CN107580498A

CN107580498A - 用于增强细胞再生和细胞生长的血小板浓缩物

Info

Publication number: CN107580498A
Application number: CN201680016647.0A
Authority: CN
Inventors: E·特尔科夫; M·德特克; A·阿德勒
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2018-01-12
Also published as: US20180021377A1; EP3247367A1; US11564943B2; IL253575A0; KR20170109585A; EP3247367C0; IL253575B; EP3247367B1; CA2974225A1; WO2016116560A1; KR102670912B1; CA2974225C

Abstract

本发明涉及降解的血小板浓缩物，其含有≤50％完整的血小板和任选地≥200pg/ml的RANTES，特别涉及在预防或治疗毛发脱落和/或促进头发生长中的应用，本发明还涉及包含降解的血小板浓缩物和人体脂肪细胞的组合物，以及使用所述组合物用于重建和美容以及治疗性手术和镇痛治疗。

Description

用于增强细胞再生和细胞生长的血小板浓缩物

技术领域

本发明涉及降解的血小板浓缩物，其含有≤50％完整的血小板和任选地≥200pg/ml的趋化因子，特别是其在预防或治疗毛发脱落和/或促进头发生长中的应用。本发明还涉及一种组合物，其包含降解的血小板浓缩物和人体脂肪细胞，以及所述组合物用于重建和美容和治疗性手术和镇痛治疗。

背景技术

全血由各种细胞成分组成，例如悬浮在全血液体成分血浆中的红细胞、白细胞和血小板。可以将全血分离成其组成成分(细胞或液体)，并且一个分离成分可以施用给需要该特定成分的患者。

血小板或凝血细胞是在伤口愈合和新组织生成中起关键作用的血细胞。血小板促进血凝块形成，并在血管破裂部位作为物理屏障，从而防止感染并避免进一步的失血。此外，血小板及其中的蛋白质和多肽具有刺激血管生成(新血管形成)以及增加胶原形成、细胞分裂和细胞生长的能力。

已知富含血小板的浓缩物，即与正常血液相比含有更多血小板/μl的血清，具有愈合伤口和形成新组织的优点。已经表明，在手术部位使用富含血小板的血浆(PRP)可快速增强硬组织和软组织的再生和修复。

由于PRP促进伤口愈合和新组织形成的能力，其在一些医疗领域中受到关注。在头发修复领域，现有证据表明，PRP治疗是促进毛发生长有前景的治疗选择。

虽然在毛发修复中PRP处于科学研究的早期阶段，但是根据现有技术，并不意味着目前PRP取代现有的治疗方法(如DHT阻断剂和米诺地尔)，而是在现有的治疗方法失效或显示出不足时对其进行完善。

PRP或血小板浓缩物中的血小板具有含有多种生长因子(例如PDGF、TGF-β等)的颗粒，其有助于促进血管生成(伤口愈合)、骨生成(骨生长)和软骨修复。当与凝血酶结合时，PRP/血小板浓缩物也可以辅助地用于控制出血(止血)、愈合伤口，以及作为递送药物和/或生物制剂的载体。此外，通过与PRP/血小板浓缩物组合，添加或不加凝血酶，可以改善某些有机材料(例如骨粉)的处理特性。这种组合还为有机材料提供了更安全的的放置。PRP/血小板浓缩物和凝血酶的某些性质(例如止血和伤口愈合)与纤维蛋白胶相似，除了纤维蛋白胶具有更高的粘合性质，因为其纤维蛋白原浓度高于基线水平。

PRP还引起了整形手术和皮肤病学的关注，因为其在各种美容手术、重建手术和再生手术(如乳房重建、隆胸、各种脂肪填充手术)、皮肤修复和头发修复中潜在的用途。

毛发脱落或秃发在技术上被称为脱发，是头发从头部或身体脱落。秃发可以指一般性毛发脱落或雄激素性脱发(雄性型秃发)。一些类型的秃发可以由斑秃造成，其是一种自身免疫性疾病。斑秃的极端形式是全秃，其涉及所有头发脱落和全身脱毛，其涉及头部和身体所有毛发脱落。

秃发和少毛症可以有很多原因，包括真菌感染(头癣)、创伤性损伤(例如强迫性拉扯(拔毛癖))、由放疗或化疗引起、以及由营养缺乏(如缺铁)引起、以及由自身免疫现象引起，包括与系统性红斑狼疮相关的斑秃和毛发脱落。

雄激素性脱发，在限定的模式中头皮头发的遗传性和雄激素依赖性变薄，是一种常见的皮肤病，更多地影响男性而偶尔影响女性，对他们的社会和心理健康有显著的负面影响。其通常从20岁开始，影响近50％的50岁男性。它的发病机制主要是雄激素依赖性并通过睾酮代谢物二氢睾酮、与毛囊相关的雄激素受体的表达调节，且也涉及遗传因子。

PRP也已经显示对脂肪的有益辅助，用于增强脂肪填充的吸收，特别是在美容和重建手术中。自体脂肪移植能够修复和增加软组织，并且越来越多地用于手术中。自体脂肪组织被认为是增加软组织的理想填充物，因为其生物相容性、通用性、天然存在性、非免疫原性、便宜且易于获得。脂肪移植的主要限制是其不可预测的吸收。增强吸收的一种方法是在移植前将脂肪移植物与PRP混合，然而这需要大量的PRP。具体来说，现有技术工艺建议将至少20％的PRP加入到移植的脂肪中，以实现最佳可能的增强吸收。对于需要重复接受捐血用于PRP富集的患者，如果要移植超过100ml的脂肪，这可能会引起高度不适。

Murillo等人(J.Plastic.Reconstructive&Aesthetic Surgery，2010，63，e818-e822)描述了使用富含血小板的血浆来增加兔子脂肪移植后的存活。其中富含血小板的血浆中血小板的理想浓度建议为至少为1mio血小板/μl。

Cervelli V.等人甚至建议将40％的PRP添加到脂肪中(Biomed Res Int.2013，2013，43491，10.1155/2013/434191)。

最常见的是，通过将全血从供体连续地或间歇地引入离心机来收集血小板，其中基于不同成分的密度，将全血分离成其组成成分，包括血小板。在血小板分离中，有时称为血小板去除法或血小板提取法，通常浓缩血小板以形成具有一些残余血浆的浓缩血小板层。

Fekete N.等人(Cytotherapy，2012，14，540-554)报道了来自全血衍生的合并血小板浓缩物的血小板裂解物，用于骨髓间充质基质细胞的扩增。还公开了高血小板含量对于成功应用是必须的。

总是指出，为了储存和/或输血给患者，血小板浓缩物必须重新悬浮在液体介质(如血浆)中，且血小板不应冷冻以避免血小板裂解。

WO2014027362A1和WO2014027363A1描述了来自人血小板的不含细胞碎片的生长因子浓缩物能够用于治疗毛发脱落浓缩物。

Murphy B.M.等人(Biomaterials，2012，33，5308-5316)报道了富含血小板的血浆用于干细胞增殖。

因此，需要不断提供优化的血小板浓缩物，其能够用于美容和重建治疗，特别是用于治疗毛发脱落，并且在整形手术中，其可以克服目前可获得的富含血小板的血浆或血小板浓缩物的缺点。此外，还需要提供足够量的最佳浓度和足够量的富含血小板的血浆，因为实际方法涉及相当大体积血液的损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的血小板浓缩物及其新应用。

该目的是通过本申请的主题解决。

根据本发明的实施例，发明人提供了一种新型的降解的血小板浓缩物，其是自体或异体来源的血小板浓缩物，含有≤50％完整的血小板和优选≥200pg/ml的RANTES。

具体地，所述血小板浓缩物是未过滤的浓缩物，因此在制备过程中不进行用于除去细胞碎片的过滤和/或无菌过滤。

根据本发明的另一个实施例，所述血小板浓缩物不含等渗介质或电解质等渗溶液。

所述血小板浓缩物优选不含凝血酶或任何其它血小板活化剂。

根据具体的实施例，所述降解的血小板浓缩物是通过冻融血小板级分获得的，从而获得了血小板浓缩物，由于冻融过程，其中超过50％的血小板被破坏，具体地含有≤40％完整的血小板，特别是≤30％，特别是≤20％，特别是≤10％，特别是≤1％完整的血小板。

在具体的实施例中，所述血小板浓缩物不含完整的血小板细胞。

根据本发明，所述血小板浓缩物的来源是含有血小板的级分，优选地，该级分从血液成分分离级分获得，特别是从机采血小板或单采血小板级分或合成来源获得。

根据可替代的来源，合成或半合成的血小板或血小板替代浓缩物可用于本发明。

本发明还特别提供了配制成香膏(balm)、溶液、悬浮液、乳液、软膏、泡沫、糊剂、凝胶、乳膏、洗液(lotion)、粉末或药膏的血小板浓缩物。

根据一实施例，本发明提供了本发明的血小板浓缩物用于制备药物，特别是用于刺激细胞生长、细胞再生或组织再生。

发明人还证明，已经冷冻和解冻或以其他方式处理以减少完整的血小板细胞的数量的血小板浓缩物可用于治疗毛发脱落并且增加移植脂肪的存活和吸收，特别是在美容和重建手术中。

发明人还证明，这种方法可以成功实施，因为PRP在美容和重建手术中的有益效果，不是由于完整和功能性的凝血细胞，而可能是由于PRP含有的生长因子或任何其他蛋白质或多肽。

根据本发明，提供了一种降解的、特别是未过滤的血小板浓缩物，其含有≤50％完整的血小板，用于预防或治疗毛发脱落和/或促进毛发生长。

根据本发明的实施例，毛发脱落可以是瘢痕性或非瘢痕性毛发脱落、秃头症、雄激素性脱发、斑秃。

根据本发明的另一实施例，所述血小板浓缩物可以用于预防或治疗头发稀疏和/或毛囊细胞和/或头皮再生。

根据又一实施例，所述血小板浓缩物局部、皮内地或皮下施用，特别地经由针或微针施用。

在另一实施例中，重复施用所述血小板浓缩物。

令人意外地，本发明还显示出本发明的血小板浓缩物可以用于以美容和重建为目的的脂肪填充领域。

因此，本发明还提供了一种新型组合物，其包含含有≤50％完整的血小板的降解的血小板浓缩物，所述降解的血小板浓缩物与分离的人体脂肪细胞混合。具体地，所述浓缩物和脂肪细胞来源相同，即来自相同的供体。具体地，所述组合物是自体来源。

根据具体实施例，所述脂肪细胞来自脂肪组织提取物。

脂肪细胞和血小板浓缩物的最佳体积比可由任何技术人员确定，优选体积比为10:1至2:1，特别是至少5:1至3:1。

根据本发明，还提供了富含脂肪的移植物，其包含根据本发明的组合物。

根据另一个实施例，本发明的组合物和/或富含脂肪的移植物用于美容和重建手术。

本发明还提供了一种制备如上所述的降解的血小板浓缩物的方法，包括以下步骤：

-在不含任何冷冻保护剂和/或不含等渗介质情况下，在约-10℃、特别是约-15℃、特别是约-20℃、特别是约-25℃、特别是约-30℃、特别是约-35℃、更特别地约-40℃，冷冻含有血小板的级分，任选地存在抗凝血剂，和

-任选地将冷冻的血小板浓缩物储存大约几个小时至一年或多年；

-在室温下解冻所述级分以及任选地，

-重复冻融过程，直到破坏至少50％的血小板，特别是至少80％，更特别是至少90％。

本发明还提供了一种用于美容和/或重建乳房手术的方法，其中将本发明的组合物或富含脂肪的移植物施用于有需要的患者以增加乳房体积或用于重建手术的任何其它应用，例如体积再造或美容矫正，其中将脂肪细胞施用于面部或患者身体的任何其他区域。

根据本发明的另一个实施例，重复施用本发明的组合物或富含脂肪的移植物。

本发明还提供了一种提供恒定组成的始终富含脂肪的移植物，其中将50-300ml本发明的组合物填充在储存装置中并在合适的条件下储存。

具体实施方式

本发明提供了降解的血小板浓缩物，其含有≤50％完整的血小板和优选含量≥200p/ml的RANTES。

本文所涵盖的术语“血小板浓缩物”是指任何血小板或凝血细胞浓缩物或血小板或凝血细胞级分，其中至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选超过95％的血小板通过化学或非化学方法破坏或裂解。

根据具体实施例，所述降解的血小板浓缩物不含完整的血小板，特别是包含血小板裂解物及其各自的细胞多肽和蛋白质。

因此，本发明的血小板浓缩物含有<50％完整的血小板，特别是≤40％，特别是≤30％，特别是≤20％，特别是≤10％，特别是≤1％完整的血小板。

根据本发明的术语“不含完整的血小板”是指至少99％的血小板被破坏，特别是99.5％，特别是超过99.9％。因此，术语不含完整的血小板是通过含有<1％完整的血小板来定义的，特别是<0.5％，特别是<0.1％，特别是<0.01％。

在另一个实施例中，所述血小板浓缩物含有至少200pg/ml的RANTES(CCL5)。

根据另一个实施例，所述血小板浓缩物含有增加量的其它生长因子，例如EGF、VEGF、PDGF、转化生长因子β1。

具体地，本发明的血小板浓缩物还包含至少一种生长因子，所述生长因子选自由PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-AA、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、趋化因子(CCL5)、转化生长因子β(TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TFNα)、白介素1α(IL-1α)、白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-8)、白介素19(IL-10)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)、细胞分化抗原40(CD40L)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM1、CD54)、趋化因子配体(例如CXC配体、C-C配体)组成的组。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有200.000-600.000pg/ml的PDGF-AB/BB。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有150.000-250.000pg/ml的PDGF-AA。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有1000-1300pg/ml的EGF。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有100-250pg/ml的VEGF。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有100-500pg/ml的bFGF。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有2×10log6-3.10log6pg/ml的趋化因子。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有50.000-150.000pg/ml的TGF-β。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有10-20pg/ml的IFNγ。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有50-100pg/ml的GCSF。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有15-55pg/ml的GMCSF，特别是18-50pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有5-12pg/ml的TFNα，特别是6-10pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有30-50pg/ml的IL-1α，特别是35-47pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有0.5-6pg/ml的IL-1β，特别是1-5pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有1-5pg/ml的IL-6。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有15-50pg/ml的IL-7，特别是30-47pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有70-90pg/ml的IL-8，特别是74-86pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有0.5-6pg/ml的IL-10，特别是1-5pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有250-400pg/ml的MIP-1α，特别是290-360pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有30-60pg/ml量的MIP-1β，特别是43-51pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有21000-40000pg/ml的CD40L，具体地21350-38100pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有600000-3000000pg/ml的VCAM-1，特别是690000-2897000pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有40000-250000pg/ml的ICAM-1，特别是43000-231000pg/ml。

根据一个具体实施例，本发明的血小板浓缩物含有4000-20000pg/ml的CXC配体，特别是4600-17600pg/ml。

术语“自体来源”是指基于一种或多种捐献，浓缩物源自从单一供体分离的血小板级分。优选地，所述血小板浓缩物在单次收集过程中或在几次收集过程中获得，并且储存用于单次或重复施用。在自体设置中，供体和患者是同一个人。

根据优选实施例，所述血小板浓缩物是自体来源的。

术语“异体来源”是指所述浓缩物源自从健康供体分离的血小板级分或源自供体库。所述浓缩物用于非供体的人/患者。优选地，所述血小板浓缩物在单次收集过程中从单个供体获得。

术语“合成来源”是指所述浓缩物由合成产生，即源于合成的血小板替代物。

用作本发明降解的血小板浓缩物的源材料的所述富含血小板的级分可以是但不限于全血、富含血小板的血浆或其他浓缩血液。

根据本发明的降解的血小板浓缩物特别是来源于或源自任何富含血小板的级分，含有至少150000完整的血小板/μl，特别是>200000完整的血小板/μl，特别是>500000完整的血小板/μl，优选>1.10⁶/μl。

在一个具体的实施例中，所述富含血小板的级分是从血液成分分离级分获得的，具体地从机采血小板或单采血小板或血浆去除法的级分获得。

用作源材料的富含血小板的级分的病毒灭活可以通过用于血浆或全血病毒灭活的任何已知的方法进行，其可以是但不限于溶剂-洗涤剂(SD)处理并加入亚甲基蓝(MB)、UV处理、补骨脂素处理(例如补骨脂素S-59)、加入维生素B2和广谱UV光、窄带UV-C光(Schlenke P，2014，Transfus.Med.Hemother.，41，309-325)。

根据本发明，可以使用本领域技术人员已知的任何化学或非化学方法进行血小板裂解。优选地，非化学处理血小板/细胞裂解，包括但不限于冻融法、超声法、冻干法、使用弗氏细胞压碎器、热处理法、低渗休克法或氮蚀法。

优选地，冻融血小板源。

根据优选的方法，将含有血小板的级分(platelet containing fraction)在至少-10℃的温度下冷冻，特别是至少-25℃，特别是至少-30℃，特别是至少-35℃，优选地在不存在任何冷冻保护剂的情况下，需要足够时间进行细胞裂解，具体地至少15分钟，具体地至少20分钟，具体地至少30分钟，具体地至少45分钟，具体地1小时，具体地至少1.5小时，具体是至少2小时。具体地，冷冻温度高于-120℃，具体地高于-85℃，具体地高于-80℃，具体地高于-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-35℃、-30℃。

冷冻后在室温下进行解冻处理，具体地在25℃，更具体地在约27.5℃，具体地在约30℃，具体地在约35℃，具体地在约37.5℃。

根据一个具体实施例，通过冻融循环重复处理血小板级分，具体地，所述循环可以重复2次、3次、4次、5次或更多次，直到达到所需的血小板裂解。

具体地，所述血小板浓缩物不含任何血小板活化剂，例如不含凝血细胞、CaCl₂和其他添加剂(如海藻糖)。

具体地，本发明的血小板浓缩物不进行进一步过滤。

具体地，血小板浓缩物不含等渗缓冲液或电解质等渗介质。

更具体地，血小板浓缩物不含NaCl、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、KCl、氯化镁、人血清白蛋白。

根据本发明的血小板浓缩物可以具有适用于各种需要的任何结构或稳定性。具体地，这种浓缩物可以以涂层的形式(例如凝胶、乳膏或糊剂)施用到个体的表面或伤口，或者其可以直接以液体形式施用，例如，通过吸入

或者，其可以配制成香膏、悬浮液、乳液、软膏、泡沫、糊剂或洗液。

本发明还提供了将所述血小板浓缩物用于制备药物。

本发明的血小板浓缩物可以用于刺激毛发生长、毛发增多、细胞生长、细胞再生或组织再生或增加脂肪填充的吸收。

用于制备本发明降解的血小板浓缩物的方法，包括以下步骤：

-冷冻含有血小板的级分，任选地，存在抗凝血剂，和

-任选地储存冷冻的血小板浓缩物；

-解冻所述级分。

用于制备本发明降解的血小板浓缩物的替代方法，包括以下步骤：

-在约-25℃冷冻含有血小板的级分，可选地，在存在抗凝血剂的情况下冷冻至少30分钟，和

-可选地，将冷冻的血小板浓缩物储存约几小时/天/年；

-在室温下解冻所述级分约30分钟。

可选地，可以通过已知的方法处理血小板浓缩物以浓缩各自的血小板裂解化合物。所述方法可以是例如过滤或离心。

血小板浓缩物的制备应在无菌条件下进行。

为了进一步纯化，还可以通过病毒灭活处理血小板浓缩物。

在使用合成或自体血小板浓缩物的情况中，可能不需要去除病毒的方法。

血小板浓缩物还可以在冷冻条件下储存数天、数周、数月或数年。

本发明的另一方面是，使用本发明的降解的、自体来源的血小板浓缩物用于预防或治疗脱发和/或促进毛发生长的新方法，所述血小板浓缩物含有≤50％的完整血小板。

所述降解的血小板浓缩物可以单次施用或重复给药。

例如，本发明降解的血小板浓缩物可以每一个月、两个月、三个月至四个月或任何其它期望的间隔施用于头皮。或者，所述降解的血小板浓缩物可以在手术前或手术期间施用以确保成功的自体毛发移植物存活。

本发明的浓缩物也可用于自然刺激稀疏的头发。

所述降解的自体血小板浓缩物含有血小板裂解物，其可以通过刺激位于真皮乳头以及毛囊的其它结构中的干细胞来引起毛发生长。这些裂解物促进愈合、加速组织愈合和再生的速度和程度，使身体对损伤做出响应以及诱导新细胞生长。在毛发修复中使用自体降解的血小板浓缩物的主要目的是刺激无活性或新植入的毛囊进入活性生长期。

毛囊具有非常复杂的生物学结构，而毛发生长过程由特定的生长周期调节。成熟的卵泡经历从生长期，活跃的毛干的产生，到退行期(驱动细胞凋亡的回归)到休止期，毛囊退化的休止期的连续转化。通过半胱天冬酶级联反应(caspases cascade)的途径，细胞凋亡在确定从生长期到退行期的作用是众所周知的。许多生长因子在毛囊的终生循环转化中发挥根本的作用，其作为在不同阶段开启和关闭控制激活期并促进细胞凋亡的生物开关，以诱导生长期和休止期。在毛囊形成中涉及的主要生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素1样生长因子和成纤维细胞生长因子(FGF)。血小板裂解物含有大量血小板衍生的生长因子(PDGFAA、PDGF BB和PDGF AB)，转化生长因子β(TGFβ1和β2)。

使用本发明降解的血小板浓缩物可以增加真皮乳头细胞的增殖并刺激细胞外信号调节激酶和Akt的信号传导。所述降解的血小板浓缩物的有益效果可归因于各种血小板衍生的生长因子引起的毛囊功能的改善并促进毛发生长，同时避免增加失血，并且在单次治疗中不需要重复的血液捐献。本发明血小板浓缩物的另一个有益效果可能是由于源自富含血小板的级分的成分的平衡存在，除了冷冻和解冻之外，这些成分并没有特别地通过过滤或任何其它处理除去。

具体地，所述降解的血小板浓缩物可用于预防或治疗任何类型的毛发脱落，无论是遗传性还是非遗传性毛发脱落，例如瘢痕性或非瘢痕性脱发、秃头症、雄激素性脱发，斑秃，稀毛症。

它还可以用于预防或治疗毛发稀疏和/或毛球细胞和/或头皮再生。

所述血小板浓缩物可以局部、皮内或皮下或经由针(例如微针)施用。所述血小板浓缩物可以通过nappage技术施用，即无菌条件下在1cm间隔的线形图案中进行多次小注射。

根据另一方法，在自体头发移植后刺激头皮以激活伤口愈合过程。可以在将注射血小板浓缩物的头皮部位实施局部麻醉。除了注射本发明的血小板浓缩物外，还可以使用微型针刺辊装置。所述辊使用约200个非常细的针以刺穿表皮，产生微创伤，从而刺激胶原蛋白形成。除了注射外，然后将本发明的血小板浓缩物另外施用于微型针刺区域。所产生的“微通道效应”也有助于使血小板浓缩物输注到该区域，从而提高有效性。

在单次应用中施用的降解的血小板浓缩物的体积相对于该区域的表面而变化，具体地，其可以在小于5ml至大于15ml之间。

根据美容和乳房重建手术以及身体的其他重建和美容过程中的既定方法，所述降解的血小板浓缩物在快施用前与脂肪细胞结合。已经证明，所述降解的血小板浓缩物是脂肪的有用辅助物，用于增强脂肪填充的吸收。

通过使用该方法，患者不需要经历反复的血液或血浆捐献，但是需要提供质量稳定且足够量的降解的自体血小板浓缩物，其可以在冷冻条件下储存，并且可以在手术需要时解冻并重复施用而无任何副作用。

富含血小板的浓缩物的浓度与正常血浆相比约为1：5，且降解的血小板浓缩物与脂肪的体积比为1：3至1：5，根据各自的需要，特别是达到1:10。

为了实际生产PRP，各个医疗供应商提供了许多试剂盒。所有这些试剂盒的特征在于：从患者身上采血，离心，然后将所得的等离子体柱用于富集脂肪，而丢弃浓缩的红细胞以及最常见的-根据相关的医生的规定-还有血沉棕黄层。鉴于使用任何现有的试剂盒，可以从10ml血液中获得的PRP量在1-3ml之间变化的事实，因此仅可以对少量脂肪移植进行有效的PRP富集。因此，PRP浓缩在面部美容过程方面仍然受到限制，其中1)在接受区少量的脂肪就足以达到所需的体积增加以及2)少量的PRP足以使具有实际推荐的浓度和体积比的该少量脂肪富集。

然而，对于美容隆胸，每边需要200-350ml的脂肪，因此PRP富集几乎是不可能的，因为对于500ml自体脂肪需要约100ml的PRP。使用可购得的试剂盒生产100ml PRP，需要500-1000ml的血液，而对于接受手术的患者，该体积损失是无法忍受的。

令人惊奇地，发明人发现了一种生产优越功效和耐受性的大体积血小板浓缩物的方法，其可以以任何所需的浓度生产而不必浪费单一的红细胞，并且具有可以以分批方式提供的稳定的质量和组成。

因此，本发明的另一方面是一种新型的组合物，其包含降解的血小板浓缩物并与来自相同个体的分离的人体脂肪细胞结合，具体地，所述降解的血小板浓缩物是自体来源含有≤50％完整的血小板。

脂肪组织或身体脂肪是主要由脂肪细胞组成的疏松的结缔组织，。除了脂肪细胞外，脂肪组织含有细胞的基质血管级分(SVF)，所述细胞包括前体脂肪细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和各种免疫细胞(即脂肪组织巨噬细胞(ATM))。脂肪组织来源于前体脂肪细胞。它的主要作用是以脂质的形式储存能量，尽管它也使身体缓冲和绝缘。脂肪组织的两种类型是白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)。

具体地，本发明所使用的自体脂肪细胞来自通过抽脂方法获得的脂肪组织提取物。脂肪组织提取物是丰富的干细胞源；脂肪干细胞可以从脂肪组织提取物中大量获得。

脂肪细胞和血小板浓缩物的重量比优选为10:1至2:1，特别是8:1和2.5:1，更特别是6:1至3:1，更特别是5:1至3:1。

脂肪细胞和降解的血小板浓缩物的所述组合也可用于提供富含脂肪的移植物。

根据本发明，术语富含脂肪的移植物包括本发明的血小板浓缩物和脂肪细胞的混合物，任选地用水溶液洗涤，特别是人体脂肪细胞。脂肪细胞和血小板浓缩物的比例为10：1至2：1，特别是10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1。

可以通过任何缓冲液或水溶液洗涤从患者分离的人体脂肪细胞，例如，盐水溶液，特别是用于去除血细胞。

已经成功地证明，用于重建和美容手术时，本发明的组合物非常有利，特别是在需要大量的脂肪细胞用于重建的外科手术中，特别是在乳房手术中或不期望重复、痛苦和耗时的血液捐献时。

因此，本发明提供了一种用于乳房重建和乳房美容手术，其中将本发明的组合物或包含所述组合物的富含脂肪的移植物施用于有需要的患者，以增加乳房体积，并且当需要重复应用时，还提供了一种对任何种类的脂肪填充手术非常有利的方法。

具体地，本发明的组合物也可以用于镇痛治疗，其中将组合物施用于通过手术方法去除组织的区域部位或疤痕处。

所述施用可以是单次施用或重复施用。

该组合物可以填充到袋子、注射器或任何其它适当的储存装置中并储存以用于反复使用，特别是提供相同或相似含量的组合物。

具体地，包括提供恒定组合的始终富含脂肪的移植物的方法，其中将50-300ml或更多的组合物填充到储存装置中。

本发明还包括以下条目：

1.降解的血小板浓缩物，其含有≤50％完整的血小板和≥200pg/ml的RANTES。

2.根据条目1所述的血小板浓缩物，其中所述浓缩物是自体、异体或合成来源。

3.根据条目1或2所述的血小板浓缩物，其中所述降解的血小板浓缩物是通过冻融血小板级分获得的。

4.根据条目1-3所述的血小板浓缩物，其中所述血小板级分是从血液成分分离级分获得，特别是从机采血小板级分获得。

5.根据条目1-4中任一项所述的血小板浓缩物，其中所述血小板浓缩物含有≤40％完整的血小板，特别是≤30％，特别是≤20％，特别是≤10％，特别是≤1％完整的血小板。

6.根据条目1-5中任一项所述的血小板浓缩物，其中所述血小板浓缩物不含完整的血小板。

7.根据条目1-6所述的血小板浓缩物，其中所述血小板浓缩物配制为香膏、溶液、悬浮液、乳液、软膏、泡沫、糊剂、凝胶、乳膏、洗液、粉末或药膏。

8.根据条目1-7中任一项所述的血小板浓缩物用于制备药物。

9.根据条目1-8的血小板浓缩物用于刺激细胞生长、细胞再生或组织再生。

10.降解的血小板浓缩物的应用，其含有≤50％完整的血小板，用于预防或治疗毛发脱落和/或促进毛发生长。

11.根据条目1-10中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中所述毛发脱落选自由瘢痕性或非瘢痕性毛发脱落、秃头症、雄激素性脱发、斑秃组成的组。

12.根据条目1-11中任一项所述的血小板浓缩物的应用，用于预防或治疗头发稀疏和/或毛囊细胞和/或头皮再生。

13.根据条目1-12中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中重复施用血小板浓缩物。

14.根据条目10-13项中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中所述血小板浓缩物局部、皮内或皮下施用或经由针施用。

15.一种组合物，其包含根据条目1-7中任一项所述的降解的血小板浓缩物和人体脂肪细胞。

16.根据条目15所述的组合物，其中所述脂肪细胞来自脂肪组织提取物。

17.根据条目15或16所述的组合物，其中脂肪细胞和血小板浓缩物的重量比为10:1至4:1，特别是5:1至3:1。

18.根据条目15-17中任一项所述的组合物，其中所述人体脂肪细胞和血小板浓缩物来自相同的供体。

19.富含脂肪的移植物，其包含根据条目15-18中任一项的组合物。

20.根据条目15-19中任一项所述的血小板浓缩物或组合物或富含脂肪的移植物，用于人体的美容和重建手术，特别是用于乳房手术。

21.制备根据条目1-6中任一项所述的降解血小板浓缩物的方法，包括以下步骤：

-冷冻含有血小板的级分，任选地存在抗凝血剂；和

-任选地储存冷冻的血小板浓缩物；

-解冻所述级分。

22.用于脂肪填充的方法，其中将根据条目15-18中任一项所述的组合物或根据条目19的富含脂肪的移植物施用于有需要的患者，以在身体的任何区域增加任何所需量的体积。

23.用于乳房手术的方法，其中将根据条目15-18中任一项的组合物或根据条目19所述的富含脂肪的移植物施用于有需要的患者以增加乳房体积。

24.根据条目22或23所述的方法，其中重复施用所述组合物或富含脂肪的移植物。

25.根据条目22或23所述的方法，其中所述组合物是自体组合物。

26.用于提供连续的恒定组合的始终富含脂肪的移植物的方法，其中将50-300ml根据条目19的组合物填充在储存装置中。

本文描述的实例是对本发明的说明，并不意图对其进行限制。根据本发明已经描述了本发明不同的实施例。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述和示出的技术进行许多修改和变化。因此，应当理解，这些实例仅是说明性的，并不限制本发明的范围。

实例

实例1：冷冻和解冻血小板级分以制备降解的血小板组合物：

为了细胞裂解/打破外细胞膜，冷冻和解冻血小板。为了冷冻血小板级分，在不加入任何冷冻保护剂的情况下，将溶液暴露在低于-25℃的温度下，并保持在低于-25℃的温度至少2小时。在室温下进行解冻。冷冻-解冻循环至少重复两次，并且通过在商品化的细胞计数器上进行常规的血液计数来控制细胞裂解。应该裂解至少>80％的血小板，否则重复冷冻/解冻循环，直到最终的QC参数达到>80％血小板裂解为止。最终无血小板的上清液可以储存在低于-25℃的温度直至使用。

实例2：在乳房手术中使用降解的血小板组合物

接受乳腺癌手术(部分乳房切除/乳房肿瘤切除术)以及已计划用自体脂肪转移(脂肪填充)进行乳房重建的女性患者参加了这项试点研究。在手术之前，将所有患者送至血型血清和输血科，以检查自体PRP捐献的资格(病毒载量、肘静脉口径)。如果符合资格，则进入医院就诊，并将病人转介到血型血清和输血科，在那里，患者连接细胞分离器(来自Fresenius Inc.的Amicus^TM)。45分钟内，分离出100毫升血小板浓度是外周血1/7的PRP，将所述级分分成10份10毫升，然后进行如上所述的冷冻和储存过程。在手术当天，外科医生预估所需体积的脂肪，并且通知血型血清和输血科解冻冷冻的浓缩物，解冻量为预估患者转移脂肪量的五分之一。通过半湿法，用环乳酸和1mg肾上腺素/500ml浸润供体部位。用Sattler插管(3mm直径，直径为1.5mm的16个孔)和小于0.5bar的真空手工去除脂肪。接下来，用盐水溶液反复清洗得到的脂肪组织提取物，直至去除大部分的血细胞。最后，将解冻的浓缩物送至室温，接着通过气动输送运送至手术室，并立即以1:5的比例加入已清洗的脂肪中，完成脂肪填充。

结论

可以在所有适合静脉的患者中实施富含PRP的脂肪填充。转移的脂肪量从90ml到320ml，分别加入1/5体积的PRP。术后没有发生并发症，即无感染、肿块形成等。术前1天、术后10天、1个月及3个月后，所有患者均可预期。

实例3：制备自体血小板(凝血细胞)浓缩物(PC)“

测试患者无病毒和细菌感染，并连接细胞分离器(来自Fresenius的模型Amycus)约45分钟。

获得250ml的血小板浓缩物(PC)，并通过使用标准塑料袋将其分成每小份10ml(如果专用于头发修复)或40ml(如果专用于自体脂肪及转移)。

步骤1

将袋子在-80°冷冻并储存3周。解冻、测试和释放小样品。在每次手术步骤前，将袋子交给手术组，在室温下解冻并立即使用。

步骤2

将袋子在-80°冲击冷冻20分钟，解冻并再次冲击冷冻。解冻、测试和释放小样品。在每次手术步骤前，将袋子交给手术组，在室温下解冻并立即使用。

实例4：秃头症治疗

预处理头皮

步骤1：

用70％酒精清洗头皮，将2％的利多卡因与1：100000肾上腺素(3-5mL)的局部麻醉剂注射到额叶和顶叶区域。

步骤2

要求患者在干预前2小时用消毒的洗发水清洗头发。患者用咪达唑仑/异丙酚镇静。

治疗

皮内注射解冻的血小板浓缩物(PC)，使用26规针(cauge needle)进行0.1-0.2ml/注射。注射间距：1-1.5cm，取决于治疗面积，进行50-200次注射。

患者每4周共进行3-5次治疗。

治疗6个月后，可以看到患者有显著的改善。

实例5：自体脂肪移植-乳房重建

将40ml血小板浓缩物(PC)与通过抽脂获得的自体脂肪按1∶4(v/v)混合。

在完全麻醉下进行脂肪获取，然后用半湿法将溶液(1000ml乳酸林格氏液(RingerLactate)+1mg肾上腺素)滴注到供体区域。等待10分钟后，用手和10mlLuer接口注射器(Luer-Lock Syringes)和插管(直径为2mm和直径为1mm的18个孔)进行抽脂。

将脂肪组织提取物在1000-1200g力离心14秒；然后将脂肪柱状物转移到60ml大的Luer接口注射器中；当填充至50ml时，加入10ml PC；然后温和连续混合，将脂肪/PC悬浮液转移到5ml小的Luer接口注射器中，并通过亚胸部、外膜和皮下位置转移到乳房，避免内插应用。

根据患者的情况，每2个月重复一次第三步骤，至评估前一次治疗成功后，通常进行3-4次。在最后一次治疗3个月后，可以看到患者有显著的改善。

文献

Lee，S.·H.et al.Therapeutic efficacy of autologous platelet-richplasma and polydeoxyribonucleotide on female pattern hair lossWound RepairRegen.23，30-36(2015).

Schiavone，G.，Raskovic，D.，Greco，J.&Abeni.D.Platelet-R_ich Plasma forAndrogenetic Alopecia：A Pilot Study.Dermatol.Surg.40，1010-1019(2014).

Cervelli.V.et alThe Effect of Autologous Activated Platelet RichPlasma(AA-PRP)Injection on Pattern Hair Loss：Clinical and HistomorphometricEvaluation.Biomed Res.Int.760709(2014).doi：101155/2014/760709Sclafani，A，P.Platelet-Rich Fibrin Matrix(PRFM)for Ardrogenetic Alopecia.FacialPlast.Surg.30，219-224(2014).

Takikawa，M.et al.Enhanced Effect of Plateet-Rich Plasma Containing aNew Carrier on Hair Growth.Dermatol.Surg.37，1721-1729(2011).

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Claims

1.降解的血小板浓缩物的应用，所述降解的血小板浓缩物含有≤50％完整的血小板，用于预防或治疗头发稀疏或毛发脱落和/或促进头发生长。

2.根据权利要求1所述的血小板浓缩物的应用，其中所述脱发选自由瘢痕性或非瘢痕性毛发脱落、秃头症、雄激素性脱发、斑秃组成的组。

3.根据权利要求1或2所述的血小板浓缩物的应用，用于再生毛囊球部细胞和/或头皮。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中所述血小板浓缩物局部、皮内或皮下施用或经由针施用。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中所述降解的血小板浓缩物是通过冻融血小板级分获得的。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中所述血小板级分是从血液成分分离级分获得的，特别是从机采血小板级分获得的。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中所述血小板浓缩物含有≤40％完整的血小板，特别是≤30％，特别是≤20％，特别是≤10％，特别是≤1％，特别是血小板浓缩物不含完整的血小板。

8.降解的血小板浓缩物，其含有≤50％完整的血小板和≥200pg/ml的RNATES。

9.根据权利要求8所述的血小板浓缩物，用于制备药物。

10.根据权利要求8或9所述的血小板浓缩物的应用，用于刺激细胞生长、细胞再生或组织再生。

11.一种组合物，其包含根据权利要求8所述的降解的血小板浓缩物和人体脂肪细胞。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述脂肪细胞从脂肪组织提取物。

13.根据权利要求11或12所述的组合物，其中所述人体脂肪细胞和所述血小板浓缩物来自相同的供体。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的组合物，其中脂肪细胞和血小板浓缩物的体积比为10:1-4:1，特别是5:1-3:1。

15.富含脂肪的移植物，其包含根据权利要求11-14中任一项所述的组合物。

16.根据权利要求8-15中任一项所述的血小板浓缩物，用于增加脂肪体积，特别是用于增加乳房体积。

17.根据权利要求1-7中任一项所述的血小板浓缩物的应用或根据权利要求8-15中任一项所述的血小板浓缩物，其中所述浓缩物是自体、异体或合成来源的。

18.根据权利要求1-7中任一项所述的血小板浓缩物的应用或根据权利要求8-15中任一项所述的血小板浓缩物，其中所述血小板浓缩物配制成香膏、溶液、悬浮液、乳液、软膏、泡沫、糊剂、凝胶、乳膏、洗液、粉末或药膏。

19.根据项1-18中任一项所述的血小板浓缩物的应用，其中重复施用所述血小板浓缩物。

20.制备根据权利要求8-10中任一项所述的降解的血小板浓缩物的方法，包括以下步骤：

-冷冻含有血小板的级分，任选地存在抗凝剂而不存在冷冻保护剂；

-任选地储存所述冷冻的血小板浓缩物；

-在室温下解冻所述级分。

21.用于脂肪填充的方法，其中将权利要求11-15中任一项所述的组合物施用于有需要的患者，以在身体任何区域增加任何所需量的体积。

22.用于乳房手术的方法，其中将权利要求11-15中任一项所述的组合物施用于有需要的患者，以增加乳房体积。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述组合物是自体组合物。

24.提供恒定复合的始终富含脂肪的移植物的方法，其中将50-300ml的根据权利要求15所述的组合物填充在储存装置中。