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CN107779429A - 一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法 - Google Patents

一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法 Download PDF

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CN107779429A CN201711281938.5A CN201711281938A CN107779429A CN 107779429 A CN107779429 A CN 107779429A CN 201711281938 A CN201711281938 A CN 201711281938A CN 107779429 A CN107779429 A CN 107779429A
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戴博
聂苏秦
郭康合
何婷婷
王波
董凤娇
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Shaanxi Jiuzhou Biopharmaceutical Science And Technology Group Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，该方法将成人或儿童术后遗弃的新鲜包皮组织清洗剪切后，依次采用分散酶II溶液和胶原酶IV溶液在37℃，水浴震荡的条件下消化，再经离心收集皮肤组织块，用培养基重悬，在37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中进行培养。本发明将分散酶II和胶原酶IV消化作用的温度由4℃提高到37℃，两种酶的活性均得到提高，通过水浴震荡使两种酶与对应底物的接触面积增大，有利于酶促反应的进行，从而大大缩短了两种酶消化的时间，提高了成纤维细胞分离培养的速度；同时降低了酶对组织细胞的损伤，提高了细胞的贴壁率，得到的原代成纤维细胞培养6～8天即进行传代。

Description

一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。
背景技术
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，来源于中胚层，体积较大，轮廓清晰，为突起的纺锤状或星状结构，主要合成胞外基质和胶原，对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损及骨创伤的修复有着十分重要的作用。成纤维细胞广泛存在于人体皮肤组织中，取材方便，易于在体外培养操作。尤其自从iPS技术诞生以后，成纤维细胞成为诱导各种干细胞或成体细胞的种子细胞，例如诱导多能干细胞(iPSCs)、胰岛细胞、心肌细胞、神经细胞等，方便了疾病机制探索、药物检测筛选及新治疗方法的研究。
目前，人皮肤成纤维细胞的分离培养方法主要有两类：酶消化法和组织块法。酶消化法利用胰蛋白酶、胶原酶等对双抗清洗后的人皮肤组织进行消化，去除组织表皮后，进行离心、重悬和培养，得到人皮肤成纤维细胞；该方法分离及培养的周期较长，一般10～14天才可传代，并且胶原酶对细胞存在不利影响，导致细胞的活性不高，贴壁率低。组织块法将人皮肤组织剪碎成小组织块后接种于培养皿中进行培养；该方法操作简单，但组织块贴壁率较低，细胞爬出较慢，一般20天左右才可进行传代，且技术稳定性差。
申请公布号为CN106591223的发明专利中公开了一种人皮肤成纤维细胞分离与原代培养方法，该方法利用胰蛋白酶在3～6℃将人包皮小块消化过夜，去除角质层后再进行培养直至获得人皮肤成纤维细胞；该方法避免了离心操作过程，有效提高了贴壁率，工艺简单，但整个周期较长，人皮肤成纤维细胞的活性降低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供了一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。该方法依次采用分散酶II和胶原酶IV在37℃，水浴震荡条件下消化成人或儿童术后遗弃的新鲜包皮组织，大大缩短了酶处理的时间，降低了酶对细胞的损伤，提高了细胞的贴壁率，得到的人原代皮肤组织来源成纤维细胞培养6～8天即进行传代。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、将成人或儿童术后遗弃的新鲜包皮组织用含双抗的生理盐水清洗2～3次，然后用无菌剪刀和镊子去除包皮底面的脂肪组织，并剪成大小为0.5cm2的包皮小块；
步骤二、将步骤一中得到的包皮小块浸入分散酶II溶液中，然后置于37℃，水浴震荡的条件下进行一次消化；
步骤三、向步骤二中消化后的分散酶II溶液中加入两倍体积的生理盐水终止消化，然后用无菌剪刀和镊子去除包皮小块的组织表皮，得到真皮组织，将所述真皮组织剪至1mm3，再浸入胶原酶IV溶液中，置于37℃，水浴震荡的条件下进行二次消化；
步骤四、向步骤三中消化后的胶原酶IV溶液中加入两倍体积的生理盐水终止消化，然后用生理盐水离心洗涤两次后去除上清，向离心沉淀中加入培养基重悬，再转入培养皿中，置于37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中培养；所述离心沉淀的质量和培养基的体积之比为3:7，质量的单位为g，体积的单位为mL。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤一中所述生理盐水中的双抗为青霉素和链霉素，所述青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤二中所述分散酶II溶液的质量浓度为0.4％。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤二中所述一次消化的时间为1h。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤三中所述胶原酶IV溶液的质量浓度为0.2％。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤三中所述二次消化的时间为15min。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤四中所述离心的转速为1500rpm，时间为5min。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤四中所述培养基为含有胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基，所述DMEM高糖培养基中胎牛血清的体积含量为15％，所述双抗为青霉素和链霉素，所述青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
上述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤四中所述培养的过程为：培养24h后进行补液，培养至第2～3天进行半量换液，培养至第4～5天进行全量换液，培养至第6～8天，细胞汇合度达80％～90％时，即进行消化传代。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明依次采用分散酶II和胶原酶IV在37℃，水浴震荡条件下消化成人或儿童术后遗弃的新鲜包皮组织，消化作用的温度由4℃提高到37℃，由于消化温度的提高，两种酶的活性均得到提高，而水浴震荡使两种酶与对应底物的接触面积增大，因此两种酶的消化产物可迅速从消化作用点转移至培养液中，有利于酶促反应的进行，从而进一步缩短两种酶消化的时间，提高了成纤维细胞分离培养的速度与成活率。
2、本发明采用的分散酶II性能温和，对细胞损伤小，稳定性强，不易受温度和pH的影响，可有效消除细胞聚集现象，从而完全去除组织表皮，提高了成纤维细胞的纯度；而胶原酶IV兼有低胰酶活性，对细胞组织损伤较大，因此缩短胶原酶IV消化时间，既能有效水解胶原和结缔组织，又保持了酶解后成纤维细胞的完整性，提高了后续培养过程中细胞贴壁率。
3、本发明得到的成纤维细胞在培养过程进行多次补液和换液操作，为成纤维细胞生长及时提供了营养，提高了成纤维细胞的活性和增殖的速度。
4、本发明得到的成纤维细胞纯度较高，选用其P4代成纤维细胞做免疫组化染色，胞浆波形蛋白(Vimentin)呈阳性，且阳性率较高。
下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述。
附图说明
图1是本发明人皮肤组织来源成纤维细胞培养第3天的生长状态图。
图2是本发明人皮肤组织来源成纤维细胞培养第5天的生长状态图。
图3是本发明人皮肤组织来源成纤维细胞培养第7天的生长状态图。
图4是本发明P4代人皮肤组织来源成纤维细胞的胞浆波形蛋白免疫组化的染色图。
图5是对照组鳞状上皮细胞的胞浆波形蛋白免疫组化的染色图。
具体实施方式
本实施例中一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，包括以下步骤：
步骤一、取成人或儿童术后遗弃的新鲜包皮组织，在生物安全柜内用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的生理盐水清洗2～3次，然后用无菌剪刀和镊子去除包皮底面的脂肪组织，并剪成大小为0.5cm2的包皮小块；
步骤二、将步骤一中得到的包皮小块放入质量浓度为0.4％的分散酶II溶液中，然后置于37℃，水浴震荡的条件下消化1h；
步骤三、向步骤二中消化后的分散酶II溶液中加入两倍体积的生理盐水终止消化，然后用无菌剪刀和镊子去除包皮小块的组织表皮，得到真皮组织，将所述真皮组织剪至1mm3，再放入质量浓度为0.2％的胶原酶IV溶液中，置于37℃，水浴震荡的条件下消化15min；
步骤四、向步骤三中消化后的胶原酶IV溶液中加入两倍体积的生理盐水终止消化，然后在转速为1500rpm，时间为5min的条件下，用生理盐水离心洗涤两次后去除上清液，向离心沉淀中加入培养基重悬，再转入培养皿中，置于37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，培养24h后补液，培养至第2～3天时可见少量成纤维细胞，进行半量换液，培养至第4～5天时细胞汇合度达50％～60％，进行全量换液，培养至第6～8天时细胞汇合度达80％～90％，即可进行传代培养；所述离心沉淀的质量和培养基的体积之比为3:7，质量的单位为g，体积的单位为mL；所述培养基为含有胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基，所述DMEM高糖培养基中胎牛血清的体积含量为15％，所述双抗为青霉素和链霉素，所述青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
分别在人皮肤组织来源成纤维细胞培养的第3天、第5天和第7天后取相应的细胞，制片后对各培养时期的细胞生长状态进行观察，结果如图1、图2和图3所示。
从图1、图2和图3可以看出，培养至第3天时成纤维细胞开始出现，呈长梭形、扁平星形，培养至第5天时成纤维细胞部分汇合，且代谢物增多，培养至第7天时成纤维细胞高度汇合，并成簇排列。
人皮肤组织来源成纤维细胞传代培养过程：将培养至第6～8天的成纤维细胞培养液弃去上清，用生理盐水洗涤两次后加入质量浓度为0.25％的胰酶溶液(2mL/10cm培养皿，4mL/15cm培养皿)，然后在37℃的条件消化2min，加入等体积含胎牛血清(体积含量为10％)的DMEM高糖培养基终止消化；用移液管反复吹打培养皿内壁，收集贴壁细胞，再将上清转入离心管中并加入生理盐水，在转速为1500rpm，时间为5min的条件下一次离心，弃去上清液，向一次离心沉淀中加入生理盐水重悬细胞，并进行细胞计数和二次离心，弃去上清液，向二次离心沉淀中加入含10％(体积含量)胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬细胞，并调节细胞悬液密度为5.0×104/mL～7.5×104/mL，然后向15cm培养皿中加入2mL的细胞悬液和18mL含10％(体积含量)胎牛血清的DMEM高糖培养基，再置于37℃培养箱中培养，每隔3～4天进行传代。
人皮肤组织来源成纤维细胞的胞浆波形蛋白免疫组化检测：培养P4代人皮肤组织来源成纤维细胞并制作细胞爬片，当细胞爬满玻片的60％～70％时，取出玻片用PBS溶液漂洗，再用95％乙醇固定15min后水洗，然后用含3％过氧化氢的甲醇溶液阻断12min，用PBS溶液漂洗3次；向细胞爬片上滴加鼠抗人波形蛋白作为一抗，并置于室温下放置90min，用PBS溶液漂洗3次后加入酶标羊抗鼠/兔IgG作为二抗，并置于室温下放置18min，再次用PBS溶液漂洗3次后加入DAB溶液显色5min，用苏木素复染后封片；用显微镜观察细胞爬片上的成纤维细胞形态，结果如图4所示。
从图4可以看出，P4代人皮肤组织来源成纤维细胞的细胞核不着色，细胞质着色。
对照组：选用鳞状上皮细胞做对照，具体免疫组化检测过程同上，用显微镜观察细胞爬片上的鳞状上皮细胞形态，结果如图5所示。
从图5可以看出，鳞状上皮细胞的细胞核和细胞质均不着色。
将图4和图5比较可以得知，本发明快速分离培养的人皮肤组织来源成纤维细胞传至P4代后，仍保持较高的细胞活性和纯度。
本实施例中鼠抗人波形蛋白的生产厂家为无锡傲锐东源生物科技有限公司，产品批号为17A10402。
酶标羊抗鼠/兔IgG的生产厂家为无锡傲锐东源生物科技有限公司，产品批号为17872。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (9)

1.一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、将成人或儿童术后遗弃的新鲜包皮组织用含双抗的生理盐水清洗2～3次，然后用无菌剪刀和镊子去除包皮底面的脂肪组织，并剪成大小为0.5cm2的包皮小块；
步骤二、将步骤一中得到的包皮小块浸入分散酶II溶液中，然后置于37℃，水浴震荡的条件下进行一次消化；
步骤三、向步骤二中消化后的分散酶II溶液中加入两倍体积的生理盐水终止消化，然后用无菌剪刀和镊子去除包皮小块的组织表皮，得到真皮组织，将所述真皮组织剪至1mm3，再浸入胶原酶IV溶液中，置于37℃，水浴震荡的条件下进行二次消化；
步骤四、向步骤三中消化后的胶原酶IV溶液中加入两倍体积的生理盐水终止消化，然后用生理盐水离心洗涤两次后去除上清，向离心沉淀中加入培养基重悬，再转入培养皿中，置于37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中培养；所述离心沉淀的质量和培养基的体积之比为3：7，质量的单位为g，体积的单位为mL。
2.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤一中所述生理盐水中的双抗为青霉素和链霉素，所述青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
3.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤二中所述分散酶II溶液的质量浓度为0.4％。
4.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤二中所述一次消化的时间为1h。
5.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤三中所述胶原酶IV溶液的质量浓度为0.2％。
6.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤三中所述二次消化的时间为15min。
7.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤四中所述离心的转速为1500rpm，时间为5min。
8.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤四中所述培养基为含有胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基，所述DMEM高糖培养基中胎牛血清的体积含量为15％，所述双抗为青霉素和链霉素，所述青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
9.根据权利要求1所述的一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤四中所述培养的过程为：培养24h后进行补液，培养至第2～3天进行半量换液，培养至第4～5天进行全量换液，培养至第6～8天，细胞汇合度达80％～90％时，即进行消化传代。
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