电转仪购自Bio-Rad公司；LLB、LLB+Zeocin、YPD、YPD+Zeocin、BMGY、BMMY培养基均按照Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒操作手册配制，镍柱纯化试剂盒购自上海生工生物工程公司，其余试剂均为国内外购买的分析纯级别。
实施例1：突变脂肪酶表达质粒的构建
以pPICZαA-Lip2为模板(构建方法参考中国专利申请201610279266.3“一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用”)和表1中引物进行突变，获得3段突变氨基酸。其中，3段氨基酸序列如下所示：
脂肪酶4s的氨基酸序列如下：
VYTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTCTCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKCNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQENPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；
脂肪酶5s的氨基酸序列如下：
VCTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTCTCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKCNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQECPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；
脂肪酶6s的氨基酸序列如下：
VCTSTETCHIDQECYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTCTCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKCNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQECPDVCKCSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI。
编码所述耐热脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：
脂肪酶4s的核苷酸序列如下：
gtgtacacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagaaccccgatgtctgtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
脂肪酶5s的核苷酸序列如下：
gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctgtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
脂肪酶6s的核苷酸序列如下：
gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtgttacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctgtaagtgttccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa。
以pPICZαA-Lip2为模板进行反向PCR，每引入一对二硫键需要进行两次反向PCR。由于二硫键S14-216和S2-210、S8-214均处于两段loop间(第1位氨基酸至第14位氨基酸和第207位氨基酸至221位氨基酸)，而二硫键S14-216和S2-210离酶活中心相对较近，所以选择S8-214、S60-69、S122-196和S118-177作为4s的四条二硫键，S2-210、S8-214、S60-69、S122-196和S118-177作为5s的五条二硫键，S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和S118-177作为6s的六条二硫键。以表1的122C-F和122-R作为引物，得到脂肪酶4s第一次扩增引物。
表1突变引物汇总
Figure BDA0001486270170000081
注：斜线加粗处为突变位点
PCR扩增条件为：94℃2min；94℃10s、66℃30s、68℃5min，10个循环。反应体系如下表2所示。
表2PCR反应体系
上游引物(10μM) 1.5μL
下游引物(10μM) 1.5μL
KOD-Plus高保真酶 1μL
模板(50ng/μL) 1μL
双蒸水 35μL
5×SmartPCR buffer 5μL
5×dNTP(2M) 5μL
总体系 50μL
扩增产物以DnpⅠ酶消化模板，在琼脂糖凝胶电泳检测突变条带大小后，用T4连接酶连接环化过夜，随后使用热激法将突变质粒转入TOP10大肠杆菌感受态细胞，并涂布于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/ml)平板37℃过夜培养，挑选阳性转化子进行质粒的测序。
将测序正确的阳性转化子于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/ml)液体培养基过夜扩培后，提取质粒。以该质粒为模板，按照同样的方法，依次以表1的引物196C-F和196C-R，196+118C-F和196+118C-R，177C-F和177C-R，8C-F和8C-R，214C-F和214C-R，60C-F和60C-R，69C-F和69C-R进行7次突变，获得脂肪酶4s的重组质粒。
以脂肪酶4s的质粒为模板，依次以表1的引物210+8C-F和210+8C-R，210+214C-F和210+214C-R进行2次突变，获得脂肪酶5s的重组质粒。
以脂肪酶5s的质粒为模板，依次以表1的引物210+214+14C-F和210+214+14C-R，210+214+216C-F和210+214+216C-R进行2次突变，获得脂肪酶6s的重组质粒。
实施例2：线性化质粒电转化毕赤酵母、转化子筛选与产酶筛选
将测序正确的阳性转化子于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/ml)液体培养基过夜扩增培养后，提取质粒，以PmeⅠ线性化处理并纯化回收，以总量为5μg的质粒线性化产物与X33毕赤酵母感受态混合电击转化。毕赤酵母感受态制备参照Invitrogen公司操作手册。电转程序按照Bio-Rad公司推荐参数设置。
电转完毕立刻加入1mL 1mol/L山梨醇溶液，将菌液在30℃孵育复苏1小时后，均匀涂布于YPDS+Zeocin(Zeocin浓度为100μg/ml)抗性平板上筛选。
实施例3：重组工程菌株的发酵
参考Invitrogen公司毕赤酵母表达试剂盒操作手册并稍作修改，修改内容如下：把工程菌株单菌落接种到2mL YPDS-Zeocin(Zeocin浓度为100μg/mL)液体培养基中进行纯化培养过夜，离心将细胞以BMGY液体培养基重悬并过夜培养，再接种至50mL BMMY液体培养基，以25℃、280r/min培养96h，每天补充甲醇至终浓度为1％(v/v)。
实施例4：脂肪酶的分离和纯化
1)超滤浓缩
将100mL发酵液于4℃5000r/min离心5分钟后吸取上清液并用10kDa超滤管于5000r/min 4℃离心50min，收集浓缩酶液。
2)一步法镍柱纯化
①用5mL的含咪唑10mM的Binding Buffer平衡镍柱，充分除去残留的乙醇；
②浓缩酶液与含咪唑120mM的Binding Buffer按照1:1比例混合后添加至镍柱中结合；
③用15mL含咪唑60mM的Washing buffer充分洗脱杂蛋白；
④用15mL含咪唑300mM的Elution Buffer洗脱目标蛋白；
⑤纯化酶液按照上述条件超滤浓缩；
得到纯化的突变脂肪酶，最后以还原性SDS-PAGE垂直电泳检测酶纯度，纯度均在90％以上。
实施例5：脂肪酶的酶学性质测定。
利用荧光定量PCR仪，按照Protein Thermal Shift试剂盒推荐反应程序测定突变脂肪酶的Tm值，结果如表3所示，引入的多对二硫键极大幅度提升了脂肪酶的Tm，6s的Tm值较4s和5s进一步提高。
表3DSF测定结果
脂肪酶 T<sub>m</sub> ΔT<sub>m</sub>
Lip2 48.32±0.25 -
4s 64.77±0.10 16.45
5s 68.55±0.15 20.23
6s 70.85±0.01 22.53
T50测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中分别以30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃精确保温15min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应5min，在20％(w/v)的碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余的相对酶活。
t1/2测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中55或70℃精确保温0、5、10、15、30、45、60min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应，20％(w/v)碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余活性。
Topt测定方法：向0.15mg/mL的纯化蛋白溶液中加入在30、35、40、45、50、55、60、65和70℃条件下预热后的50mM含40mM的p-NPP的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应，20％(w/v)碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度下脂肪酶的相对酶活。
pHopt值的测定：把p-NPP标准母液加入到pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(表4)，将5μL纯化的0.1mg/mL酶液加入其中，以比色法在30℃精确反应10min测定残余活性，将最适反应pH下的酶活定义为100％，以pH对相对活性作图，得到其测定曲线。
pH稳定性的测定：用双蒸水把酶液的浓度稀释至1mg/mL，再用pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液稀释酶液至终浓度为0.1mg/ml；其中pH 2.0～8.0范围使用柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(表4)，pH9.0～11.0范围使用甘氨酸—氢氧化钠缓冲液(配方详见表5)。在25℃下孵育24h，以比色法在30℃下精确反应10min测定脂肪酶残余活性。
表4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液(25℃)
Figure BDA0001486270170000111
注：Na2HPO4分子量＝141.98，0.2mol/L溶液为28.40g/L；以Na2HPO4·2H2O配制Na2HPO4溶液，Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05，0.2mol/L溶液为35.61g/L；柠檬酸分子量＝210.14，0.1mol/L溶液为21.01g/L。
表5甘氨酸—氢氧化钠缓冲液(0.05mol/L)
pH x/ml y/ml pH x/ml y/ml
8.6 50 4.0 9.6 50 22.4
8.8 50 6.0 9.8 50 27.2
9.0 50 8.8 10.0 50 32.0
9.2 50 12.0 10.4 50 38.6
9.4 50 16.8 10.6 50 45.5
注：x ml 0.2mol/L甘氨酸+y ml 0.2mol/L NaOH，加水稀释至200mL；甘氨酸分子量＝75.07，0.2mol/L甘氨酸溶液为15.01g/L。
T50、t1/2和Topt如表6所示，pHopt和pH稳定性分别如图1和图2所示:
表6热稳定性测定结果
T<sub>50</sub>(℃) t<sub>1/2</sub>(min) T<sub>opt</sub>(℃)
Lip2 40.86 0.34 35
4s 68.35 11.95 40
5s 70.69 24.76 55
6s 72.06 101.93 55
注：Lip2测定温度为55℃，其余为70℃。
可见，脂肪酶4s、脂肪酶5s和脂肪酶6s的热稳定性均显著地提高，T50均大幅度提高。脂肪酶4s的最适反应温度提升至40℃，而脂肪酶5s和脂肪酶6s的均提升至55℃。且脂肪酶5s和脂肪酶6s在70℃下具有较长的半衰期，其pH反应区间得以拓宽且耐酸碱能力得以增强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 脂肪酶4s的氨基酸序列
<400> 1
Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
35 40 45
His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe Cys Asp Pro Arg Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Cys Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Cys Thr Cys Asp Cys Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu
130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly
145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Cys Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Cys Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Asn Pro Asp Val Cys Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
290 295 300
<210> 2
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 脂肪酶5s的氨基酸序列
<400> 2
Val Cys Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
35 40 45
His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe Cys Asp Pro Arg Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Cys Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Cys Thr Cys Asp Cys Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu
130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly
145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Cys Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Cys Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Cys Pro Asp Val Cys Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
290 295 300
<210> 3
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 脂肪酶6s的氨基酸序列
<400> 3
Val Cys Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Cys Tyr Asn
1 5 10 15
Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
35 40 45
His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe Cys Asp Pro Arg Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Cys Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Cys Thr Cys Asp Cys Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu
130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly
145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Cys Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Cys Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Cys Pro Asp Val Cys Lys Cys Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
290 295 300
<210> 4
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 脂肪酶4s的核苷酸序列
<400> 4
gtgtacacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60
tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120
ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttctgt 180
gacccccgtc tcatctttga tgtttgtggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240
atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300
atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac ttgtacttgt 360
gattgttgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaagtg taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgcttgttt tgctaactgg 600
gtcgataaac tcttctttgg ccaggagaac cccgatgtct gtaaggtgtc caaagaccga 660
aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840
cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaataa 909
<210> 5
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 脂肪酶5s的核苷酸序列
<400> 5
gtgtgtacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60
tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120
ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttctgt 180
gacccccgtc tcatctttga tgtttgtggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240
atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300
atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac ttgtacttgt 360
gattgttgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaagtg taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgcttgttt tgctaactgg 600
gtcgataaac tcttctttgg ccaggagtgt cccgatgtct gtaaggtgtc caaagaccga 660
aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840
cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaataa 909
<210> 6
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 脂肪酶6s的核苷酸序列
<400> 6
gtgtgtacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt gttacaactt ctttgagaag 60
tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120
ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttctgt 180
gacccccgtc tcatctttga tgtttgtggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240
atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300
atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac ttgtacttgt 360
gattgttgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaagtg taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgcttgttt tgctaactgg 600
gtcgataaac tcttctttgg ccaggagtgt cccgatgtct gtaagtgttc caaagaccga 660
aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840
cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaataa 909
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 122C-F
<400> 7
tgttgtcttg tccacaatgg cttcatc 27
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 122C-R
<400> 8
atcacaagta gcagtagaag agatgttagc agc 33
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 196C-F
<400> 9
acaagcgtta ccgacaatgg gctg 24
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 196C-R
<400> 10
tttgctaact gggtcgataa actcttcttt g 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 196+118C-F
<400> 11
acttgtgatt gttgtcttgt ccacaatggc t 31
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 196+118C-R
<400> 12
acaagtagaa gagatgttag cagcaagatc aaagttc 37
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 177C-F
<400> 13
tgtaacggcc acgatcccct cgt 23
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 177C-R
<400> 14
cttgaggttg attccgaaca gaagggc 27
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 8C-F
<400> 15
tgtcacattg accaggagtc ctacaacttc 30
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 8C-R
<400> 16
ggtctcggta gaggtgtaca catggtgat 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 214C-F
<400> 17
tgtaaggtgt ccaaagaccg aaagctcta 29
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 214C-R
<400> 18
gacatcgggg ttctcctggc ca 22
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 60C-F
<400> 19
tgtgaccccc gtctcatctt tgatgt 26
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 60C-R
<400> 20
gaactcctcg atgagctcaa cgttgg 26
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 69C-F
<400> 21
tgtggttacc tcgctgttga tcatgc 26
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 69C-R
<400> 22
aacatcaaag atgagacggg ggtcac 26
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+8C-F
<400> 23
tgtcacattg accaggagtc ctacaacttc 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+8C-R
<400> 24
ggtctcggta gaggtacaca catggtgatg 30
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+214C-F
<400> 25
tgtaaggtgt ccaaagaccg aaagctcta 29
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+214C-R
<400> 26
gacatcggga cactcctggc ca 22
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+214+14C-F
<400> 27
tacaacttct ttgagaagta cgcccgactc 30
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+214+14C-R
<400> 28
acactcctgg tcaatgtgac aggtctcg 28
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+214+216C-F
<400> 29
ccgaatcacc caccgaggag atatc 25
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210+214+216C-R
<400> 30
tagagctttc ggtctttgga acacttacag 30

Claims (6)

1.一种耐热突变脂肪酶，其特征在于：是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变获得；所述的引入多对二硫键为引入4～6对二硫键；
所述的二硫键为二硫键S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和S118-177；
所述的耐热突变脂肪酶为脂肪酶4s、脂肪酶5s或脂肪酶6s；
所述的脂肪酶4s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的脂肪酶5s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的脂肪酶6s的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的耐热突变脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于：
所述的脂肪酶4s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的脂肪酶5s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的脂肪酶6s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.权利要求1所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以pPICZαA-Lip2为模板，通过反向PCR突变，将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序，获得引入四对、五对或六对二硫键的突变脂肪酶重组质粒；
（2）将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母X33中，进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选，得到对应的突变工程菌；
（3）将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；
（4）利用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的耐热突变脂肪酶。
4.根据权利要求3所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的大肠杆菌为大肠杆菌TOP10。
5.根据权利要求3所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度为100 μg/mL。
6.根据权利要求3所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于还包括如下步骤：
（5）通过DSF荧光检测测定脂肪酶的熔解温度，p-NPP比色法测定15 min半失活温度，55或70℃下的半衰期，最适反应温度，最适反应pH，以及pH稳定性。
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