CN107602727A - 一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法 - Google Patents
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，包括以下步骤：步骤一将脱乙酰度为55‑90％以上的壳聚糖与醋酸溶液配制成壳聚糖醋酸溶液；步骤二以纤维素酶与木瓜蛋白酶复合酶制剂进行酶解反应；步骤三升高温度钝化酶反应，冷却至室温对酶解液进行过滤分离纯化；步骤四，加入CrCL3溶液与酶解物进行配位反应；步骤五真空减压浓缩、沉淀生成壳六糖～壳八糖铬配合物。本发明的制备方法使用复合酶制剂对高分子壳聚糖进行酶解，将分子量调控在1300Da，并与Cr3+反应形成铬配合物，提高了葡萄糖糖耐量因子的结合活性，降低了降解成本、提高了产品安全性。
Description
技术领域
本发明涉及壳寡糖配合物的制备方法，具体涉及一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法。
背景技术
糖尿病(diabetes)是一种与胰岛素的产生和作用异常相关、以高血糖症为主要特征的内分泌代谢疾病，主要包括1型和2型糖尿病。据最新数据统计，我国目前糖尿病患者人数已高达1.14亿，占全世界糖尿病患者总数的三分之一，成为全球糖尿病第一大国。调查报告显示，我国糖尿病人群以II型糖尿病为主，占糖尿病患者总数的90％以上。以胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗为主的II型糖尿病最终会导致高血糖，长期的高血糖症状会引起一系列的慢性并发症，如足病(足部溃疡、感染和坏疽)、肾病(肾功能衰竭、尿毒症)、眼病(视网膜病变、模糊不清、失明)、脑病(脑血管病变)、心脏病、皮肤病、性病等。因此，糖尿病并发症是导致糖尿病患者死亡的主要因素。
然而，当前药物的药效有限且有副作用，如腹泻、恶心、呕吐等胃肠道功能紊乱，乳酸性酸中毒，体质量增加、低血糖等，因此开发作用于II型糖尿病新靶点的药物和康复制品成为国内外研究的热点。
壳寡糖(chitooligosaccharides，COS)不仅具有和壳聚糖一些相似的性质，而且一些生理活性或功能性质更加显著，有提高机体免疫、抗肿瘤、降血脂、降血糖、促进双歧杆菌生长、清除超氧阴离子自由基、羟自由基，降低丙二醛水平等作用。而壳寡糖中以六糖为主的成分是活性主体。
下图为壳聚寡糖的结构式。
壳寡糖结构式
铬是动物和人必需的微量元素，维持人体健康的是三价铬。在体内，铬与蛋白质、核酸以及各种低分子量的配体结合，参与人体的糖类、脂肪代谢，促进人体生长发育。缺铬可以导致糖耐量受损、高血糖、糖尿、低血糖症循环、胰岛素含量升高、胰岛素受体增加、体重下降等类似糖尿病症状。葡萄糖耐量因子是三价铬与两分子烟酸、甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸形成的不对称有机铬复合物，它可以通过协助胰岛素α链与细胞膜上胰岛素受体形成二硫键，促进胰岛素发挥作用。
现有技术中由壳聚糖降解得到的壳寡糖，分子量范围较宽，聚合度(Degree ofPolymerization,DP)通常多高于20，并且现有技术中降解壳聚糖的专一性酶---壳聚糖酶其价格较为昂贵，不利于工业化生产，因此，壳寡糖在食品、医药、化妆品领域的功能性应用受到制约，目前迫切需要获得壳寡糖的壳多糖降解方法，制得聚合程度低、与糖耐量因子结合靶点结合效果好的壳六糖至八糖铬配合物。下图为糖耐量因子分子式。
发明内容
为了克服现有技术上的问题，本发明提供了一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，使用复合酶制剂对高分子壳聚糖进行酶解，将分子量调控在1300Da，并与Cr3+反应形成铬配合物，提高了糖耐量因子的结合活性，降低了降解成本、提高了产品安全性。
本发明提供以下技术方案：
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一将脱乙酰度为55-90％以上的壳聚糖以浓度1-2％的醋酸溶液配制成浓度为5％的壳聚糖醋酸溶液；
步骤二在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入浓度为0.05％的任意比例的纤维素酶与木瓜蛋白酶复合酶制剂，进行酶解反应；
步骤三升高温度钝化酶反应，冷却至室温对酶解液进行过滤分离纯化；
步骤四将截留物加10倍体积的无离子水，以Cr3+与壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下进行配位反应8-10h；
步骤五真空减压浓缩反应液至原体积的1/3，加入5～10倍体积的无水乙醇溶液沉淀生成壳六糖～壳八糖铬配合物。
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一将脱乙酰度为55-90％以上的壳聚糖以浓度1-2％的醋酸溶液配制成浓度为5％的壳聚糖醋酸溶液；
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入浓度为0.05％的任意比例的纤维素酶、木瓜蛋白酶与脂肪酶的复合酶制剂，进行酶解反应；
步骤三 升高温度钝化酶反应，冷却至室温对酶解液进行过滤分离纯化；
步骤四 将截留物加10倍体积的无离子水，以Cr3+与壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下进行配位反应8-10h；
步骤五 真空减压浓缩反应液至原体积的1/3，加入5～10倍体积的无水乙醇溶液沉淀生成壳六糖～壳八糖铬配合物。
进一步地，在步骤三中，所述过滤分离纯化的步骤为：
一次过滤，以定性滤纸进行过滤，滤液调整PH为7.5～8,加热至50℃，得初滤液；
分离纯化，将初滤液以截留分子量为1.5-3KDa的超滤膜，在循环温度为50℃的条件下进行分离纯化，得透过液；
三次过滤，透过液以截留分子量为500-900Da带负电荷的纳滤膜进行过滤，得截留物。
进一步地，所述分离纯化，将初滤液以截留分子量为2KDa的超滤膜；所述透过液以截留分子量为800Da带负电荷的纳滤膜进行过滤。
进一步地，其特征在于，步骤一中所述的脱乙酰度为70％；步骤二中所述纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:1，酶解反应时间为5-7h；步骤三中钝化温度为70-90℃钝化时间为30-45min。
进一步地，步骤一中所述的脱乙酰度为70％；步骤二中所述纤维素酶、木瓜蛋白酶与脂肪酶的质量比为5:4:1，酶解反应时间为5-7h；步骤三中钝化温度为70-90℃钝化时间为30-45min。
进一步地，还包括步骤六，对壳六糖～壳八糖铬配合物进行离心沉淀，沉淀物抽滤后在50℃温度下烘干得到壳六糖～壳八糖铬配合物固体。
进一步地，所述制备获得的壳六糖～壳八糖铬配合物产品用于制造食品、药品、化妆品。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1、本发明制得的产物，充分发挥壳寡糖中具有明显活性作用的壳六糖-壳八糖效能，将分子量调控在1300Da左右，避免分子量范围过宽，影响功能性。
2、本发明的降解反应使用了非专一性复合酶技术降解壳聚糖，选择的酶复合物成本较低，便于工业化生产。
3、本发明在纯化时利用膜技术，选择性的分离目标寡糖，相比于其他方法具有高效、易操作、成本低等特点。
4、用天然有机物壳寡糖配合三价铬制得本发明的产物，提高了产品安全性，减少临床应用可能出现的副反应。
附图说明
图1为壳六糖铬配合物的分子式示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法包括以下步骤：
步骤一 将脱乙酰度为90％以上的壳聚糖以1％醋酸溶液配制成5％的壳聚糖醋酸溶液，
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入浓度为0.05％质量比为1:1的纤维素酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶制剂，酶解反应5h，
步骤三 升温至70℃保持45min钝化酶，冷却至室温后第一次过滤：以定性滤纸过滤，滤液调整PH为7.5，加热至50℃，得初滤液，分离纯化：以截留分子量MWCO为3KDa的超滤膜，在循环温度为50℃的条件下进行分离纯化，得透过液，第三次过滤：透过液以截留分子量为500Da带负电荷的纳滤膜，得截留物，
步骤四 截留物加10倍体积的无离子水，以Cr3+与壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCL3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下配位反应10h，
步骤五 60℃真空减压浓缩至原体积1/3，加入5～10倍无水乙醇沉淀生成的壳六糖～壳八糖铬配合物，
步骤六离心取得沉淀物，抽滤后50℃烘干成为固体壳六糖～壳八糖铬配合物。
其中，图1表示了壳六糖铬配合物的结构式。
实施例2
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法包括以下步骤：
步骤一 将脱乙酰度为70％以上的壳聚糖以1％醋酸溶液配制成5％的壳聚糖醋酸溶液，
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入浓度为0.05％质量比为1:1的纤维素酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶制剂，酶解反应6h，
步骤三 升温至80℃保持30min钝化酶，冷却至室温后第一次过滤：以定性滤纸过滤，滤液调整PH为8，加热至50℃，得初滤液，分离纯化：以截留分子量为1.5KDa的超滤膜，在循环温度为50℃的条件下进行分离纯化，得透过液，第三次过滤：透过液以截留分子量为800Da带负电荷的纳滤膜，得截留物，
步骤四 截留物加10倍体积的无离子水，以Cr3+与壳寡糖的摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下配位反应9h，
步骤五 60℃真空减压浓缩至原体积1/3，加入10倍无水乙醇沉淀生成的壳六糖～壳八糖铬配合物，
步骤六 离心取得沉淀物，抽滤后50℃烘干成为固体壳六糖～壳八糖铬配合物。
实施例3
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将脱乙酰度为55％以上的壳聚糖以浓度2％的醋酸溶液配制成浓度为5％的壳聚糖醋酸溶液；
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入浓度为0.05％的质量比为5:4:1的纤维素酶、木瓜蛋白酶与脂肪酶的复合酶制剂，进行酶解反应，酶解反应时间7h；
步骤三 升高温度钝化酶反应，冷却至室温对酶解液进行过滤分离纯化，一次过滤，以定性滤纸进行过滤，滤液调整PH为8,加热至50℃，得初滤液，分离纯化，将初滤液以截留分子量为2KDa的超滤膜，在循环温度为50℃的条件下进行分离纯化，得透过液，三次过滤，透过液以截留分子量为900Da带负电荷的纳滤膜进行过滤，得截留物；
步骤四 将截留物加10倍体积的无离子水，以Cr3+/壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下进行配位反应8h；
步骤五 真空减压浓缩反应液至原体积的1/3，加入5倍体积的无水乙醇溶液沉淀生成壳六糖～壳八糖铬配合物。
步骤六 离心取得沉淀物，抽滤后50℃烘干成为固体壳六糖～壳八糖铬配合物。
实施例4
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将脱乙酰度为55％以上的壳聚糖以2％醋酸溶液配制成5％的壳聚糖醋酸溶液，
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入纤维素酶与木瓜蛋白酶(纤维素酶、木瓜蛋白酶质量比为1:1)组成浓度为0.05％的复合酶制剂，酶解反应6h，
步骤三 升温至80℃保持30min钝化酶，冷却至室温后以定性滤纸过滤，滤液调整PH为7.5～8之间，加热至50℃，以MWCO为3KDa的超滤膜，在循环温度为50℃的条件下进行分离纯化，透过液以MWCO为500Da带负电荷的纳滤膜进行进一步纯化，
步骤四 截留物加10倍无离子水，以Cr3+/壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下配位反应10h，
步骤五 60℃真空减压浓缩至原体积1/3，加入10倍无水乙醇沉淀生成的壳六糖～壳八糖铬配合物，
步骤六 离心取得沉淀为，抽滤后50℃烘干成为固体壳六糖～壳八糖铬配合物。
实施例5
一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将脱乙酰度为70％以上的壳聚糖以2％醋酸溶液配制成5％的壳聚糖醋酸溶液，
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入纤维素酶、木瓜蛋白酶与脂肪酶(质量比为：纤维素酶50％，木瓜蛋白酶40％，脂肪酶10％，)组成的复合酶制剂0.05％，酶解反应6h，
步骤三 升温至80℃保持30min钝化酶，冷却至室温后以定性滤纸过滤，滤液调整PH为7.5～8，加热至50℃，得初滤液，以MWCO为1.5KDa的超滤膜，在循环温度为50℃的条件下进行分离纯化，得透过液，透过液以MWCO为900Da带负电荷的纳滤膜进行进一步纯化，得截留物，
步骤四 截留物加10倍无离子水，以Cr3+/壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化在PH值为7的条件下，于45℃温度下进行配位反应10h，
步骤五 在60℃温度下真空减压浓缩至原体积1/3，加入10倍无水乙醇沉淀生成的壳六糖～壳八糖铬配合物，
步骤六 离心取出沉淀，抽滤后50℃烘干成为固体壳六糖～壳八糖铬配合物。得率约为51％。
对实施例1-5中壳六糖-壳八糖铬配合物数均分子量的测定，试验方法如下：
1、盐酸氨基葡萄糖标准曲线的绘制
精密量取盐酸氨基葡萄糖标准溶液,0，1.0,2.0,3.0,4.0，5.0ml于具塞试管中，各加去离子水5.0ml，乙酰丙酮溶液1.0ml，摇匀，沸水浴加热5min，强制冷却后加入对-二甲氨基苯甲醛溶液1ml，用无水乙醇定容至10ml，摇匀后置于60℃水浴中保温60min，冷却至室温，以0管为空白对照在525nm波长处进行比色，测定吸光值，以吸光值A为横坐标，盐酸氨基葡萄糖微克数为纵坐标，绘制标准曲线。
2、壳六糖～壳八糖铬数均分子量测定(乙酰丙酮法)
精密称取实施例1-5中制备完成的壳六糖-壳八糖铬配合物样品Wg，蒸馏水定容至1000ml，用移液管移取3ml于试管中，加去离子水5.0ml，乙酰丙酮溶液1.0ml，摇匀，沸水浴加热5min，强制冷却后加入对-二甲氨基苯甲醛溶液1ml，用无水乙醇定容至10ml，摇匀后置于60℃水浴中保温60min，冷却至室温，在525nm波长处进行比色，测定吸光值，以标准曲线计算样品浓度X(μg/ml)。
式中：X-样品浓度μg/ml
1000-稀释倍数
W-样品重量g
215.6-盐酸氨基葡萄糖分子量
各实施例中目标产物的得率见下表：
本发明的制备方法获得的壳六糖～壳八糖铬配合物产品可以用于制造食品、药品、化妆品。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将脱乙酰度为55-90％以上的壳聚糖以浓度1-2％的醋酸溶液配制成浓度为5％的壳聚糖醋酸溶液；
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入浓度为0.05％的任意比例的纤维素酶与木瓜蛋白酶复合酶制剂，进行酶解反应；
步骤三 升高温度钝化酶反应，冷却至室温对酶解液进行过滤分离纯化；
步骤四 将截留物加10倍体积的无离子水，以Cr3+与壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下进行配位反应8-10h；
步骤五 真空减压浓缩反应液至原体积的1/3，加入5～10倍体积的无水乙醇溶液沉淀生成壳六糖～壳八糖铬配合物。
2.一种壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将脱乙酰度为55-90％以上的壳聚糖以浓度1-2％的醋酸溶液配制成浓度为5％的壳聚糖醋酸溶液；
步骤二 在PH5.5、温度为55℃的条件下，加入浓度为0.05％的任意比例的纤维素酶、木瓜蛋白酶与脂肪酶的复合酶制剂，进行酶解反应；
步骤三 升高温度钝化酶反应，冷却至室温对酶解液进行过滤分离纯化；
步骤四 将截留物加10倍体积的无离子水，以Cr3+与壳寡糖摩尔比为0.3的比例加入CrCl3搅拌溶化，在PH值为7的条件下，于45℃温度下进行配位反应8-10h；
步骤五 真空减压浓缩反应液至原体积的1/3，加入5～10倍体积的无水乙醇溶液沉淀生成壳六糖～壳八糖铬配合物。
3.根据权利要求1、2中任一项所述的壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，在步骤三中，所述过滤分离纯化的步骤为：
一次过滤，以定性滤纸进行过滤，滤液调整PH为7.5～8,加热至50℃，得初滤液；
分离纯化，将初滤液以截留分子量为1.5-3KDa的超滤膜，在循环温度为50℃的条件下进行分离纯化，得透过液；
三次过滤，透过液以截留分子量为500-900Da带负电荷的纳滤膜进行过滤，得截留物。
4.根据权利要求3所述的壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，所述分离纯化，将初滤液以截留分子量为2KDa的超滤膜；所述透过液以截留分子量为800Da带负电荷的纳滤膜进行过滤。
5.根据权利要求1所述的壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，步骤一中所述的脱乙酰度为70％；步骤二中所述纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:1，酶解反应时间为5-7h；步骤三中钝化温度为70-90℃钝化时间为30-45min。
6.根据权利要求2所述的壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，步骤一中所述的脱乙酰度为70％；步骤二中所述纤维素酶、木瓜蛋白酶与脂肪酶的质量比为5:4:1，酶解反应时间为5-7h；步骤三中钝化温度为70-90℃钝化时间为30-45min。
7.根据权利要求1、2中任一项所述的壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，还包括步骤六，对壳六糖～壳八糖铬配合物进行离心沉淀，沉淀物抽滤后在50℃温度下烘干得到壳六糖～壳八糖铬配合物固体。
8.根据权利要求1、2中任一项所述的壳六糖至八糖铬配合物的制备方法，其特征在于，所述制备获得的壳六糖～壳八糖铬配合物产品用于制造食品、药品、化妆品。
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