CN107596361B

CN107596361B - 牛a型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107596361B
Application number: CN201710819084.5A
Authority: CN
Inventors: 钱泓; 吴有强; 张强; 王娟; 白志军; 查银河
Original assignee: Novo Biotech Corp
Current assignee: Zhejiang Hailong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2037-09-12
Also published as: CN107596361A

Abstract

本发明提供了一种牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗以及制备方法和应用，所述亚单位疫苗包括牛A型产气荚膜梭菌α‑毒素蛋白截短体以及药学上可以接受的佐剂，所述α‑毒素蛋白截短体为α‑毒素蛋白的从氨基酸255位到氨基酸372位的抗原决定簇氨基酸序列。所述亚单位疫苗具有以下优势：1)不存在灭活不彻底导致的安全性问题；2)质量可控，不存在批次间差异；3)生产设备和空间要求较低，表达量高，成本低；4)不存在散毒的风险，生产操作人员的安全有保障。

Description

牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗的制备和应用，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是自然界和动物肠道中的厌氧的能产芽孢并且耐热的条件致病菌。该病导致的牛肠毒血症和牛猝死症等均具有发病急、病程短、死亡率高等特点。所以药物往往起不到好的治疗效果。

A型产气荚膜梭菌主要产生α-毒素，该毒素是主要的免疫原，能够刺激机体产生中和性抗体。因此，α-毒素是亚单位疫苗设计的主要靶抗原。但α-毒素具有磷脂酶C活性，能将细胞膜的磷脂酰胆碱水解，细胞膜完整性受到破坏，最终导致细胞破裂死亡，因此其具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。因此，设计表达α-毒素时须考虑将磷脂酶C活性失活。

目前，有将α-毒素进行截短表达，以获得不含毒性但保留免疫原性的α-毒素截短体(具体参见公开号为CN93107585的发明专利)；有将表达出来的α-毒素进行灭活处理，以获得丧失毒性的α-毒素(具体参见公开号为CN200680021810的发明专利)。但是，由于当时技术条件的限制，截短表达时截短位置或长或短，这不仅可能会影响目的蛋白的免疫原性，也可能会降低目的蛋白的产量，导致生产成本较高；另外将野生型的α-毒素进行灭活可能存在灭活不彻底而带来的毒性，也增加了生产工艺的步骤和时间，会导致生产成本的升高，影响疫苗的生产销售。

发明内容

本发明要解决的技术问题一是提供一种可大规模工业化生产的牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗及其制备方法；二是克服现有技术中截短位置或长或短可能带来的缺陷；三是克服现有技术中对α-毒素进行灭活时可能存在的缺陷。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包括牛A型产气荚膜梭菌的α-毒素蛋白截短体以及药学上可以接受的佐剂，所述α-毒素蛋白截短体为α-毒素蛋白的从氨基酸255位到氨基酸372位的抗原决定簇氨基酸序列

本发明的技术方案中，优选地，所述α-毒素蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明的技术方案中，优选地，所述药学上可以接受的佐剂为ISA 201VG佐剂，所述α-毒素蛋白截短体与佐剂的重量比为1:1。

本发明的技术方案中，优选地，所述亚单位疫苗中每头份含有30～200μgα-毒素蛋白截短体。

本发明的技术方案中，优选地，所述亚单位疫苗中每头份含有100μgα-毒素蛋白截短体。

根据本发明另一个方面，本发明还提供了一种制备α-毒素蛋白截短体的方法，所述方法包括以下步骤：1)将α-毒素蛋白的核苷酸序列进行密码子优化，得到密码子优化后的α毒素蛋白核苷酸序列，将密码子优化后的α毒素蛋白核苷酸序列通过PCR扩增出α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列；2)将α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列插入到pET28a载体中，得到重组载体；3)将重组载体转入转化E.coli BL21(DE3)，诱导表达、纯化后获得α-毒素蛋白截短体。

本发明的技术方案中，优选地，所述密码子优化后PCR扩增出的α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明另一个方面，本发明还提供了一种亚单位疫苗在牛A型产气荚膜梭菌治疗和预防中的应用。

根据本发明另一个方面，本发明还提供了一种α-毒素蛋白截短体在牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗的制备中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的亚单位疫苗首先能够很好的克服现有技术中对α-毒素进行灭活时可能存在的灭活不彻底的问题(本发明的亚单位疫苗中的α-毒素蛋白不具有毒性，也不需要灭活)。其次，本发明的α-毒素蛋白在截短时仅仅将α-毒素蛋白中的毒性结构域截掉，保留所有可能的免疫原性(实施例5对比实验中，本发明的α-毒素蛋白截短体的免疫原性较现有技术中的α-毒素蛋白截短体的免疫原性好)，因此，本发明能够很好的克服现有技术中截短位置或长或短可能带来的缺陷。再次，本发明在制备α-毒素蛋白截短体时，工艺简单(表达出来的蛋白在镍柱纯化即可得到)，产量高(约有800mg/L)，成本低(使用大肠杆菌表达，发酵时间短，耗材便宜)，适合大规模的工业化生产。最后，本发明的α-毒素蛋白截短体在注射小鼠后跟踪的7天内，小鼠都是正常的，因此，本发明的α-毒素蛋白截短体是安全的；且这种α-毒素蛋白截短体在制备疫苗后，在免疫兔子和小鼠后，能够保护兔子或小鼠免受强毒的攻击，这说明本发明的疫苗能够产生良好的免疫反应，适合用于牛A型产气荚膜梭菌的治疗和预防。

附图说明

图1α-毒素蛋白截短体双酶切鉴定结果：M：Marker，DL10000；1-4：质粒pET28a-PLC-C用Nco I&Pvu I双酶切的结果。

图2α-毒素蛋白截短体纯化结果。

图3α-毒素蛋白截短体小鼠毒性实验结果(增重跟踪结果)：实验组为α-毒素蛋白截短体注射后增重结果。

图4α-毒素蛋白截短体核苷酸序列优化前后比较，OPTI-PLC-C为优化后的核苷酸序列，PLC-C为优化前的核苷酸序列。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

试剂均为国产市售产品。

实施例1α-毒素蛋白截短体的制备

1.1α-毒素蛋白截短体截短位置的选择

α毒素是A型产气荚膜梭菌主要的致病因子，能够刺激机体产生中和性抗体。其自身是一种依赖于锌离子磷脂酶C(PLC)活性的金属酶，该酶能将细胞膜的磷脂酰胆碱水解，细胞膜完整性受到破坏，最终导致细胞破裂死亡。对α-毒素蛋白的结构(PDB:1GYG)进行分析，它的结构可分成两个结构域：N端结构包括九个紧密连接的α-螺旋，C端结构由8个反平行的β折叠组成，N端和C端由一段短而有弹性的连接子连接。其中磷脂酶活性区域完全存在N端结构域，而含有大量抗原决定簇的C端区域并无磷脂酶活性。为了确保免疫原性(避免截短太短缺失部分免疫原性；或截短太长，导致后续制备时产量不高)，通过分析比较，选择的截短位置为整个C端结构域，即α-毒素的255位氨基酸到372位氨基酸的序列。

1.2α-毒素蛋白密码子优化

根据GenBank(GenBank：AY823400)序列号，将C57的核酸序列提交至南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，得到OPTI-PLC(密码子优化后的α毒素蛋白核苷酸序列)。

其中，密码子优化前后的α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列比较见图4所示，有77/354＝21.75％的核苷酸不同。

1.3表达载体构建及验证

1.3.1PCR扩增目的片段PLC-C(α毒素蛋白截短体)

1.3.1.1PCR反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-CATGCCATGGGCAAGAACGTGAAAGAACTGGTT-3’

下游引物:5’-ccgCTCGAGTTTAATGTTGTAGGT-3’

(2)加样体系50μL，如下表所示：

1.3.1.2PCR扩增程序：

1.3.1.3PCR产物进行胶回收

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，65℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置5min，10,000rpm/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入700μL漂洗液PW buffer，静置5min，离心10,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

1.3.2PCR产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的200μL PCR管，在PCR管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系

(2)将步骤(1)中的PCR管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴1-2h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.3.1.3中PCR产物胶回收。

1.3.3连接反应

(1)准备洁净的200μL PCR管若干，做好标记，置于EP管架上待用。

(2)在200μL PCR管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于PCR仪16℃反应2h；

(4)取出步骤(3)中的EP管，置于4℃保存。

1.3.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

1.3.5质粒抽提与双酶切鉴定

1.3.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入50μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。

1.3.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的200μL PCR管，按照下表进行加样：10μL反应体系

(2)将步骤(1)中的200μL PCR管10μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴1h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图1：目的条带分别为4124bp和1467bp均正确，酶切鉴定构建正确。

(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。

1.4α-毒素蛋白截短体表达

1.4.1转化大肠杆菌BL21

吸取1μl质粒加入100μl BL21感受态细胞中，冰浴30min；

42℃热激90s；

冰浴2min；

在超净台内加入500μl无抗性的LB培养液；

37℃220rpm摇1h；

吸取100μl菌液涂卡那抗性LB平板，37℃过夜培养。

1.4.2大量诱导表达

挑菌：挑取单克隆至3ml卡那抗性LB培养液中，37℃过夜培养；

转接：按1:100比例转接菌液至15ml卡那抗性LB培养液中，37℃220rpm培养3.5-4h；

发酵：按1:150比例接种至2L卡那抗性LB培养液中进行摇瓶发酵，37℃220rpm培养3.5-4h至OD₆₀₀值到0.8-1.0；

诱导：加入1mL IPTG(1M)至IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃220rpm诱导培养4h；

菌体收集：菌液8,000rpm离心10min，收集菌体；用40ml PBS清洗菌体，8,000rpm离心10min，收集菌体，置于-20℃保存；

1.5α-毒素蛋白截短体纯化

(1)样品制备：向1.4中得到的菌体中加入裂解液(10ml/g湿重)(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，0.2％Triton X-114，0.05％Tween 20，pH 8.0；使用0.8μm的滤膜过滤)，用50mL注射器吹打均匀至无颗粒状菌块；将菌体样品倒入到细胞均质仪样品槽中，出样口用烧杯收集样品；以样品的90％流出出样口为一个循环，一个循环完成后，将出样口烧杯收集的样品倒回样品槽，继续重复5个循环。将破碎完全的样品分装到250mL Beckman离心管中，12,000rpm，4℃离心30min，弃上清，收集沉淀。将沉淀用裂解液重悬(可辅助研磨)、离心(12,000rpm，4℃离心30min)，重复该操作清洗沉淀3次，最后将清洗干净的沉淀用含8M尿素的裂解液(1g/100mL)过夜溶解，次日12,000rpm，4℃离心30min，收集上清作为样品，预留80μL样品用于SDS-PAGE检测；

(2)柱平衡：用超纯水平衡2～3柱体积(CV)，排出20％的乙醇保存液；然后用裂解液平衡2～3柱体积(CV)，5mL/min。控制压力小于0.5MPa。

(3)上样：2mL/min进行上样，收集流穿液(Flow through)，取80μL用于SDS-PAGE检测。

(4)冲洗1：用清洗缓冲液组分1(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，8M尿素，0.2％TritonX-114，0.05％Tween 20，pH 7.4，使用0.8μm的滤膜过滤)洗柱，5mL/min，冲洗30柱体积(CV)。

(5)冲洗2：用10倍柱体积(CV)的洗脱缓冲液组分1(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，8M尿素，0.05％Tween 20，pH 7.4，使用0.8μm的滤膜过滤)洗柱，减少Triton X-114的残留。

(6)洗杂：4％洗脱缓冲液组分2(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，20mM咪唑，8M尿素，0.05％Tween 20，pH 7.4，使用0.8μm的滤膜过滤)除去杂蛋白，至基线洗平，速度5ml/min,收集，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析；

(7)洗脱：50％洗脱缓冲液组分2(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，250mM咪唑，8M尿素，0.05％Tween 20，pH 7.4，使用0.8μm的滤膜过滤)洗脱目的蛋白，至基线洗平，速度5ml/min,收集，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析；100％脱缓冲液2组分清洗柱子(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4，使用0.8μm的滤膜过滤)，至基线洗平，5mL/min,收集，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析。

(8)4M尿素外液透析目的蛋白复性：收集50％洗脱缓冲液组分2的洗脱液，于孔径3KDa的透析袋里进行复性，透析6h以上，透析外液为20mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，4M尿素，0.05％Tween 20，pH 7.4。

(9)2M尿素外液透析目的蛋白复性：把透析袋转移至2M尿素外液中进行复性，透析6h以上，透析外液为20mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，2M尿素，0.05％Tween 20，pH 7.4。

(10)1M尿素外液透析目的蛋白复性：把透析袋转移至1M尿素外液中进行复性，透析6h以上，透析外液为20mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，1M尿素，0.05％Tween 20，pH 7.4。

(11)0.5M尿素外液透析目的蛋白复性：把透析袋转移至0.5M尿素外液中进行复性，透析6h以上，透析外液为20mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，0.5M尿素，0.05％Tween 20，1％甘油，pH 7.4。

(12)蛋白保存缓冲液透析目的蛋白复性：把透析袋转移至蛋白保存缓冲液的外液中进行复性，透析2h以上，透析外液为20mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，0.05％Tween 20，5％甘油，5％蔗糖，pH 7.4，重复进行步骤(12)2-3次。

(13)除菌过滤：收集的蛋白溶液在4℃，12,000rpm离心15min，收集上清，移至生物安全柜，过0.2μm蛋白结合率低的针头滤器，过滤后置于-80℃冰箱保存。

(14)纯化结果如图2所示：纯化后的α-毒素蛋白截短体的SDS-PAGE纯度均能达到90％以上；经过计算，在没有优化发酵培养的情况下，α-毒素蛋白截短体的表达量均能达到800mg/L以上。

实施例2α-毒素蛋白截短体小鼠毒性实验

购买10只18-20g BALB/C小鼠，随机分成2组，每组5只。其中一组作为对照组，腿部肌肉注射200μl PBS；一组腿部肌肉注射200μl(蛋白总量为200μg)的α-毒素蛋白截短体。注射后连续观察7天，每天观察精神食欲和测量体重。

在注射跟踪的7天内，2组小鼠精神食欲都很好，未见明显区别，且增重(见图3)也没有明显差别。这说明，我们制备的α-毒素蛋白截短体是安全的，且小鼠的耐受量非常高(最低能达到200μg)，远远满足制备疫苗的需求。

实施例3牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗制备

将适量α-毒素蛋白截短体加入到ISA 201VG佐剂中(抗原相和佐剂重量比为1:1，乳化、质检合格后置于4℃保存；具体疫苗信息如下表所示：

实施例4免疫攻毒实验

购买25只2kg左右的新西兰白兔，随机分成5组，每组5只，组1-组3分别免疫实施例4制备的疫苗1-疫苗3，组4免疫市场苗(灭活苗)，组5作为空白对照组。于免疫后21天攻毒(C57-1毒素攻1个兔MLD)，连续观察14天。在观察的14天内，对照组全部死亡，保护率为0，4组免疫组兔子均没有死亡，且精神食欲良好，保护率均为100％。

接下来，我们将我们制备的α-毒素蛋白截短体制备成疫苗(100μg/头份，具体制备参见实施例4)，并参见CN93107585的发明专利制备同种截短体蛋白，并制备成疫苗(100μg/头份，具体制备参见本发明的实施例4)，将2种疫苗同时免疫兔子并攻毒。结果显示，我们制备的α-毒素蛋白截短体制备的疫苗能保护兔子免受强毒的攻击，在攻毒后观察的14天，兔子精神食欲均正常，未出现任何不良反应，保护率为100％，而参见CN93107585的发明专利制备的α-毒素蛋白截短体制备的疫苗免疫兔子攻毒后，虽然没有发生死亡，但是1/5的兔子有精神食欲变差的症状，因此，保护率为80％。

为了进一步比较我们制备的α-毒素蛋白截短体与CN93107585的发明专利制备的α-毒素蛋白截短体的免疫原性，我们使用Bal b/c小鼠进行了免疫攻毒实验。按照实施例4的方法制备2种疫苗，疫苗中α-毒素蛋白截短体的浓度均为100μg/头份。购买15只Bal b/c小鼠，随机分成3组，每组5只，1组腿部肌肉注射100μl我们制备的α-毒素蛋白截短体制备的疫苗(记为实验组1)，1组腿部肌肉注射100μl CN93107585的发明专利制备的α-毒素蛋白截短体制备的疫苗(记为实验组2),1组作为空白对照组，腿部肌肉注射100μl PBS。在免疫后21天攻毒(C57-1毒素攻1个小鼠MLD)，连续观察14天。在观察的14天内，对照组全部死亡，保护率为0，实验组1均没有死亡，且精神食欲良好，保护率为100％，实验组2有1只小鼠死亡，保护率为80％。

从上述结果可以看出，我们制备的α-毒素蛋白截短体的免疫原性很好，能起到100％的保护作用，与现有的市场苗(灭活苗)免疫效果相当，且比现有技术制备的α-毒素蛋白截短体的免疫原性较好。由于我们使用的是蛋白作为抗原，比现有的灭活苗有明显的优势：1)不存在灭活不彻底导致的安全性问题；2)质量可控，不存在批次间差异；3)生产设备和空间要求较低，表达量高，成本低；4)不存在散毒(细菌)的风险，生产操作人员的安全有保障。另外，我们制备的α-毒素蛋白截短体能够实现产业化生产(现有技术专利中未突出能否产业化生产，也不清楚具体的产量能够达到多少)，大肠杆菌表达产量能够达到800mg/L，如果对现有工艺进行优化，表达产量还能够进一步增加，这样能够显著降低生产成本，有利于疫苗的推广和应用。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110> 浙江海隆生物科技有限公司

<120> 牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> 密码子优化后的α-毒素蛋白截短体核苷酸序列(2 Ambystoma lateralex Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

aagaacgtga aagaactggt tgcgtacatc agcaccagcg gcgagaagga tgcgggcacc 60

gacgattaca tgtacttcgg tatcaagacc aaggacggca aaacccagga gtgggaaatg 120

gataacccgg gtaacgactt catgaccggc agcaaggata cctatacctt taagctgaaa 180

gacgagaacc tgaaaatcga cgatattcaa aacatgtgga tccgtaagcg taaatacacc 240

gcgttcccgg acgcgtataa gccggaaaac atcaaactga ttgcgaacgg caaggtggtt 300

gtggataaag acatcaacga gtggattagc ggcaacagca cctacaacat taaa 354

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> 密码子优化前的α-毒素蛋白截短体核苷酸序列(2 Ambystoma lateralex Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 60

gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 120

gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa 180

gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 240

gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagttaa tagcaaatgg aaaagttgta 300

gtggacaagg atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaa 354

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> α-毒素蛋白截短体氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 4

Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys

1 5 10 15

Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp

20 25 30

Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met

35 40 45

Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu

50 55 60

Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr

65 70 75 80

Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Leu Ile Ala Asn

85 90 95

Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn

100 105 110

Ser Thr Tyr Asn Ile Lys

115

Claims

1.一种牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包括牛A型产气荚膜梭菌的α-毒素蛋白截短体以及药学上可以接受的佐剂，所述α-毒素蛋白截短体为α-毒素蛋白的从氨基酸255位到氨基酸372位的抗原决定簇氨基酸序列，所述α-毒素蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述药学上可以接受的佐剂为ISA201VG佐剂，所述α-毒素蛋白截短体与佐剂的重量比为1:1。

3.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗中每头份含有30～200μg所述α-毒素蛋白截短体。

4.根据权利要求3所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗中每头份含有100μg所述α-毒素蛋白截短体。

5.一种制备如权利要求1-4任一权利要求中所述α-毒素蛋白截短体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将α-毒素蛋白的核苷酸序列进行密码子优化得到密码子优化后的α毒素蛋白核苷酸序列，将密码子优化后的α毒素蛋白核苷酸序列通过PCR扩增出α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列；

2)将所述α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列插入到pET28a载体中，得到重组载体；以及

3)将重组载体转入转化E.coliBL21(DE3)，诱导表达、纯化后获得α-毒素蛋白截短体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述密码子优化后PCR扩增出的α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.一种如权利要求1～4任一权利要求所述亚单位疫苗在制备用于治疗和预防牛A型产气荚膜梭菌的疫苗中的应用。

8.一种如权利要求1～4任一权利要求中所述α-毒素蛋白截短体在牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗的制备中的应用。