CN107796770A - 一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法 - Google Patents
一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107796770A CN107796770A CN201710928061.8A CN201710928061A CN107796770A CN 107796770 A CN107796770 A CN 107796770A CN 201710928061 A CN201710928061 A CN 201710928061A CN 107796770 A CN107796770 A CN 107796770A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- reagent
- isocitrate lyase
- total
- lyase activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003599 lyase activity assay Methods 0.000 title claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims abstract description 26
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N threo-D-isocitric acid Natural products OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N D-threo-isocitric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N 0.000 claims abstract description 10
- ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N Isocitric acid Natural products OC(=O)[C@@H](O)[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N 0.000 claims abstract description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K trisodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 7
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 52
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 23
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 16
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 9
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 28
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 229960005137 succinic acid Drugs 0.000 abstract description 5
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 abstract description 2
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 6
- 244000248349 Citrus limon Species 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- GOLXNESZZPUPJE-UHFFFAOYSA-N spiromesifen Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(C(O1)=O)=C(OC(=O)CC(C)(C)C)C11CCCC1 GOLXNESZZPUPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010036824 Citrate (pro-3S)-lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- WVVOBOZHTQJXPB-UHFFFAOYSA-N N-anilino-N-nitronitramide Chemical compound [N+](=O)([O-])N(NC1=CC=CC=C1)[N+](=O)[O-] WVVOBOZHTQJXPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法，其试剂盒中包括有由Tris‑HCl缓冲溶液、KCl、MnCl2、DTT和EDTA混合成的溶液，由磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液和水混合成的溶液，由MgCl2·6H2O、DTT和NADH混合成的粉剂，乳酸脱氢酶和异柠檬酸。该方法的测定原理为ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率间接反映ICL活性。本发明通过酶偶联作用，在紫外波长下检测NADH含量来间接反映ICL活性的高低，能够有效排除有色物质的干扰，大大提高了检测的准确度。
Description
技术领域
本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法。
背景技术
异柠檬酸裂解酶（ICL）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物，异柠檬酸裂解酶则是乙醛酸循环的关键酶之一。
异柠檬酸裂解酶催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，可通过测定乙醛酸的变化间接反映异柠檬酸裂解酶活性的高低。目前应用较的异柠檬酸裂解酶活性测定方法是比色法，即乙醛酸和二硝基苯肼作用形成乙醛酸苯肼，在碱性条件下显褐色，颜色的深浅与乙醛酸含量呈正比，以此间接算出异柠檬酸裂解酶的活性。由于丙酮酸也能与二硝基苯肼反应，该方法受到的干扰较大，存在假阳性，科研工作中迫切需要开发一种新的方法来检测异柠檬酸裂解酶活性。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法，可高效准确地测定异柠檬酸裂解酶的活性。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液、KCl、MnCl2、DTT和EDTA混合而成，并调pH至7.0，置于100mL容量瓶中，4℃保存；
试剂一，液体15mL×1瓶，由磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和水混合而成，置于15mL试剂瓶中，4℃保存；
试剂二，粉剂×1瓶，由MgCl2·6H2O、DTT和NADH混合而成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂三，液体360μL×1支，由乳酸脱氢酶组成，置于1.5mL EP管中，4℃保存；
试剂四，粉剂×1瓶，由异柠檬酸组成，置于5mL试剂瓶中，4℃保存。
进一步的，所述提取液中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为100mmol/L，pH为7.0，体积为100mL，KCl的质量为150mg，MnCl2的质量为99mg，DTT的质量为31mg，EDTA的质量为3mg。
进一步的，所述试剂一中含有的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的物质的量浓度为0.1mmol/L，pH为7.0，体积为3.85mL，水的体积为11.15mL。
进一步的，所述试剂二中含有的MgCl2·6H2O的质量为20mg，DTT的质量为3mg，NADH的质量为4.5mg。
进一步的，所述试剂三中含有的乳酸脱氢酶的酶浓度为500U/mL，体积为360uL。
进一步的，所述试剂四中含有的异柠檬酸的质量为25.8mg。
一种采用上述试剂盒的异柠檬酸裂解酶活性测定方法，基于微量法，其原理是异柠檬酸裂解酶（ICL）催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应异柠檬酸裂解酶的活性；
该方法的具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2 样本的前处理；
1）对于细菌或培养细胞的前处理，具体操作如下：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；最后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
2）对于组织的前处理，具体操作如下：
先按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，然后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3将酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤4样本测定；
1）工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2）在试剂四中加入4mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3）在微量石英比色皿中加入10μL样本、150μL所述工作液和40μL试剂四，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2；
步骤5异柠檬酸裂解酶活性计算；
1）按样本蛋白浓度计算：
ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（V样×Cpr）÷T = 3216×ΔA÷Cpr；
ICL（nmol/min/mg prot）单位的定义为每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位；
2）按样本鲜重计算：
ICL（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W×V样÷V样总）÷T = 3216×ΔA÷W；
ICL（nmol/min/g 鲜重）单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位；
3）按细菌或细胞密度计算：
ICL（nmol/min/104 cell）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T = 6.25×ΔA；
ICL（nmol/min/104 cell）单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位；
其中，V反总表示反应体系总体积，且V反总=2×10-4 L；
ε表示NADH摩尔消光系数，且ε=6.22×103 L/mol/cm；
d表示微量石英比色皿光径，且d=0.5cm；
V样表示加入样本体积，且V样=0.01mL；
V样总表示加入提取液的体积，且V样总=1mL；
T表示反应时间，且T=2 min；
Cpr表示样本蛋白质的浓度，其单位为mg/mL；
W表示样本的质量，其单位为g；
500表示细菌或细胞总数，代表500万个。
本发明的有益效果是：
1、本发明方法的测定原理为ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率间接反映ICL活性。目前市面上还没有一种酶偶联紫外分光光度法微量ICL检测试剂盒及其检测方法，该方法通过酶偶联作用，在紫外波长下检测NADH含量来间接反映ICL活性的高低，能够有效排除有色物质的干扰，大大提高了检测的准确度。
2、本发明的方法通过简单配制工作液和试剂四，3分钟内即可完成一个样本的测定，大大提高了检测效率。
3、本发明的反应体系为200μL，相比于分光光度法的3mL反应体系，大大缩小了试剂用量，成本极低。
4、本发明的方法重复性较好，变异系数(CV值)在2％以内。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液、KCl、MnCl2、DTT和EDTA混合而成，并调pH至7.0，置于100mL容量瓶中，4℃保存；
试剂一，液体15mL×1瓶，由磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和水混合而成，置于15mL试剂瓶中，4℃保存；
试剂二，粉剂×1瓶，由MgCl2·6H2O、DTT和NADH混合而成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂三，液体360μL×1支，由乳酸脱氢酶组成，置于1.5mL EP管中，4℃保存；
试剂四，粉剂×1瓶，由异柠檬酸组成，置于5mL试剂瓶中，4℃保存。
进一步的，所述提取液中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为100mmol/L，pH为7.0，体积为100mL，KCl的质量为150mg，MnCl2的质量为99mg，DTT的质量为31mg，EDTA的质量为3mg。
进一步的，所述试剂一中含有的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的物质的量浓度为0.1mmol/L，pH为7.0，体积为3.85mL，水的体积为11.15mL。
进一步的，所述试剂二中含有的MgCl2·6H2O的质量为20mg，DTT的质量为3mg，NADH的质量为4.5mg。
进一步的，所述试剂三中含有的乳酸脱氢酶的酶浓度为500U/mL，体积为360uL。
进一步的，所述试剂四中含有的异柠檬酸的质量为25.8mg。
一种采用上述试剂盒的异柠檬酸裂解酶活性测定方法，基于微量法，其原理是异柠檬酸裂解酶（ICL）催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应异柠檬酸裂解酶的活性；
该方法的具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2 样本的前处理；
1）对于细菌或培养细胞的前处理，具体操作如下：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；最后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
2）对于组织的前处理，具体操作如下：
先按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，然后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3将酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤4样本测定；
1）工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2）在试剂四中加入4mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3）在微量石英比色皿中加入10μL样本、150μL所述工作液和40μL试剂四，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2；
步骤5异柠檬酸裂解酶活性计算；
1）按样本蛋白浓度计算：
ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（V样×Cpr）÷T = 3216×ΔA÷Cpr；
ICL（nmol/min/mg prot）单位的定义为每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位；
2）按样本鲜重计算：
ICL（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W×V样÷V样总）÷T = 3216×ΔA÷W；
ICL（nmol/min/g 鲜重）单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位；
3）按细菌或细胞密度计算：
ICL（nmol/min/104 cell）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T = 6.25×ΔA；
ICL（nmol/min/104 cell）单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位；
其中，V反总表示反应体系总体积，且V反总=2×10-4 L；
ε表示NADH摩尔消光系数，且ε=6.22×103L/mol/cm；
d表示96孔板光径，且d=0.5cm；
V样表示加入样本体积，且V样=0.01mL；
V样总表示加入提取液的体积，且V样总=1mL；
T表示反应时间，且T=2 min；
Cpr表示样本蛋白质的浓度，其单位为mg/mL；
W表示样本的质量，其单位为g；
500表示细菌或细胞总数，代表500万个。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
提取液，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液、KCl、MnCl2、DTT和EDTA混合而成，并调pH至7.0，置于100mL容量瓶中，4℃保存；
试剂一，液体15mL×1瓶，由磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和水混合而成，置于15mL试剂瓶中，4℃保存；
试剂二，粉剂×1瓶，由MgCl2·6H2O、DTT和NADH混合而成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂三，液体360μL×1支，由乳酸脱氢酶组成，置于1.5mL EP管中，4℃保存；
试剂四，粉剂×1瓶，由异柠檬酸组成，置于5mL试剂瓶中，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述提取液中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为100mmol/L ，pH为7.0，体积为100mL，KCl的质量为150mg，MnCl2的质量为99mg，DTT的质量为31mg，EDTA的质量为3mg。
3.根据权利要求1所述的异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的物质的量浓度为0.1mmol/L，pH为7.0，体积为3.85mL，水的体积为11.15mL。
4.根据权利要求1所述的异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有的MgCl2·6H2O的质量为20mg，DTT的质量为3mg，NADH的质量为4.5mg。
5.根据权利要求1所述的异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中含有的乳酸脱氢酶的酶浓度为500U/mL，体积为360uL。
6.根据权利要求1所述的异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂四中含有的异柠檬酸的质量为25.8mg。
7.一种采用如权利要求1所述的试剂盒的异柠檬酸裂解酶活性测定方法，其特征在于，基于微量法，具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2 样本的前处理；
对于细菌或培养细胞的前处理，具体操作如下：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例，超声波破碎细菌或细胞；最后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
对于组织的前处理，具体操作如下：
先按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例，进行冰浴匀浆，然后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3将酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤4样本测定；
1）工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于37℃或25℃水浴5min；
2）在试剂四中加入4mL蒸馏水，充分溶解待用；3）在微量石英比色皿中加入10μL样本、150μL所述工作液和40μL试剂四，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2；
步骤5异柠檬酸裂解酶活性计算；
1）按样本蛋白浓度计算：
ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（V样×Cpr）÷T = 3216×ΔA÷Cpr；
2）按样本鲜重计算：
ICL（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W×V样÷V样总）÷T = 3216×ΔA÷W；
3）按细菌或细胞密度计算：
ICL（nmol/min/104 cell）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T = 6.25×ΔA；
其中，V反总表示反应体系总体积，且V反总=2×10-4 L；
ε表示NADH摩尔消光系数，且ε=6.22×103 L/mol/cm；
d表示微量石英比色皿光径，且d=0.5cm；
V样表示加入样本体积，且V样=0.01mL；
V样总表示加入提取液的体积，且V样总=1mL；
T表示反应时间，且T=2 min；
Cpr表示样本蛋白质的浓度，其单位为mg/mL；
W表示样本的质量，其单位为g；
500表示细菌或细胞总数，代表500万个。
8.根据权利要求7所述的异柠檬酸裂解酶活性测定方法，其特征在于：步骤2的1）中，所述的超声波破碎细菌或细胞的方法为先冰浴，然后采用功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710928061.8A CN107796770A (zh) | 2017-10-09 | 2017-10-09 | 一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710928061.8A CN107796770A (zh) | 2017-10-09 | 2017-10-09 | 一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107796770A true CN107796770A (zh) | 2018-03-13 |
Family
ID=61533852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710928061.8A Pending CN107796770A (zh) | 2017-10-09 | 2017-10-09 | 一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107796770A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109060791A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-21 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法 |
| CN109211817A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-01-15 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种基于微量法的辅酶a含量测定试剂盒及其方法 |
| CN109324006A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-02-12 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法 |
| CN109541052A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-03-29 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种亚精胺合成酶活性测定试剂盒及其方法 |
| CN110779887A (zh) * | 2019-09-30 | 2020-02-11 | 浙江大学 | 一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101793740A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 异柠檬酸测定试剂(盒)及异柠檬酸浓度测定方法 |
| CN101793738A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 异柠檬酸测定试剂(盒)及异柠檬酸浓度测定方法 |
| CN102124119A (zh) * | 2008-04-30 | 2011-07-13 | 巴斯夫欧洲公司 | 使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法 |
| WO2015126221A1 (ko) * | 2014-02-24 | 2015-08-27 | 서강대학교산학협력단 | 신규 탄소고정회로 및 이의 용도 |
-
2017
- 2017-10-09 CN CN201710928061.8A patent/CN107796770A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102124119A (zh) * | 2008-04-30 | 2011-07-13 | 巴斯夫欧洲公司 | 使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法 |
| CN101793740A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 异柠檬酸测定试剂(盒)及异柠檬酸浓度测定方法 |
| CN101793738A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 异柠檬酸测定试剂(盒)及异柠檬酸浓度测定方法 |
| WO2015126221A1 (ko) * | 2014-02-24 | 2015-08-27 | 서강대학교산학협력단 | 신규 탄소고정회로 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 郝方等: "《结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及酶学性质研究》", 《中华结核和呼吸杂质》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109060791A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-21 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法 |
| CN109211817A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-01-15 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种基于微量法的辅酶a含量测定试剂盒及其方法 |
| CN109324006A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-02-12 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法 |
| CN109541052A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-03-29 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种亚精胺合成酶活性测定试剂盒及其方法 |
| CN110779887A (zh) * | 2019-09-30 | 2020-02-11 | 浙江大学 | 一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107796770A (zh) | 一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法 | |
| CN102297962B (zh) | 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒 | |
| CN103698541B (zh) | 谷氨酸发酵在线检测系统及采用该系统在线检测的方法 | |
| CN1804602B (zh) | 表面清洁程度及细菌污染快速检测方法和装置 | |
| JP2004508833A (ja) | バイオマスの検出および測定のための方法 | |
| Jelikić-Stankov et al. | Determination of uric acid in human serum by an enzymatic method using N-methyl-N-(4-aminophenyl)-3-methoxyaniline reagent | |
| CN100507524C (zh) | 微生物抗干扰快速检测方法 | |
| CN104293884B (zh) | 一种乙酰辅酶a含量测定试剂盒及其方法 | |
| Verma et al. | Fiber optic biosensor for the detection of Cd in milk | |
| CN109609594A (zh) | 一种基于微量法的6-磷酸葡萄糖含量测定试剂盒及方法 | |
| CN107782684A (zh) | 辅酶ⅱnadp+或nadph含量测定试剂盒及其方法 | |
| CN109596550A (zh) | 一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法 | |
| CN101942498A (zh) | 快速检测糖尿病试剂盒 | |
| CN107727589A (zh) | 一种转氢酶‑1活性测定试剂盒及其方法 | |
| CN102818801A (zh) | 一种测定atp的方法 | |
| CN102495011B (zh) | 一种细菌亚硝酸盐还原酶活性测定方法 | |
| CN109060791A (zh) | 一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法 | |
| WO1999011816A1 (fr) | Reactifs pour controler la proprete et procede de controle de la proprete | |
| CN109913527A (zh) | 一种利用atp生物发光反应检测食品中痢疾杆菌的方法 | |
| Burns et al. | Methods for the measurement of a bacterial enzyme activity in cell lysates and extracts | |
| Keller | An enzymatic method for glucose quantitation in normal urine | |
| CN105483208A (zh) | 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定试剂盒及其方法 | |
| US3817830A (en) | Method for obtaining optically active composition from racemate of vanillylmandelic acid | |
| CN109211817A (zh) | 一种基于微量法的辅酶a含量测定试剂盒及其方法 | |
| US3749643A (en) | Measurement of urinary d(-)vanillylmandelic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180313 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |