CN107629122A - 鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白 - Google Patents
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Abstract
用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，以鱼皮为原料，通过添加处理剂预处理除去鱼皮中可溶性的非胶原蛋白，然后加入混合液进行脱脂，再加入鲶鱼内脏蛋白酶进行酶解，将酶解后的滤液加入氯化钠盐析，得到沉淀物，在沉淀物中加入醋酸溶解后，转入透析袋透析，倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得奶白色胶原蛋白，有益效果为：纯度高、杂质少，无色无味，具有提取时间短，得率高，且对环境污染较小等特点，对胶原蛋白损伤小，能获得具有良好生物活性的胶原蛋白，可适用于食品以及化妆品加工领域，实现了对鲶鱼鱼皮的增值利用，提高了鲶鱼的经济附加值。
Description
技术领域
本发明涉及水产品加工领域，尤其是涉及鱼皮胶原蛋白的提炼技术。
背景技术
随着生物化学的发展，人们对胶原蛋白的认识逐渐提高，从动物中提取不同组织中不同类型的胶原蛋白，其功能和作用也不同，胶原蛋白和免疫球蛋白一样，富有多样性和组织分布的特异性，是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白，随着水产养殖业和加工业的迅速发展，产生大量的下脚料鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉，其中鱼皮、鱼鳞大约占7.5%～10%，胶原蛋白占鱼皮、鳞原料的三分之一左右，如能充分利用，不仅可提高鱼类加工的附加值，同时可减少环境污染，获得良好的经济效益与社会效益，鱼皮中含有丰富的胶原，因此可将鱼皮加工成胶原和明胶及其附加产品，而胶原及其改性产物属生物高分子材料，可进一步加工成营养保健品、高级化妆品、食品、生物农药、生物肥料等，具有更高的经济价值。
现有技术如授权公告号为CN103131746B的中国发明专利，公开了一种带鳞鱼皮中胶原蛋白肽的提取方法，能够简化清洗和采用盐酸的步骤，减少用水量、降低成本。该方法按重量计，包括步骤：A：1份带鳞鱼皮中加入0.003-0.01份碳酸钠和2-3份水，搅拌，并排水，后加1-3份水清洗，得到脱脂的带鳞鱼皮；B：向脱脂的带鳞鱼皮中加入2-5份水，混合并粉碎，得到浆液；C：将所述浆液的温度调至50-65℃，并将所述浆液的pH值调至8-9，后加入0.001-0.004份蛋白酶，进行酶解，得到酶解的浆液；D：将所述酶解的浆液过滤得到清液，并向清液加入0.02-0.05份活性炭，搅拌后过滤，得到滤液和滤质；E：将所述滤液浓缩，喷雾干燥，得到胶原蛋白肽；但该方法提取的胶原蛋白纯度不高、效率低、操作不方便。 发明内容
本发明的目的在于提供一种提取纯度高、提取方便、活性稳定的鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，以鱼皮为原料，通过以下步骤得到:
粗处理：将鱼皮进行切块预处理，用其质量25-35倍的处理剂浸泡，用脱脂棉纱过滤，鱼皮用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，再在鱼皮中加入其质量的30-45倍倍的混合液于2-8℃浸泡12-18h，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，混合液成份为乙醚、异丙醇、蒸馏水，三者的含量比为2:2:8-10，处理剂为浓度1-2.5%NaCl和0.1-0.4mol/L的NaOH混合液，浸泡时长6-12h，在切块后的鱼皮中加入处理剂，增大处理剂与鱼皮的接触面积，加快反应速率，去除鱼皮中的肌原纤维，破坏鱼皮中的非胶原蛋白成分，使得鱼皮软化，杂蛋白析出。中性盐的加入还可以降低胶原水解，纯化胶原，能较好的将鱼皮中的胶原蛋白和杂蛋白分开，从而充分除去可溶性非胶原蛋白，得到较高的提取率；在鱼皮中加入混合液，使鱼皮中的脂肪溶解在混合液中，从而在浸泡过程中去除鱼皮多余脂肪，直至脂肪除尽，再用蒸馏水将其洗净沥干，使得到的鱼皮脱脂、去杂质，方便胶原蛋白的提取；
酶解：在脱脂后的碎鱼皮中加入鲶鱼内脏蛋白酶和蒸馏水，在50-65℃酶解6-7h,鱼皮、鲶鱼内脏蛋白酶、蒸馏水三者之间的重量体积比为1g:0.01-0.02g：5-10ml，酶解结束后，100-120℃灭酶8-12min，过滤，收集滤液；鲶鱼内脏蛋白酶使鱼皮细胞间的蛋白质的特定肽键水解从而使细胞离散，蛋白质特定肽键因弯曲变形并被活化水解，分别形成氨基和羧基，得到小分子多肽或氨基酸，从鱼皮细胞中释放出来，通过灭酶操作，使多余的鲶鱼内脏蛋白酶终止反应，防止酶解过度，过滤后得到含有胶原蛋白的滤液；
盐析：在收集的滤液中加入氯化钠盐析，使氯化钠终浓度达2.2-2.7mol/L，在4-9℃，11000-13000r/min下离心12-17min，弃上清，得到沉淀物；通过将胶原蛋白滤液与氯化钠混合、离心，得到盐析沉淀物，该步骤中加入的氯化钠，使胶原蛋白的溶解度降低而沉淀析出，上述方法优点在于氯化钠盐析沉淀效果好，节约能耗；
透析：将沉淀以0.2-0.8mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出，倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得奶白色胶原蛋白；上述透析过程是将与沉淀物溶解的醋酸液装入含有蒸馏水的透析袋中，密封进行透析，将透析袋中的胶原蛋白溶液冷却处理后，即得奶白色胶原蛋白，上述方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到分离小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗。
作为优选，鲶鱼内脏蛋白酶含有0.1-0.5%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为SCASRYGRRCRAGRCKRAGGYACRCRSFAGRGRCKCFRC；鲶鱼内脏蛋白酶中添加的活性多肽，可以提高蛋白的可溶性，暴露酶切位点，有利于蛋白酶的接近，可选择性切除非螺旋的端肽而溶解出胶原分子，而胶原蛋白的三股螺旋结构在酶解时具有较高的稳定性，不易被切除，从而显著提高胶原的得率。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提取的胶原蛋白，黏度高、杂质少，无色无味，具有提取时间短，得率高，且对环境污染较小等特点，对胶原蛋白损伤小，保留了较完整的纤维网络结构，三螺旋结构完整，能获得具有良好生物活性的胶原蛋白，可适用于食品以及化妆品加工领域，实现了对鲶鱼鱼皮的增值利用，提高了鲶鱼的经济附加值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，以鱼皮为原料，鱼皮胶原蛋白的制备方法包括粗处理、酶解、盐析、透析，具体步骤为：
1）粗处理：将鱼皮进行切块预处理，用其质量25-35倍的处理剂浸泡，用脱脂棉纱过滤，鱼皮用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，再在鱼皮中加入其质量的30-45倍倍的混合液于2-8℃浸泡12-18h，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，混合液成份为乙醚、异丙醇、蒸馏水，三者的含量比为2:2:8-10，处理剂为浓度1-2.5%NaCl和0.1-0.4mol/L的NaOH混合液，浸泡时长6-12h，在切块后的鱼皮中加入处理剂，增大处理剂与鱼皮的接触面积，加快反应速率，去除鱼皮中的肌原纤维，破坏鱼皮中的非胶原蛋白成分，使得鱼皮软化，杂蛋白析出。中性盐的加入还可以降低胶原水解，纯化胶原，能较好的将鱼皮中的胶原蛋白和杂蛋白分开，从而充分除去可溶性非胶原蛋白，得到较高的提取率；在鱼皮中加入混合液，使鱼皮中的脂肪溶解在混合液中，从而在浸泡过程中去除鱼皮多余脂肪，直至脂肪除尽，再用蒸馏水将其洗净沥干，使得到的鱼皮脱脂、去杂质，方便胶原蛋白的提取；
2）酶解：在脱脂后的碎鱼皮中加入鲶鱼内脏蛋白酶和蒸馏水，在50-65℃酶解6-7h,鱼皮、鲶鱼内脏蛋白酶、蒸馏水三者之间的重量体积比为1g:0.01-0.02g：5-10ml，酶解结束后，100-120℃灭酶8-12min，过滤，收集滤液；鲶鱼内脏蛋白酶使鱼皮细胞间的蛋白质的特定肽键水解从而使细胞离散，蛋白质特定肽键因弯曲变形并被活化水解，分别形成氨基和羧基，得到小分子多肽或氨基酸，从鱼皮细胞中释放出来，通过灭酶操作，使多余的鲶鱼内脏蛋白酶终止反应，防止酶解过度，过滤后得到含有胶原蛋白的滤液；
3）盐析：在收集的滤液中加入氯化钠盐析，使氯化钠终浓度达2.2-2.7mol/L，在4-9℃，11000-13000r/min下离心12-17min，弃上清，得到沉淀物；通过将胶原蛋白滤液与氯化钠混合、离心，得到盐析沉淀物，该步骤中加入的氯化钠，使胶原蛋白的溶解度降低而沉淀析出，上述方法优点在于氯化钠盐析沉淀效果好，节约能耗；
4）透析：将沉淀以0.2-0.8mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出，倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得奶白色胶原蛋白；上述透析过程是将与沉淀物溶解的醋酸液装入含有蒸馏水的透析袋中，密封进行透析，将透析袋中的胶原蛋白溶液冷却处理后，即得奶白色胶原蛋白，上述方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到分离小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗。
鲶鱼内脏蛋白酶含有0.1-0.5%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为SCASRYGRRCRAGRCKRAGGYACRCRSFAGRGRCKCFRC；鲶鱼内脏蛋白酶中添加的活性多肽，可以提高蛋白的可溶性，暴露酶切位点，有利于蛋白酶的接近，可选择性切除非螺旋的端肽而溶解出胶原分子，而胶原蛋白的三股螺旋结构在酶解时具有较高的稳定性，不易被切除，从而显著提高胶原的得率。
实施例2：
用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，以鱼皮为原料，其制备方法包括以下步骤：
1）粗处理：将鱼皮进行切块预处理，用其质量25倍的处理剂浸泡，用脱脂棉纱过滤，鱼皮用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，处理剂为浓度2.2%NaCl和0.2mol/L的NaOH，浸泡时长8h；再在鱼皮中加入其质量的30倍的混合液于8℃浸泡12h，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，混合液成份为乙醚、异丙醇、蒸馏水，三者的含量比为2:2:8；
2）酶解：在在脱脂后的碎鱼皮中加入鲶鱼内脏蛋白酶和蒸馏水，在50℃酶解6h,鱼皮、鲶鱼内脏蛋白酶、蒸馏水三者之间的重量体积比为1g:0.01g：5ml，酶解结束后，100℃灭酶8min，过滤，收集滤液；
3）盐析：在收集的滤液中加入氯化钠盐析，使氯化钠终浓度达2.3mol/L，在4℃，12000r/min下离心12min，弃上清，得到沉淀物；
4）透析：将沉淀以0.2mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出，倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得奶白色胶原蛋白。
鲶鱼内脏蛋白酶含有0.2%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为SCASRYGRRCRAGRCKRAGGYACRCRSFAGRGRCKCFRC。
实施例3：
用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，以鱼皮为原料，包括以下步骤：
1）粗处理：将鱼皮进行切块预处理，用其质量26倍的处理剂浸泡，用脱脂棉纱过滤，鱼皮用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，处理剂为浓度2.3%NaCl和0.3mol/L的NaOH，浸泡时长9h；再在鱼皮中加入其质量的36倍的混合液于7℃浸泡12-18h，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干，混合液成份为乙醚、异丙醇、蒸馏水，三者的含量比为2:2:10；
2）酶解：在脱脂后的碎鱼皮中加入鲶鱼内脏蛋白酶和蒸馏水，在65℃酶解7h,鱼皮、鲶鱼内脏蛋白酶、蒸馏水三者之间的重量体积比为1g:0.02g:10ml，酶解结束后，20℃灭酶12min，过滤，收集滤液；
3）盐析：在收集的滤液中加入氯化钠盐析，使氯化钠终浓度达2.5mol/L，在4℃，12500r/min下离心14min，弃上清，得到沉淀物；
4）透析：将沉淀以0.3mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出，倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得奶白色胶原蛋白；
鲶鱼内脏蛋白酶含有0.25%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为SCASRYGRRCRAGRCKRAGGYACRCRSFAGRGRCKCFRC；
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宁波市鄞州区超锐食品科技有限公司
<120> 用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工合成(Mytilus coruscus)
<400> 1
Ser Cys Ala Ser Arg Tyr Gly Arg Arg Cys Arg Ala Gly Arg Cys Lys
1 5 10 15
Arg Ala Gly Gly Tyr Ala Cys Arg Cys Arg Ser Phe Ala Gly Arg Gly
20 25 30
Arg Cys Lys Cys Phe Arg Cys
35
Claims (5)
1.用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，其特征在于：所述的用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白以鱼皮为原料，通过以下步骤得到:
1）粗处理：将鱼皮进行切块预处理，用其质量25-35倍的处理剂浸泡，用脱脂棉纱过滤，鱼皮用蒸馏水反复洗涤，充分沥干,再在鱼皮中加入其质量的30-45倍倍的混合液于2-8℃浸泡12-18h，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干；
2）酶解：在脱脂后的碎鱼皮中加入鲶鱼内脏蛋白酶和蒸馏水，在50-65℃酶解6-7h,酶解结束后，100-120℃灭酶8-12min，过滤，收集滤液；
3）盐析：在收集的滤液中加入氯化钠盐析，使氯化钠终浓度达2.2-2.7mol/L，在4-9℃，11000-13000r/min下离心12-17min，弃上清，得到沉淀物；
4）透析为：将沉淀以0.2-0.8mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出，倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得奶白色胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，其特征在于：所述酶解步骤中鲶鱼内脏蛋白酶含有0.1-0.5%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为SCASRYGRRCRAGRCKRAGGYACRCRSFAGRGRCKCFRC。
3.根据权利要求1所述的用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，其特征在于：所述脱脂步骤中混合液成份为乙醚、异丙醇、蒸馏水，三者的含量比为2:2:8-10。
4.根据权利要求1所述的用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，其特征在于：所述预处理步骤中处理剂为浓度1-2.5%NaCl和0.1-0.4mol/L的NaOH混合液，浸泡时长6-12h。
5.根据权利要求1所述的用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白，其特征在于：所述酶解步骤中鱼皮、鲶鱼内脏蛋白酶、蒸馏水三者之间的重量体积比为1g:0.01-0.02g：5-10ml。
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