CN107670020B - 四胜肽gekg在治疗退化性关节炎中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种四/五胜肽GEKG(F)在治疗退化性关节炎中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及四/五胜肽GEKG(F)在治疗退化性关节炎中的新用途。
先前技术
退化性关节炎(degenerative joint disease)是指关节软骨的持续性病变且伴随有赘生骨的增生，其中增生骨大多发生在关节边缘或软骨下方。发生退化性关节炎的原因相当复杂，但是主要是与发病时患者的年龄有关。退化性关节炎常发生在年纪较大的长者。确认退化性关节炎的发生是基于检测发现关节软骨磨损和纤维化、赘生骨(骨刺)发生及/或软组织发炎。虽然已知年龄变化确实会影响软骨病变，但是退化性关节炎的真正致病机转迄今仍尚未明了。
退化性关节炎大多发生在承载身体体重的关节或手指指间关节，尤其是末端指节，其中关节疼痛与活动受限为临床上主要征候。病理学检查常发现关节变形且关节边缘肿胀及触压疼痛甚至合并关节响声。
现今治疗退化性关节炎的药物包括非类固醇消炎剂(诸如COX2药物制剂)、关节内局部注射用类固醇及关节内注射营养润滑剂(即玻尿酸制剂)。
US 4528133揭露某些包含2或3个丙胺酸(Ala；A)残基的四胜肽在治疗关节炎中的用途。
US 6034057揭露某些包含8个胺基酸残基和2个连接基团的环胜肽在治疗类风湿性关节炎中的用途。
US 6589750B2和US 7429448B2揭露五胜肽QHNPR在预防或治疗组织或器官(诸如骨)的水-矿物质不平衡中的用途，其中Q表示谷氨酰胺(Gln)；H表示组胺酸 (His)；N表示天冬酰胺酸(Asn)；P表示脯胺酸(Pro)；且，R表示精胺酸(Arg)。
先前技术皆未教示或建议：可使用富含甘胺酸(Gly；G)的四/五胜肽以治疗退化性关节炎。
因此，本发明人针对现有问题进行深入探讨，并借助多年从事相关产业的研发与制造经验，经不断努力的改良与试作，终于成功开发出一种用于治疗退化性关节炎的四/五胜肽GEKG(F)，借此能提供治疗退化性关节炎的新选择。
发明内容
因此，本发明的主要目的是在提供一种四/五胜肽GEKG(F)在治疗退化性关节炎中的用途。
基于此，本发明主要是透过下列的技术手段来具体实现前述的目的及功效。
为使贵审查委员能进一步了解本发明的构成、特征及其他目的，以下乃举本发明的较佳实施例，并配合图式详细说明如后，同时让本领域技术人员能够具体实施。
附图说明
图1显示四胜肽对软骨细胞DNA含量的影响；
图2显示四胜肽对培养软骨组织胶原合成的影响；
图3显示四胜肽对培养软骨组织蛋白多醣合成的影响。
具体实施方式
本发明公开了一种四/五胜肽GEKG(F)在治疗退化性关节炎中的用途。以下通过特定的具体实施例说明本发明的技术内容，使本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的优点与功效。然而，本发明亦可通过其他不同的具体实施方式加以施行或应用。可在不离开本发明的申请专利范围的内容的前提下，根据本发明的具体实施例的设计与需求而进行变化。
本发明也公开了一种医药组成物，其包含治疗有效量的四/五胜肽GEKG(F)及医药上可接受的载剂。该医药上可接受的载剂包括固体载剂、半固体载剂及液体载剂，其中该等固体载剂、半固体载剂及液体载剂的种类和适当用量业已为此技术领域所习知且惯用。该医药组成物可呈锭剂、药片、丸剂、粉末或颗粒的形式。该医药组成物亦可呈凝胶、糊剂或贴片的形式。该医药组成物亦可呈水溶性缓冲液的形式，其中该水溶性缓冲液包括但不限于磷酸盐或柠檬酸盐的水溶液。
此外，本发明使用生化科学上定义的简称：赖胺酸(Lys；K)；谷氨酰胺(Glu； E)；及，苯丙胺酸(Phe；F)。
本发明揭露的四胜肽GEKG(SEQ ID NO.1所示)和五胜肽GEKGF(SEQ ID NO.2所示)可依据先前技术，诸如TW 201129368A1和TW 201333045A1，所记载的方法进行制备。
本发明使用的测量关节液中SOD、NO及MDA的方法及测量软骨细胞基质中胶原和蛋白多糖的方法业已为本领域技术人员所习知且惯用。
实施方式
实施例1
一、动物模型
以15只健康成年纽西兰大白兔随机分为3组：正常对照组(A组)、模型对照组 (B组)及胜肽关节腔注射组(C组)，每组各5只。手术前禁食4小时，肌肉注射Ketamine (10mg/kg)及Atropine(0.2mg/kg)。待麻醉生效后，将动物固定在手术台上，于膝盖骨韧带后缘做8cm纵向切口并掀起皮肤，沿膝盖骨后缘打开关节囊及滑膜，将膝关节弯曲90°，使股骨下端软骨曝露，并做2个直径为3mm、深度3mm的圆柱型缺损，清除缺损处的凝血，以无菌生理食盐水清洗关节内腔后，分层仔细缝合。手术后注射青霉素抗感染一周。5天后可正常饮食并自主站立。
二、实验方法
手术后第2周开始，A及B组不做任何处理，C组按250ppm/kg关节腔注射四胜肽GEKG，每7天注射一次，共给药12周。关节腔注射0.5ml生理食盐水，收集0.2ml关节液。切开关节囊，取出滑膜且完整取出胫骨关节面，肉眼及手术镜下观察关节软骨病变程度，并切片后分别进行苏木精-伊红(HE Stain，Hematoxylin and Eosin Stain)及甲苯胺蓝染色的光学显微镜观察。
三、实验结果
肉眼观察结果
12周后，A组膝关节表面光滑，有弹性，关节腔中可见少许关节液；B组缺损组仅部分修复，但缺损中央仍残留凹陷及隙缝；C组全部缺损均已完全修复，剖面结构与正常关节无异，表面软骨及其下松质骨均已完全修复，且未见骨化及修复痕迹。
组织型态学观察
A组关节组织与正常关节组织的特征相同，表面为成熟软骨组织、中间为排列有序的成熟骺板及下方为骨化良好的松质骨，且软骨组织的厚度正常；B组缺损组的修复组织以纤维样软骨和纤维组织为主，与正常组织间界面连续，部分标本缺损区有较多的纤维性软骨组织充填，但在缺损区无明显的骺板形成且下方的松质骨骨化不良；C组修复组织已与正常关节组织的特征无明显差异，表面软骨组织、骺板及下方松质骨均已达到正常组织学形态，新生软骨厚度与正常相同，软骨及骨交界处已无法区分。
生化指标检测
与B组比较，C组关节软骨形态明显改善且同时关节液中SOD明显升高，而 NO及MDA均明显降低，结果如表1所示。
表1.各组关节液中NO、SOD及MDA值
| 组别 | NO(c/mol.L<sup>-1</sup>) | SOD(c/mol.L<sup>-1</sup>) | MDA(c/mol.L<sup>-1</sup>) |
| A | 49.12±1.26 | 5.67±1.85 | 13.46±2.83 |
| B | 115.39±12.94 | 16.29±1.57 | 23.69±2.78 |
| C | 20.76±2.88 | 6.60±1.37 | 13.12±2.28 |
结论
1、组织形态学实验结果表明：注射四胜肽GEKG于关节腔可明显修复已损伤的软骨组织，对于退化性关节炎的治疗效果十分确切。
2、四胜肽GEKG显著降低滑膜中MDA，降低关节腔内的脂质过氧化损伤程度，因而减轻自由基对软骨细胞及基质的损伤，达到保护关节软骨的作用。
3、四胜肽GEKG明显提高兔子关节内腔SOD浓度，消除发炎所产生的自由基，进而保护软骨且抑制与防止软骨病变。
4、四胜肽GEKG明显提高兔子关节内腔NO浓度，因而减轻NO对软骨的破坏。
实施例2
一、实验方法
1、取兔子生长板软骨细胞，进行持续培养，设四胜肽GEKG单独作用组、胶原单独作用组、四胜肽GEKG+胶原联合作用组，分别添加四胜肽GEKG(250ppm) 、胶原(100ng/ml)及四胜肽GEKG(250ppm)+胶原(100ng/ml)，并设阴性对照组，待新生软骨组织长满离心管底部后，转移至24孔培养板内继续培养，隔天更换培养基，到达预定培养时间(3、7及14天)后，收取标本进行各项检测。
2、组织学与组织化学检测：收集标本进行HE染色，免疫组织化学(S-P法)检测。
3、使用Hoechst 33258法测定软骨细胞DNA含量。
4、软骨细胞基质合成：除水分外，软骨细胞基质中最主要的成分是胶原和由糖胺聚糖与核心蛋白构成的蛋白多糖。通过对新生组织中胶原与蛋白多糖含量的测定，定量分析基质含量与代谢状况。
5、羟脯胺酸法测定软骨细胞胶原合成：由于羟脯胺酸在胶原中的比例相对恒定(约占胶原重量的10％)，因此可以通过定量羟脯胺酸以分析软骨细胞胶原的产量。严格按羟脯胺酸检测试剂盒说明书操作，并计算各样品的胶原含量。
二、实验结果
1、四胜肽GEKG对软骨细胞增生的影响：添加四胜肽GEKG对软骨细胞增生显著，其中软骨细胞DNA含量与对照组显示统计学的差异(图1)，该结果说明四胜肽GEKG可有效促进软骨细胞增生。
2、四胜肽GEKG对软骨细胞基质合成的影响：添加四胜肽GEKG显著促进胶原与蛋白多醣的合成且进一步有效促进软骨细胞增生，该结果与对照组有统计学的差异(图2及图3)。
藉此，可以理解本发明为一创意极佳的发明，除了有效解决现有问题，更大幅增进治疗功效，且在相同的技术领域中未见相同或近似的产品创作或公开使用，同时具有功效的增进。故本发明已符合发明专利有关「新颖性」与「创造性」的要件，乃依法提出申请发明专利。
Claims (3)
1.一种四胜肽GEKG在制备药物中的用途，其中该药物用于治疗病患的退化性关节炎，其中该经治疗的病患的关节液中SOD含量升高且NO和MDA含量降低，且该经治疗的病患的关节软骨细胞增生。
2.如权利要求1所述的用途，其中该药物呈锭剂、药片、丸剂、粉末、颗粒、凝胶、糊剂、贴片或水溶性缓冲液的形式。
3.如权利要求2所述的用途，其中该水溶性缓冲液为磷酸盐或柠檬酸盐的水溶液。
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