CN107653231B

CN107653231B - 鸭源性冠状病毒弱毒株ibvdcv35及其应用

Info

Publication number: CN107653231B
Application number: CN201710897708.5A
Authority: CN
Inventors: 刘兴友; 陈明艳; 姚四新; 欧长波; 刘明成
Original assignee: Henan Institute of Science and Technology
Current assignee: Henan Institute of Science and Technology
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: CN107653231A

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体提供了一株鸭源性冠状病毒弱毒株IBV DCV35(保藏编号为CGMCC NO.13852)及其应用。所述鸭源性冠状病毒弱毒株IBV DCV35是由鸭源冠状病毒强毒株IBV ZZ2004(保藏编号为CGMCC NO.3842)传代致弱筛选得到，所述弱毒株IBV DCV35的S1基因序列发生明显变异，且变异后的序列能在第22～35代稳定遗传。本发明筛选的弱毒株IBV DCV35通过人工感染试验和水平传播试验进行SPF鸡感染，均未见毒力返强现象。实验表明，本发明的致弱毒株接种于鸡后，可有效激活鸡体内的免疫系统并对鸡传染性支气管炎有良好的预防作用，能用来作为预防鸡传染性支气管炎的疫苗毒。

Description

鸭源性冠状病毒弱毒株IBVDCV35及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一种鸭源性冠状病毒弱毒株。

背景技术

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)严重危害我国的养殖业，每年因鸡传染性支气管炎所导致的经济损失非常严重，而预防本病主要用的是弱毒疫苗，其中使用最为广泛的弱毒疫苗为H120和H52。但是由于IBV血清型众多，IBV基因组又容易变异，新的IB变异株不断出现，使得现有的疫苗对新出现的变异流行毒株不能产生有效的保护作用，导致IBV的防治变得困难。

IBV ZZ2004是从引起免疫抑制和生长抑制为主要症状的番鸭中分离到的一种病毒，该病毒能引起肉仔鸡发生类似的症状，发病率为80％，死亡率为10％以上，发病鸡群体重减轻37％左右，免疫力下降，经济损失达30％以上。鸭源性IBVZZ2004在致病性上与国内所报道的IBV存在明显的不同，引起显著的免疫抑制和生长抑制，且对鸡和鸭均能感染。IBVZZ2004毒株与国内流行的IBV亲缘性很低，与国内的主要疫苗株的亲缘性也很低，如M41株、H120、Beaudette、IBV4/91的同源性为85.2％～87.9％。该病毒分离株ZZ2004的分离和鉴定方法、致病性以及基因变异等相关特性都已经在发明专利ZL201010225577.4中有所展示，在生产实践中现有的疫苗对鸭源性IBVZZ2004不能产生有效的保护力，使得该病不断流行。从已获得研究资料看，鸭源性IBVZZ2004毒株的免疫原性良好，具备作为疫苗毒的基本要素。因此，有必要对其进行致弱研究，以期制备一株良好的弱毒株，为IBVZZ2004弱毒疫苗研发奠定基础。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种鸭源性冠状病毒弱毒株，并对其基因特征以及在传染性支气管炎预防方面的应用进行研究。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种鸭源性冠状病毒弱毒株IBV DCV35，经鉴定为鸭源性冠状病毒弱毒株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年05月27日，保藏编号为CGMCC No.13852。

所述鸭源性冠状病毒弱毒株IBV DCV35由鸭源冠状病毒强毒株IBV ZZ2004(保藏编号为CGMCC NO.3842，保藏日期为2010年04月29日)作为种子病毒，进行传代致弱而获得，具体过程为：

种子病毒接种鸡胚前先经56℃水浴20min，接种SPF鸡胚后，进行31～33℃低温培养，再用前述方法做同样处理，连续传至第25代，从第26代开始采用37℃培养，再连续传代至第35代，获得致弱毒株IBV DCV35。

本发明在传代过程中比较分析各代次病毒S1基因序列的变异情况，发现传至第22代时S1基因有12个碱基发生了变异，这种变异在传至第35代仍保持稳定。S1基因的12个变异位点分别是：188ntT→C(Val→Ala)，191ntA→G(Asn→Ser)，228ntT→G(Asn→Lys)，232ntA→C(Ser→Arg)、347ntT→A(Phe→Try)、351ntG→T(Arg→Ser)、360nt T→G(Ser→Arg)、454ntG→A(Valr→Ile)、471ntT→G(Ser→Arg)、560ntC→A(Thr→Lys)、1477ntT→C(Ser→Pro)、1497ntA→C(Gln→His)。

进一步，本发明通过EID50测定、SPF鸡致病力试验、同居感染试验和毒力返强试验来测定DCV35的致病性；通过该毒株接种SPF鸡、灭活毒株接种兔子和攻毒保护试验来测定DCV35的免疫原性。试验结果表明DCV35毒株对鸡胚适应性增强，对SPF鸡不具有致死性，同居只感染不发病，毒力不返强；同时DCV35免疫靶动物后，机体抗体水平升高，鸡的攻毒保护率也升高。

据此，本发明所述弱毒株IBV DCV35是经过特殊的致弱手段获得的，S1基因具有明显的遗传稳定性特征。

第二方面，基于本发明所筛选得到的鸭源性冠状病毒弱毒株IBVDCV35及其毒力优势，本发明进一步提供其在制备免疫试剂方面的应用。

具体体现为，一种弱毒疫苗或一种灭活疫苗。研究发现，将本发明所述弱毒株IBVDCV35直接免疫动物或者与免疫上可接受的载体混合从而获得的弱毒疫苗或者灭活疫苗，都能够显著提高动物机体的免疫能力。

附图说明

图1为原序列、7、15、20、22～25代碱基比对结果。

图2为原序列、7、15、20、22～25代氨基酸比对结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制，对本发明方法、步骤或者条件的修改或者替换，均属于本发明的范围。

实施例1低温培养诱导弱毒株

将ZZV6种子毒(EID₅₀为10-4.88/0.2mL)先经56℃水浴20min，用0.22um的细菌滤器过滤后，接种9日龄SPF鸡胚，每代接种5枚，每胚0.2mL，于31～32℃孵化。每日观察，24小时之内死亡的鸡胚弃之，死亡鸡胚暂放4℃冰箱，72小时无菌收取病毒，同时观察鸡胚的病变情况，选择典型病变鸡胚的尿囊液进行传代，每代均做同样处理和培养，连续传至第25代，从第26代开始采用37℃培养，再连续传至第35代获得DCV35。

实施例2传代病毒S1基因序列测定

在连续传代过程中选取第7代、第15代、第20～35代病毒，RT-PCR克隆S1基因，测定其核酸序列。S1基因引物：上游(P1)：5'-AGTTATTGGTTAGAGATGTTGGGGA-3'，下游(P2)：5'-CGTA TGG ACA GCT TGT GAC ATT TTC-3'。

应用DNASTAR分析软件将测序的第7、15、20、22～35代毒与母本毒的S1基因的碱基序列及推导氨基酸序列的差异，见表1，各代碱基和氨基酸比较分析结果见附录A和附录B。结果表明传至第22代时S1基因有12个碱基发生了变异，这种变异在传至第35代仍保持稳定。S1基因的12个变异位点分别是：188ntT→C(Val→Ala)，191ntA→G(Asn→Ser)，228ntT→G(Asn→Lys)，232ntA→C(Ser→Arg)、347ntT→A(Phe→Try)、351ntG→T(Arg→Ser)、360nt T→G(Ser→Arg)、454ntG→A(Val r→Ile)、471ntT→G(Ser→Arg)、560ntC→A(Thr→Lys)、1477ntT→C(Ser→Pro)、1497ntA→C(Gln→His)。

表1原序列和第7、15、20、22～25代S1基因变异的碱基和氨基酸

实施例3DCV35对SPF雏鸡的致病性试验

(1)DCV35EID₅₀测定取DCV35病毒液1mL用0.22um的无菌滤器过滤后，用生理盐水作10倍递增稀释，每个稀释度接种5枚9日龄的SPF鸡胚，0.2mL/每胚，37℃培养，每天观测记录死胚数，24小时之内死亡的鸡胚弃之，孵育至19日龄解剖剩余活胚，以死亡和侏儒胚作为感染的判定标准。用同剂量生理盐水接种9日龄的SPF鸡胚作为对照。以Reed-Muench二氏法计算EID₅₀。

结果表明：随着病毒传代次数的增加，病毒对SPF鸡胚的适应性越来越强，EID₅₀也随之升高，经Reed-Muench方法计算得到DCV35的EID₅₀为10^-6.75/0.2mL。

(2)DCV35人工感染SPF雏鸡39只5日龄SPF雏鸡，采用完全随机法将其分成3大组，第1和2组每组15只鸡，对照组9只鸡，将IBV ZZ2004第6代毒(10^4.88EID₅₀/0.2mL)、35代毒(10^6.75EID₅₀/0.2mL)经0.22μm的无菌过滤器过滤之后，经点眼、滴鼻途径分别接种第1组、第2组，每组接种2mL，第3组鸡注射同等剂量的生理盐水。自接种之日起，每日观察记录发病情况，对死亡鸡病变的鸡只进行剖检，观察死亡鸡病变。

结果如表2所示，DCV35毒株接种SPF鸡不发病，也不致死SPF鸡。

表2 IBV ZZ2004ZZV6和DCV35病毒对SPF雏鸡的致病力

(3)DCV35感染鸡同居感染试验用DCV35的病毒尿囊液经滴鼻、点眼接种5日龄SPF鸡4只，每只剂量不低于10^6.75EID₅₀/0.2mL，与同日龄的未接种病毒的健康SPF鸡4只同群饲养于同一SPF隔离器中，观察7天，记录鸡只的临床表现情况；7天后处死所有鸡只，对DCV35同群饲养的没有接种毒的鸡只脏器进行RT-PCR检测。

结果表明：5只接种过DCV35的SPF雏鸡与5只同日龄SPF鸡同群饲养7天，无一只发病。对同居的鸡只脏器进行RT-PCR检测结果均为阳性。

(4)DCV35毒力返强试验用DCV35代传代病毒液(10^6.75EID₅₀/0.2mL)接种5日龄SPF鸡5只，每只从接种之日起观察小鸡的发病情况，接种7天后扑杀，取其肾脏和气管加入生理盐水作1:2混合。研磨后，离心取上清液，经双抗处理后再接种SPF雏鸡5只，其为第二代，如此通过易感雏鸡连续传5代。并对每代的病毒作RT-PCR测定其是否带毒。

结果表明：病毒回归鸡体5代，每代回归均用RT-PCR检测其M基因是阳性，接种雏鸡却未见接种鸡只有任何临床表现，说明该致弱病毒的毒力稳定。

实施例4DCV35的免疫原性测定

(1)DCV35弱毒接种SPF鸡血清抗体检测将SPF鸡饲养于负压隔离器中，自由采食与饮水，并于15日龄时进行首次免疫，DCV35接种剂量为10^6.75EID₅₀/0.2mL。首次免疫后14天，每组鸡随机采取4只鸡的血，将采集的血样置于37℃的恒温箱中孵育2h，然后1000r/min离心10min，收集血清，分装于200uL的PCR管，-20℃保存，待使用间接ELISA方法检测鸡群血清中的抗体。

结果如表3所示：接种过DCV35毒株鸡只血清抗体在稀释比例为1:800时，P/N的值达到2.1，未接种的对照组鸡血清样品抗体检测均为阴性。

表3鸡群血清抗体产生水平

(2)DCV35弱毒免疫兔后血清抗体检测选择健康、体重在2.0kg左右的大白兔2只，首次免疫用灭活的病毒抗原—弗氏完全佐剂(FAC)制成的乳剂(灭活抗原浓度为2.4mg/mL，抗原：FAC体积为1:1)，颈背部皮下多点注射，0.2mL/每个部位，每只兔子注射1mL；两周后用不完全佐剂(FIC)制成的乳剂二免，剂量为1mL；两周后直接用第35代病毒进行加强免疫。三免后7天耳缘静脉采血，用间接ELISA检测其效价。

结果表明：使用本实验室保存的蛋白包板对DCV35弱毒3免后的兔子采血进行ELISA检测，DCV35免疫的兔子能产生很好的抗体，效价达到1:3200，见表4。

表4兔血清抗体水平

(3)攻毒保护试验14只SPF雏鸡，在5日龄和19日龄分别免疫DCV35，接种剂量为每只10^6.75EID₅₀/0.2mL。二免两周后使用ZZV6进行攻毒，每只鸡经滴鼻、点眼接种2mL(10^4.88EID₅₀)，同时设非免疫攻毒对照组。自攻毒之日起，每天观察、记录鸡群的发病、死亡情况，对死鸡进行剖检，观察病理变化，连续观察7天。

结果表明：DCV35毒株组鸡不发病，病死率为0，而非免疫组鸡发病，并出现死亡。其结果如表5。

表5 DCV35对SPF雏鸡的免疫保护力

Claims

1.一种鸭源性冠状病毒弱毒株IBV DCV35，其特征在于，保藏编号为：CGMCC NO.13852。

2.权利要求1所述的鸭源性冠状病毒弱毒株IBV DCV35在制备预防鸡传染性支气管炎的免疫药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫药物为疫苗。

4.一种弱毒疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的鸭源性冠状病毒弱毒株IBV DCV35制备。