CN107746846B

CN107746846B - 编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因及应用

Info

Publication number: CN107746846B
Application number: CN201711018018.4A
Authority: CN
Inventors: 边小峰; 禹阳; 贾赵东; 马佩勇; 郭小丁; 谢一芝
Original assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Current assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2037-10-26
Also published as: CN107746846A

Abstract

本发明公开了一种正向调控植物开花甘薯ABF4基因的编码序列及其应用。其中编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因，是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。IbABF4基因编码的蛋白质是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明从甘薯中分离出编码bZIP转录因子的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，转基因植株开花提前。此基因可以应用于植物遗传改良。

Description

编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因、该基因编码的蛋白质以及含有该基因的重组载体及基因的抗逆应用。

背景技术

开花的发生决定了高等植物具备繁殖和遗传的能力，对植物个体和子代发育具有重要的意义。植物的花期调控是由多条途径参与调控的，综合不断更新的开花分子遗传结果，将植物响应各种内源和外源信号启动开花的途径归纳为：经典的光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径和较新的年龄途径共5条。在农业生产过程中，作物的开花和和产量、适应区域有着密不可分的关系，如水稻、小麦、玉米、马铃薯等。

转录因子在调控植物开花途径中其重要作用，bZIP家族基因是调节植物开花一类重要的转录因子。其中，ABF是一类可以与ABRE结合的bZIP转录因子，该类基因的碱性区域的氨基酸序列非常保守，还含有特别的MKIK和QAY/Q基序。该类基因主要参与植物的抗非生物胁迫途径(旱、冷、盐和氧化胁迫等)和ABA信号转导，然而与植物开花相关的报道却不多。

甘薯不仅是重要的粮食作物，而且还是重要的经济作物和能源作物。甘薯广泛种植在世界上的100多个国家，我国是世界上的最大生产国，甘薯生产约占世界甘薯的80％。与其他粮食作物相比，甘薯相对较为耐旱，但品种间差异较大，世界上相当比例的甘薯种植在干旱的环境下，而世界干旱、半干旱地区已占陆地面积的三分之一以上，干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中居首位。甘薯全基因组约4G，含有丰富的基因资源，在甘薯中分离克隆ABF类转录因子，研究其功能特性，能为作物遗传改良提供基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因。

本发明的第二个目的是提供一种该基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种含有该基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种含有该表达载体的宿主细胞。

本发明的最后一个目的在于提供该基因的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因，它是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列由1263个碱基组成。

上述基因编码的蛋白质，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。所述的序列由420个氨基酸残基组成。

一种含有上述基因的表达载体pCAMBIA1305-IbABF4，它含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种含有上述表达载体的农杆菌宿主细胞EHA105：pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4。

上述表达载体或农杆菌宿主细胞在转化植物获得转基因植株中的应用，尤其是在制备转基因拟南芥中的应用。

本发明的优点：

本发明从甘薯中分离出编码bZIP转录因子基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得的转基因植株，结果表明IbABF4基因能够促进植物的开花。

附图说明

图1.IbABF4氨基酸序列的系统进化树分析结果；

图2.pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4载体示意图；

图3.未转化的南芥株系和转IbABF4基因植株根系比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

实施例1

甘薯中bZIP转录因子IbABF4基因序列获得，具体如下：

利用OMEGA RNA试剂盒，从100mg的新鲜的甘薯叶片中提取总RNA，利用反转录试剂盒(Bioteke)合成cDNA。

具体反应体系如下：

在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：1、50℃，45min；2、70℃，10min；之后冰上冷却。

将提取的总RNA送华大基因(Beijing Genomic Institute，BGI)，通过高通量测序获得甘薯转录组数据库，并通过De novo拼接获得甘薯Unigene数据库，其中CL3260与NR数据库比对后发现该基因可能参与ABA途径。将CL3260通过OFR FINDER(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在线软件预测基因完成的ORF，并利用PrimerPremier 5设计扩增完整ORF引物：

IbABF4(F)：5′ATGATGGGGTCATACTTGGA 3′

IbABF4(R)：5′TTACCAAGGCCCAGTAAGCG 3′

利用TAKARA公司Primerstar GXL DNA聚合酶进行扩增，具体步骤如下：

反应条件如下：94℃，4min；98℃，10Sec；55℃，15Sec；68℃，1.5min；72℃，10min；30个循环。使用OMEGA DNA纯化试剂盒将PCR产物纯化，纯化后的PCR产物与pEASY-Blunt载体连接(本过程使用TransGEN的pEASY-Blunt Vector Cloning Kit试剂盒)，反应体系如下：IbABF4基因的cDNA片段4u1，pEASY-Blunt载体1μL。反应条件：20-30℃，30min。连接产物转化E-Coli.DH5α感受态，涂布在含有40u125mg/ml的X-Gal、16ul 50mg/ml的IPTG、100mg/mL Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，使用菌落PCR法确认pEASY-Blunt载体中插入片段的长度大小，与预期一致。送南京金斯瑞生物科技公司测序获得基因序列SEQ ID NO.1。

实施例2

IbABF4蛋白序列同源分析，具体如下：

测序获得IbABF4基因序列为1263bp，编码421个氨基酸如SEQ ID NO.2所示，将翻译获得蛋白序列与NCBI蛋白数据进行比对(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得了与IbABF4蛋白序列相似的植物种属同源基因。在多重比较分析的基础上，建立了各同源植物种属基因的系统进化树，详见图1。包括牵牛花(Ipomoea nil)，烟草(Nicotiana tabacum)，土豆(Solauum tuberosum)，蕃茄(Solanum lycopersicum)，辣椒(Capsicum annuum)，龙葵(Solanum nigrum)，亚洲棉(Gossypium arboretum)，水稻(Oryzasativa)，核桃(Juglans regia)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)。利用MEGA 5.1软件进行系统进化树的构建，得到IbABF4亲缘关系与拟南芥和葡萄亲缘关系较近(如图1)。

实施例3

双元植物表达载体pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4的构建，具体如下：

pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4载体示意图如图2所示，首先以pEASY-Blunt-IbABF4质粒为模板，采用引物

IbABF4-PstI(F)：5′aaCTGCAG ATGGCTGCCACTATTGAT3′

IbABF4-BamHI(R)：5′ccGGATCCTTATGACCCGCCCGAACCTG 3′

在IbABF4前后分别引入酶切位点PstI和BamHI，其反应体系和条件如实施例1中所述。然后PCR产物和pCAMBIA1305空载体质粒分别用BamHI和PstI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接体系如下：

连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含100mg/ml浓度卡纳霉素抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4构建正确。

实施例4

用于植物转基因的农杆菌菌种EHA105：pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4的构建，具体如下：

本发明使用的农杆菌菌株为EHA105。采用的是液氮冻融法将构建好的表达载体转入农杆菌。具体过程为：1)冰浴融化EHA105感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴20～30min；2)液氮速冻5min，37℃热击5min，迅速置于冰上1～2min；3)加入800μL无抗生素的LB培养基，28℃，200rpm复苏3.5h；4)4000rpm离心3min，吸掉培养基；5)混匀剩余菌液，涂抹于添加100mg/ml卡纳霉素和100mg/ml利福平的固体LB培基上；6)28℃倒置培养30～48h；7)PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

实施例5

IbABF4转化Col野生型拟南芥，具体如下：

将实施例4中阳性克隆接种到50ml YEP(含100μg/ml Rif、100μg/ml Kan)液体培养基中，28℃180rpm继续培养至OD600＝0.8。4000rpm离心10min，弃培养基，收集菌体。用拟南芥渗入缓冲液将菌体稀释OD600＝0.6，制备成拟南芥侵染液。当拟南芥抽苔4-5cm时即可准备侵染，侵染的前3d去除其顶生花序，以利用腋生花序的生长。待长出腋生花序后，其下部的花开始授粉时即可进行转化。转化前大量浇水，并将已授粉的花蕾及荚果摘除。共配制50ml拟南芥侵染液(5％蔗糖，0.05％SilwetL-77)，倒入培养皿，将拟南芥的花序浸入其中30s，注意莲座叶不要沾染到菌液。取出植株，横放在托盘中，暗处理24h。之后直立放置方盘正常光照培养。待果荚成熟时收获T0代种子。

将T0代种子播种前在4℃冰箱春化3d，0.5％NaClO表面消毒后，播种于1/2MS固体培养基上(大量元素、微量元素减半，含20mg/L潮霉素)培养。7～14d后挑选转化体，具有潮霉素抗性的转化植株体能在含有潮霉素培养基上生长，根明显伸长，而非转化体渐渐黄化死亡。待植株长出4-5片叶子时，提取叶片DNA进行PCR鉴定，引物及PCR程序同实施例1中的IbABF4基因中间片断的克隆。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。过PCR扩增能够得到目的片断的为拟南芥阳性转化体，将其继续培养待果荚成熟收获T1代种子。将PCR鉴定为阳性的植株所收获的T1代种子继续播种，同样经过潮霉素抗性筛选，统计其性状分离比。经卡方检验符合孟德尔遗传定律中3∶1分离比。将部分抗性苗移植入土壤中，收获T2代纯合的转基因种子。

对转IbABF4基因拟南芥的表型进行鉴定

取IbABF4过表达拟南芥株系(OV-1，OV-2)和为转化的野生型(WT)植株点播于1/2MS培养基上生长，观察表型(图3)在拟南芥中过表达IbABF4可以正向调控植株的开花时间。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因及应用

<130> 2017

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> Ipomoea batatas

<400> 1

atgatggggt catacttgga cttcaagaac tttgtggaga caccacagcc agaaggtaat 60

ggagggaagc cagccagtct tttccctttg gctcgacaat cttcgatata ctccttgaca 120

tttgatgagc tccagacaac atttagcgga cttgggaagg atttcgggtc tatgaatatg 180

gaggatctgt tgaagagcat ttggactgcc gaggaatctc aacccttcca ggcatgttgt 240

gttggtgcag gagataatgg tagtgtccct ggtgggaact tgcagagaca aggctctcta 300

acgctgccca ggacgctcag tcagaaaact gtggatgaag tgtggaaaga ctttcagaaa 360

gacactggtg ccaccaaaga ttgtggctat ggtggatcaa gctttggcca aagacaatct 420

actttggggg aaatgacatt ggaggagttt ttgttcaaag caggggttgt aagggaagaa 480

atggttccaa atagtgttgg atttggcagc agtgtgactc agctgaatag tatgggattt 540

caagaaatca cagataataa cagtgctgcc attcctggtg catcatctaa ttcaatgctt 600

agtgcaggag ccaccagatc tacccagcaa caacctttgc agcatcatca acagcttcag 660

cttcaccaac cactttttcc taagcagaca accttgacct ttgcctctcc aatgcaatta 720

caaaacaatg ctcagcaggc taggtcagga gcaaggcgtc ctgctcttgg aatgccaagt 780

cctccacata acactaatca agttcaggga gaacttatcc aaggcagtgc gaatagcatg 840

gcaggattac gccaaaatgg ggctgcagga ggaggaggag gaggatcccc tggaattcca 900

ttgtcttcag atgtggctct taatagtaat ctgggcatgt catccctatc cccttcgcct 960

tatgcattta acgaaggcgg gagagggagg agagcatgta actctataga aaaggtggtg 1020

gagcggaggc gtaggagaat gattaagaac agagagtctg ctgcaagatc acgagccagg 1080

aagcaggcct ataccataga gttggaagcg gaagtagaaa agcttaaaga aatcaaccaa 1140

gaattgatga aaaaacaggc tgaatttctg gagaagcgga aaaatcagat gagggagaaa 1200

atgtttgtgc catgggaaag taaaccaaga tgcttgaaga ggacgcttac tgggccttgg 1260

taa 1263

<210> 2

<211> 420

<212> PRT

<213> Ipomoea batatas

<400> 2

Met Met Gly Ser Tyr Leu Asp Phe Lys Asn Phe Val Glu Thr Pro Gln

1 5 10 15

Pro Glu Gly Asn Gly Gly Lys Pro Ala Ser Leu Phe Pro Leu Ala Arg

20 25 30

Gln Ser Ser Ile Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Leu Gln Thr Thr Phe

35 40 45

Ser Gly Leu Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Glu Asp Leu Leu

50 55 60

Lys Ser Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser Gln Pro Phe Gln Ala Cys Cys

65 70 75 80

Val Gly Ala Gly Asp Asn Gly Ser Val Pro Gly Gly Asn Leu Gln Arg

85 90 95

Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp

100 105 110

Glu Val Trp Lys Asp Phe Gln Lys Asp Thr Gly Ala Thr Lys Asp Cys

115 120 125

Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Phe Gly Gln Arg Gln Ser Thr Leu Gly Glu

130 135 140

Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Phe Lys Ala Gly Val Val Arg Glu Glu

145 150 155 160

Met Val Pro Asn Ser Val Gly Phe Gly Ser Ser Val Thr Gln Leu Asn

165 170 175

Ser Met Gly Phe Gln Glu Ile Thr Asp Asn Asn Ser Ala Ala Ile Pro

180 185 190

Gly Ala Ser Ser Asn Ser Met Leu Ser Ala Gly Ala Thr Arg Ser Thr

195 200 205

Gln Gln Gln Pro Leu Gln His His Gln Gln Leu Gln Leu His Gln Pro

210 215 220

Leu Phe Pro Lys Gln Thr Thr Leu Thr Phe Ala Ser Pro Met Gln Leu

225 230 235 240

Gln Asn Asn Ala Gln Gln Ala Arg Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ala Leu

245 250 255

Gly Met Pro Ser Pro Pro His Asn Thr Asn Gln Val Gln Gly Glu Leu

260 265 270

Ile Gln Gly Ser Ala Asn Ser Met Ala Gly Leu Arg Gln Asn Gly Ala

275 280 285

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ile Pro Leu Ser Ser Asp

290 295 300

Val Ala Leu Asn Ser Asn Leu Gly Met Ser Ser Leu Ser Pro Ser Pro

305 310 315 320

Tyr Ala Phe Asn Glu Gly Gly Arg Gly Arg Arg Ala Cys Asn Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Arg Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu

340 345 350

Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Ile Glu Leu

355 360 365

Glu Ala Glu Val Glu Lys Leu Lys Glu Ile Asn Gln Glu Leu Met Lys

370 375 380

Lys Gln Ala Glu Phe Leu Glu Lys Arg Lys Asn Gln Met Arg Glu Lys

385 390 395 400

Met Phe Val Pro Trp Glu Ser Lys Pro Arg Cys Leu Lys Arg Thr Leu

405 410 415

Thr Gly Pro Trp

420

Claims

1.一种编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因，其特征在于它是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述IbABF4基因具有正向调控植物开花的功能。

2.权利要求1所述IbABF4基因编码的蛋白质，其特征在于，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.一种含有权利要求1所述基因的表达载体pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4。

4.一种含有权利要求3所述表达载体的农杆菌宿主细胞EHA105：pCAMBIA1305-2×35s-IbABF4。

5.权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述农杆菌宿主细胞在转化植物获得转基因植株中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。