CN107574159A

CN107574159A - 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体

Info

Publication number: CN107574159A
Application number: CN201711012420.1A
Authority: CN
Inventors: 刘松; 任蕊蕊; 李江华; 陈坚; 堵国成; 石�诚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2018-01-12
Anticipated expiration: 2037-10-26
Also published as: CN107574159B

Abstract

本发明公开了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于基因工程和发酵工程领域。本发明以解脂耶氏酵母为宿主，构建了高产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌po1h/hpro‑mTG。该菌株产酶水平高，摇瓶发酵酶活可达11.7U/mL，较改造前提高了106倍，发酵罐发酵酶活可以达到43.7U/mL。通过共表达蛋白酶TAMEP和hpro‑mTG，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，摇瓶发酵酶活可达6.7U/mL，发酵罐发酵酶活达到21.4U/mL。本发明构建的重组菌发酵产酶水平高，可降低谷氨酰胺转氨酶的生产成本，利于谷氨酰胺转氨酶的工业化生产。

Description

一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体

技术领域

本发明涉及一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于酶工程领域。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)，可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联。TGase在食品加工领域的应用广泛，比如，TGase可使蛋白质与必须氨基酸(如赖氨酸)交联，提升一些食品的营养价值。TGase可以将碎肉粘结成块，提高肉制品的利用率，改善肉制品的弹性。此外，TGase在医药，化妆品，生物技术研究，纺织业及皮革加工等领域均有巨大的市场需求。

微生物具有生产成本低、易于培养和改造等优点，所以生产上主要依赖微生物来生产TGase。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原(pro-MTG)的形式分泌，需经蛋白酶dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性MTG。酶原区(pro)位于信号肽与成熟酶之间，属于前导肽，对谷氨酰胺转氨酶的折叠和分泌具有重要的影响。有些链霉菌如Streptomyces lividans 3113、Streptomyces ladakanum等，其自身可以表达活化MTG的蛋白酶，因而可以表达活性MTG，但是MTG酶活相对较低，普遍在1.0-6.0U/mL。

近年来利用基因工程技术将谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌等异源宿主中表达MTG成为了一种新的趋势，然而，一方面，大肠杆菌等异源宿主是非食品级表达体系，另一方面，在异源宿主中，谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原的形式分泌，需在体外经蛋白酶TAMEP，SAM-P45，dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性谷氨酰胺转氨酶。且重组菌生产谷氨酰胺转氨酶的产量普遍较低，如刘松的《Overproduction ofpro-transglutaminase from Streptomyces hygroscopicus in Yarrowia lipolytica andits biochemical characterization》中将吸水链霉菌来源的pro-TGase的突变体N355Q异源表达得到重组菌产量可达35U/mL，重组菌产谷氨酰胺转氨酶的产量有提升较小。因此，如何在食品级表达体系中稳定、的直接表达谷氨酰胺转氨酶，是目前亟待解决的问题。另外，如果在异源宿主中可以直接表达活性谷氨酰胺转氨酶，不仅可以简化生产步骤，还能降低生产成本，一举两得。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体。

本发明第一个目的是提供一种高效表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达所述突变体的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。

本发明第三个目的是提供一种所述的重组菌的构建方法是，具体步骤如下：

(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，所述吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(2)重组质粒pINA1297/hpro-mTG线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得重组菌po1h/hpro-mTG。

本发明的第四个目的是提供一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌，所述重组菌共表达蛋白酶TAMEP和hpro-mTG，所述蛋白酶TAMEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述hpro-mTG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第五个目的是提供一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌的构建方法，具体步骤如下：

将氨基酸序列为SEQ ID NO.4的蛋白酶TAMEP的基因构建质粒pINA1297/HT，将质粒线性化后转化到重组菌po1h/hpro-mTG中，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，得到表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/HM+HT。

本发明第六个目的是提供一种所述重组菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，所述方法的步骤如下：

(1)摇瓶培养：将重组菌接种于YPD液体培养基中，培养25-30℃，180-230rpm培养20-27h后，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25℃-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d。

(2)发酵罐培养方法：将重组菌接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。

重组菌po1h/hpro-mTG接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活最高可达43.7U/mL。

本发明的有益效果：

1.本发明通过改造茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区，得到了一种高产谷氨酰胺转氨酶的突变体，摇瓶发酵酶活可达11.7U/mL，较改造前提高了106倍，发酵罐发酵酶活可以达到43.7U/mL，为目前所报道的最高水平；通过共表达蛋白酶TAMEP和hpro-mTG，摇瓶发酵酶活可达6.7U/mL，发酵罐发酵酶活达到21.4U/mL，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，无需经酶切处理，不仅可以简化生产步骤，还能降低生产成本。

2.解脂耶氏酵母为食品级表达体系(已被FDA认定是安全的)，发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产。易于培养，发酵方法简单，周期短。高密度发酵，分泌能力强，利于大量表达谷氨酰胺转氨酶。本发明采用的po1h系的解脂耶氏酵母已敲除胞外蛋白酶基因，所以胞外几乎无杂蛋白，易于谷氨酰胺转氨酶的分离纯化。

3.本发明使用的谷氨酰胺转氨酶基因来源于茂源链霉菌，pH适应范围广，稳定性高(pH适应范围为5-9，最适反应pH范围为6-7，最适反应温度为55℃)。

附图说明

图1：重组菌发酵mTG酶活

图2：重组菌发酵上清SDS-PAGE图

图3：活性表达重组菌产mTG酶活

图4：活性表达mTG重组菌发酵上清SDS-PAGE图

具体实施方式

培养基：

LB培养基：Yeast Extract 5g/L，Tryptone 10g/L，NaCl 10g/L。

YPD培养基：Yeast Extract 10g/L，Tryptone 20g/L，葡萄糖20g/L。

YNB培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L。

固体培养基则是在液体培养基中加2％的琼脂。

发酵培养基：甘油15g/L，酵母粉20g/L，氯化铵2.64g/L，磷酸二氢钾0.32g/L，无水硫酸镁0.25g/L，维生素B13.34×10^-4g/L，调节pH至8.0。

proMTG的体外活化：

取40μL发酵上清，加入2μL中性蛋白酶dispase(0.1mg/mL)，用旋涡振荡仪混匀，37℃保温20min。

谷氨酰胺转氨酶酶活力的测定：

采用比色法测定谷氨酰胺转氨酶酶活。1个单位的酶活定义为：在37℃的条件下,每分钟催化α-N-CBZ-GLN-GLY合成1μmol的L-谷氨酸-γ-单轻胺酸所用的酶量(U/mL)。酶活测定条件：在37℃条件下，40μL发酵上清液，100μL 30mMα-N-CBZ-GLN-GLY反应10min，加入40μL终止剂(3M HCl，12％三氯乙酸，5％FeCl₃)终止反应。在525nm处测定吸光值，通过L-谷氨酸-γ-单轻胺酸绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。

MTG纯化方法：

发酵液于5000rpm，4℃条件下离心20min，收集上清液。上清液转移至透析袋中，于pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液中低温(4℃)透析12h，然后过0.22μm滤膜，并将样品收集至洁净的试管中。pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液平衡强阳离子交换柱Fractogel EMDSO₃ ^-，进样，之后继续用pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液洗下与柱子结合不牢的杂蛋白，然后用含有0-1.0mol/L NaCl的醋酸盐缓冲液(pH5.0，0.05mol/L)洗脱，在出峰处收集目的蛋白mTG。

实施例1重组菌po1h/hpro-mTG的构建

以实验室保留的质粒pINA1297/N355Q为模板，P1和P2为引物进行PCR，通过PCR扩增含有hpro酶原区的1297表达载体。PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，primeSTAR 25μL，双蒸水22μL。PCR条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃5min30s，72℃20min，30个循环。以实验室保留的质粒pET 20b/mpro-mTG为模板，P3和P4为引物进行PCR，通过PCR扩增含有mTG的基因片段。PCR扩增体系同上，PCR条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃1min 20s，72℃10min，30个循环。两种PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，回收产物以摩尔比为1:2进行混合，使用One Step Cloning Kit进行连接后，转化E.coli JM109，菌落PCR筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h,交由上海生工进行测序，测序正确即说明重组菌pINA1297/hpro-mTG构建成功。将重组质粒pINA1297/hpro-mTG经快切酶Not I线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得重组菌po1h/hpro-mTG。

表1引物

实施例2重组菌po1h/mpro-mTG的构建

质粒pINA1297/N355Q经快切酶Sfi I，BamH I酶切后进行胶回收，得到线性化的pINA1297基因片段。以实验室保留的质粒pET 20b/mpro-mTG为模板，P5和P4为引物进行PCR，通过PCR扩增mpro-mTG的基因片段。PCR扩增体系同实施例1，PCR条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃1min 20s，72℃10min，30个循环。PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，得到mpro-mTG的基因片段。pINA1297基因片段与mpro-mTG的基因片段以摩尔比为1:2进行混合，使用One Step Cloning Kit进行连接后，转化E.coli JM109，菌落PCR筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h,交由上海生工进行测序，测序正确即说明重组菌pINA1297/mpro-mTG构建成功。将重组质粒pINA1297/mpro-mTG经快切酶Not I线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得重组菌po1h/mpro-mTG。

实施例3重组菌po1h/hpro-mTG和重组菌po1h/mpro-mTG摇瓶发酵

将实施例1中构建的重组菌hpro-mTG与实施例2构建的重组菌po1h/mpro-mTG分别接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，按10％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶(规格：250mL)培养120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。检测发现酶活分别为11.7U/mL和0.11U/mL。重组菌po1h/hpro-mTG，酶原区替换为hpro后酶活较对照提高了106倍(图1)。SDS-PAGE的结果进一步论证了酶原区替换为hpro能显著提高谷氨酰胺转氨酶的分泌表达量(图2)。

实施例4重组菌po1h/hpro-mTG发酵罐发酵

实施例5：表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/HM+HT的构建

以实验室保留的质粒pINA1297/N355Q为模板，P1和P2为引物进行PCR，通过PCR扩增含有hpro酶原区的1297表达载体。PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，primeSTAR 25μL，双蒸水22μL。PCR条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃5min30s，72℃20min，30个循环。以实验室保留的质粒pINA1297/TAMEP-Q为模板，P6和P7为引物进行PCR，通过PCR扩增TAMEP基因。PCR扩增体系同上，PCR条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃2min 25s，72℃10min，30个循环。两种PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，回收产物以摩尔比为1:2进行混合，使用One Step Cloning Kit进行连接后，转化E.coli JM109，菌落PCR筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，交由上海生工进行测序，测序正确即说明重组菌pINA1297/HT构建成功。将重组质粒pINA1297/HT经快切酶Not I线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母重组菌hpro-mTG，经营养缺陷型培养基YNB筛选及菌落PCR验证后，获得一株表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/HM+HT。

实施例6重组菌po1h/HM+HT摇瓶发酵

将重组菌po1h/HM+HT种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，次日按10％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶培养120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，检测发现胞外酶活最高达到了6.768U/mL(图1)。SDS-PAGE的结果进一步论证了共表达TAMEP与hpro-mTG能实现谷氨酰胺转氨酶在解脂耶氏酵母中的活性表达。

实施例7重组菌po1h/HM+HT发酵罐发酵

重组菌po1h/HM+HT接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。

经检测酶活最高可达21.4U/mL。

实施例8酶学性质

对纯化谷氨酰胺转氨酶进行酶学性质方面的研究，具体见表2(mpro-mTG的酶活性质参考刘松的《A Rapid and Simple Method for the Purification ofTransglutaminase from Streptoverticillium Mobaraense》)。可以看出，重组菌hpro-mTG与野生菌相比比酶活有较大提高，km值变大。活性表达重组菌HM+HT与hpro-mTG各方面的性质相似，无太大变化。

表2酶学性质

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ala Ser Gly Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His

1 5 10 15

Gly Leu Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Lys Arg

20 25 30

Ala Leu Thr Ala Gly Gln Pro Gly Asn Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro

35 40 45

Ser Val Ser Ala Leu Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr

50 55 60

Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln

85 90 95

Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu

100 105 110

Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn

115 120 125

Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu

130 135 140

Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu

145 150 155 160

Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu

165 170 175

Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg

180 185 190

Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys

195 200 205

Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg

210 215 220

Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg

225 230 235 240

Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser

245 250 255

Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg

260 265 270

Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu

275 280 285

Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro

290 295 300

Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His

325 330 335

Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe

340 345 350

Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val

355 360 365

Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys

370 375 380

Gln Gly Trp Pro

385

<210> 2

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met

1 5 10 15

Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn

20 25 30

Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg

35 40 45

Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60

Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu

65 70 75 80

Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn

85 90 95

Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val

100 105 110

Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu

115 120 125

Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser

130 135 140

Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala

145 150 155 160

Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175

Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg

180 185 190

Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg

195 200 205

Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

210 215 220

Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile

225 230 235 240

Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255

Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp

260 265 270

Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met

275 280 285

His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp

290 295 300

Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn

305 310 315 320

Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

325 330

<210> 3

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Ala Ser Gly Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His

1 5 10 15

Gly Leu Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Lys Arg

20 25 30

Ala Leu Thr Ala Gly Gln Pro Gly Asn Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro

35 40 45

Ser Val Ser Ala Leu Phe Arg Ala Pro

50 55

<210> 4

<211> 759

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Arg Pro Thr Pro Gln Arg Arg Ala Val Ala Thr Gly Ala Leu Val Ala

1 5 10 15

Val Thr Ala Met Leu Ala Val Gly Val Gln Thr Thr Ser Ala Asn Ala

20 25 30

Gly Gln Asp Lys Ala Ala His Pro Ala Pro Arg Gln Ser Ile His Lys

35 40 45

Pro Asp Pro Gly Ala Glu Pro Val Lys Leu Thr Pro Ser Gln Arg Ala

50 55 60

Glu Leu Ile Arg Asp Ala Asn Ala Thr Lys Ala Glu Thr Ala Lys Asn

65 70 75 80

Leu Gly Leu Gly Ala Lys Glu Lys Leu Val Val Lys Asp Val Val Lys

85 90 95

Asp Lys Asn Gly Thr Leu His Thr Arg Tyr Glu Arg Thr Tyr Asp Gly

100 105 110

Leu Pro Val Leu Gly Gly Asp Leu Val Val Asp Ala Thr Arg Ser Gly

115 120 125

Gln Val Lys Thr Ala Ala Lys Ala Thr Lys Gln Arg Ile Ala Val Ala

130 135 140

Ser Thr Thr Pro Ser Leu Ala Ala Ser Ala Ala Glu Lys Asp Ala Val

145 150 155 160

Lys Ala Ala Arg Ala Lys Gly Ser Lys Ala Gly Lys Ala Asp Lys Ala

165 170 175

Pro Arg Lys Val Val Trp Ala Ala Lys Gly Thr Pro Val Leu Ala Tyr

180 185 190

Glu Thr Val Val Gly Gly Val Gln Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gln Leu

195 200 205

His Val Ile Thr Asp Ala Lys Thr Gly Lys Lys Leu Phe Glu Phe Gln

210 215 220

Gly Val Lys Gln Gly Thr Gly Asn Ser Gln His Ser Gly Gln Val Gln

225 230 235 240

Ile Gly Thr Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr Gln Met Asn Asp Thr Thr

245 250 255

Arg Gly Gly His Lys Thr Tyr Asn Leu Asn His Gly Ser Ser Gly Thr

260 265 270

Gly Thr Leu Phe Thr Asp Ser Asp Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Asn

275 280 285

Ser Asp Pro Ala Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Gln Leu

290 295 300

Thr Trp Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Gly Arg Asn Gly Ile Arg Gly

305 310 315 320

Asp Gly Val Gly Ala Tyr Ser Arg Val His Tyr Gly Asn Asn Tyr Val

325 330 335

Asn Ala Phe Trp Asp Asp Ser Cys Phe Cys Met Thr Tyr Gly Asp Gly

340 345 350

Asn Gly Ile Pro Leu Thr Ser Ile Asp Val Ala Ala His Glu Met Thr

355 360 365

His Gly Val Thr Ser Ala Thr Ala Asn Leu Thr Tyr Ser Gly Glu Ser

370 375 380

Gly Gly Leu Asn Glu Ala Thr Ser Asp Met Met Ala Thr Ala Val Glu

385 390 395 400

Phe Trp Ala Asn Asn Pro Ala Asp Pro Gly Asp Tyr Leu Ile Gly Glu

405 410 415

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420 425 430

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450 455 460

Leu Ala Ser Glu Gly Ser Gly Pro Lys Asp Ile Gly Gly Val His Tyr

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

Glu Leu Phe Gly Val Asn Ser Asp Thr Tyr Asn Asn Val Ala Asn Ala

530 535 540

Trp Ala Ala Ile Asn Val Gly Pro Arg Ala Ser Ser Gly Val Ser Val

545 550 555 560

Thr Ser Pro Gly Asp Gln Thr Ser Ile Val Asn Gln Ala Val Ser Leu

565 570 575

Gln Ile Lys Ala Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ala Leu Thr Tyr Ser Ala

580 585 590

Thr Gly Leu Pro Ala Gly Leu Ser Ile Asn Ala Ser Thr Gly Leu Ile

595 600 605

Ser Gly Thr Pro Thr Thr Thr Gly Thr Ser Asn Val Thr Val Thr Val

610 615 620

Lys Asp Ser Ala Gly Lys Thr Gly Ser Thr Ser Phe Lys Trp Thr Val

625 630 635 640

Asn Thr Thr Gly Gly Gly Ser Val Phe Glu Asn Thr Thr Gln Val Ala

645 650 655

Ile Pro Asp Ala Gly Ala Ala Val Thr Ser Pro Ile Val Val Thr Arg

660 665 670

Ser Gly Asn Gly Pro Ser Ala Leu Lys Val Asp Val Asn Ile Thr His

675 680 685

Thr Tyr Arg Gly Asp Leu Thr Ile Asp Leu Val Ala Pro Asn Gly Lys

690 695 700

Thr Trp Arg Leu Lys Asn Ser Asp Ala Trp Asp Ser Ala Ala Asp Val

705 710 715 720

Ser Glu Thr Tyr Thr Val Asp Ala Ser Ser Val Ser Ala Asn Gly Thr

725 730 735

Trp Lys Leu Lys Val Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ser Gly Thr Ile

740 745 750

Asp Lys Trp Arg Leu Thr Phe

755

<210> 5

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg

1 5 10 15

Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala

20 25 30

Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp

35 40 45

Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro

50 55 60

Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile

65 70 75 80

Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln

85 90 95

Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val

100 105 110

Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala

115 120 125

Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro

130 135 140

Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu

145 150 155 160

Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser

165 170 175

Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu

180 185 190

Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn

195 200 205

Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser

210 215 220

Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala

225 230 235 240

Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser

245 250 255

Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro

260 265 270

Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser

275 280 285

Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe

290 295 300

Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly

305 310 315 320

Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr

325 330 335

Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg

340 345 350

Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro

355 360 365

Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

370 375

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成，引物序列

<400> 6

cggtacctcc atggcctgtc cccacgttgc cggtcttgcc tcctactacc tgtccatca 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成，引物序列

<400> 7

gaagagcgca ctgacgctcg gcggcaattc cgtcagagaa ttgccaggtt gacccgcag 59

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工合成，引物序列

<400> 8

ttgccgccga gcgtcagtgc gctcttccgg gcccccgact ccgacgacag ggtcacc 57

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成，引物序列

<400> 9

aggccatgga ggtaccggat cctattacgg ccagccctgc tttacc 46

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成，引物序列

<400> 10

actattctca cggccgttct ggccgacaat ggcgcggggg aa 42

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成，引物序列

<400> 11

ggtaaagcag ggctggccgt aataggatcc atgaagctcg ctaccgcctt tactattc 58

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工合成，引物序列

<400> 12

ggcaacgtgg ggacaggcca tggaggtacc tcagaaggtc agccgccact tgtcgat 57

Claims

1.一种高效表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，其特征在于，为以下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有谷氨酰胺转氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。

3.表达权利要求1所述突变体的重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，以解脂耶氏酵母po1h为宿主。

5.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，构建方法是：将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，将重组质粒线性化后转到宿主菌中，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

6.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，构建方法是：

(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

7.一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌共同表达蛋白酶TAMEP和谷氨酰胺转氨酶hpro-mTG，所述蛋白酶TAMEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述谷氨酰胺转氨酶hpro-mTG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法：首先构建蛋白酶TAMEP的表达载体pINA1297/HT，将质粒线性化后转化到重组菌po1h/hpro-mTG中，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，得到表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/HM+HT。

9.应用权利要求3-8任一所述重组菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶突变体的方法，其特征在于，所述方法为：

(1)摇瓶发酵：将重组菌接种于YPD液体培养基中，25-30℃，180-230rpm培养20-27h，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d；

(2)发酵罐发酵：将重组菌接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm，当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。

10.根据权利要求9所述方法得到的谷氨酰胺转氨酶在医药、化妆品生产以及皮革加工方面的应用。