CN107622185B - 一种数字pcr浓度计算方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种数字PCR浓度计算方法，根据PCR扩增过程中实时荧光定量曲线的扩增周期Ct值并结合实时聚类方法，确定计算反应物初始浓度的计算方法。荧光阈值R₁₁与每个阳性反应单元扩增曲线在指数增长期都有一个交点，该交点对应相应的扩增周期值Ct_i。根据Ct_i进行聚类，获得k个聚类，每个聚类对应的中心值从大到小依次为M₁，M₂，……，M_k；并得到每个聚类中包含Ct_i的数量为S_j。通过M_j和S_j计算每个聚类中的靶基因个数并累加每个聚类中靶基因的个数最终得到初始靶基因的浓度值。

Description

一种数字PCR浓度计算方法

技术领域

本发明涉及一种数字PCR浓度计算方法。

背景技术

数字PCR是把荧光定量反应体系均匀地分配到大量微小的反应单元中，每个微小反应单元中不包含或包含一个到多个目标基因片段。扩增结束后，含有目标基因片段的产生阳性检测信号，而不含有目标基因的不产生检测信号，通过终点荧光信号判断的阳性反应单元的数量所占总的反应单元的比率和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。

基于泊松分布的数字PCR对基因浓度的定量测量可以具有非常高的精度，对于未知样本动态范围内稀释度下的测量精度不能保障。本发明根据PCR扩增过程中实时荧光定量曲线的扩增周期Ct值并结合实时聚类方法，确定计算反应物初始浓度，提高了PCR实验中计算反应物初始浓度的精确度，且拓宽了满足精度要求的浓度检测范围。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种数字PCR浓度计算方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种数字PCR浓度计算方法，该方法根据PCR扩增过程中实时荧光定量曲线的扩增周期Ct值并结合实时聚类方法，确定计算反应物初始浓度。进一步地，采用实时聚类浓度计算方法计算反应物初始浓度C，具体为：

(1)荧光阈值R₁₁与每个阳性反应单元扩增曲线在指数增长期都有一个交点，该交点对应相应的扩增周期值Ct_i。根据Ct_i进行聚类，获得k个聚类，每个聚类对应的中心值从大到小依次为M₁，M₂，……，M_k；第j个聚类中包含的扩增周期值Ct_i的数量为Sj。

其中，荧光阈值R₁₁为至少包含3～20个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期。或为第C_n个周期的荧光强度值，第C_n个周期的荧光强度值满足：

其中C_n代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。

(2)计算扩增效率平均值：

η_i为第i个反应单元的反应效率，n为反应单元个数，

其中，荧光阈值R₂₂不等于R₁₁，荧光阈值R₂₂为至少包含3～20个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期。或为第C_n个周期的荧光强度值，第C_n个周期的荧光强度值满足：

其中C_n代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。

R_B为本底荧光值，c_i1,c_i2分别为是荧光阈值R11、R22与第i个反应单元的扩增曲线的交点所对应的扩增周期，c₂>c₁。

(3)反应物初始浓度C为：

本发明的有益效果在于：本发明根据PCR扩增过程中实时荧光定量曲线的扩增周期Ct值并结合实时聚类方法，来计算反应物初始浓度。本发明提高了PCR实验中计算反应物初始浓度的精确度，且拓宽了满足精度要求的浓度检测范围。

附图说明

图1为各反应单元的实时荧光曲线图和荧光阈值R11和R22。

图2为采用实时聚类浓度计算方法的聚类结果。

具体实施方式

基于实时聚类浓度计算方法采用多反应点检测，对反应点进行实时监测，每个反应周期内都进行数据检测。检测反应点的数据表达可以是光强、分子数、核酸数、蛋白数等具有表达分子或单一核酸或蛋白数的可以量化的一些物理或化学量。这种检测是一种动态的检测，从反应开始至反应结束都进行反应点数据检测。每个反应点的多周期检测的数据都要对应的存储起来，然后在反应扩增结束后绘制反应点的扩增曲线图，该扩增曲线图一般以荧光扩增曲线图为主。

反应单元中初始靶基因个数相差很小时，在扩增反应结束后终点荧光值的大小是很难区分荧光值大小差异不明显。在每个反应单元的实时扩增曲线的指数期对初始靶基因的个数是比较敏感的，可以通过检测该区段的扩增周期Ct值明显的区分开来。首先选取两个阈值R11、R22，R11<R22，荧光阈值R11、R22缺省设置至少包含3～20个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期。或为第C_n个周期的荧光强度值，第C_n个周期的荧光强度值满足：

其中C_n代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。

荧光阈值R11与每个阳性反应单元扩增曲线在指数增长期都有一个交点，对应相应的扩增周期Cti。根据Cti进行聚类，获得k个聚类，每个聚类对应的中心值从大到小依次为M1，M2，……，Mk；第j个聚类中包含的扩增周期值Cti的数量为Sj。由于反应单元通常为数万个，可以通过以下方法进行聚类：

对阳性反应单元进行编号，140个为一组，编号i分别为1到140，可以得到M组Cti。把M组Cti放到同一个图表中，如图2所示。含有相同初始靶基因个数的反应单元，对应的扩增周期Cti会聚集在一起。

聚类是将物理或抽象对象的集合分成相似的对象类的过程。使得同一个簇中的对象之间具有较高的相似性，而不同簇中的对象具有较高的相异性。簇是数据对象的集合，这些对象与同一簇中的对象彼此相似，而与其他簇的对象相异。假设所有的反应单元初始靶基因含量只有k种，则通过数据挖掘聚类算法，可以求出k个聚类集及相对应的中心Mj和每个聚类集包含的点数Sj(j＝1,2,3...k)。图2所示，中心值越大的聚类，其包含的靶基因个数越少，而反应单元中，初始靶基因个数是泊松分布，依次逐个递增。在正常的可测范围之内，中心值最大的聚类，其包含的反应单元的初始靶基因个数为1，随着聚类的中心值逐渐递减，其中包含的反应单元的初始靶基因个数逐个递增。

误差平方和准则：若Sj是第j个簇c_j中的对象数目，m_j是这些对象的均值，O是簇c_j中的一个点即：

误差平方和准则J就是所有簇的簇中各个对象与均值间误差平方和之和，即：

以k为参数，把n个对象分成k个簇，使簇内具有较高的相似度，而簇间的相似度较低。处理过程如下：首先，随机地选择k个对象，每个对象初始地代表了一个簇的平均值或中心；对剩余的每个对象，根据其与各簇中心的距离，将它赋给最近的簇；然后重新计算每个簇的平均值。这个过程不断重复，直到准则函数J收敛。

使用扩增周期聚类方法，最终可以得到含有一个靶基因的扩增周期M1，两个靶基因的扩增周期M2，以此类推得到含k个靶基因的扩增周期MK。PCR反应单元中的反应溶液是来源于同一初始反应液，可以认为在每个扩增周期内每个反应单元中靶基因的扩增效率η_i是相同的。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间才存在线性对应关系，在此阶段进行定量计算才是准确的。只要满足公式1都可以看做是有效的扩增曲线指数增长期。

如图1所示，分别取荧光阈值R11和R22。

其中X₀代表该条扩增曲线的反应单元初始靶基因个数，c_i1,c_i2分别为是荧光阈值R11、R22与第i个反应单元的扩增曲线的交点所对应的扩增周期。R_B为本底荧光值，R_S为每个目标分子的荧光值。

由公式(2)、(3)得到：

可以得到平均扩增效率：

基于此点，图1所示在扩增周期最后所对应的一条或一簇扩增曲线代表初始溶液中只含有一个靶基因。取R11和该曲线的交点对应的扩增周期为Ct₁，Ct₁代表通过聚类得到的结果。

其中X_j指第j个聚类集中每个阳性反应单元中初始靶基因平均个数。由公式(6)、(7)得到第j个聚类集中靶基因的总个数：

XX_j＝S_j*X_j (8)

由公式8可以得到初始反应液靶基因的浓度C：

其中V代表反应单元中反应液的总体积。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

利用上述方法和常规方法对八组不同模板浓度的PCR芯片进行分析对比，结果如下表所示：

PCR扩增完后，通过常规方法计算得到的结果和采用本发明的方法得到的结果进行对比，发现采用本发明方法得到的靶基因浓度值更接近原始靶基因浓度真实值，大大提高了PCR实验中计算反应物初始浓度的精确度，且拓宽了满足精度要求的浓度检测范围。

Claims (1)

1.一种数字PCR浓度计算方法，其特征在于，该方法根据PCR扩增过程中实时荧光定量曲线的扩增周期Ct值并结合实时聚类方法，确定计算反应物初始浓度；

所述数字PCR浓度计算方法，包括以下步骤：

(1)确定两个荧光阈值R11、R22，R11<R22，荧光阈值R11、R22缺省设置包含3～20个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期；或为第C_n个周期的荧光强度值，第C_n个周期的荧光强度值满足：

其中C_n代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值；

(2)荧光阈值R₁₁与每个阳性反应单元扩增曲线在指数增长期都有一个交点，该交点对应相应的扩增周期值Ct_i；根据Ct_i进行聚类，获得k个聚类，每个聚类对应的中心值从大到小依次为M₁，M₂，……，M_k；第j个聚类中包含的扩增周期值Ct_i的数量为Sj；

(3)计算扩增效率平均值：

η_i为第i个反应单元的反应效率，n为反应单元个数，

R_B为本底荧光值，c_i1,c_i2分别为是荧光阈值R11、R22与第i个反应单元的扩增曲线的交点所对应的扩增周期，c₂＞c₁；

(4)反应物初始浓度C为：

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