[go: up one dir, main page]

CN107663516B - 一种人神经干细胞培养基及应用 - Google Patents

一种人神经干细胞培养基及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107663516B
CN107663516B CN201711065847.8A CN201711065847A CN107663516B CN 107663516 B CN107663516 B CN 107663516B CN 201711065847 A CN201711065847 A CN 201711065847A CN 107663516 B CN107663516 B CN 107663516B
Authority
CN
China
Prior art keywords
neural stem
culture medium
human neural
stem cell
cell culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711065847.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107663516A (zh
Inventor
王娟
马静
辛文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing quanshijin Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
BEIJING TRANSGEN BIOTECH CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING TRANSGEN BIOTECH CO LTD filed Critical BEIJING TRANSGEN BIOTECH CO LTD
Priority to CN201711065847.8A priority Critical patent/CN107663516B/zh
Publication of CN107663516A publication Critical patent/CN107663516A/zh
Priority to PCT/CN2018/113675 priority patent/WO2019085993A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107663516B publication Critical patent/CN107663516B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种人神经干细胞培养基，所述培养基包括以下组分：基础培养基、营养添加剂、生长因子和信号通路调控小分子。本发明还公开了上述培养基在培养人神经干细胞的应用。本发明培养基配方简单，成本低廉，化学成分明确，不含动物源性成分，不含蛋白提取物和水解物，批次之间均一稳定，没有潜在引入动物源性和人源性病原微生物的风险，更加安全，可以应用在临床研究和临床实验人神经干细胞的培养中；另外，本发明首次将信号通路调控小分子应用到了人神经干细胞的培养中，在信号通路调控小分子的作用下，可以长期支持各种来源的人神经干细胞的快速增殖和干性的维持，成功解决了人神经干细胞在体外培养易分化和难以长期扩增的技术问题。

Description

一种人神经干细胞培养基及应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种人神经干细胞培养基及应用。
背景技术
各种神经损伤和退行性的神经系统疾病的发病率呈逐年上升趋势，传统的医学方法很难彻底治愈这类疾病，细胞替代性治疗是彻底治愈这类疾病潜在的最有效的手段。
神经干细胞具有自我复制能力和分化为神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突角质细胞等细胞类型的潜能，是疾病发病机制研究、药物筛选等的重要工具，也是神经退行性和损伤类疾病细胞替代性治疗的理想种子资源细胞。目前，已经有许多途径可以在体外获得神经干细胞，如从脑组织内原代分离培养获得，多能性干细胞诱导分化获得，体细胞转分化获得。
神经干细胞培养液一般由基础培养基、营养添加剂和生长因子组成，如专利CN103045538A、专利CN105296429A和专利CN1536073A。基础培养基负责提供细胞生长必须的无机盐、维生素、氨基酸、葡萄糖、有机物等物质，目前培养神经干细胞常用的基础培养基一般是商品化的DMEM/F12medium和Neurobasal medium。营养添加剂负责提供细胞生长必须的蛋白、激素、微量元素等成分，商售的N2和B27是比较常用的神经干细胞培养添。N2成分简单，只含有胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和硒酸钠五种成分，批次之间均一性比较好控制，但是由于缺乏一些细胞生长需求物，不能长期支持神经干细胞的生长。B27在支持神经干细胞生长方面效果较好，但是其成分复杂，含有动物提取蛋白-牛血清白蛋白，不仅批次之间稳定性难以控制，还会有潜在引入动物源性病原微生物的风险，为细胞替代性治疗带来了潜在的安全隐患。生长因子负责调控相关的信号通路来维持细胞的自我更新能力，目前培养神经干细胞常用的生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和上皮细胞生长因子(EGF)。但是人神经干细胞在目前已有的培养基中增殖能力有限，自发分化比较严重。
因此，需要提供一种新型的人神经干细胞培养基，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种人神经干细胞培养基，该培养基配方简单、成本低廉、化学成分明确，不含动物源性成分，不含蛋白提取物和水解物。
本发明的目的之二在于提供上述人神经干细胞培养基在培养人神经干细胞的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种人神经干细胞培养基，所述培养基包括以下组分：基础培养基、营养添加剂、生长因子和信号通路调控小分子；
进一步，所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和上皮细胞生长因子(EGF)，二者的最终使用浓度均为5-100ng/mL，优选的为6-50ng/mL，最优选的为10-30ng/mL。
所述信号通路调控小分子为Wnt信号通路激活剂、凋亡抑制小分子、p53信号通路抑制剂中的一种或几种组合；优选的，为Wnt信号通路激活剂和p53信号通路抑制剂一种或两种组合。
其中，
所述Wnt信号通路激活剂及最终使用浓度，可以是WNT3a，1-100ng/mL；6-BIO，1-20μM；CHIR-98014，0.1-20μM；TDZD-8，10-100μM；AZD1080，0.1-50μM；CHIR99021，0.1-20μM中的一种或者几种的组合。优选的，为WNT3a，1-100ng/mL或6-BIO，1-20μM；最优选的，为6-BIO，1-20μM。
所述凋亡抑制小分子及最终使用浓度，可以是Bax inhibitor peptide V5，0.1-100μM；iMAC2，0.01-100μM；Embelin，0.5-500μM中的一种或者几种的组合。优选的，为Baxinhibitor peptide V5,0.1-100μM和iMAC2，0.01-100μM中的一种或两种的组合；最优选的，为Bax inhibitor peptide V5,0.1-100μM。
所述p53信号通路抑制剂及最终使用浓度，可以是Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM；Cyclic Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM；Pifithrin-μ，0.1-100μM；SJ172550，0.5-500μM中的一种或几种的组合。优选的，为Cyclic Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM或Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM；最优选的，为Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM。
进一步，所述基础培养基为DMEM/F12medium、Neurobasal medium中的一种或两种；优选的，为体积比为1:1的DMEM/F12medium和Neurobasal medium混合培养基；
进一步，所述营养添加剂组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素0.1-20mg/L、维生素C 10-200mg/L、谷胱甘肽10-100mg/L、亚麻酸0.05-5mg/L、肉毒碱0.2-20mg/L、N-乙酰半胱氨酸5-500μM、乙醇胺0.01-10mg/L、亚油酸0.05-5mg/L。
优选的，所述营养添加剂的组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素0.5-15mg/L、维生素C 20-100mg/L、谷胱甘肽20-90mg/L、亚麻酸0.1-4mg/L、肉毒碱0.5-15mg/L、N-乙酰半胱氨酸10-400μM、乙醇胺0.05-8mg/L、亚油酸0.1-4mg/L。
最优选的，所述营养添加剂的组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素1-10mg/L、维生素C 30-80mg/L、谷胱甘肽30-80mg/L、亚麻酸1-3mg/L、肉毒碱1-10mg/L、N-乙酰半胱氨酸50-100μM、乙醇胺0.1-5mg/L、亚油酸1-3mg/L。
本发明还提供了上述人神经干细胞培养基在培养人神经干细胞中的应用。
另外，如无特殊说明，本发明所用到的试剂、组分均可通过市售商购获得，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
本发明的有益效果如下：
1、本发明培养基配方简单，成本低廉，化学成分明确，不含动物源性成分，不含蛋白提取物和水解物，因此批次之间均一稳定，没有潜在引入动物源性和人源性病原微生物的风险，更加安全，可以应用在临床研究和临床实验人神经干细胞的培养中。
2、本发明首次将信号通路调控小分子应用到了人神经干细胞的培养中，在信号通路调控小分子的作用下，可以长期支持各种来源的人神经干细胞的快速增殖和干性的维持，成功解决了人神经干细胞在体外培养易分化和难以长期扩增的技术问题。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出人神经干细胞在实验组和对照组培养基中培养10代后的形态图。
图2示出流式细胞术检测人神经干细胞分别在实验组和对照组培养基中培养10代后神经干细胞标志基因Nestin的表达比例。
图3示出人神经干细胞在实验组培养基中培养10代后Nestin免疫荧光染色图片。
图4示出人神经干细胞随机分化10天后免疫荧光检测神经元标志基因TUJ1和胶质细胞标志基因GFAP的表达情况。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明中实施例中所使用的基础培养基DMEM/F12medium和Neurobasal medium购自Life Technologies；生长因子bFGF和EGF购自Peprotech；其他材料均为本领域常用材料。
实施例1 人神经干细胞培养基
一种人神经干细胞培养基，所述培养基包括以下组分：
基础培养基(体积比)：50％DMEM/F12medium和50％Neurobasal medium。
营养添加剂：所述营养添加剂的组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素10mg/L、维生素C 50mg/L、谷胱甘肽50mg/L、亚麻酸1mg/L、肉毒碱20mg/L、N-乙酰半胱氨酸5μM、乙醇胺5mg/L、亚油酸1mg/L。
生长因子组成组分和其最终使用浓度：bFGF：20ng/mL；EGF：20ng/mL。
信号通路调控小分子组成组分和和其最终使用浓度：Pifithrin-αhydrobromide，5μM和6-BIO，2μM。
实施例2 人神经干细胞培养基
一种人神经干细胞培养基，所述培养基包括以下组分：
基础培养基(体积比)：50％DMEM/F12medium和50％Neurobasal medium。
营养添加剂：所述营养添加剂的组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素0.1mg/L、维生素C 10mg/L、谷胱甘肽10mg/L、亚麻酸0.05mg/L、肉毒碱0.2mg/L、N-乙酰半胱氨酸5μM、乙醇胺0.01mg/L、亚油酸0.05mg/L。
生长因子组成组分和其最终使用浓度：bFGF：5ng/mL；EGF：5ng/mL。
信号通路调控小分子组成组分和和其最终使用浓度：WNT3a，1ng/mL和Baxinhibitor peptide V5,0.1μM和Cyclic Pifithrin-αhydrobromide，0.1μM。
实施例3 人神经干细胞培养基
一种人神经干细胞培养基，所述培养基包括以下组分：
基础培养基(体积比)：50％DMEM/F12medium和50％Neurobasal medium。
营养添加剂：所述营养添加剂的组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素20mg/L、维生素C 200mg/L、谷胱甘肽100mg/L、亚麻酸5mg/L、肉毒碱20mg/L、N-乙酰半胱氨酸500μM、乙醇胺10mg/L、亚油酸5mg/L。
生长因子组成组分和其最终使用浓度：bFGF：100ng/mL；EGF：100ng/mL。
信号通路调控小分子组成组分和和其最终使用浓度：WNT3a，1ng/mL和Baxinhibitor peptide V5,100μM和Cyclic Pifithrin-αhydrobromide，100μM。
实施例4 人神经干细胞生物培养
1、人神经干细胞培养基
实验组所用的人神经干细胞培养基的配方同实施例1；
对照组所用的人神经干细胞培养基为实施例1的培养基减去信号通路调控小分子。
2、人神经干细胞的培养
2.1 PLO-Laminin培养皿的包被
将多聚鸟氨酸(PLO)用PBS稀释至15μg/mL，加入到待包被的培养皿中，加入的量请参考表1，37℃孵育2h或者4℃过夜，注意孵育过程中不要让培养皿的底部干掉。弃掉PLO，用PBS润洗两遍，DMEM/F12润洗一遍。将层黏连蛋白(Laminin)用DMEM/F12稀释至5μg/mL，加入到PLO包被过的培养皿中，加入的量请见表1，37℃孵育2h或者4℃过夜，注意孵育过程中不要让培养皿的底部干掉。
表1 包被培养皿所需的PLO和Laminin的量
培养皿规格 生长面积(cm<sup>2</sup>) 加入的量(mL)
6孔板 10cm<sup>2</sup>/well 1mL/well
12孔板 4cm<sup>2</sup>/well 0.4mL/well
24孔板 2cm<sup>2</sup>/well 0.2mL/well
35mm培养皿 10cm<sup>2</sup> 1mL
60mm培养皿 20cm<sup>2</sup> 2mL
100mm培养皿 60cm<sup>2</sup> 6mL
2.2 人神经干细胞的获得
采用将人多能性干细胞诱导分化获得人神经干细胞的方法。
其中人多能性干细胞分化为神经干细胞的培养基，配方如下：
基础培养基(体积比)：50％DMEM/F12medium和50％Neurobasal medium。
营养添加剂：同实施例1中营养添加剂的配方。
诱导分化的小分子：SB431542 10μM和LDN193189 100nM(为本领域内常用的诱导人多能性干细胞分化为神经干细胞的商售小分子)。
将人多能性干细胞诱导分化为神经干细胞的方法如下：
将生长状况良好的人多能性干细胞用Accutase消化成单细胞，按照105cells/mL的密度接种至事先包被好PLO-Laminin的培养皿中，并在人多能性干细胞分化为神经干细胞的培养基中培养4天，即可以获得Nestin阳性的神经干细胞。
2.3 人神经干细胞的培养
将人神经干细胞分别在实验组和对照组的培养液中进行培养，培养的步骤如下：
弃掉人多能性干细胞分化为神经干细胞的培养基，用PBS清洗一遍，加入适量的Accutase，加入的量以盖过细胞为宜，37℃消化3min，此时细胞呈现松散的贴壁状态，小心弃掉Accutase，用人神经干细胞培养基重新悬浮细胞，并进行细胞计数，按照105cells/mL的密度接种至事先包被好的培养皿中。
培养结果如图1-3所示，图1给出了人神经干细胞在实验组和对照组培养液中分别培养10代后的形态图，由此可以看出人神经干细胞在实验组人神经干细胞培养基中的生长状态要比对照组人神经干细胞培养基的好。图2给出了人神经干细胞在实验组和对照组人神经干细胞培养基中分别培养10代后人神经干细胞标志性基因Nestin的表达比例，培养10代后，在实验组培养基中，人神经干细胞Nestin的表达比例仍然在90％以上，而在对照组培养基中，Nestin的表达比例缺不足50％。由此可以看出，我们筛选出的信号通路调控小分子，在维持神经干细胞自我更新和干性维持方面具有重要的作用。图3给出了实验组人神经干细胞在实验组培养液中培养10代后人神经干细胞标志基因Nestin的免疫荧光染色图片。
实施例5 本发明培养得到的神经干细胞的分化能力试验
对神经干细胞进行分化，发现本发明培养的神经干细胞培养10代后仍具有分化成神经元和胶质细胞的潜能。
具体的方法如下：
1、神经干细胞随机分化培养液的配方如下：
DMEM/F12medium：49％；
Neurobasal medium：49％。
营养添加剂：配方同实施例1中的营养添加剂配方。
血清(Fetal Bovin Serum,FBS)：1％。
2、人神经干细胞在体外随机分化成神经元和胶质细胞的方法如下：
按照实施例4所述的方法将神经干细胞消化接种，接种后第2天给细胞换成神经干细胞随机分化培养液，以后隔日换液，直到培养到第10天，进行免疫荧光染色鉴定，结果如图4所示，从图4中可以看出人神经干细胞在本神经干细胞培养液培养10代后，随机分化10天后，仍然具有分化成神经元和胶质细胞的潜能。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (13)

1.一种人神经干细胞培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：基础培养基、营养添加剂、生长因子和信号通路调控小分子，其中，
所述基础培养基为DMEM/F12 medium、Neurobasal medium中的一种或两种；
所述营养添加剂组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素0.1-20mg/L、维生素C10-200mg/L、谷胱甘肽10-100mg/L、亚麻酸0.05-5mg/L、肉毒碱0.2-20mg/L、N-乙酰半胱氨酸5-500μM、乙醇胺0.01-10mg/L、亚油酸0.05-5mg/L；
所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和上皮细胞生长因子，二者的最终使用浓度均为5-100ng/mL；
所述信号通路调控小分子为Wnt信号通路激活剂和p53信号通路抑制剂；其中，所述Wnt信号通路激活剂及最终使用浓度为WNT3a，1-100ng/mL；6-BIO，1-20μM；CHIR-98014，0.1-20μM；TDZD-8，10-100μM；AZD1080，0.1-50μM；CHIR99021，0.1-20μM中的一种或者几种的组合；所述p53信号通路抑制剂及最终使用浓度为Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM；CyclicPifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM；Pifithrin-μ，0.1-100μM；SJ 172550，0.5-500μM中的一种或几种的组合。
2.根据权利要求1所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和上皮细胞生长因子，二者的最终使用浓度均为6-50ng/mL。
3.根据权利要求2所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和上皮细胞生长因子，二者的最终使用浓度均为10-30ng/mL。
4.根据权利要求1所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述Wnt信号通路激活剂及最终使用浓度为WNT3a，1-100ng/mL或6-BIO，1-20μM；所述p53信号通路抑制剂及最终使用浓度为Cyclic Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM或Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM。
5.根据权利要求1所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述Wnt信号通路激活剂及最终使用浓度为6-BIO，1-20μM；所述p53信号通路抑制剂及最终使用浓度为Pifithrin-αhydrobromide，0.1-100μM。
6.根据权利要求1所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述信号通路调控小分子还包括凋亡抑制小分子。
7.根据权利要求6所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述凋亡抑制小分子及最终使用浓度为Bax inhibitor peptide V5，0.1-100μM；iMAC2，0.01-100μM；Embelin，0.5-500μM中的一种或几种的组合。
8.根据权利要求6所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述凋亡抑制小分子及最终使用浓度为Bax inhibitor peptide V5,0.1-100μM和iMAC2，0.01-100μM中的一种或两种的组合。
9.根据权利要求6所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述凋亡抑制小分子及最终使用浓度为Bax inhibitor peptide V5,0.1-100μM。
10.根据权利要求1所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为体积比为1:1的DMEM/F12 medium和Neurobasal medium混合培养基。
11.根据权利要求1所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述营养添加剂的组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素0.5-15mg/L、维生素C 20-100mg/L、谷胱甘肽20-90mg/L、亚麻酸0.1-4mg/L、肉毒碱0.5-15mg/L、N-乙酰半胱氨酸10-400μM、乙醇胺0.05-8mg/L、亚油酸0.1-4mg/L。
12.根据权利要求1所述的人神经干细胞培养基，其特征在于，所述营养添加剂的组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素1-10mg/L、维生素C 30-80mg/L、谷胱甘肽30-80mg/L、亚麻酸1-3mg/L、肉毒碱1-10mg/L、N-乙酰半胱氨酸50-100μM、乙醇胺0.1-5mg/L、亚油酸1-3mg/L。
13.一种如权利要求1-12任一所述的人神经干细胞培养基在培养人神经干细胞中的应用。
CN201711065847.8A 2017-11-02 2017-11-02 一种人神经干细胞培养基及应用 Active CN107663516B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711065847.8A CN107663516B (zh) 2017-11-02 2017-11-02 一种人神经干细胞培养基及应用
PCT/CN2018/113675 WO2019085993A1 (zh) 2017-11-02 2018-11-02 一种人神经干细胞培养基及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711065847.8A CN107663516B (zh) 2017-11-02 2017-11-02 一种人神经干细胞培养基及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107663516A CN107663516A (zh) 2018-02-06
CN107663516B true CN107663516B (zh) 2020-08-25

Family

ID=61144323

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711065847.8A Active CN107663516B (zh) 2017-11-02 2017-11-02 一种人神经干细胞培养基及应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN107663516B (zh)
WO (1) WO2019085993A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663516B (zh) * 2017-11-02 2020-08-25 北京全式金生物技术有限公司 一种人神经干细胞培养基及应用
CN109652374A (zh) * 2019-02-27 2019-04-19 赛璟生物医药科技(上海)有限公司 一种用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基
CN110042079A (zh) * 2019-04-16 2019-07-23 深圳大学 一种用于培养间充质干细胞的培养基
CN113088492A (zh) * 2021-04-14 2021-07-09 山东水发生命科学研究有限公司 一种神经干细胞的培养基和培养方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8927276B2 (en) * 2010-02-17 2015-01-06 Cellin Technologies Oue Ex vivo progenitor and stem cell expansion and differentiation for use in the treatment of disease of the nervous system
EP3279318A4 (en) * 2015-03-30 2018-08-29 Ajinomoto Co., Inc. Human serum albumin-containing culture medium for growth of neural stem cells
CN104928247B (zh) * 2015-07-02 2018-03-23 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法
CN107201339A (zh) * 2017-06-28 2017-09-26 温州市鹿城区中津先进科技研究院 神经干细胞培养基
CN107663516B (zh) * 2017-11-02 2020-08-25 北京全式金生物技术有限公司 一种人神经干细胞培养基及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107663516A (zh) 2018-02-06
WO2019085993A1 (zh) 2019-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107663516B (zh) 一种人神经干细胞培养基及应用
CN109844102B (zh) 分化多能细胞的方法
Wang et al. L-Cysteine promotes the proliferation and differentiation of neural stem cells via the CBS/H2S pathway
Learish et al. Inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase blocks proliferation of neural progenitor cells
EP1144591A2 (en) Low oxygen culturing of cells
EP2360241A1 (en) Stem cells
Weibel et al. Chemically defined medium for rat astroglial cells in primary culture
Lee et al. Comparative biochemical, morphological, and immunocytochemical studies between C‐6 glial cells of early and late passages and advanced passages of glial cells derived from aged mouse cerebral hemispheres
CN111690595A (zh) 一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用
WO2019085992A1 (zh) 一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法
Erickson et al. Roles of insulin and transferrin in neural progenitor survival and proliferation
Isoda et al. Robust production of human neural cells by establishing neuroepithelial-like stem cells from peripheral blood mononuclear cell-derived feeder-free iPSCs under xeno-free conditions
Benzing et al. Neural conversion of human embryonic stem cell colonies in the presence of fibroblast growth factor-2
CN112779220B (zh) 一种用于神经干细胞扩增的培养基
A Baghbaderani et al. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials
WO2019085991A1 (zh) 一种诱导人多能性干细胞分化为脊髓运动神经前体细胞的方法
JP6981403B2 (ja) 神経分化能を亢進させる神経幹細胞用培地
AU2003302707B2 (en) Method for culturing neural stem cells using hepatocyte growth factor
CN114457016B (zh) 一种用于培养神经干细胞的无血清培养基及其用途
CN107760649B (zh) 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
Ghourichaee et al. The effect of hypoxia and laminin-rich substrates on the proliferative behavior of human neural stem cells
CN117355601A (zh) 神经突生长促进用试剂盒及其用途
Noviantari et al. Differentiation ability of rat‐mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue to neurons and glial cells
Fleischer‐Lambropoulos et al. Stimulation of glutamine synthetase activity by excitatory amino acids in astrocyte cultures derived from aged mouse cerebral hemispheres may be associated with non‐N‐methyl‐D‐aspartate receptor activation
US9428730B2 (en) Coatings and culture media for promoting neurogenesis in adipose tissue derived stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 100192 building 4, Tiandi Linfeng, No.1, yongtaizhuang North Road, Haidian District, Beijing

Patentee after: Beijing quanshijin Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 100192 building 4, Tiandi Linfeng, No.1, yongtaizhuang North Road, Haidian District, Beijing

Patentee before: BEIJING TRANSGEN BIOTECH Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder