CN107782829A

CN107782829A - 一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法

Info

Publication number: CN107782829A
Application number: CN201711047617.9A
Authority: CN
Inventors: 尉小平; 余进
Original assignee: SHANGHAI RAAS BLOOD PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RAAS BLOOD PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2018-03-09

Abstract

本发明公开了一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法。该方法采用脉冲安培检测器、柱后补液衍生的方法，用CS16阳离子交换色谱柱，流动相为甲基磺酸溶液，柱后补液为碱性溶液，采用外标法绘制Tris的浓度‑峰面积标准曲线，得出标准曲线的回归方程，通过该回归方程计算得到Tris的含量。本方法Tris的最低检出限为3.14E‑5 mmol/L，最低定量限为1.05E‑4 mmol/L，回收率为93.8％‑100.1％，重现性范围为0.10％‑0.52％(RSD，n＝5)。本方法无需衍生和复杂样品前处理，不受生物制品中蛋白质上携带的酸碱基团的干扰，也不受样品中阴阳离子的干扰，检测灵敏度高，分析速度快，可应用于相关行业生物制品中Tris的含量检测和质量评判。

Description

一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法

技术领域

本发明涉及一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，属于分析检测领域。

背景技术

三羟甲基氨基甲烷（英文简称Tris）又名氨基丁三醇；缓血酸胺；2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇。Tris是一种弱碱，常用作生物制品生产过程中的生物缓冲体系。Tris可引起低血糖、低血压、恶心、呕吐，亦可抑制呼吸，甚至使呼吸停止。过量摄入或肾功能不全时可引起碱血症。

目前关于Tris的定量检测主要采用酸碱滴定的方法，定量限较高且易受到各种酸碱基团的干扰。而生物制品中由于含有大量的羧基、氨基和阴阳离子，制品中的Tris无法通过滴定的方法进行定量检测。因此建立一种快速、准确的生物制品中的Tris的检测方法，是目前亟待解决的问题。

离子色谱脉冲安培检测器通常用来检测富含羟基的糖类等小分子物质的含量。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法。本发明的方法是采用脉冲安培检测器、柱后补液衍生的方法，采用CS16阳离子交换色谱柱，流动相为甲基磺酸溶液，柱后补液为碱性溶液，采用外标法绘制Tris的浓度-峰面积标准曲线，得出标准曲线的回归方程，通过该回归方程计算得到Tris的含量。

本发明的检测Tris的方法，是采用离子色谱仪，柱后补液衍生的方法检测待测样品；其中色谱柱为CS16阳离子交换色谱柱；柱温为29-31℃；柱后补液为氢氧化钾或氢氧化钠溶液；柱后补液溶液浓度为200-500 mmol/L；柱后补液流速为0.29-0.31 ml/min；流动相为40mmol/L的甲基磺酸溶液；流动相流速为0.95-1.05mL/min；检测器为脉冲安培检测器；以Au为电极，Ag-AgCl电极为参比电极，波形为Carbohydrates。

在一种实施方式中，所述离子色谱使用的是Thermo Fisher公司ICS 5000离子色谱仪。

在一种实施方式中，所述色谱柱为戴安Ionpac CS16阳离子交换柱，包括分析柱(250mm×5mm)和保护柱(50mm×5mm)。柱温为30℃。

在一种实施方式中，所述方法中待测样品的进样体积为25μL。

在一种实施方式中，所述方法是采用500 mmol/L氢氧化钠溶液进行柱后补液。

在一种实施方式中，流动相为40 mmol/L的甲基磺酸溶液；流动相流速为1.0 mL/min。

在一种实施方式中，所述方法，还包括配置不同浓度的Tris标准溶液，采用离子色谱检测，得到不同Tris标准溶液下的峰面积，绘制峰面积与Tris浓度之间的标准曲线, 得出标准曲线的回归方程；将待测样品检测得到的峰面积代入标准曲线的回归方程，即可获知待测样品中的Tris浓度。

本发明的有益效果

(1)本发明方法检测Tris的最低检出限为3.14E-5 mmol/L，最低定量限为1.05E-4mmol/L，回收率为93.8％-100.1％，重现性范围为0.10％-0.52％(RSD，n＝5)；

(2)本发明方法与传统酸碱滴定法相比检出限和定量限更低，且不受蛋白质上携带的酸碱基团的干扰，也不受样品中阴阳离子的干扰；

(3)本发明方法无需衍生和复杂样品前处理即可检测不同生物制品中Tris的含量；

(4)本发明方法具有较好的选择性，在Tris保留时间区域内没有其他的色谱峰干扰。

附图说明

图1：实施例1条件下Tris离子色谱图。

图2：实施例2条件下Tris离子色谱图。

图3：实施例3条件下Tris离子色谱图。

具体实施方式

以下给出实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1：

供试品样品为上海莱士血液制品股份有限公司生产的冻干人凝血酶，按规定加注射用水复溶，经500倍稀释后进样检测。实验使用的仪器为Thermo Fisher公司ICS 5000离子色谱仪，色谱条件为：戴安Ionpac CS16阳离子交换柱，包括分析柱(250mm×5mm)和保护柱(50mm×5mm)，，柱温为30℃；采用柱后补液衍生的方法，柱后补液为500mmol/L氢氧化钠溶液；流动相为甲基磺酸溶液，流动相流速为1.0mL/min；检测器为脉冲安培检测器，以Au为电极，Ag-AgCl电极为参比电极，波形为Carbohydrates；Tris离子色谱图见图1。

将不同浓度的标准溶液，在本实施例的色谱条件下进行检测分析.以Tris浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，并通过回归计算，得到标准曲线为Y =1755.3X+1.838，相关系数在0.9998之间。根据测试结果以及基线噪声，推算出Tris的理论检出限为3.33E-5 mmol/L，理论定量限为1.05E-4 mmol/L。根据推算结果，配制Tris浓度分别为1.0E-4 mmol/L和3.33E-5 mmol/L的溶液，在本实施例条件下进行检测以确认检测限和定量限。检测限实测值为2.99E-5 mmol/L，定量限实测值为1.05E-4 mmol/L。符合理论检测限和定量限推算结果。供试样品平行5次测定，平行样品间的相对标准偏差在0.10％-0.52％之间。对供试样品进行了加标回收实验，回收率在93.8％-100.1％之间。

实施例2

供试品样品为1%的甘氨酸溶液，经500倍稀释后进样检测。实验使用的仪器为ThermoFisher公司ICS 5000离子色谱仪，色谱条件为：戴安Ionpac CS16阳离子交换柱，包括分析柱(250mm×5mm)和保护柱(50mm×5mm)，，柱温为30℃；采用柱后补液衍生的方法，柱后补液为500mmol/L氢氧化钠溶液；流动相为甲基磺酸溶液，流动相流速为1.0mL/min；检测器为脉冲安培检测器，以Au为电极，Ag-AgCl电极为参比电极，波形为Carbohydrates；Tris离子色谱图见图2。

因为脉冲安培检测器可以检测含羟基和氨基的的小分子化合物，图中可以看出在Tris的保留时间位置上无甘氨酸的干扰。

实施例3

供试品样品为上海莱士血液制品股份有限公司生产的冻干人凝血因子FVIII（AHF），按规定加注射用水复溶，经500倍稀释后进样检测。实验使用的仪器为Thermo Fisher公司ICS5000离子色谱仪，色谱条件为：戴安Ionpac CS16阳离子交换柱，包括分析柱(250mm×5mm)和保护柱(50mm×5mm)，，柱温为30℃；采用柱后补液衍生的方法，柱后补液为500mmol/L氢氧化钠溶液；流动相为甲基磺酸溶液，流动相流速为1.0mL/min；检测器为脉冲安培检测器，以Au为电极，Ag-AgCl电极为参比电极，波形为Carbohydrates；Tris离子色谱图见图3。

上海莱士血液制品股份有限公司生产的冻干人凝血因子FVIII（AHF）产品生产工艺中未添加Tris。图中可以看出在Tris的保留时间位置上无其他物质的干扰。

在上述实施例之外，还进行了本发明所述检测方法耐用性的研究。

柱温变化范围为±3.3%，在柱温箱29℃、30℃和31℃时分别进样，结果皆符合要求。

流动相流速变化范围为±5%，在流动相流速为0.95 ml/min、1.00 ml/min和1.05ml/min时分别进样，结果皆符合要求。

补液流速变化范围为±3.3%，在补液流速为0.29 ml/min、0.30 ml/min和0.31ml/min时分别进样，结果皆符合要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明保护范围。

Claims

1.一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，其特征在于：所述测定方法包括如下步骤：

（1）供试样品和对照品的制备：生物冻干制品加入注射用水溶解过滤或生物水溶液制品直接过滤，取滤液作为供试品溶液；称取Tris，加入注射用水溶解，梯度稀释后得到不同浓度的Tris溶液作为对照品溶液；

（2）离子色谱法：采用脉冲安培检测器，柱后补液衍生的方法；色谱柱为CS16阳离子交换色谱柱；流动相为甲基磺酸溶液；柱后补液为碱性溶液；以Au为电极，Ag-AgCl电极为参比电极；波形为Carbohydrates；柱温为30℃；

（3）计算供试样品中Tris含量：定量分析采用外标法，将配制好的各种浓度的对照品溶液液进样，检测结果，并绘制出Tris的浓度-峰面积标准曲线，得出标准曲线的回归方程；在与对照品溶液相同的进样条件下进供试品溶液，通过上述回归方程计算得到供试样品中Tris的含量。

2.根据权利要求1所述的一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的供试样品为生物水溶液制品或生物冻干制品注射用水复溶液的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的供试样品为冻干人凝血酶、冻干人凝血因子FVIII、静脉注射人丙种球蛋白、肌肉注射人丙种球蛋白、皮下注射人丙种球蛋白、冻干人凝血酶原复合物、冻干人纤维蛋白原和人血白蛋白的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的色谱柱为CS16阳离子交换色谱柱。

5.根据权利要求1所述的一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的甲基磺酸溶液浓度为40 mmol/L，流速为1mL/min。

6.根据权利要求1所述的一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，其特征在于：柱后补液的碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液的一种或几种，浓度为500 mmol/L，流速为0.3 mL/min。

7.根据权利要求1所述的一种利用离子色谱法检测生物制品中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的方法，其特征在于：经柱后补液后，溶液的pH值在12-14之间。