CN107760762B - 一种检测dna腺嘌呤甲基转移酶的荧光化学传感器及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测Dam甲基转移酶的荧光化学传感器包括：Dam甲基转移酶检测探针和辅助探针；所述Dam甲基转移酶检测探针为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有Dam甲基转移酶的识别位点；所述发夹DNA探针3'末端使用氨基修饰；所述Dam甲基转移酶的识别位点为5'‑G‑A‑T‑C‑3'的回文序列；所述辅助探针为一个近3'末端具有脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)的富T单链DNA序列。本发明荧光化学传感器制备及检测方法简单，极大提高了检测灵敏度同时有效防止非特异性反应的发生，可实现在复杂生物样品中对Dam甲基转移酶的精准检测。

Description

一种检测DNA腺嘌呤甲基转移酶的荧光化学传感器及其检测 方法

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及基于一种基于超分支化扩增零背 景检测DNA腺嘌呤甲基转移酶的荧光化学传感器及其检测方法。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传学基因调控的最突出形式，在细胞增殖，基因转录 和衰老中起关键作用。以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，由DNA 甲基转移酶催化，在识别序列中靶向腺嘌呤/胞嘧啶残基共价加成甲基基团。 DNA甲基化通常发生在胞嘧啶的C-5/N-4位和腺嘌呤的N-6位。已经在多种 类型的癌症如乳腺癌，卵巢癌和肺癌中发现了过度甲基化和缺乏甲基化现象。 而DNA甲基化的异常与DNA甲基转移酶的异常表达和活性相关。因此，DNA 甲基转移酶也已经成为临床诊断和药物筛选中的靶点。亦因此，因此，开展对 DNA甲基化转移酶的超灵敏检测不仅对基础生物化学的深入研究有很大帮助， 同时对发展人类疾病的新的治疗方法和策略具有重大意义。

迄今为止，针对DNA甲基化转移酶的传统检测方法包括放射性标记法、 高效液相色谱(HPLC)、基于免疫的分析方法和凝胶电泳。这些方法中用到放 射性标记的底物，特异性抗体，昂贵的仪器，这不仅增加了实验成本而且增加 了实验的复杂程度，费时费力，灵敏度低。

为了克服这些问题，近年来，相关研究人员已经引入了比色法，荧光测定 法和生物发光测定法，这些方法具有直观、安全、简单、灵敏度高的优点。然 而，它们一般需要繁琐的纳米颗粒制备、依赖于用荧光团和猝灭剂进行外部标 记，分析时间长，涉及到复杂的设计且费用高。电化学方法响应速度快，设计 成本较低，然而复杂的电极表面修饰限制了它的应用。引入核酸扩增的方法大 大提高了检测的灵敏度，然而现有的核酸扩增通常需要DNA模板、核酸内切 酶的特定识别序列以及核酸底物的荧光标记，这都加大了方案设计的难度以及 实验操作的复杂性。因此，迫切需要开发一种操作简单、无需荧光标记、零背 景信号的用于灵敏检测复杂生物样品中DNA甲基转移酶的方法。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种检 测DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam甲基转移酶)的荧光化学传感器，该传感器 基于末端转移酶(TDT)不需要任何DNA模板即可实现催化三磷酸脱氧腺苷 (dATPs)重复加入DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)的特点，结合核酸内切 酶Ⅳ能够特异性识别水解双链DNA中完整的脱嘌呤嘧啶(AP)位点从而暴露 DNA分子的3'-羟基实现超支化扩增的检测策略，无需荧光标记即可实现对 DNA腺嘌呤甲基转移酶的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种检测Dam甲基转移酶的荧光化学传感 器，所述荧光化学传感器包括：Dam甲基转移酶检测探针和辅助探针；

其中，所述Dam甲基转移酶检测探针为一个具茎环结构的发夹DNA探针， 两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有Dam甲基转移酶的识别位 点；所述发夹DNA探针3'末端使用氨基修饰，从而防止TdT(末端转移酶)激 活非特异性扩增；

具体的，所述Dam甲基转移酶的识别位点为5'-G-A-T-C-3'的回文序列；

所述辅助探针为一个近3'末端具有脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)的富T单链 DNA序列，所述辅助探针3'末端使用氨基修饰，从而防止TdT(末端转移酶) 激活非特异性扩增；

所述荧光化学传感器还包括依赖甲基化的内切酶DpnI、末端转移酶(TdT)、 核酸内切酶IV和三磷酸脱氧腺苷(dATPs)，所述依赖甲基化的内切酶DpnI 能够识别并剪切Dam甲基转移酶甲基化后的Dam甲基转移酶检测探针，从而 使得所述检测探针分解为三个单链DNA片段，其中两个单链DNA片段含有游 离的3'-OH末端，在末端转移酶(TdT)作用下，三磷酸脱氧腺苷添加至具有 3'-OH末端的单链DNA片段中得到具有富A序列的DNA片段，所述具有富A 序列的DNA片段与所述辅助探针杂交互补形成稳定的双链DNA，所述双链 DNA中的脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)被核酸内切酶IV(Endo IV)催化，导 致辅助探针的断裂并产生游离的3'-OH末端。具有游离3'-OH末端的新DNA片 段引发新的末端转移酶(TdT)介导的延伸反应以形成更长的富A序列。值得 注意的是，过量的辅助探针与富A序列杂交，引发切割延伸的新循环，诱导超 支化扩增，产生大量DNA片段；得到的不同数量的DNA片段通过荧光指示剂 产生不同的荧光值，从而实现对Dam甲基转移酶活性的测定。

优选的，所述Dam甲基转移酶检测探针长度为37nt，所述Dam甲基转移 酶检测探针的碱基序列为：5'-GAA GGA TCT TCT CGA CTT GCT GAA GAT CCT TCT TAA T-NH₂-3'，其中下划线标出的碱基序列GATC即Dam甲基转移 酶的识别位点，所述Dam甲基转移酶检测探针3'端进行氨基修饰。

优选的，所述辅助探针长度为26nt，所述辅助探针的碱基序列为：5'-TTT TTT TTTTTT TTT TTT TTX TTT TT-NH₂-3'，其中X代表脱嘌呤嘧啶位点，所 述辅助探针3'端进行氨基修饰；

优选的，所述荧光化学传感还包括荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYBR Gold；

优选的，所述荧光化学传感还包括Dam甲基转移酶反应缓冲液，所述Dam 甲基转移酶反应缓冲液包括：50毫摩尔每升Tris-HCl缓冲液，10毫摩尔每升 EDTA，5毫摩尔每升2-巯基乙醇，pH 7.5；

优选的，所述荧光化学传感还包括末端转移酶缓冲液，所述末端转移酶缓 冲液包括：50毫摩尔每升醋酸钾，20毫摩尔每升Tris-Ac，10毫摩尔每升醋酸 镁，pH 7.9；

本发明还公开了所述荧光化学传感器用于Dam甲基转移酶检测的方法，具 体包括：

1)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；

2)向步骤1)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II进行聚合反应；

3)对步骤2)反应后的溶液进行荧光化学检测，实现对待测样品中Dam甲 基转移酶的定量分析。

其中，步骤1)所述反应溶液I中包括Dam甲基转移酶检测探针，S-腺苷 甲硫胺酸，限制性核酸内切酶DpnⅠ和Dam甲基转移酶反应缓冲液；

步骤1)中孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1.5～3h(优选为2h)；高 温灭活处理温度为80℃，处理时间为10～30min(优选为20min)；

步骤2)中所述反应溶液II包括辅助探针，三磷酸脱氧腺苷，末端转移酶(TdT)，核酸内切酶IV，二氯化钴和末端转移酶缓冲液和SYBR Gold；

步骤2)中反应条件为：37℃，反应时间为60～200min(优选为100min)；

步骤3)中采用实时定量PCR仪实时定量检测荧光强度。

本发明还公开了上述荧光化学传感器和/或检测方法在定量检测Dam甲基 转移酶和/或筛选Dam甲基转移酶抑制剂/激活剂中的应用。

本发明所述荧光化学传感器检测方法的原理为：本发明是基于超分支化扩 增零背景检测DNA甲基转移酶的荧光方法。

发明人设计了一种具有5'-G-A-T-C-3'回文序列的发夹DNA探针作为底物。 为了防止TdT(末端转移酶)激活的非特异性扩增，使用氨基修饰了发夹探针 和辅助探针的3'末端。用Dam甲基转移酶处理后，发夹DNA探针茎中的 5'-G-A-T-C-3'序列被甲基化，得到5'-G-mA-T-C-3'。甲基化的发夹DNA探针随 后通过DNA甲基化依赖性的核酸内切酶DpnI剪切，释放三个单链DNA片段， 其中两个含有游离的3'-OH末端。

在TdT(末端转移酶)的存在下，将多个dATPs(三磷酸脱氧腺苷)顺序 加入到单链DNA游离的3'-OH末端以获得富A序列。具有AP位点的富T序 列辅助探针(3'末端由氨基修饰)与所得富A序列杂交以形成稳定的双链DNA。 双链DNA中的AP位点被Endo IV(核酸内切酶Ⅳ)催化，导致辅助探针的断 裂并产生游离的3'-OH末端。具有游离3'-OH末端的新DNA片段可引发新的 TdT(末端转移酶)介导的延伸反应以形成更长的富A序列。值得注意的是，过量的辅助探针与富A序列杂交，引发切割延伸的新循环，诱导超支化扩增， 产生大量DNA片段。得到的不同数量的DNA片段可以通过SYBR Gold作为 指示剂产生不同的荧光值。而在没有Dam甲基转移酶的情况下，TdT(末端转 移酶)介导的延伸和EndoⅣ(核酸内切酶Ⅳ)介导的辅助探针的切割都不能 启动，并且不会观察到明显的荧光。

本发明的有益效果如下：

(1)现有方法为了提高灵敏度引入了多种核酸扩增方法，但是这些方法通 常需要特定的核酸内切酶识别序列，增加了DNA探针设计的复杂性。而本发明 利用了末端转移酶(TDT)不需要任何DNA模板即可实现催化三磷酸脱氧腺苷 重复加入DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)的特点，极大简化了DNA探针的设计；

(2)本发明利用核酸内切酶IV(EndoⅣ)能够特异性识别水解双链DNA 中完整的脱嘌呤嘧啶(AP)位点，从而暴露DNA分子的3'-羟基，在TDT催化下 继续扩增，实现超支化扩增，大大提高了检测灵敏度；

(3)本发明通过氨基修饰发夹探针和辅助探针的3'末端有效地防止TdT激活 非特异性扩增，TdT的高精确性识别导致了仅在游离3'-OH末端才能发生扩增， 和Endo IV只能水解完整的AP位点，实现了零背景信号，从而极大提高本发明检 测方法的特异性；

(4)本发明以SYBR Gold为指示剂，无需荧光标记，操作简单，降低实验 成本。

综上，本发明荧光化学传感器制备及检测方法简单，无需大型昂贵仪器设 备，同时由于我们对本发明中的各反应条件也都进行了细致优化，因此在检测 过程中，极大提高了检测灵敏度同时有效防止非特异性反应的发生，可实现在 复杂生物样品中对Dam甲基转移酶的精准检测。经试验验证，与核酸外切酶介 导目标循环的荧光测定法、基于核酸内切酶辅助信号扩增的荧光测定法和基于 转录介导的双链特异性核酸酶辅助循环信号扩增的荧光测定法相比，本发明所 述检测方法的灵敏度提高了1个数量级，与基于发夹形DNA酶信号扩增的荧 光测定法和基于DNA酶介导信号扩增的比色法相比，本发明所述检测方法的灵敏度提高了2个数量级。

附图说明

图1为本发明所述荧光化学传感器用于Dam甲基转移酶检测的机理示意图；

图2(A)通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析Dam对发夹底物的甲基化 和随后的DpnI切割示意图，其中泳道M为DNA marker(分子质量参照)；泳 道1为发夹探针(0.5微摩尔每升)+Dam甲基转移酶(20单位每毫升)+限制 性核酸内切酶DpnI(50单位每毫升)；泳道2为发夹底物(0.5微摩尔每升)+ DpnI(50单位每毫升)；泳道3，发夹探针(0.5微摩尔每升)+Dam甲基转移 酶(20单位每毫升)；图2(B)为超支化扩增产物的PAGE分析，其中，泳 道M为DNAmarker(分子质量参照)；泳道1为在Dam甲基转移酶(20单 位每毫升)+限制性核酸内切酶DpnI(50单位每毫升)存在下的超支化扩增产 物；泳道2为在限制性核酸内切酶DpnI(50单位每毫升)存在下的超支化扩 增产物，图2(C)为在Dam甲基转移酶(20单位每毫升)+限制性核酸内切 酶DpnI(50单位每毫升)同时存在(即实验组)和不存在Dam甲基转移酶只 添加50单位每毫升限制性核酸内切酶DpnI(即对照组)的情况下，实时荧光 监测超支化扩增情况。

图3(A)为不同浓度的辅助探针对应的F-F₀值；图3(B)为TdT固定为8单 位时不同用量的Endo IV对应的F-F₀值；图3(C)为Endo IV用量固定为4单 位时不同用量的TdT对应的F-F₀值；图3(D)为不同浓度的dATP对应的F-F₀值；其中F和F₀分别是存在和不存在Dam甲基转移酶时的荧光强度；误差条 表示的是三次重复实验的标准偏差。

图4(A)为由不同浓度的Dam引发的扩增获得的实时荧光曲线；图4(B)为 Dam甲基转移酶浓度在0.005～40单位每毫升范围内的荧光强度与其浓度的对 数之间的线性相关性，图4(B)中的荧光强度为在100分钟时获得；误差条表 示的是三次重复实验的标准偏差。

图5为本发明检测方法对Dam甲基转移酶的选择性测定，图5(A)为响应于 Dam甲基转移酶，M.Sss I甲基转移酶，牛血清白蛋白(BSA)和仅有缓冲液的 对照组的实时荧光曲线；图5(B)为响应于Dam甲基转移酶，M.Sss I甲基转 移酶，BSA和仅有缓冲液的对照组的荧光强度的测量值，图5(B)中的荧光强 度在100分钟时获得，其中各组的Dam甲基转移酶，M.Sss I甲基转移酶，牛 血清白蛋白(BSA)的浓度均为20单位每毫升；误差条表示的是三次重复实验 的标准偏差。

图6为检测反应缓冲液和LB培养基中的Dam甲基化转移酶；用反应缓冲液以 1:10的比例稀释LB；误差条表示的是三次重复实验的标准偏差。

图7(A)为用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析5-氟尿嘧啶对TdT和Endo IV活性的 影响，其中，泳道M为DNA marker(分子质量参照)；泳道1为引物(67纳 摩尔每升)；泳道2为引物(67纳摩尔每升)+辅助探针(0.13微摩尔每升)+ TdT(8单位)；泳道3为引物(67纳摩尔每升)+辅助探针(0.13微摩尔每升) +TdT(8单位)+5-氟尿嘧啶(10微摩尔每升)；泳道4为引物(67纳摩尔每 升)+辅助探针(0.13微摩尔每升)+TdT(8单位)+Endo IV(4单位)；泳 道5为引物(67纳摩尔每升)+辅助探针(0.13微摩尔每升)+TdT(8单位) +Endo IV(4单位)+5-氟尿嘧啶(10微摩尔每升)，图7(B)为在10微摩尔 每升5-氟尿嘧啶存在下和不存在5-氟尿嘧啶的情况下荧光强度测量值。

图8为不同浓度5-氟尿嘧啶对Dam甲基转移酶活性的抑制作用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图 限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确 指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说 明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、 组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术对甲基化转移酶测定存在灵敏度偏低、 检测方法繁琐、所需仪器昂贵等各种问题；

有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种检测Dam甲基转移酶 的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：Dam甲基转移酶检测探针和辅 助探针；

其中，所述Dam甲基转移酶检测探针为一个具茎环结构的发夹DNA探针， 两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有Dam甲基转移酶的识别位 点；所述发夹DNA探针3'末端使用氨基修饰，从而防止TdT(末端转移酶)激 活非特异性扩增；

所述Dam甲基转移酶的识别位点为5'-G-A-T-C-3'的回文序列；

所述辅助探针为一个近3'末端具有脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)的富T单链 DNA序列；所述辅助探针3'末端使用氨基修饰，从而防止TdT(末端转移酶) 激活非特异性扩增；

所述荧光化学传感器还包括依赖甲基化的内切酶DpnI、末端转移酶(TdT)、 核酸内切酶IV和三磷酸脱氧腺苷(dATPs)；

本发明的又一具体实施方式中，所述Dam甲基转移酶检测探针长度为37 nt，所述Dam甲基转移酶检测探针的碱基序列为：5'-GAA GGA TCT TCT CGA CTT GCT GAA GAT CCTTCT TAAT-NH₂-3'，其中下划线标出的碱基序列 GATC即Dam甲基转移酶的识别位点，所述Dam甲基转移酶检测探针3'端进 行氨基修饰；

本发明的又一具体实施方式中，所述辅助探针长度为26nt，所述辅助探针 的碱基序列为：所述辅助探针的碱基序列为：5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTX TTT TT-NH₂-3'，其中X代表脱嘌呤嘧啶位点，所述辅助探针3'端进行氨 基修饰；

本发明的又一具体实施方式中，所述荧光化学传感还包括荧光指示剂，所 述荧光指示剂为SYBR Gold；

本发明的又一具体实施方式中，所述荧光化学传感还包括Dam甲基转移酶 反应缓冲液，所述Dam甲基转移酶反应缓冲液包括：50毫摩尔每升Tris-HCl 缓冲液，10毫摩尔每升EDTA，5毫摩尔每升2-巯基乙醇，pH 7.5；

本发明的又一具体实施方式中，所述荧光化学传感还包括末端转移酶缓冲 液，所述末端转移酶缓冲液包括：50毫摩尔每升醋酸钾，20毫摩尔每升Tris-Ac， 10毫摩尔每升醋酸镁，pH 7.9；

本发明的又一具体实施方式中，公开了所述荧光化学传感器用于Dam甲基 转移酶检测的方法，包括：

1)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；

2)向步骤1)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II进行聚合反应；

3)对步骤2)反应后的溶液进行荧光化学检测，实现对待测样品中Dam甲 基转移酶的定量分析。

其中，步骤1)所述反应溶液I中包括Dam甲基转移酶检测探针，S-腺苷 甲硫胺酸，限制性核酸内切酶DpnⅠ和Dam甲基转移酶反应缓冲液；

步骤1)中孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1.5～3h(优选为2h)；高 温灭活处理温度为80℃，处理时间为10～30min(优选为20min)；

步骤2)中所述反应溶液II包括辅助探针，三磷酸脱氧腺苷，末端转移酶 (TdT)，核酸内切酶IV，二氯化钴和末端转移酶缓冲液和SYBR Gold；

步骤2)中反应条件为：37℃，反应时间为60～200min(优选为100min)；

步骤3)中采用实时定量PCR仪实时定量检测荧光强度。

本发明的又一具体实施方式中，公开了上述荧光化学传感器和/或检测方法 在定量检测Dam甲基转移酶和/或筛选Dam甲基转移酶抑制剂/激活剂中的应 用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。

实施例

实验方法步骤

1.Dam甲基转移酶的检测：在含有0.5微摩尔每升发夹探针，160微摩尔 每升SAM(S-腺苷甲硫胺酸)，10单位限制性核酸内切酶DpnⅠ，1×DNADam 缓冲液(50毫摩尔每升Tris-HCl缓冲液，10毫摩尔每升EDTA，5毫摩尔每升 2-巯基乙醇，pH 7.5)和不同数量的Dam甲基转移酶的200微升反应混合物中 进行发夹探针的甲基化和切割。混合物在37℃下孵育2小时，然后在80℃灭 活20分钟。在30微升含有1×末端转移酶缓冲液(50毫摩尔每升醋酸钾，20 毫摩尔每升Tris-Ac，10毫摩尔每升醋酸镁，pH 7.9)，0.25毫摩尔每升二氯化 钴，1×SYBR Gold，0.13微摩尔每升辅助探针反应溶液中进行超支化扩增，1 毫摩尔每升dATPs(三磷酸脱氧腺苷)，4单位EndoⅣ(核酸内切酶Ⅳ)，8 单位TDT(末端转移酶)和4微升甲基化产物。聚合反应在Bio-Rad CFX 96实 时定量PCR仪(Bio-Rad，USA)上于37℃进行100分钟，并以30秒的间隔监 测荧光强度。

2.凝胶电泳分析：在1×TBE缓冲液(9毫摩尔每升Tris-HCl，9毫摩尔每 升硼酸，0.2毫摩尔每升EDTA，pH7.9)中，以1×SYBR Gold作为荧光指示 剂，在110V恒定电压下室温进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)50 分钟。

3.Dam甲基转移酶检测的选择性：为了研究提出的方法的选择性，我们使用M.SssI甲基转移酶和牛血清蛋白作为干扰酶。用20单位每毫升干扰酶使用上述 方法进行实验。

4.溶菌酵母培养基样品中检测Dam甲基转移酶：总体积为200微升的含有10％溶菌酵母培养基(LB)的样品混合物，加入各种浓度的Dam甲基转移酶， 0.5微摩尔每升发夹探针，160微摩尔每升SAM(S-腺苷甲硫胺酸)，10单位限制 性核酸内切酶DpnⅠ，1×Dam反应缓冲液(50毫摩尔每升Tris-HCl缓冲液，10毫 摩尔每升EDTA，5毫摩尔每升2-巯基乙醇，pH7.5)，在37℃下孵育2小时，然 后在80℃灭活20分钟。用如上所述方法测定Dam甲基转移酶的活性。

5.抑制剂分析：为了研究5-氟尿嘧啶对Dam甲基转移酶活性的影响，各种浓 度的5-氟尿嘧啶，0.5微摩尔每升发夹探针和1×Dam反应缓冲液(50毫摩尔每升 Tris-HCl缓冲液，10毫摩尔每升EDTA，5毫摩尔每升2-巯基乙醇，pH 7.5)，在 37℃下孵育15分钟。然后在溶液中加入20单位每毫升Dam甲基转移酶，50单位 每毫升限制性核酸内切酶DpnⅠ和160微摩尔每升SAM(S-腺苷甲硫胺酸)，37℃ 下反应2小时，80℃下灭活20分钟。使用上述程序分析测定Dam甲基转移酶的活 性。Dam甲基转移酶的相对活动(RA)通过公式1计算：

其中F₀是在没有Dam甲基转移酶的情况下的荧光强度，Ft是存在20单位每毫 升Dam甲基转移酶时的荧光强度，F_i是存在20单位每毫升Dam甲基转移酶和5-氟 尿嘧啶时的荧光强度。

结果分析与讨论

1.本发明原理的实验验证

为了验证本技术方案的可行性，我们利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来研 究Dam甲基转移酶的甲基化过程(图2)。在没有Dam甲基转移酶或DpnI的 情况下，仅观察到一个20bp的条带(图2A中泳道2和3)，表明发夹没被剪 切。当Dam甲基转移酶和DpnI都存在时，出现一个新的20nt带(图2A，泳 道1)，表明发生了甲基化和剪切过程。为了验证TdT激活的Endo IV辅助超 支化扩增，我们使用非变性聚丙烯酰胺凝胶来检测扩增产物。在20单位每毫升 Dam甲基转移酶和50单位每毫升DpnI的存在下，观察到明显的扩增产物条带 (图2B，泳道1)，表明因超支化扩增产生了大量DNA片段。相比之下，在 没有Dam甲基转移酶的对照组中没有观察到扩增产物条带(图2B，泳道2)。 为了进一步证实TdT激活的Endo IV辅助超支化扩增，我们也进行了实时荧光 检测(图2C)。在Dam甲基转移酶和Dpn I的存在下，荧光强度随时间呈线 性增加(图2C)。在没有Dam甲基转移酶的对照组中，观察到零背景信号(图2C)。零背景信号的实现可能归因于发夹探针3'末端的修饰和具有氨基修饰的 辅助探针可以有效地防止没有Dam甲基转移酶的情况下TdT激活的非特异性 扩增。

2.优化实验条件

为了获得最佳效果，我们优化了辅助探针和dATP的浓度，以及Endo IV 和TdT的用量。如图3A所示，随着辅助探针浓度的增加，F-F₀(F和F₀分别 为Dam存在和不存在时的荧光强度)的值增加，辅助探针浓度为0.13微摩尔 每升时达到平台。因此，在随后的实验中使用的辅助探针浓度是0.13微摩尔 每升。荧光信号的产生依赖于TdT介导的DNA链的延伸和Endo IV介导的对 辅助探针的切割，因此Endo IV和TdT的用量也需要优化。我们实验了TdT用量固定为8单位时不同的Endo IV的用量对荧光信号的影响。如图3B所示， 随着Endo IV的增加，F-F₀(F和F₀分别为Dam存在和不存在时的荧光强度) 的值增加，并于用量为4单位时达到最大值。然后我们研究了TdT对荧光信 号的影响，此时Endo IV用量固定为4单位。如图3C所示，TdT从4单位到 8单位的区间内F-F₀(F和F₀分别为Dam存在和不存在时的荧光强度)的值随 着TDT用量的增加而增加，超过8单位时F-F₀的值降低。因此，4单位Endo IV 和8单位TdT用于后续实验。

我们进一步研究了dATP的浓度对荧光信号的影响。图3D显示，随着dATP 浓度的增加，F-F₀(F和F₀分别为Dam存在和不存在时的荧光强度)的值增加， 在浓度为1毫摩尔每升时达到最大值。因此，在随后的实验中使用1毫摩尔每 升dATP。

3.灵敏度检测

在最佳实验条件下，我们实时监测不同浓度的Dam甲基转移酶产生的荧光 信号。如图4A所示，荧光信号以时间依赖性和浓度依赖性方式线性增加。Dam 甲基转移酶的浓度越高，被甲基化的DNA底物越多，随后被DpnI切割而产生 的游离3'-OH末端越多，因此荧光信号越高。此外，在0.005至40单位每毫升 的4个数量级的范围内，荧光强度和Dam甲基转移酶浓度的对数之间存在良好 的线性相关性(图4B)。回归方程为F＝2889.8+1164.4log10C，相关系数为 0.991，其中F和C分别表示荧光强度和Dam甲基转移酶浓度(单位每毫升)。 通过计算空白的平均响应值加三倍标准偏差代入线性方程，可以得到检测限为 0.003单位每毫升。值得注意的是，与核酸外切酶介导目标循环的荧光测定法 (0.01单位每毫升)、基于核酸内切酶辅助信号扩增的荧光测定(0.06单位每 毫升)和基于转录介导的双链特异性核酸酶辅助循环信号扩增的荧光测定法 (0.015单位每毫升)相比，该方法的灵敏度提高了1个数量级，与基于发夹形 DNA酶信号扩增的荧光测定法(0.4单位每毫升)和基于DNA酶介导信号扩增 的比色法(0.25单位每毫升)相比，该方法的灵敏度提高了2个数量级。重要 的是，此发明提出的方法非常简单，不需要设计任何核酸内切酶的特异性识别 序列，并且表现出优异的特异性即在没有目标物Dam甲基转移酶存在时背景信 号几乎为零。灵敏度的提高可归因于以下三个因素：(1)TdT激活Endo IV辅 助的超支化扩增诱导荧光信号增强；(2)TdT的高精确性识别导致了仅在游离 3'-OH末端才能发生扩增，和Endo IV只能水解完整的AP位点，实现了零背景 信号；(3)通过氨基修饰发夹探针和辅助探针的3'末端有效地防止TdT激活非 特异性扩增。

4.选择性检测

为了研究本发明检测方法的选择性，我们使用M.SssI甲基转移酶和BSA 作为干扰酶。M.SssI甲基转移酶可以在双链DNA的5'-C-G-3'识别序列中特异 性甲基化胞嘧啶残基，而BSA是一种不相关的蛋白质。如图5A所示，荧光 信号在存在20单位每毫升Dam甲基转移酶时呈时间依赖性的方式增加，而在 20单位每毫升M.Sss I甲基转移酶、20单位每毫升BSA和对照组的存在下均没 有观察到荧光信号。此外，响应于Dam甲基转移酶的荧光强度远高于响应于 M.Sss I甲基转移酶，BSA和对照组的荧光强度(图5B)。这可以通过以下事 实来解释：5'-G-A-T-C-3'的特异性识别序列只能通过Dam甲基转移酶而不是 M.Sss I和BSA进行甲基化。这些结果清楚地表明了提出的方法对Dam甲基转 移酶有极好的选择性。

5.在溶菌酵母培养基中对Dam甲基转移酶检测

为了进一步验证该方法在实际样品分析中的可行性，我们检测了Dam甲基 转移酶在含有10％溶菌酵母(LB)培养基的复杂样品中的活性。如图6所示， Dam甲基转移酶在稀释的溶菌酵母培养基样品中的响应荧光强度与其在反应缓 冲液中的响应值一致，0.5单位每毫升和20单位每毫升Dam甲基转移酶的回收 率分别为99.8％±4.62％和103.8％±4.18％。这些结果表明，所提出的方法在 复杂生物样品中具有进一步应用的巨大潜力。

6.抑制剂分析

Dam甲基转移酶在越来越多的细菌病原体的毒性中起重要作用，已成为抗 菌药物发展的目标。为了证明所提出的抑制实验方法的可行性，我们以5-氟尿 嘧啶为模型抑制剂。已有的研究表明，小于10微摩尔每升浓度的5-氟尿嘧啶对 DpnI的活性没有影响。我们利用凝胶电泳分析和实时荧光检测的方法，研究5- 氟尿嘧啶对TDT和Endo IV活性的影响。如图7A所示，只存在TDT的体系中 在含有10微摩尔每升5-氟尿嘧啶(图7A，泳道2)和不含5-氟尿嘧啶(图7A， 泳道3)时，观察到反映TdT介导扩增产物的两条泳带没有明显区别，表明10 微摩尔每升5-氟尿嘧啶对TdT的活性没有影响。此外，在TDT和Endo IV的 存在的体系中，含有10微摩尔每升5-氟尿嘧啶(图7A，泳道4)和不含5-氟 尿嘧啶(图7A，泳道5)时，观察到反映TdT激活Endo IV辅助超支化扩增产 物的两条泳带没有明显差异，表明10微摩尔每升5-氟尿嘧啶对Endo IV的活性 没有影响。另外，在10微摩尔每升5-氟尿嘧啶存在下获得的荧光强度(图7B) 与不存在5-氟尿嘧啶(图7B)时获得的荧光强度无明显差异，表明无论只存在 TdT或同时存在TDT和Endo IV时，10微摩尔每升5-氟尿嘧啶对TDT和Endo IV的活性没有明显影响。这些结果表明5-氟尿嘧啶不影响DpnI，TdT和Endo IV 的酶活性。

图8显示5-氟尿嘧啶对Dam甲基转移酶活性的影响。随着5-氟尿嘧啶浓度 的增加，Dam甲基转移酶相对活性逐渐降低。IC₅₀值是将酶活性降低50％所 需的抑制剂的浓度。对于5-氟尿嘧啶，计算得IC₅₀值为1.29微摩尔每升，与 基于发夹探针的引物生成滚环扩增(PG-RCA)诱导的化学发光测定法(1.42 ±0.07μM)获得的IC₅₀值一致。这些结果表明，所提出的方法可用于筛选Dam 甲基转移酶抑制剂。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领 域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之 内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 一种检测DNA腺嘌呤甲基转移酶的荧光化学传感器及其检测方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaaggatctt ctcgacttgc tgaagatcct tcttaat 37

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tttttttttt tttttttttt xttttt 26

Claims (9)

1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括：反应溶液I和反应溶液II；反应溶液I中包括Dam甲基转移酶检测探针，S-腺苷甲硫胺酸，限制性核酸内切酶DpnⅠ和Dam甲基转移酶反应缓冲液；反应溶液II包括辅助探针，三磷酸脱氧腺苷，末端转移酶（TdT），核酸内切酶IV，二氯化钴和末端转移酶缓冲液和SYBR Gold；

所述Dam甲基转移酶检测探针为一个具茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，所述双链DNA具有Dam甲基转移酶的识别位点；所述Dam甲基转移酶检测探针长度为37nt，所述Dam甲基转移酶检测探针的碱基序列为：5'-GAA GGA TCT TCT CGA CTT GCTGAA GAT CCT TCT TAA T-NH₂-3'；所述Dam甲基转移酶检测探针3'端进行氨基修饰；

所述Dam甲基转移酶的识别位点为5'-G-A-T-C-3'的回文序列；

所述辅助探针为一个近3'末端具有脱嘌呤嘧啶位点（AP位点）的富T单链DNA序列，所述辅助探针长度为26 nt，所述辅助探针的碱基序列为5'-TTT TTT TTTTTTTTTTTTTTX TTTTT-NH₂-3'，其中X代表脱嘌呤嘧啶位点，所述辅助探针3'端进行氨基修饰。

2.如权利要求1所述的荧光化学传感器，其特征在于，所述Dam甲基转移酶反应缓冲液包括：50毫摩尔每升Tris-HCl缓冲液，10毫摩尔每升EDTA，5毫摩尔每升2-巯基乙醇，pH7.5。

3.如权利要求1所述的荧光化学传感器，其特征在于，所述末端转移酶缓冲液包括：50毫摩尔每升醋酸钾，20毫摩尔每升Tris-Ac，10毫摩尔每升醋酸镁，pH 7.9。

4.权利要求1-3任一项所述荧光化学传感器以非疾病诊断治疗为目的的用于Dam甲基转移酶检测的方法，其特征在于，步骤包括：

1）将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；

2）向步骤1）高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II进行聚合反应；

3）对步骤2）反应后的溶液进行荧光化学检测，实现对待测样品中Dam甲基转移酶的定量分析。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤1）中孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1.5~3 h；高温灭活处理温度为80℃，处理时间为10~30 min。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1）中孵育时间为2 h。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1）中高温灭活处理时间为20 min。

8.权利要求1-3任一项所述荧光化学传感器在非疾病诊断治疗目的的定量检测Dam甲基转移酶和/或筛选Dam甲基转移酶抑制剂或激活剂中的应用。

9.权利要求5-7任一项所述检测方法在非疾病诊断治疗目的的定量检测Dam甲基转移酶和/或筛选Dam甲基转移酶抑制剂或激活剂中的应用。

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