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CN107614693A - 使用裸藻生产有机酸的方法 - Google Patents

使用裸藻生产有机酸的方法 Download PDF

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CN107614693A
CN107614693A CN201680026829.6A CN201680026829A CN107614693A CN 107614693 A CN107614693 A CN 107614693A CN 201680026829 A CN201680026829 A CN 201680026829A CN 107614693 A CN107614693 A CN 107614693A
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acid
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平井优美
饭岛宽子
中谷由佳
铃木健吾
岩田修
中岛绫香
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Youluna Co Ltd
RIKEN
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Abstract

本发明的课题在于：提供一种利用藻类生物量生产有机酸的方法。本发明涉及通过下述方法使用裸藻生产琥珀酸等有机酸，所述方法包括如下步骤：将裸藻在缺氮条件下进行需氧培养的缺氮培养步骤或者将裸藻用含碳源的培养基进行需氧培养的异养培养步骤的任一个步骤；以及厌氧培养步骤，在厌氧条件下培养通过缺氮培养步骤获得的培养产物。

Description

使用裸藻生产有机酸的方法
技术领域
本发明涉及使用裸藻(Euglena)生产作为聚丁二酸丁二醇酯(polybutylenesuccinate，PBS)的原料等有用的琥珀酸所代表的有机酸的方法、以及通过该方法获得的裸藻的培养产物。
背景技术
作为代替现有的石油系塑料的新的塑料原材料，以生物量(biomass)为原料的生物量塑料、以及在自然界利用微生物的作用降解的生物降解性塑料的研究开发近年来正在进行。作为具有生物量塑料和生物降解性塑料两者的性质的生物降解性生物量塑料，例如已知有聚乳酸(polylactic acid，PLA)、淀粉树脂、多羟基烷酸酯(多羟基脂肪酸酯，polyhydroxy alkanoate，PHA)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等。
PBS是由琥珀酸和1,4-丁二醇通过缩合反应合成的，作为有用性高的生物降解性生物量塑料而已知。原料琥珀酸以往是以石油为原料合成的，但最近还使用来自玉米或甘蔗等的糖质，通过异养细菌的发酵来进行生产等。然而，以食物系植物为原料时，与食物和饲料用需求产生竞争，在稳定供给方面存在问题。因此，优选以不会与现存的食物生产发生竞争的生物量为原料生产琥珀酸。
作为该生物量，近年来藻类备受关注。其中，已知裸藻(Midorimushi，ミドリムシ)具有通过光合成生产各种化合物的能力，还可用于燃料生产。例如，专利文献1中公开了：含有高浓度的作为生物燃料的原料的蜡酯的裸藻的生产方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-153730号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
迄今为止，虽然对各种藻类进行了研究，但尚未发现大量产生琥珀酸等有机酸的藻类的种类和培养条件等。本发明的目的在于：提供一种通过藻类生产琥珀酸等有机酸的方法。
用于解决课题的手段
本发明人研究了各种藻类，结果发现：在缺氮条件下、或者使用含有有机或无机碳源的培养基在异养条件下培养裸藻，之后在厌氧条件下进行培养，从而得到了含有大量有机酸的培养产物。本发明的要点如下。
(1) 使用裸藻生产有机酸的方法，该方法包括如下步骤：缺氮培养步骤，在缺氮条件下对裸藻进行需氧培养；以及厌氧培养步骤，将通过缺氮培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养。
(2) (1)所述的方法，其中，缺氮培养步骤进行3天以上。
(3) 使用裸藻生产有机酸的方法，该方法包括如下步骤：异养培养步骤，使用含有碳源的培养基对裸藻进行需氧培养；以及厌氧培养步骤，将通过异养培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养。
(4) (1)～(3)中任一项所述的方法，该方法还包括如下步骤：从厌氧培养步骤的培养产物中取出含有有机酸的培养液。
(5) (1)～(4)中任一项所述的方法，该方法还包括如下步骤：在厌氧培养步骤前，将缺氮培养步骤或异养培养步骤的培养产物中所含的裸藻细胞体浓缩。
(6) (1)～(5)中任一项所述的方法，其中，裸藻为野生型裸藻。
(7) (1)～(6)中任一项所述的方法，其中，有机酸为琥珀酸。
(8) 培养产物，该培养产物是培养裸藻而获得的，其中以100mg/L以上的浓度含有裸藻所产生的有机酸。
(9) (8)所述的培养产物，其中，有机酸为琥珀酸。
(10) (8)或(9)所述的培养产物，该培养产物是在培养裸藻之后获得的培养液。
(11) (8)～(10)中任一项所述的培养产物，该培养产物是通过包括如下步骤的方法培养裸藻而获得的：缺氮培养步骤，将裸藻在缺氮条件下进行3天以上的需氧培养；以及厌氧培养步骤，将通过缺氮培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养。
(12) (8)～(10)中任一项所述的培养产物，该培养产物是通过包括如下步骤的方法培养裸藻而获得的：异养培养步骤，使用含有碳源的培养基对裸藻进行需氧培养；以及厌氧培养步骤，将通过异养培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养。
(13) (8)～(12)中任一项所述的培养产物，其中上述裸藻为野生型。
(14) 裸藻细胞体，其是通过包括如下步骤的方法获得的：缺氮培养步骤，将裸藻在缺氮条件下进行3天以上的需氧培养；厌氧培养步骤，将通过缺氮培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养；以及从通过厌氧培养步骤获得的培养产物中采集裸藻细胞体的步骤。
(15) 裸藻细胞体，其是通过包括如下步骤的方法获得的：异养培养步骤，使用含有碳源的培养基对裸藻进行需氧培养；厌氧培养步骤，将通过异养培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养；以及从通过厌氧培养步骤获得的培养产物中采集裸藻细胞体的步骤。
发明效果
根据本发明，可以利用作为藻类生物量的裸藻生产作为PBS等的原料有用的琥珀酸所代表的有机酸。另外，在生产有机酸的同时，还可获得有用的裸藻细胞体。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本特愿2015-095993号的说明书、权利要求书和附图中记载的内容。
具体实施方式
本发明的方法的特征在于包括如下步骤：在缺氮条件下对裸藻进行需氧培养的缺氮培养步骤或使用含有碳源的培养基对裸藻进行需氧培养的异养培养步骤的任一个步骤；以及将通过该步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养的厌氧培养步骤。作为目标化合物的琥珀酸等有机酸包含在通过厌氧培养步骤获得的培养产物中。需要说明的是，在本说明书中，“培养产物”是指包含培养裸藻而获得的全部产物的概念。更具体而言，在装入培养槽中的培养液中培养裸藻时，培养产物是指包含含裸藻细胞体和裸藻所产生的物质的培养液的全部、即培养槽的全部内容物的概念。
裸藻(Euglena、日文名：ミドリムシ)是属于裸藻属的微生物的总称。裸藻是指具有运动性的藻类，已知其大多数兼具进行鞭毛运动的动物的性质和具有叶绿体进行光合成的植物的性质这两种性质。作为裸藻的具体例子，可以列举：梭形裸藻(Euglena acus)、尾裸藻(Euglena caudata)、Euglena chadefaudii、静裸藻(Euglena deses)、纤细裸藻(Euglena gracilis)、颗粒裸藻(Euglena granulata)、中型裸藻(Euglena intermedia)、易变裸藻(Euglena mutabilis)、尖尾裸藻(Euglena oxyuris)、近轴裸藻(Euglena proxima)、旋纹裸藻(Euglena spirogyra)、绿裸藻(Euglena viridis)、Euglena vermiformis等。其中，在本发明的方法中，可以适当使用以往广泛用于研究的纤细裸藻(Euglena gracilis)。
当使用未进行基因重组的野生型裸藻时，在培养时不必考虑其与自然界的基因杂交等，因此即使在室外也可以培养裸藻，可以抑制培养所花费的成本，因此优选。然而，并不限于此，当想要产生大量的琥珀酸等有机酸时，可以使用进行了基因重组的裸藻。
(缺氮培养步骤和异养培养步骤)
在缺氮培养步骤中，在缺氮条件下例如使用缺氮培养基对裸藻进行需氧培养。在缺氮条件下进行培养时，虽然利用了当初蓄积在裸藻细胞体中的氮源，但将其全部同化后，裸藻会陷入缺氮状态。认为裸藻是根据其应力产生琥珀酸等有机酸并将其蓄积在细胞体内。缺氮培养期间为3天以上，特别是设为4天以上、尤其是5天以上、进一步为6天以上时，认为会蓄积更多的有机酸，因此优选。
使用了缺氮培养基的裸藻的需氧培养条件可以采用以往的裸藻培养方法中已知的条件。为了有效生长，培养温度通常优选设为20～34℃的范围内。另外，优选在培养基中吹入空气，特别是由于裸藻同化CO2，所以更优选在培养基中吹入含有1～5%的CO2的空气。需氧培养优选在光照射下(明亮条件下)进行，更优选在明暗循环、特别是遵循昼夜节律的明暗循环条件下(例如12小时明暗循环)进行。明亮条件下的光强度优选设为30～200μmol m- 2s-1的范围。培养基的pH优选设为3～8的范围。
在裸藻的培养中，例如可以使用将Cramer-Myers培养基(CM培养基)、Hutner培养基、以及Koren-Hutner培养基、AY培养基等公知的培养基的一部分组成变更后的改良培养基。培养基的改良包括除去氮源以形成缺氮条件。例如，当为CM培养基时，通过从组成中除去磷酸铵((NH4)2HPO4)，可以形成缺氮条件。需要说明的是，缺氮条件是指培养基中的氮浓度以N原子换算计为0.1mmol/L以下、特别是0.01mmol/L以下的状态。
用于培养裸藻的培养基的改良还可包括：追加促进裸藻增殖的营养源、或者像作为有机酸的生物合成原料的这样的碳源。裸藻的培养可以使用追加了碳源的培养基，在完全异养条件下、或者可结合使用光合成和追加到培养基中的碳源的条件下(在本说明书中，这样的结合使用光合成的条件也包含在异养条件的概念中)进行。通过在异养条件下进行裸藻的培养，与在自养条件下进行培养时相比，蓄积了更多的有机酸。上述的缺氮培养步骤可以替换成在异养条件下进行培养的异养培养步骤。异养培养步骤可以在未从培养基中除去氮源的氮充足条件下进行。异养培养步骤除了使用不同构成的培养基以外，可以与缺氮培养步骤一样地实施。
作为向培养基中追加的碳源，例如可以列举：葡萄糖或果糖等糖类、乙醇等醇类、乙酸或苹果酸等羧酸、或者谷氨酸等氨基酸这样的有机酸或其盐等、以及碳酸氢钠等无机碳化合物。例如，在培养基中加入0.5～1.0容量%的乙醇时，关系到裸藻的生长促进。需要说明的是，作为碳源以外的营养源，可以在培养基中加入氯化钾或氯化镁等碱金属或碱土金属的盐。作为在培养基中追加的碳源，优选糖类和有机酸，其中特别优选葡萄糖以及乙酸及其盐。从与培养基的其他成分的平衡的角度考虑，培养基中追加的碳源优选以1～200mM、特别是1～100mM、尤其是1～20mM范围的浓度添加。
关于缺氮培养步骤或异养培养步骤中使用的裸藻，使用事先利用普通的不缺氮的培养基进行了预培养的裸藻。采集分散有优选进行了1天以上、特别是2天以上、尤其是3天以上的预培养的裸藻的培养液进行离心分离，根据需要用去离子水清洗，之后加入到培养基中等，在缺氮条件下或异养条件下放置。从裸藻的生长效率、以及有机酸的产生效率方面考虑，培养步骤开始时的裸藻细胞体浓度优选设为10～20g/L、而培养步骤结束时的裸藻细胞体浓度优选设为20～50g/L。
需要说明的是，在本说明书中，在没有特别说明的情况下，裸藻细胞体的重量是指干燥重量。裸藻细胞体的干燥重量是指，采集规定量的分散有裸藻的培养液，经过离心分离、清洗和冷冻干燥等步骤除去水分，之后测定所得裸藻细胞体而获得的重量。因此，以单位g/L表示的裸藻细胞体的浓度是指每升培养液中所含的裸藻细胞体的干燥重量。
(厌氧培养步骤)
在厌氧培养步骤中，在厌氧条件下培养通过上述的缺氮培养步骤或异养培养步骤获得的培养产物。厌氧条件下的培养优选在暗条件下进行。这里，“暗条件”具体是指光强度为1μmol m-2s-1以下的弱光条件或无光的黑暗条件。
“厌氧培养”是指也可称作厌氧发酵的步骤，由于裸藻在厌氧条件下获得能量，因此厌氧培养是指通过厌氧呼吸将有机物氧化，以生产琥珀酸等有机酸和二氧化碳的分解代谢。另外，“厌氧条件”是指低于裸藻能够进行有氧呼吸的最低氧量的、实质上不存在氧的条件，氧浓度通常在1%以下、优选0.5%以下、特别是0.2%以下、进一步为完全无氧(氧量在检测限以下)的条件。裸藻在有氧且缺氮条件下或者异养条件下进行培养时细胞内会蓄积琥珀酸等有机酸，但认为若进一步在厌氧且暗条件下培养裸藻，则会进一步促进琥珀酸等有机酸的生物合成，而且会将有机酸释放到细胞外。厌氧条件可以通过将培养槽内的气相中的氧浓度调整至上述范围内而达成。例如，可以通过用氮或氩等惰性气体置换气相中的气体而达成。
经历厌氧培养的培养产物若在离心分离后舍弃上清，将已沉淀的裸藻细胞体分散在少量的新的培养基中等，预先将裸藻细胞体浓缩，则裸藻细胞体在培养液中容易释放有机酸，厌氧培养步骤后的培养液中的有机酸含量增高，因此优选。进行浓缩使经历厌氧培养步骤的裸藻细胞体分散液的容量相对于培养产物的容量为1/10以下、特别是1/20以下、尤其是1/50以下、进一步为1/75以下时，厌氧培养步骤后的培养液中的有机酸含量变得更高，因此优选。需要说明的是，用于浓缩的方法并不限于离心分离，可以利用其他公知的方法、例如通过滤器过滤集聚分散质等方法来进行。
厌氧培养步骤中的培养基可以使用与上述缺氮培养步骤和异养培养步骤相同的培养基，或者，可以使用不具有如促进裸藻增殖这样的营养源的缓冲液。作为可用于培养的缓冲液，可以列举：HEPES缓冲液、Tris缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液等。此外，厌氧培养步骤中的培养条件除了未进行空气吹入以外，可以和上述的缺氮培养步骤和异养培养步骤相同，但在进行振荡培养时厌氧培养步骤后的培养液中的有机酸含量会变得更高，因此优选。
厌氧培养优选进行至少1天以上，更优选进行2天以上、特别是3天以上。通过经历厌氧培养，裸藻将琥珀酸等有机酸释放到培养液中。在厌氧培养后的培养液中，在培养刚刚结束后的未浓缩状态下含有100mg/L以上、优选200mg/L以上、特别优选300mg/L以上的琥珀酸。通过将培养条件最优化，厌氧培养后的培养液中的琥珀酸含量还可以达到800mg/L以上、1000mg/L以上、进一步为1500mg/L以上。因此，在厌氧培养后的培养液中，在培养刚刚结束后的未浓缩状态下可以含有100mg/L以上、200mg/L以上、300mg/L以上、800mg/L以上、1000mg/L以上、或者1500mg/L以上的有机酸。需要说明的是，由于所产生的有机酸(特别是琥珀酸)具有抗菌作用，所以能够防止特定细菌等的增殖。
厌氧培养后的培养液中的有机酸含量可以如下求得：将培养产物进行离心分离，将采集的上清进行干燥，再将所得样品例如通过HPLC等进行分析而求得。上清中所含的有机酸的重量相对于厌氧培养后的裸藻细胞体的干燥重量的比率优选为0.5重量%以上，特别是1重量%以上，更进一步优选为1.5重量%以上。
厌氧培养后的培养液中所含的有机酸除了琥珀酸以外，例如还可以列举：枸橼酸、苹果酸和乳酸等。与琥珀酸相比，枸橼酸以外的有机酸的含量往往是极少的。厌氧培养后的培养液中所含的苹果酸和乳酸的量分别可以是琥珀酸含量的1/5以下、特别是1/6以下、尤其是1/7、进一步为1/10以下。从有用性更高的琥珀酸的分离纯化方面考虑，优选苹果酸和乳酸的量少。另外，在厌氧培养后的培养液中，还可包含其他的下述有用化合物：3-羟基丙酸、丙二酸、丙酸、丝氨酸、乙偶姻、天冬氨酸、富马酸、3-羟基丁内酯、苏氨酸、阿拉伯胶素醇、糠醛、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、脯氨酸、木糖醇、木糖酸、乌头酸、枸橼酸、2,5-呋喃二羧酸(2,5-furandicarboxylic acid，2,5-呋喃二甲酸)、葡糖二酸、赖氨酸、左旋葡聚糖、山梨醇。它们的含量可以是琥珀酸含量的1/5以下、特别是1/6以下、尤其是1/7、进一步为1/10以下。
在厌氧培养后的培养产物中，不仅是培养液中、就连裸藻细胞体中也含有有机酸。裸藻细胞体中所含的有机酸可以通过用水或有机溶剂进行提取而取出。此时，可以利用超声波破碎装置等施加机械力、或者添加溶菌酶等酶等以破坏细胞膜。需要说明的是，在裸藻细胞体中不仅含有有机酸，也可含有如上所述的有用的化合物。
利用以往公知的方法，可以从厌氧培养后获得的含有有机酸的培养产物中纯化高纯度的有机酸。例如，将培养产物进行离心分离，将采集的上清进行干燥，再将所得产物通过离子交换树脂等进行脱盐，利用结晶化或柱层析等方法可以纯化成高纯度的琥珀酸。
关于厌氧培养后获得的培养产物中的裸藻细胞体，不仅其中所含的有机酸具有有用性，就连细胞体本身也具有有用性。已知裸藻细胞体含有大量的维生素、矿物质、氨基酸、不饱和脂肪酸等，可用作食品或营养辅助食品或饲料。另外，根据本发明的方法，在厌氧培养后获得的裸藻细胞体中，由于在厌氧培养期间细胞体中所含的糖质减少，因此根据本发明的方法可以提供附加值较以往高的低糖质的裸藻细胞体。因此，本发明的另一侧面还涉及通过下述方法获得的裸藻细胞体，所述方法包括上述的缺氮培养步骤或异养培养步骤和厌氧培养步骤，还包括从通过厌氧培养步骤获得的培养产物中通过离心分离等采集裸藻细胞体的步骤。
另外，如上所述，在本发明的方法中，在厌氧培养步骤后的培养液中，在培养刚刚结束后的未浓缩状态下含有100mg/L以上、优选200mg/L以上、特别优选300mg/L以上的有机酸。更优选在厌氧培养步骤后的培养液中，在培养刚刚结束后的未浓缩状态下含有100mg/L以上、优选200mg/L以上、特别优选300mg/L以上的琥珀酸。因此，本发明的又一侧面涉及一种培养裸藻而获得的培养产物、特别是培养液，其中以100mg/L以上的浓度含有裸藻所产生的有机酸(琥珀酸)。这是培养包含裸藻的其他藻类后的培养液，像这种含有大量有机酸的培养液迄今为止尚未知晓。
实施例
以下，利用实施例来更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
1. 试验顺序
(1) 裸藻的培养(氮充足或缺氮条件下)
对于野生型纤细裸藻(Euglena gracilis)(由Euglena公司获取、在氮充足下的普通培养环境下进行了1～2周左右的预培养的纤细裸藻)，初期裸藻细胞体浓度设为10～20g/L，使用具有表1所示组成的改良Cramer-Myers培养基(改良CM培养基、pH3.5)，在25℃、12小时明暗循环下吹入含有1% CO2的空气，同时在培养箱中进行需氧静置培养。光强度设为50～100μmol m-2s-1。培养使用1L的培养容器来进行。需要说明的是，在缺氮下进行培养时，从改良CM培养基的组成中除去了作为氮源的(NH4)2HPO4。
[表1]
(2) 厌氧培养
采集规定量的上述(1)中获得的培养液进行离心分离(5000rpm×5分钟)，舍弃上清。将所得的裸藻细胞体悬浮于10mL 20mM的 HEPES-KOH缓冲液(pH7.8)中，转移到20mL容量的小瓶(vial bottle)中。在小瓶上盖上橡胶栓，插入2根注射针，由其中1根注射针导入氮气达1小时。需要说明的是，在此期间将小瓶放置在30℃的光照环境下。1小时后拔掉注射针，将用铝箔遮光的小瓶放入25℃的培养箱中，进行振荡培养。3天后或6天后打开塞子，将内容物转移到15mL的管中，立即进行离心分离(10,000rpm×2分钟)。将所得上清转移到其他的管中，进行冷冻干燥。
厌氧培养前的裸藻细胞体的干燥重量如下计算：另外采集50mL份的上述(1)中获得的培养液装入管中，离心分离后舍弃上清，再用灭菌水清洗细胞体2次，从而除去盐，在-80℃下冷冻干燥1天以上，测定所得冷冻干燥物(冻干物)的重量，即可求得。
(3) 有机酸定量
通过使用溴百里酚蓝的后标记法(post-labeling method)进行分析。将上述(2)中获得的上清的冷冻干燥物溶解于经过滤的100μL 3mM的高氯酸水溶液中，使用具备光电二极管阵列检测器和2根柱(RSpak KC-811、昭和电工公司制造)的高效液相色谱仪(LC-2000Plus、日本分光公司制造)进行分析。使用0.2mM的溴百里酚蓝溶液(15mM的磷酸钠缓冲液中)定量有机酸，在波长445nm下检测峰。柱温设为60℃，3mM的高氯酸水溶液和0.2mM的溴百里酚蓝溶液的流速分别设为1.0mL/分钟和1.5mL/分钟。
2. 试验结果
(1) 试验1
将在氮充足下或缺氮下培养11天而获得的800mL培养液进行离心分离，将所得裸藻细胞体悬浮于10mL的缓冲液中，厌氧培养3天。厌氧培养后的培养液中所含的有机酸量见表2。即使将在氮充足下培养的裸藻进行厌氧培养，所得上清中也几乎不含琥珀酸，琥珀酸的量相对于厌氧培养前的细胞体的干燥重量只不过是0.08重量%。另一方面，将在缺氮下培养11天的裸藻进行厌氧培养时，所得上清中含有大量的琥珀酸，其量相对于厌氧培养前的细胞体的干燥重量为1.9重量%，达到了在氮充足下培养的样品中的琥珀酸量的20倍以上(以厌氧培养前的细胞体的干燥重量为标准)。需要说明的是，枸橼酸因HPLC图中的峰与其他成分重叠而无法定量，但由图推测产生了与琥珀酸相同程度的量的枸橼酸。
[表2]
样品 琥珀酸(mg) 枸橼酸(mg) 苹果酸(mg) 乳酸(mg) 干燥重量(g)
氮充足 12 ± 2 N/I ND ND 14.8 ± 1.4
缺氮11天 870 ± 270 N/I 140 ± 70 ND 45.5 ± 10.0
有机酸：厌氧培养后的每升培养液的重量；干燥重量：厌氧培养前的每升培养液的细胞体重量；N/I：与其他成分的峰重叠而无法特定；ND：没有检测；样品数n=3。
(2) 试验2
将在缺氮下培养11天或14天而获得的800mL培养液进行离心分离，将所得裸藻细胞体悬浮于10mL的缓冲液中，厌氧培养3天。厌氧培养后的培养液中所含的有机酸量见表3。即使在任意一个培养天数下，所得上清中都含有大量的琥珀酸，其量相对于厌氧培养前的细胞体的干燥重量分别为7.5重量%和3.1重量%。
[表3]
样品 琥珀酸(mg) 枸橼酸(mg) 苹果酸(mg) 乳酸(mg) 干燥重量(g)
缺氮11天 1760 N/I 160 20 23.3
缺氮14天 1340 N/I 110 40 42.7
有机酸：厌氧培养后的每升培养液的重量；干燥重量：厌氧培养前的每升培养液的细胞体重量；N/I：与其他成分的峰重叠而无法特定；样品数n=1。
(3) 试验3
将在缺氮下培养14天而获得的800mL培养液进行离心分离，将所得裸藻细胞体悬浮于10mL的缓冲液中，厌氧培养6天。厌氧培养后的培养液中所含的有机酸量见表4。与试验2的结果相比，即使将厌氧培养的天数由3天增加到6天，琥珀酸的含量也没有太大的变化。琥珀酸的含量相对于厌氧培养前的细胞体的干燥重量为4.8重量%。需要说明的是，关于试验1～3的结果中的琥珀酸含量的偏差，推测其源于培养容器在培养箱中的位置和其所伴随的光照程度等的不同。
[表4]
样品 琥珀酸(mg) 枸橼酸(mg) 苹果酸(mg) 乳酸(mg) 干燥重量(g)
缺氮14天(厌氧培养6天) 1590±110 1240±0 150±20 110±20 32.9±6.0
有机酸：厌氧培养后的每升培养液的重量；干燥重量：厌氧培养前的每升培养液的细胞体重量；样品数n=3。
(4) 试验4
将在氮充足下使用加入有10mM的乙酸钠的CM培养基、或者作为对照而未加入添加剂的CM培养基培养14天而获得的20～100mL培养液进行离心分离，将所得的裸藻细胞体悬浮于10mL缓冲液中，厌氧培养3天。需要说明的是，氮充足下的培养是将光强度设为200μmol m- 2s-1来进行的。相对于厌氧培养前的细胞体的干燥重量，在对照中琥珀酸的含量为1.1重量%，而在培养基中添加有乙酸钠的情况下琥珀酸的含量为1.5重量%。需要说明的是，认为与其他试验例相比琥珀酸生产量少的原因在于使用的裸藻细胞体的量少。
[表5]
氮充足(14天)、厌氧培养3天
样品 琥珀酸(mg) 干燥重量(g)
对照 29.9 2.7
+10 mM的乙酸钠 42.7 2.8
琥珀酸：厌氧培养后的每升培养液的重量； 干燥重量：厌氧培养前的每升培养液的细胞体重量；样品数n=2。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。

Claims (7)

1.使用裸藻生产有机酸的方法，该方法包括如下步骤：缺氮培养步骤，在缺氮条件下对裸藻进行需氧培养；以及厌氧培养步骤，将通过缺氮培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养。
2.权利要求1所述的方法，其中，缺氮培养步骤进行3天以上。
3.使用裸藻生产有机酸的方法，该方法包括如下步骤：异养培养步骤，使用含有碳源的培养基对裸藻进行需氧培养；以及厌氧培养步骤，将通过异养培养步骤获得的培养产物在厌氧条件下进行培养。
4.权利要求1～3中任一项所述的方法，该方法还包括如下步骤：从厌氧培养步骤的培养产物中取出含有有机酸的培养液。
5.权利要求1～4中任一项所述的方法，该方法还包括如下步骤：在厌氧培养步骤之前，将缺氮培养步骤或异养培养步骤的培养产物中所含的裸藻细胞体浓缩。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，裸藻为野生型裸藻。
7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，有机酸为琥珀酸。
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