CN107793483B - 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carmsln-nkt细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carmsln-nkt细胞及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107793483B CN107793483B CN201610807069.4A CN201610807069A CN107793483B CN 107793483 B CN107793483 B CN 107793483B CN 201610807069 A CN201610807069 A CN 201610807069A CN 107793483 B CN107793483 B CN 107793483B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nkt cell
- cell
- nkt
- culture
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 20
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 title abstract description 8
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 claims abstract 6
- 102100025096 Mesothelin Human genes 0.000 claims abstract 6
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 121
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 20
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 10
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 claims description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 5
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 108010016290 deoxyribonucleoprotamine Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 2
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005282 malignant pleural mesothelioma Diseases 0.000 claims description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 24
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 13
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 abstract description 11
- 238000004904 shortening Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 40
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 15
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 4
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 3
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- -1 5-carboxyfluorescein succinimide ester Chemical class 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100023678 Killer cell lectin-like receptor subfamily B member 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010041047 Slow virus infection Diseases 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101001049181 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily B member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000009311 VIPoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70517—CD8
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2305—Interleukin-5 (IL-5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CARMSLN‑NKT细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLNScFv、缩短的CD8铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。采用本发明的CARMSLN‑NKT细胞与MSLN阳性的间皮瘤细胞共培养时，对间皮瘤细胞具有很好的特异杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化MSLN靶向性的NKT细胞(CARMSLN-NKT细胞)及其制备方法和应用。
背景技术
自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INFγ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。而且，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了NKT细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。再者，研究表明，NKT细胞并不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，且对部分肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高。
间皮素(MSLN)是一个40kDa的表面糖蛋白，表达于多种肿瘤细胞表面，如恶性间皮瘤、胰腺瘤、卵巢癌等，其中恶性胸膜间皮瘤MSLN的表达率达到90％以上，而在正常组织呈现低表达的现象。研究发现，MSLN与肿瘤的进展、转移及患者较低生存率有很大的相关性。由于以上特性，MSLN抗原成为抗体为基础治疗的理想靶点。目前，大量研究采用MSLN单克隆抗体或MSLN疫苗的方案靶向杀伤MSLN阳性的肿瘤细胞，然而，这些方案在产生一定效应的基础上，同时也存在一定的缺陷，如：MSLN单克隆抗体靶向效应的短暂性及MSLN单克隆抗体在肿瘤部位分布的不足等。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高以及现有临床研究中MSLN单克隆抗体及疫苗靶向治疗存在的上述的缺陷，提供一种嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化MSLN靶向性的NKT细胞(CARMSLN-NKT细胞)及其制备方法和应用。
本发明的发明人在研究中意外发现，采用本发明的嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞与MSLN阳性的间皮瘤细胞共培养时，对间皮瘤细胞具有很好的特异杀伤活性。
因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLNScFv、缩短的CD8的铰链区(hinge区)和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。
第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。
第三方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
第四方面，本发明提供了一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上述嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。
第五方面，本发明提供了一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞的制备方法，所述方法包括：包装携带PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。
第六方面，本发明提供了上述方法制备得到的工程化MSLN靶向性的NKT细胞。
第七方面，本发明提供了上述工程化MSLN靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
在与MSLN阳性的间皮瘤细胞共培养时，本发明的嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，即工程化MSLN靶向性的NKT细胞能够特异性结合MSLN抗原，增强免疫细胞靶向识别癌细胞表面MSLN抗原的能力，加强对MSLN阳性间皮瘤细胞的特异杀伤活性。本发明的工程化MSLN靶向性的NKT细胞为治疗MSLN阳性的肿瘤提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。
图2为本发明的慢病毒表达载体PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶MluI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。
图3为本发明的慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶BamHI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。
图4为本发明的慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。
图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓缩液对NKT细胞的感染效率。
图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(CARMSLN-NKT细胞)表型鉴定的结果。
图7为本发明的CARMSLN-NKT细胞对MSLN阳性的间皮瘤细胞的杀伤作用的细胞毒性分析图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLN单链抗体MSLNScFv、缩短CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。
优选情况下，嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ由CD8a信号肽、MSLNScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。进一步优选地，嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，更进一步优选地，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，所述基因具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，编码上述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。
对于慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法包括以下步骤：
(1)从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域，并克隆至载体PWPT-GFP中，构建得到PWPT-CD8-CD137-CD3ζ；
(2)合成编码CD8a信号肽和MSLNScFv的核苷酸序列，并克隆至PWPT-CD8-CD137-CD3ζ中，经测序验证后得到序列正确的PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。
步骤(1)中，对于从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为RT-PCR法。其中，NKT细胞可以通过分离人静脉血中的单个核细胞，然后进行培养获得。
具体地，得到PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的方法可以包括：提取NKT细胞的总RNA，逆转录获得NKT细胞cDNA，以得到的NKT细胞cDNA为模板，利用引物P1(SEQID NO.11)和P2(SEQIDNO.12)进行PCR扩增获得CD8基因的hinge区和跨膜区(SEQID NO.3)；利用引物P3(SEQIDNO.13)和P4(SEQID NO.14)进行PCR扩增获得CD137基因的胞内信号结构域(SEQID NO.4)；利用引物P5(SEQID NO.15)和P6(SEQID NO.16)进行PCR扩增获得CD3ζ基因的胞内信号结构域(SEQID NO.5)，将获得的PCR产物分别进行双酶切，然后与MluI/SalI双酶切后的慢病毒表达载体PWPT-GFP连接。
步骤(2)中，对于合成编码CD8a信号肽和MSLNScFv的核苷酸序列的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以通过全基因合成技术合成。
具体地，得到序列正确的PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的方法可以包括：通过全基因合成技术合成编码CD8a信号肽和MSLNScFv融合基因的核苷酸序列(SEQID NO.8)，克隆至载体pGSI中，得到pGSI-MSLNScFv；然后将pGSI-MSLNScFv进行BamHI/MluI双酶切，与用BamHI/MluI双酶切后的步骤(1)得到的重组质粒PWPT-CD8-CD137-CD3ζ连接，经测序鉴定，得到序列正确的PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。其中，CD8a信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，MSLNScFv核苷酸序列如SEQID NO.7所示。
本发明还提供了一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是由上述嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(即CARMSLN-NKT细胞)。
本发明还提供了一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞的制备方法，该方法包括：包装携带PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。
对于包装携带PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒的方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员常用的各种方法，优选情况下，将慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ与辅助质粒(如psPAX2、pMD2.G)共转染293T包装细胞，转染48-72h时收集病毒上清，离心、过滤，在滤液中添加5×PEG6000-NaCl进行混匀，离心后弃上清，沉淀用0-4℃预冷的无菌PBS溶解，获得病毒浓缩液。
本发明的方法中，还包括通过如下方法制备NKT细胞：
(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；
(2)在白介素-2存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养。
优选情况下，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一NKT细胞培养液中，所述第一NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15；进一步优选地，第一NKT细胞培养液中，所述CD3单克隆抗体的浓度为30-70ng/mL，和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mL，和/或所述白介素-15的浓度为30-70ng/mL。
优选情况下，所述第二阶段培养的实施方式包括：将所述第一阶段培养的细胞培养于第二NKT细胞培养液中，所述第二NKT细胞培养液中含有NKT细胞培养基和白介素-2；进一步优选地，第二NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL。
对于NKT细胞培养基没有特别的限定，可以为本领域常用的各种用于培养NKT细胞的培养基，例如可以为GT-T551培养基。
在制备NKT细胞时，对于第一阶段培养和第二阶段培养的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种条件，例如可以在30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO2培养箱中进行培养。本领域技术人员可以对培养的时间进行适应性调整，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明制备得到的NKT细胞中，CD3+细胞平均比率>90％，CD3+CD8+细胞占总CD3+细胞的平均比率>70％；CD3+CD56+细胞占总CD3+细胞的平均比率>15％。
对于感染NKT细胞的方法没有特别限定，可以为本领域常用的各种方法，优选情况下，该方法包括：
(1)在病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2存在下，将NKT细胞进行第一阶段感染培养；
(2)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将所述第一阶段感染培养的细胞进行第二阶段感染培养。
优选地，所述第一阶段感染培养的实施方式包括：将NKT细胞培养于第三NKT细胞培养液中，所述第三NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2；进一步优选地，第三NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL。
优选地，所述第二阶段感染培养的实施方式包括：将所述第一阶段感染培养的细胞培养于所述第一NKT细胞培养液中。第一NKT细胞培养液的具体组成可参见前述相应内容，在此不再赘述。
在感染NKT细胞时，对于第一阶段感染培养和第二阶段感染培养的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种条件，例如可以在30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO2培养箱中进行培养。本领域技术人员可以对培养的时间进行适应性调整，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
具体地，感染NKT细胞的方法包括：取1×107-5×107个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入2-4mL新鲜GT-T551培养液，再加入200-400μL病毒浓缩液、2-4μL 1×10-6mg/mL鱼精蛋白和终浓度为300-700U/mL的IL-2，置于30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO2培养箱中感染12-16h后，弃培养液，将细胞转至未包被的培养瓶中，加入20-50mL的GT-T551培养基，再加入终浓度为300-700U/mL的IL-2、终浓度为30-70ng/ml的CD3单克隆抗体和终浓度为30-70ng/mL的白细胞介素15，于30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO2培养箱中培养12-18h，获得嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。
进一步优选地，感染NKT细胞的方法还包括：
(3)先在白介素-2存在下，将所述第二阶段感染培养的细胞进行体外诱导，待细胞的密度为80-90％时，再在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将细胞进行扩增培养。
优选情况下，所述体外诱导的实施方式包括：将所述第二阶段感染培养的细胞培养于所述第二NKT细胞培养液中，所述扩增培养的实施方式包括：将细胞培养于所述第一NKT细胞培养液中。第一NKT细胞培养液和第二NKT细胞培养液的具体组成可参见前述相应内容，在此不再赘述。
具体地，感染NKT细胞的方法还包括：将第二阶段感染培养后获得的慢病毒感染的NKT细胞用IL-2的终浓度为300-700U/mL的GT-T551培养液进行体外诱导，待细胞的密度为80-90％时将细胞转入细胞培养袋中，隔1.5-2.5天加入IL-2的终浓度为300-700U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为30-70ng/ml、白细胞介素-15的终浓度为30-70ng/mL的新鲜GT-T551培养液进行扩增培养并将细胞扩增至总量为1×109-2×109个细胞。经过本发明的慢病毒对靶向MSLN抗原的嵌合抗原受体进行NKT细胞感染，其感染效率高达30％-60％，而获得的CARMSLN-NKT细胞，其CD3+CD56+细胞占总CD3+细胞的比率在15％以上。
嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞表达的嵌合抗原受体的蛋白氨基酸序列如SEQID NO.1所示。其中，本领域技术人员应该理解的是，嵌合抗原受体前体蛋白由CD8a信号肽、MSLNScFv、CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，蛋白质翻译后在细胞内粗面型内质网切除信号肽后成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后并定位于NKT细胞的细胞膜上。该嵌合抗原受体的蛋白氨基酸序列对应的基因编码序列如SEQID NO.2所示。该嵌合抗原受体以基因CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO.9所示，对应的基因编码序列如SEQID NO.10所示。
本发明还提供了上述方法制备得到的工程化MSLN靶向性的NKT细胞。
本发明还提供了工程化MSLN靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。优选情况下，肿瘤是MSLN阳性的间皮瘤，进一步优选地，所述肿瘤为MSLN阳性的恶性胸膜间皮瘤。
本发明的应用中，对于用于治疗MSLN阳性的肿瘤的制剂的组成没有特别的限定，只要含有本发明所述CARMSLN-NKT细胞或是由CARMSLN-NKT细胞制备而成即可，制剂的具体组成和制备方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：
NKT细胞培养基GT-T551购自TaKaRa公司。
淋巴细胞分离液购自TBD公司。
CD3单克隆抗体、重组纤维连接蛋白(retronectin)均购自TaKaRa公司。
重组人蛋白干扰素-γ、重组人白介素2、重组人白介素15均购自protech公司。
总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶(HS DNAPolymerase)、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。
BglⅡ、EcoRI、MluI、BamHI、SalI购自Fermentas公司。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。
PWPT-GFP、psPAX2、pMD2.G均购自Addgene公司。
pGSI购自北京天一辉远生物科技有限公司。
Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
LipofectamineTM 2000Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司。
293T包装细胞购自美国ATCC。
PEG6000-NaCl中PEG6000终浓度为25.5质量％，NaCl终浓度为1.2M，PEG6000和NaCl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。
胎牛血清购自德国PAA公司。
MSLN阳性的间皮瘤细胞系NCI-H2452购自美国ATCC公司。
5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯购自上海谱振生物科技有限公司。
膜联蛋白V-RPE试剂盒购自美国BD公司。
所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
实施例1 NKT细胞的制备
(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。
(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6体积％的人自体血清的NKT细胞培养基GT-T551调整细胞终浓度为2×106个细胞/mL；将细胞接种于预先经过终浓度为10μg/mL的retronectin包被的75cm2细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为500U/mL的重组人白介素2、50ng/ml CD3单克隆抗体和50ng/mL的重组人白介素-15，在37℃、饱和湿度为5％的CO2培养箱中培养。
(3)培养第4天，将细胞转移至未包被的培养瓶中，每2天按照细胞生长数量加入NKT细胞培养基GT-T551，控制细胞浓度为1×108个细胞/mL，并加入终浓度为500U/ml的重组人白介素2；培养至第12天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。结果见图1，其中，CD3+：95.04％；CD3+CD8+：90.99％；CD3+CD56+：24.12％；CD8+CD56+：24.63％。
实施例2 慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的构建
(1)NKT细胞cDNA的制备
离心沉淀实施例1培养得到的NKT细胞，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent提取细胞的总RNA，-80℃保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit逆转录得NKT细胞cDNA，-20℃保存备用。
(2)慢病毒质粒PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的制备
设计并合成如下引物序列(其中，下划线标记为保护碱基，方框为酶切位点)：
以步骤(1)中NKT细胞cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，得到长227bp的CD8的hinge区和缩短的跨膜区，核苷酸序列如SEQID NO.3所示，两端分别含有MluI和BglⅡ酶切位点和保护碱基；用引物P3和P4进行PCR扩增，得到长146bp的CD137胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQID NO.4所示，两端分别含有BglⅡ和EcoRI酶切位点及保护碱基；用引物P5和P6进行PCR扩增，得到长359bp的CD3ζ的胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQID NO.5所示，两端分别含有EcoRI和SalI酶切位点及保护碱基。各步PCR扩增反应体系相同，以扩增CD137胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照HS DNA Polymerase的说明书，反应体系(50μL)如下：
双蒸水：32.5μL
5×反应buffer：10μL
dNTP混合物(每种2.5mM)：4μL
P3(10mM):1μL
P4(10mM):1μL
NKT细胞cDNA(200ng/ul)：1μL
HS DNA Polymerase：0.5μL
将上述PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒回收备用。
慢病毒表达载体PWPT-GFP用MluI/SalI双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、CD137、CD3ζ片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶MluI和SalI双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2，其中，M1：DNA分子量标记D15000；1泳道：质粒PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的未酶切片段；2泳道：质粒PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(672bp)；M2：DNA分子量标记D2000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为PWPT-CD8-CD137-CD3ζ，其中，CD8的hinge区和跨膜区的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，CD137的胞内信号结构域的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
(3)慢病毒质粒PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备
全基因合成编码CD8a信号肽和MSLNScFv融合基因的核苷酸序列，序列如SEQIDNO.8所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5’端含有BamHI、kozak序列，3’端含有MluI酶切位点，将前述融合基因克隆在质粒pGSI中，命名为pGSI-MSLNScFv。质粒经BamHI/MluI双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段备用。
PWPT-CD8-CD137-CD3ζ质粒经限制性内切酶BamHI/MluI酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收的含有CD8a信号肽和MSLN ScFv的DNA片段通过T4DNA连接酶进行连接，具体方法见说明书。将连接产物转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶BamHI/SalI双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，其中，其中，1泳道：质粒PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ未酶切片段(10117bp)；2泳道：质粒PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(1488bp)；M2：DNA分子量标记D2000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ，其结构示意图如图4所示，其中包括CD8a信号肽(核苷酸序列如SEQID NO.6所示)、抗MSLN单链抗体(核苷酸序列如SEQID NO.7所示)、CD8的hinge区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域，其中，该嵌合抗原受体以基因CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO.9所示，对应的基因编码序列如SEQID NO.10所示。
实施例3 嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞的制备
(1)慢病毒的包装和浓缩
用分光光度计分别测定慢病毒表达质粒PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ和辅助质粒psPAX2、pMD2.G的浓度，三种质粒以4:2:1的质量比用LipofectamineTM2000Transfection Reagent转染试剂共转染293T包装细胞。分别在转染48h、72h时收集病毒上清于50mL EP管中，4℃，2000g离心10min，转移两次得到的上清至新EP管中，用4.5μm滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5×PEG6000-NaCl按照4:1的体积比混匀，4℃静置2h，然后4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀用1mL的4℃预冷的无菌PBS溶解，即得嵌合抗原受体的病毒浓缩液，按每管100μL进行分装，-80℃保存备用。
按照上述方法，利用慢病毒表达质粒PWPT-GFP和辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T包装细胞，收集病毒上清，浓缩，获得表达GFP绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液。
(2)慢病毒感染NKT细胞及感染后细胞的扩增培养
取实施例1的在75cm2培养瓶中培养的1×107个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入2mL新鲜NKT细胞培养基GT-T551、200μL步骤(1)得到的病毒浓缩液、2μL 1×10-6mg/mL鱼精蛋白，终浓度为500U/mL的重组人白介素2，置于37℃、饱和湿度为5％的CO2培养箱中感染12小时后，弃培养液。同时用表达GFP绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液对NKT细胞进行同步感染(得到的NKT细胞称为CART-GFP细胞)，用于计算该病毒的感染效率。将感染后的细胞转至未经CD3和retronectin包被的75cm2培养瓶中，加入20mL的NKT细胞培养基GT-T551，再加入终浓度为500U/mL的重组人白介素2、终浓度为50ng/ml的CD3单克隆抗体和终浓度为50ng/mL的重组人白介素15，于37℃、饱和湿度为5％的CO2培养箱中培养18h，得到的NKT细胞称为CARMSLN-NKT细胞。用相同的方法制备CARMSLN-T细胞(T细胞的制备方法参照文献：YajingZhang,et al.Autologous CIK Cell Immunotherapy in Patients with Renal CellCarcinoma after Radical Nephrectomy.Clinical Study,2013中2.4部分CIK细胞的制备方法)。用流式细胞术检测该病毒的感染效率，结果如图5所示，CARMSLN-NKT细胞的感染效率为48.45％。
(3)体外诱导扩增CARMSLN-NKT细胞群
将上述培养后的NKT细胞用重组人白介素2的终浓度为500U/mL的NKT细胞培养基GT-T551进行体外诱导，待细胞的密度为85％时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加入重组人白介素2的终浓度为500U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为50ng/ml、重组人白介素15的终浓度为50ng/mL的新鲜NKT细胞培养基GT-T551进行扩增培养，待细胞扩增到总量为1.5×109个细胞左右后，采用流式细胞仪对感染的细胞群体进行鉴定，细胞表型一般达到CD3阳性细胞比例＞90％；CD3CD8双阳性细胞比例>70％；CD3CD56双阳性细胞比例>15％，结果见图6，CD3+：98.23％；CD3+CD4+：15.11％；CD3+CD8+：88.02％；CD3+CD56+：23.98％；CD8+CD56+：26.55％。
实施例4 CARMSLN-NKT细胞对间皮瘤细胞杀伤作用的细胞毒性分析
分别取实施例3中制备的CARMSLN-NKT细胞、CARMSLN-T细胞和实施例1中培养的NKT细胞接种于96孔板，用5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行染色，与MSLN阳性的间皮瘤细胞系NCI-H2452以效靶比(杀伤细胞：靶细胞)5:1，10:1，20:1，40:1的比率进行共培养，经过24小时的共培养后，将细胞用膜联蛋白V-RPE试剂盒染色，同时设置对照组分别为未加入免疫细胞杀伤处理的间皮瘤细胞系NCI-H2452，并将细胞用膜联蛋白V-RPE试剂盒染色。流式细胞术对细胞凋亡进行检测，细胞凋亡的量根据下面的公式计算：凋亡率＝(对照-样品)/对照×100％，对照为未加免疫细胞杀伤处理的细胞存活数目；样品为加入相对应的效靶比(杀伤细胞：靶细胞)的免疫细胞杀伤处理的细胞存活数目，见图7。由图7可知，嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞对MSLN阳性的间皮瘤细胞具有特异杀伤活性，且CARMSLN-NKT细胞的特异杀伤活性明显优于CARMSLN-T细胞和NKT细胞。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
包装携带PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ；
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述感染NKT细胞的方法包括：
取在75cm2培养瓶中培养的1×107个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入2mL新鲜NKT细胞培养基GT-T551、200μL病毒浓缩液、2μL1×10-6mg/mL鱼精蛋白，终浓度为500U/mL的重组人白介素2，置于37℃、饱和湿度为5％的CO2培养箱中感染12小时后，弃培养液；将感染后的细胞转至未经CD3和重组纤维连接蛋白包被的75cm2培养瓶中，加入20mL的NKT细胞培养基GT-T551，再加入终浓度为500U/mL的重组人白介素2、终浓度为50ng/ml的CD3单克隆抗体和终浓度为50ng/mL的重组人白介素15，于37℃、饱和湿度为5％的CO2培养箱中培养18h；
将上述培养后的NKT细胞用重组人白介素2的终浓度为500U/mL的NKT细胞培养基GT-T551进行体外诱导，待细胞的密度为85％时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加入重组人白介素2的终浓度为500U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为50ng/ml、重组人白介素15的终浓度为50ng/mL的新鲜NKT细胞培养基GT-T551进行扩增培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括通过如下方法制备NKT细胞：
(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一NKT细胞培养液中，所述第一NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15；第一NKT细胞培养液中，所述CD3单克隆抗体的浓度为30-70ng/mL，和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mL，和/或所述白介素-15的浓度为30-70ng/mL；
(2)在白介素-2存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养；所述第二阶段培养的实施方式包括：将所述第一阶段培养的细胞培养于第二NKT细胞培养液中，所述第二NKT细胞培养液中含有NKT细胞培养基和白介素-2；第二NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL。
3.权利要求1或2所述方法制备得到的工程化MSLN靶向性的NKT细胞。
4.权利要求3所述的工程化MSLN靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述肿瘤是MSLN阳性的间皮瘤。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述肿瘤为MSLN阳性的恶性胸膜间皮瘤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610807069.4A CN107793483B (zh) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carmsln-nkt细胞及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610807069.4A CN107793483B (zh) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carmsln-nkt细胞及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107793483A CN107793483A (zh) | 2018-03-13 |
| CN107793483B true CN107793483B (zh) | 2019-08-23 |
Family
ID=61530705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610807069.4A Expired - Fee Related CN107793483B (zh) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carmsln-nkt细胞及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107793483B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109517070A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-03-26 | 南京卡提医学科技有限公司 | 嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-TREM1及其用途 |
| CN109535260B (zh) * | 2018-11-22 | 2021-08-10 | 东南大学 | 一种靶向cd46的人源嵌合抗原受体及其应用 |
| KR102070016B1 (ko) * | 2019-01-21 | 2020-01-29 | (주)녹십자셀 | 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포 |
| KR102216225B1 (ko) * | 2019-06-27 | 2021-02-17 | (주)녹십자셀 | 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포 |
| CN111057158A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-04-24 | 南京蓝盾生物科技有限公司 | 一种靶向人gpc3的嵌合抗原受体及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103483452A (zh) * | 2012-06-12 | 2014-01-01 | 上海吴孟超医学科技基金会 | 双信号独立的嵌合抗原受体及其用途 |
| CN104788573A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-07-22 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途 |
| CN105142677A (zh) * | 2013-02-15 | 2015-12-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 嵌合抗原受体及其使用方法 |
| CN105384824A (zh) * | 2014-08-26 | 2016-03-09 | 中国人民解放军总医院 | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her2靶向性的nkt细胞及其应用 |
-
2016
- 2016-09-06 CN CN201610807069.4A patent/CN107793483B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103483452A (zh) * | 2012-06-12 | 2014-01-01 | 上海吴孟超医学科技基金会 | 双信号独立的嵌合抗原受体及其用途 |
| CN105142677A (zh) * | 2013-02-15 | 2015-12-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 嵌合抗原受体及其使用方法 |
| CN105384824A (zh) * | 2014-08-26 | 2016-03-09 | 中国人民解放军总医院 | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her2靶向性的nkt细胞及其应用 |
| CN104788573A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-07-22 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107793483A (zh) | 2018-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103820393B (zh) | 工程化cd20靶向性的nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN107793483B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carmsln-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| US20230321238A1 (en) | Therapeutic agents comprising nucleic acids and car-modified immune cells, and uses thereof | |
| CN105924527B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car30-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN109678965A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd22-cd19双靶向性的t细胞及其应用 | |
| CN111743923B (zh) | 包含分离的重组溶瘤腺病毒和免疫细胞的治疗剂及其应用 | |
| CN107793482A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car133‑nkt 细胞及其制备方法和应用 | |
| CN108531457A (zh) | 一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法 | |
| CN105859890A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化cd30靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| CN105384824A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her2靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| CN105924528B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carmsln-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN107384949B (zh) | 表达GPC3嵌合抗原受体的iNKT细胞及制备、应用 | |
| CN105924530B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car20-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN105949323A (zh) | 一种EpCAM特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用 | |
| CN105367661B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her1靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| CN105384820A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化cd19靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| CN109293781A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用 | |
| CN108395480A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carher2-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN111139222B (zh) | 一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途 | |
| CN105384822A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化cd138靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| CN105384823A (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化cd33靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| CN116535521B (zh) | 靶向bcma嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN105920592B (zh) | Carher1-nkt细胞在制备用于治疗进展期her1阳性肺癌的制剂中的应用 | |
| CN116041546A (zh) | 嵌合抗原受体、分离的核酸、重组载体、car-t细胞及其应用 | |
| JP7088902B2 (ja) | キメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体タンパク質を発現するｔリンパ球 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190823 Termination date: 20200906 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |