CN107778376B - 一种三叶青多糖的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及了中草药三叶青多糖的制备及应用。以三叶青藤叶为原料，按照如下步骤依次实施：（1）热水浸提；抽滤收集滤液；真空浓缩；浓缩液加入乙醇；收集沉淀，即三叶青粗多糖。（2）将粗多糖溶于水，加入Sevag试剂；搅拌后离心除蛋白层和有机层，重复此步操作多次至不出现蛋白为止；（3）将除蛋白后的多糖溶于去离子水中，通过DEAE‑52离子交换层析和Sephadex G‑100葡聚糖凝胶层析得到三叶青多糖单一组分。本发明所涉及的三叶青多糖，可显著降低机体血糖血脂，改善机体内抗氧化酶酶活力水平，并对胰岛具有一定修复作用，具有很好的药用价值和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三叶青多糖的制备及其应用。
背景技术
三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）正名三叶崖爬藤，又名金线吊葫芦、蛇附子，生长于阴湿山坡、山谷等地带，主要分布在我国东南。西南地带。三叶青全草均可入药，是我国著名的中草药之一，具有显著的药用价值，如治疗病毒性脑膜炎、支气管炎、小儿高热惊厥、预防以及治疗癌症等。
糖尿病分为一型糖尿病和二型糖尿病，其中一型糖尿病是指胰岛素相对或绝对分泌不足，必须依赖胰岛素维系生命，二型糖尿病是指胰岛素抵抗或不敏感，患者具有典型的“三多一少”症状，即多食多饮多尿，体重减轻。随着人民生活水平日益增长，我国患糖尿病的人数与日俱增。据统计，目前我国糖尿病病人人数高达9000多万人，位居世界第一，二型糖尿病患者占据糖尿病患病人数的80%以上，且50%以上二型糖尿病患者具有一种或多种糖尿病并发症。糖尿病并发症包括高血压、高血脂、心脑血管疾病等，严重损害人民的身体健康，因此防治糖尿病刻不容缓。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三叶青多糖的制备及其应用。
为解决上述技术问题，本发明可以通过以下步骤实现。
所述三叶青多糖的制备，包括以下步骤：
（1）三叶青粗多糖的提取：
干燥三叶青经粉碎后用去离子水80℃煮提 3 小时；抽滤得滤液，滤液经过80度水浴浓缩至原体积的四分之一，加入5倍体积的无水乙醇，沉淀静止过夜；5000转/分离心10分钟收集沉淀，经冷冻干燥后得粗多糖；
（2）Savag法除蛋白。
A1：向10wt%三叶青粗多糖水溶液中加入 Sevag 试剂充分搅拌1~2小时，；
B1：然后3500～4500 转/分离心10～25分钟，去除蛋白层和氯仿层，水层重复操作至不再出现蛋白层为止，所得水溶液经透析和冷冻干燥得到脱蛋白三叶青精多糖。
（3）三叶青精多糖的分级：
将5wt%脱蛋白三叶青多糖经DEAE- 纤维素离子交换层析柱分级；3倍柱体积的不同浓度氯化钠溶液洗脱，收集0.3M氯化钠洗脱液组分，经去离子水透析、冷冻干燥得到多糖级分。
步骤（2）中，Sevag 试剂包括正丁醇及氯仿；其中 ：正丁醇与氯仿的体积比为：1 ：4；
本发明方法制得的三叶青多糖组分经过Sephadex G-100凝胶洗脱鉴定为单一组分，其中单糖组成以及摩尔比率分别为Rha：Ara：Man：Glc：:Gal = 006：0.13：0.38：0.09：0.31。分子量为9×104 ～ 10.0×104Da。
本发明的显著优点在于：
通过传统水提醇沉方式提取多糖，提取条件简单，提取成本低廉，其次通过两步纯化得到单一组分的多糖，便与后续进行降血糖活性的相关应用。
附图说明
图 1 为三叶青多糖的离子交换层析图。
图 2 为三叶青多糖的 Sephadex G-100凝胶层析图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
按如下步骤依次实施制备。
称取干燥三叶青粉末500g，用2升去离子水80℃提取3小时；抽滤得到滤液，在80℃水浴温度下浓缩至原体积的1/4；加入5倍体积的无水乙醇，沉淀静止过夜；5000转/分离心10分钟收集沉淀，经冷冻干燥后得粗多糖50.45克；
称取三叶青粗多糖50克，溶解1500毫升去离子水中，加入300毫升Sevag试剂；氯仿；正丁醇=4:1，v/v；充分搅拌1小时，3500转离心20分钟，去除蛋白层和有机层；水层反复重复除蛋白步骤到不出现蛋白层为止；所得水溶液用去离子水透析72小时，冷冻干燥得脱蛋白三叶青多糖27.56克。
将5克脱蛋白多糖溶解于50毫升去离子水中，用2.6×30cmDEAE-纤维素离子交换柱分离；依次用500毫升水、0.1M-0.3M氯化钠溶液洗脱，洗脱四度为8毫升/分钟，每20毫升洗脱液收集一管，经由苯酚硫酸法检测，收集0.3M氯化钠洗脱下来的组分，用去离子水透析72小时后，冷冻干燥得到2.2克三叶青多糖组分。
三叶青多糖降糖实验。
从100只ICR小鼠中随机取10只作为空白对照组，其余小鼠禁食12小时后，按100mg/kg剂量腹腔注射四氧嘧啶溶液。72小时后，尾静脉采血，测定禁食12小时后小鼠血糖值，取血糖值大于11.0mmol/L的小鼠为成型的糖尿病小鼠。将糖尿病模型小鼠分为6组，每组10只，模型对照组和正常对照组灌胃给去离子水，阳性对照组灌胃给予格列本脲25mg/kg，其余3组为多糖实验组，分别给予三叶青多糖剂量100、200和400mg/kg。每天灌胃给药1次，连续35天，末次给药后所有小鼠禁食12小时后，测定血糖含量。实验结果见表1。
表1 三叶青多糖对糖尿病小鼠血糖的影响。
注：与模型组比较：*，p＜0.05；**，p＜0.01。
由表1可知，糖尿病小鼠经灌胃给药35天后，三叶青多糖和阳性对照组均能显著降低小鼠血糖值，其中多糖400mg/kg实验组能够极显著降低小鼠血糖，效果接近格列本脲，说明三叶青多糖在口服的情况下即可以实现其降血糖功能。
图1为三叶青除蛋白后的多糖，经过第一轮纯化，即DEAE-52离子交换层析后的结果，如图可知，共洗脱出5个组分，选取主要组分收集起来进行下一步纯化。图2为第二轮纯化，即葡聚糖凝胶G-100的洗脱图，由图2可知，仅出现一个单峰，说明纯化到这一步的多糖是分子量均一，电荷量均一的单一组分多糖。可用于下一步降血糖实验的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种三叶青多糖在制备降血糖药物上的应用，其特征在于：所述三叶青多糖的制备方法，包括如下步骤依次实施：
（1）称取干燥三叶青粉末500g，用2升去离子水80℃提取3小时；抽滤得到滤液，在80℃水浴温度下浓缩至原体积的1/4；加入5倍体积的无水乙醇，沉淀静置过夜；5000转/分离心10分钟收集沉淀，经冷冻干燥后得粗多糖；
（2）称取三叶青粗多糖50克，溶解1500毫升去离子水中，加入300毫升Sevag试剂；充分搅拌1~2小时，3500转/分离心20分钟，去除蛋白层和有机层；水层反复重复除蛋白步骤到不出现蛋白层为止；所得水溶液用去离子水透析72小时，冷冻干燥得脱蛋白三叶青多糖；
（3）将5克脱蛋白多糖溶解于50毫升去离子水中，用2.6×30cmDEAE-纤维素离子交换柱分离；依次用500毫升水、0.1M-0.3M氯化钠溶液洗脱，洗脱速度8毫升/分钟，每 20 毫升洗脱液收集一管，经由苯酚硫酸法检测，收集0.3M氯化钠洗脱下来的组分，用去离子水透析72小时后，冷冻干燥得到三叶青多糖组分。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：Sevag试剂具体为：按体积比计，氯仿；正丁醇=4:1。
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