CN107573419A - 一种增强t细胞抗肿瘤活性的核酸分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含DAP10蛋白胞内段的新的嵌合抗原受体(CAR)分子，以及编码其的核酸，表达其的细胞，以及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明的CAR分子是在传统的第二代CAR分子中引入DAP10蛋白的胞内段而实现的，其通过CAR分子与靶抗原结合后激活T细胞DAP10下游信号通路，以提升相应的CART细胞对实体肿瘤在体内、体外的杀伤作用，增强其增殖存活能力。

Description

一种增强T细胞抗肿瘤活性的核酸分子

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，具体地，涉及一种含DAP10蛋白胞内段的嵌合抗原受体，编码其的核酸和表达其的细胞，以及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR,Chimeric Antigen Receptors)T细胞是表面表达识别特定抗原并能传递信号的嵌合型受体的T细胞。CAR T细胞通过表达嵌合抗原受体(CAR)分子而在抗肿瘤中发挥重要作用，CAR分子通常包括胞外段、跨膜区和胞内段：胞外段是由抗体重链和轻链可变区通过一条肽段相连接而形成的单链可变区(ScFv)；胞内段是各种信号传导分子的胞内段嵌合体，包括CD3zeta、CD28、OX-40、4-1BB等；跨膜区则来自其他分子(如CD8，CD4， CD28和CD3zeta)的跨膜区。单链可变片段部分的基因分离自例如产生识别靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。表达CAR分子的T细胞独立于肿瘤细胞上的主要组织相容性抗原I型的表达而直接识别肿瘤细胞表面抗原，并且在同时激活T细胞，并因此表达CAR的T细胞可以有效杀伤肿瘤细胞。简言之，CAR T细胞通过抗原-抗体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别，然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。

CAR分子的结构设计经历多代的研究发展。第一代CAR分子的结构包含识别肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段(scFv)、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3ζ的胞内结构域。由于第一代CAR的胞内段只有CD3ζ信号传递区域，没有共刺激信号，因而第一代CAR T细胞的功能存在很大缺陷，其在病人体内的扩增、持久性和效应功能等方面都表现出低水平。为了增强第一代CAR激活T细胞的能力的目的，已经开发出第二代CAR，第二代CAR在胞内加入了共刺激分子(如CD28、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)等)来源的胞内分子信号传递域。临床试验表明，第二代CAR T细胞在病人体内表现出较好的增殖、持久性和效应功能。第二代CAR T细胞的临床试验，大部分是抗CD19CAR T对B细胞白血病的治疗。虽然CAR T 细胞临床试验获得了疗效，但还存在进一步改善的空间。第三代CAR是为了进一步提高CAR T 细胞疗法的疗效而开发的。第三代CAR的胞内段引入了两个共刺激分子的信号传递区域。通常情况下，一个共刺激信号是CD28胞内区域，另一个则是CD134、CD137或ICOS等的胞内信号传递区域。共刺激信号的不同组合可能影响CAR T细胞的功能和疗效，研究表明，并不是所有的第三代CAR都比第二代好。

DAP10是一个在造血细胞上表达的独立跨膜衔接蛋白，通过与激活性受体NKG2D作用形成复合物，可在肿瘤发生、感染、自身免疫应答反应中识别异常高表达的相关配体。DAP10 信号在维持自身免疫耐受中具有重要的生理学作用。根据已报道的文献，人的NKG2D受体是 DAP10唯一的结合作用受体，通过胞外段半胱氨酸的二硫键结合形成二聚体。DAP10胞内区域包含Tyr-Ile-Asn-Met基序，与PI3K的调节亚基p85的Src同源段2区域结合。DAP10与p85结合后，与信号分子Grb2与Vav1的相互作用，起始下游Rho家族鸟苷酸三磷酸酶和C-γ2磷酸酶的激活和累积，以起始免疫细胞的激活。与一个NKG2D配体的结合可启动4个DAP10分子的磷酸化，在低配体浓度的情况下，扩大信号传递。

NKG2D-DAP10受体复合物表达于NK、γδT、NKT和胸腺细胞，且会随着固有免疫刺激的上调表达。在人体内，NKG2D只与DAP10相互作用产生免疫效应，而在小鼠细胞表达两个NKG2D异构体：NKG2D-1和NKG2D-2，NKG2D-1只与DAP10作用，而NKG2D-2则可与 DAP10、DAP12作用。鼠源NKG2D-DAP10受体的配体是I类主要组织相容性复合物(MHC I)。

研究发现，通过在C57BL/6小鼠中敲除NKG2D，提高了小鼠在甲基胆蒽诱导纤维肉瘤中的敏感性，这验证了NKG2D-DAP10在监控肿瘤发生中具有重要作用(NKG2Dfunctionprotects the host from tumor initiation.J Exp Med 2005；202:583–588.)。

NKG2D在自体免疫反应中也发挥着作用。阻断NKG2D的功能将抑制NOD小鼠体内自体反应CD8+T细胞的增殖，并提高自发糖尿病NOD小鼠的存活率。

名为“A Chimeric Receptor with NKG2D Specificity Enhances NaturalKiller Cell Activation and Killing of Tumor Cells”的一篇科技文献中阐述了一种应用于NK细胞上的新型嵌合抗原受体——CAR NKG2D-DAP10-CD3ε，其主要通过提高肿瘤抗原的特异性识别和激活能力以增强NK细胞的体内外抗肿瘤功能；而NKG2D可特异性识别肿瘤特异性抗原MIC和 RAET1/ULBP，并通过DAP10激活下游信号通路；DAP10在该嵌合抗原受体中的主要作用为帮助NKG2D受体定位于细胞膜上。

目前，CART细胞已在血液肿瘤的临床前和临床试验中取得了很好的疗效，但对于实体肿瘤其疗效并不确切。根据肿瘤免疫学和肿瘤微环境的基本原理，CART细胞在体内可能难以克服实体肿瘤微环境的抑制作用，其效应功能(如细胞杀伤，细胞因子分泌等)被直接抑制或因为耗竭作用难以进行；此外，CART细胞的增殖存活能力亦被肿瘤微环境所削弱，使CART 细胞在肿瘤中的数量难以为继。因此，需要找到途径和方法以切实提升CART细胞对实体肿瘤在体内、体外的杀伤作用，增强其增殖存活能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含DAP10蛋白胞内段的新的嵌合抗原受体(CAR)分子，以及编码其的核酸，表达其的细胞，以及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明在传统的第二代CAR分子中引入DAP10蛋白的胞内段，其通过CAR与靶抗原结合后激活T细胞 DAP10下游信号通路，以期达到提升相应的CART细胞对实体肿瘤在体内、体外的杀伤作用，增强其增殖存活能力的目的。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞内结构域包括DAP10蛋白的胞内段序列。

上述嵌合抗原受体中，所述DAP10蛋白的胞内段序列为:LCARPRRSPAQDGKVYINMPGRG(如SEQ ID NO:12所示)，其相应的核苷酸序列为： 5’-ctgtgcgcacgcccacgccgcagccccgcccaagaagatggcaaagtctacatcaacatgccaggcaggggc-3’(如SEQ ID NO:13所示)。

作为优选，所述胞内结构域包括1～9个、优选1～3个DAP10蛋白的胞内段序列；

优选地，所述胞内结构域包括通过串联方式连接在一起的两个或更多个DAP10蛋白的胞内段序列。

在具体实施方案中，上述CAR分子可以仅以一个或多个DAP10蛋白的胞内段序列作为其胞内结构域，还可以包含除了DAP10蛋白胞内段序列之外的一个或多个(例如2个或3个) 其它胞内结构域。例如，所述胞内结构域还可包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；优选地，所述胞内共刺激信号传导域选自但不限于如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD28、4-1BB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、CD27、CD28、OX40、CD30、CD40、 PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、 HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、 ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、 CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、 DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、 Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、 SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、 SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D或CD83中的任意一种或至少两种的组合，优选为TLR2、4-1BB或CD28中的任意一种或至少两种的组合。

作为优选，所述能够结合抗原的胞外结构域是指所述抗原的受体胞外段，或者所述抗原的特异性抗体的单链可变片段。

作为优选，所述抗原是肿瘤抗原和/或肿瘤相关辅助细胞抗原；所述肿瘤抗原和/或肿瘤相关辅助细胞抗原选自但不限于：5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、 CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、 CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、 GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、 HST-2、hTERT(或hTRT)、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、 MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、 MUM-2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190minor bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、 PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、 TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、、BCMA、CD123、PD-1、PD-L1/2、 TIM3、LAG3、A2ARA2AR、B7H3、B7H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)、VISTA (C10orf54)、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD44v6、B7-H3、 CD117、IL-13Ra2、IL-11Ra、PRSS21、VEGFR2、路易斯(Y)抗原、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、 NCAM、CAIX、EphA2、GM1、sLe、TGS5、HMWMAA、OAcGD2、叶酸受体β、CD248、 TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、 UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、淋巴细胞抗原6复合物、LY6K、OR51E2、 TARP、ETS、SPA17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、ERG、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、SART3、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、 CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、FCRL5、IGLL1、NY-Eso-1或NY-Eso-B中的任意一种或至少两种的组合；

此外，所述抗原也可以是在自身免疫性疾病中出现的炎性细胞表面分子或导致自身免疫的TCR。

进一步优选地，所述抗原是PCSA、Mesothelin抗原或GPC3抗原中的任意一种或至少两种的组合；更进一步优选地，所述胞外结构域为特异性识别抗原Mesothelin、PSCA或GPC3 的受体胞外段和/或抗体。

作为优选，所述跨膜结构域为胞外段受体对应的跨膜结构域或胞内段共刺激信号分子对应的跨膜结构域，优选为CD28跨膜区。

在优选的具体实施方案中，所述嵌合抗原受体自N末端侧开始依次包括作为胞外结构域的、针对抗原的抗体的单链可变区或者抗原的受体胞外段，CD28分子的跨膜区，CD3ζ链，以及一个或多个串联连接的DAP10胞内段序列。

第二方面，本发明提供了一种编码如第一方面所述的嵌合抗原受体的核酸或与其具有至少80％同一性，优选至少90％同一性的核酸。

本发明中，所述与第一方面所述的嵌合抗原受体的核酸具有至少80％同一性，优选至少 90％同一性的核酸为编码的嵌合抗原受体与第一方面所述的嵌合抗原受体具有相同或类似功能，其碱基的改变不会对嵌合抗原受体的结构和功能产生影响。

第三方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体表达细胞，其中引入了如第二方面所述的核酸；优选地，所述细胞为免疫效应细胞，进一步优选为T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供了一种制备如第三方面所述的嵌合抗原受体表达细胞的方法，其包括将如第二方面所述的核酸引入细胞的步骤；

优选地，通过由慢病毒载体介导的转导将所述核酸引入细胞；

优选地，所述细胞为免疫效应细胞，进一步优选为T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明提供一种重组载体，其包含有权利要求3所述的核酸；优选地，所述载体为重组克隆载体、重组真核表达质粒或重组慢病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为重组慢病毒载体；

优选地，所述重组克隆载体选自但不限于pUC18、pUC19、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、 pMAX或pDC315中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述真核表达质粒选自但不限于pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX或pDC315中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述重组慢病毒载体选自但不限于重组腺病毒载体、重组腺相关病毒载体、重组逆转录病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体或重组痘苗病毒载体中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，通过将所述嵌合抗原受体的核酸构建体与所述载体进行重组，从而能够实现将所述重组后的载体转染到细胞中获得T细胞，实现嵌合抗原受体的功能。

第六方面，本发明提供一种重组病毒，其包含如第五方面所述的重组载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到的重组病毒。

第七方面，本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞，其通过将如第六方面所述的重组病毒转染到T细胞中表达。

第八方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的核酸、如第五方面所述的重组载体或如第六方面所述的重组病毒用于扩增CAR T细胞

第九方面，本发明提供一种药物组合物，其包含第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的嵌合抗原受体表达细胞或如第五方面所述的重组载体，以及任选的药学上可接受的辅料。

第十方面，本发明提供了一种如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的嵌合抗原受体表达细胞或如第五方面所述的重组载体在制备治疗自身免疫性疾病或肿瘤的药物中的用途。

优选地，所述肿瘤为实体瘤和/或血液瘤，所述肿瘤可以选自但不限于肺癌、肝癌、淋巴癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、白血病、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤等中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明提供的该用途的具体实施例中，所述肿瘤为白血病、肝癌或肺癌。

第十方面，本发明提供一种治疗患有自身免疫性疾病和/或与肿瘤抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，其包括对所述受试者施用有效量的包含第八方面所述的药物组合物的药物；

优选地，所述肿瘤为实体瘤和/或血液瘤。

在本发明提供的该用途的具体实施例中，所述肿瘤为白血病、肝癌或肺癌。

值得注意的是，本发明的CAR分子的特征在于它包含DAP10胞内段作为其胞内结构域。所述DAP10胞内段包括具有相同功能的其变体。术语“变体”是指包含一个或几个至多个氨基酸的取代、缺失或添加的任何变体，条件是所述变体基本上保留原始序列所具有的相同功能。

有益效果

(1)本发明通过在传统的第二代CAR分子基础上引入DAP10胞内段作为独立的共刺激信号通路，且不受限于受体，可进一步偶联其它共刺激信号，并可通过串联方式进一步增强肿瘤免疫效应；

(2)本发明整合DAP10共刺激分子胞内信号结构域的CART细胞抗肿瘤效应功能明显提高，该细胞与未整合DAP10的第二代CART相比，对肿瘤靶细胞的细胞毒性尤其是持续性细胞毒性明显增强，分泌细胞因子IL-2，IFN-y，Granzyme B，GM-CSF的能力显著提高，同时在动物实验中显示出了更强的肿瘤抑制能力和更好的瘤内增殖能力；

(3)本发明中的DAP10共刺激信号分子仅有72bp，片段非常小，不会因为加重转染载体负荷，而造成通过各种转染方式如慢病毒、逆转录病毒、电转、脂质体等的转染效率下降的影响，且整合DAP10的CAR T细胞肿瘤免疫效应显著提高，则DAP10共刺激信号分子在提高T细胞肿瘤免疫效应的同时，为CAR分子载体提供更多改造的潜力。

附图说明

图1显示本发明实施例中所构建的一系列CAR分子包括CAR-Mes、CAR-Mes-41BB、CAR-Mes-DAP10、CAR-Mes-DAP10*3、CAR-Mes-DAP10*9、CAR-Mes-41BB-CD28、CAR-Mes-41BB-DAP10、CAR-PSCA、CAR-PSCA-DAP10、CAR-PSCA-DAP10*3、CAR-GPC3 (对照组)、CAR-GPC3-41BB、CAR-GPC3-DAP10、CAR-GPC3-41BB-CD28、 CAR-GPC3-41BB-DAP10的分子结构示意图。

图2显示CAR-Mes T、CAR-Mes-DAP10 T、CAR-Mes-DAP10*3 T细胞对A549GL细胞的体外肿瘤杀伤效应的曲线图图2(A)和柱状图图2(B)，以及CAR-Mes、CAR-Mes-DAP10 慢病毒载体转染T细胞的效率图2(C)。

图3显示CAR-Mes T、CAR-Mes-DAP10 T、CAR-Mes-DAP10*9T细胞对A549GL细胞的体外肿瘤杀伤效应的曲线图图3(A)和柱状图图3(B)，以及CAR-Mes T、CAR-Mes-DAP10 T细胞3次与肿瘤细胞共培养后的相关T细胞激活表面标志物CD25图3(C)、CD69图3(D)、 CD107a图3(E)的表达情况比较。

图4显示CAR-PSCA T、CAR-PSCA-DAP10 T细胞对A549GL细胞的体外肿瘤杀伤效应的曲线图图4(A)和柱状图图4(B)。

图5显示CAR-Mes T、CAR-Mes-41BB-CD28 T、CAR-Mes-DAP10 T细胞分别对A549GL图5(A)和H460Mes+GL图5(B)细胞的体外肿瘤杀伤效应。

图6显示CAR-GPC3 T、CAR-GPC3-41BB-CD28 T、CAR-GPC3-DAP10 T细胞分别对HepG2GL图6(A)和HC04-GL图6(B)细胞的体外肿瘤杀伤效应。

图7显示ELISA检测GFP T、CAR-MesT、CAR-Mes-DAP10 T、CAR-Mes-DAP10*3 T 或CAR-Mes-DAP10*9 T细胞与A549-GL细胞共培养18h后的细胞因子IL-2图7(A)、IFN-γ图7(B)、GZMB图7(C)和GM-CSF图7(D)的分泌情况。

图8显示NC、GFP T、CAR-Mes T或CAR-Mes-41BB-CD28、CAR-Mes-DAP10 T细胞对A549-GL细胞在免疫缺陷小鼠体内形成的肿瘤重量图8(A)和体积图8(B)的影响。

图9显示用CAR-Mes T或CAR-Mes-DAP10 T细胞体内处理肺癌肿瘤异种移植模型后肿瘤浸润T细胞的比例的柱形图。

图10显示CAR-Mes-41BB T、CAR-Mes-41BB-DAP10 T细胞对A549-GL图10(A)、H460+Mes-GL图10(B)细胞的体外肿瘤杀伤效应的曲线图，以及CAR-Mes-CD28 T、 CAR-Mes-41BBT、CAR-Mes-DAP10 T细胞对A549-GL细胞的体外3次连续杀伤效应的曲线图图10(C)。

图11显示CAR-GPC3-41BB T、CAR-GPC3-DAP10 T细胞对Hepg2-GL图11(A)、 HC04-GL图11(B)细胞的体外肿瘤杀伤效应的曲线图。

图12显示CAR-GPC3 T、CAR-GPC3-DAP10 T细胞对HC04-GL细胞的体外肿瘤杀伤效应的曲线图。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1、CAR质粒的构建

1)通过基因合成，分别合成CAR-Mes(对照组)、CAR-Mes-DAP10、CAR-Mes-41BB、CAR-Mes-DAP10*3、CAR-Mes-DAP10*9、CAR-Mes-41BB-CD28、CAR-Mes-41BB-DAP10、 CAR-PSCA(对照组)、CAR-PSCA-DAP10、CAR-PSCA-DAP10*3、CAR-GPC3(对照组)、 CAR-GPC3-41BB、CAR-GPC3-DAP10、CAR-GPC3-41BB-CD28、CAR-GPC3-41BB-DAP10 分子(各分子结构示意图如图1所示)，合成的基因C端含限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和N端含限制性内切酶AsiSI酶切位点及其保护碱基；其中，“41BB”是指所述分子中含现有技术中常用的胞内信号结构域4-1BB。

所合成的各分子的基因序列请参见序列表中的SEQ ID NO:2(CAR-Mes)、SEQIDNO:3 (CAR-Mes-DAP10)、SEQ IDNO:4(CAR-Mes-41BB)、SEQ ID NO:5(CAR-Mes-DAP10*3)、SEQ ID NO:6(CAR-Mes-DAP10*9)、SEQ ID NO：7(CAR-Mes-41BB-CD28)、SEQ ID NO:8 (CAR-Mes-41BB-DAP10)、SEQ ID NO:9(CAR-PSCA)、SEQ ID NO:10(CAR-PSCA-DAP10)、 SEQ IDNO:11(CAR-PSCA-DAP10*3)、SEQ ID NO:13(CAR-GPC3(对照组))、SEQ ID NO:14 (CAR-GPC3-41BB)、SEQ ID NO:15(CAR-GPC3-DAP10)和SEQ ID NO:16 (CAR-GPC3-41BB-CD28)、SEQ ID NO:17(CAR-GPC3-41BB-DAP10)。

2)分别通过限制性内切酶Pme1和AsiSI双酶切，获得含粘性末端的合成DNA片段(CAR-Mes、CAR-Mes-DAP10、CAR-Mes-41BB、CAR-Mes-DAP10*3、CAR-Mes-DAP10*9、 CAR-Mes-41BB-CD28、CAR-Mes-41BB-DAP10、CAR-PSCA、CAR-PSCA-DAP10、CAR-PSCA- DAP10*3、CAR-GPC3(对照组)、CAR-GPC3-41BB、CAR-GPC3-DAP10、 CAR-GPC3-41BB-CD28、CAR-GPC3-41BB-DAP10)和LEGO-2A-eGFP载体的线性化DNA (含粘性末端，其序列如SEQ ID NO:1所示)。

3)通过琼脂凝胶电泳回收，分别获得带粘性末端的合成的DNA片段(CAR-Mes、CAR-Mes-DAP10、CAR-Mes-41BB、CAR-Mes-DAP10*3、CAR-Mes-DAP10*9、 CAR-Mes-41BB-CD28、CAR-Mes-41BB-DAP10、CAR-PSCA、CAR-PSCA-DAP10、CAR-PSCA- DAP10*3、CAR-GPC3(对照组)、CAR-GPC3-41BB、CAR-GPC3-DAP10、 CAR-GPC3-41BB-CD28、CAR-GPC3-41BB-DAP10)和线性化的LEGO-2A-eGFP载体DNA 片段。

4)通过T4 DNA连接酶(Invitrogent公司)，将线性化的LEGO-2A-eGFP分别与带粘性末端的合成的DNA片段(CAR-Mes、CAR-Mes-DAP10、CAR-Mes-41BB、CAR-Mes-DAP10*3、CAR-Mes-DAP10*9、CAR-Mes-41BB-CD28、CAR-Mes-41BB-DAP10、CAR-PSCA、 CAR-PSCA-DAP10、CAR-PSCA-DAP10*3、CAR-GPC3(对照组)、CAR-GPC3-41BB、 CAR-GPC3-DAP10、CAR-GPC3-41BB-CD28、CAR-GPC3-41BB-DAP10)连接，获得CAR 质粒转化载体(LEGO-CAR-Mes-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-41BB-2A-EGFP、 LEGO-CAR-Mes-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-DAP10*3-2A-EGFP、 LEGO-CAR-Mes-DAP10*9-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-41BB-CD28-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-41BB-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-PSCA-2A-EGFP、 LEGO-CAR-PSCA-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-PSCA-DAP10*3-2A-EGFP LEGO-CAR-GPC3-2A-EGFP、LEGO-CAR-GPC3-41BB-2A-EGFP、 LEGO-CAR-GPC3-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-GPC3-41BB-CD28-2A-EGFP、LEGO-CAR-GPC3-41BB-DAP10-2A-EGFP)。

实施例2、CAR质粒的慢病毒包装

将实施例1所制备的本发明CAR质粒以及相关对照质粒进行慢病毒包装，具体步骤如下：

1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为：DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；

2)待150mm培养皿中的293T细胞密度达80-90％时，更换培养基：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；

3)更换培养基培养2-6小时后，用PEI分别将LEGO-CAR-EGFP质粒 (LEGO-CAR-Mes-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-41BB-2A-EGFP、 LEGO-CAR-Mes-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-DAP10*3-2A-EGFP、 LEGO-CAR-Mes-DAP10*9-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-41BB-CD28-2A-EGFP、LEGO-CAR-Mes-41BB-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-PSCA-2A-EGFP、 LEGO-CAR-PSCA-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-PSCA-DAP10*3-2A-EGFP、 LEGO-CAR-GPC3-2A-EGFP、LEGO-CAR-GPC3-41BB-2A-EGFP、 LEGO-CAR-GPC3-DAP10-2A-EGFP、LEGO-CAR-GPC3-41BB-CD28-2A-EGFP、LEGO-CAR-GPC3-41BB-DAP10-2A-EGFP)或空白对照质粒LEGO-EGFP分别与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转导入293T细胞，加入试剂及剂量如下：

4)分别于转化后24、48和72小时，收集培养基上清，并加入新鲜培养基(DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗)；

5)培养基上清收集完毕，将上清2500g离心0.5小时后(可选步骤)；

6)取离心上清，用0.45um过滤器过滤后，利用超高速离心机28000rpm离心1.5小时(可选步骤)；

7)超高速离心后，轻轻去除上清，加入200ul PBS，置于4度12-16小时溶解，即得CAR 慢病毒或空白对照GFP慢病毒(可选步骤)；

8)病毒溶解后，收集病毒溶液分装于PCR管，冻存于-80℃待用。

实施例3、T细胞激活和CAR慢病毒感染

①T细胞的分离纯化：通过Ficoll密度梯度法分离出血液中的单个核细胞，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再通过MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；

②分选出来的T细胞用培养基(AIM-V培养基+5％FBS+青霉素100U/ml+链霉素0.1mg/ml 稀释至细胞浓度2.5×10⁶个/ml待用；

③通过包被CD2、CD3、CD28抗体的磁珠(产品来源：德国美天旎)刺激T细胞，即包被磁珠与T细胞以1:2比例混合，T细胞最终密度应为5×10⁶个/ml/cm2。混合后，置于37℃、5％CO₂培养箱培养刺激48小时。

④慢病毒转染T细胞：将激活的T细胞-磁珠混合液中的磁珠通过磁场作用去除，300g 离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，分别加入表达CAR和GFP(空白对照)慢病毒(病毒加入量为MOI＝10)后，加入8μg/ml的polybrene和300IU/ml IL-2。置于37℃，5％CO₂培养箱培养24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/ml IL-2的新鲜培养基重悬，即得过表达CAR质粒的T细胞。

⑤CAR T细胞扩增：将CAR T细胞密度维持在1×10⁶个/ml左右，每2-3天进行一次半量换液。两周后，CAR T细胞数可扩增100倍。GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，GFP阳性比例通过流式进行检测，即得到CAR T细胞，分别简称CAR-Mes(附图中也简称M28z)、 CAR-Mes-41BB(附图中也简称MBBz)、CAR-Mes-DAP10(附图中也简称M28z10)、 CAR-Mes-DAP10*3(附图中也简称M28z10*3)、CAR-Mes-DAP10*9(附图中也简称 M28z10*9)、CAR-Mes-41BB-CD28(附图中也简称MBB28z)、CAR-Mes-41BB-DAP10(附图中也简称MBBz10)、CAR-PSCA(附图中也简称P28z)、CAR-PSCA-DAP10(附图中也简称P28z10)、CAR-PSCA-DAP10*3(附图中也简称P28z10*3)、CAR-GPC3(附图中也简称 G28z)、CAR-GPC3-41BB(附图中也简称GBBz)、CAR-GPC3-DAP10(附图中也简称G28z10)、 CAR-GPC3-41BB-CD28(附图中也简称GBB28z)、CAR-GPC3-41BB-DAP10(附图中也简称 GBBz10)或空白对照T细胞(GFP-T)的比例。

通过流式细胞技术检测CAR-Mes、CAR-Mes-DAP10慢病毒载体转染T细胞的效率(图2C)，结果显示：DAP10的整合并不影响CAR T细胞的转染效率。

实施例4、CAR-Mes-DAP10 T细胞体外识别杀伤肿瘤的效应

体外比较GFP T(空白对照)、CAR-Mes T(阴性对照)、CAR-Mes-DAP10、 CAR-Mes-DAP10*3、CAR-Mes-DAP10*9 T细胞对肺癌细胞的识别杀伤功能，肿瘤细胞选用 A549-GL带荧光素酶的人肺腺癌细胞系。

将实施例3制备的GFP T(空白对照)、CAR-Mes T(阴性对照)、CAR-Mes-DAP10T、CAR-Mes-DAP10*3 T、CAR-Mes-DAP10*9 T细胞分别与1x10⁴的肿瘤细胞A549-GL以2:1、 1：1、1：2、1：4、1：8比例(E：T比例)混合，加入到96孔U型板中，每组设3个复孔， 250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养。

荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法：CAR T细胞与肿瘤细胞共培养(实验对照组为肿瘤细胞单独培养)后18小时，在96孔细胞培养板中加入100ul/孔的荧光素酶底物 (1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间设为1秒。杀伤比例计算公式：100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)；其结果如图2(A)-(B)，图3(A)-(B)所示。

将CAR-Mes-DAP10和CAR-Mes T细胞以E:T＝1：2分别与A549-GL肿瘤细胞进行3次混合共培养，每次混合共培养时间为24小时，72小时之后，通过流式细胞技术分别检测CAR-Mes-DAP10和CAR-Mes T细胞中T细胞激活表面标记物CD25(C)、CD69(D)和T 细胞脱颗粒表面标记物CD107a(E)阳性的细胞比例，结果如图3(C)、3(D)和3(E)。

结果表明，CAR-MES-DAP10 T、CAR-MES-DAP10*3、CAR-MES-DAP10*9 T细胞对肿瘤细胞A549-GL的体外杀伤效率都显著高于CAR-MES T细胞，在E：T(即Effector T细胞与Target靶细胞的比例)很小的情况下，CAR-MES-DAP10、CAR-MES-DAP10*3、 CAR-MES-DAP10*9 T细胞也能表现出很强的肿瘤杀伤活性，显著高于CAR-MES T细胞，而CAR-MES-DAP10*3、CAR-MES-DAP10*9 T细胞的杀伤能力则分别略高于 CAR-MES-DAP10 T细胞；CAR-Mes-DAP10细胞在受到靶细胞激活后其表面CD25，CD69 和CD107a标志物均显著上调，这表明DAP10共刺激分子能够明显提升CAR T细胞的激活水平和细胞毒性作用。

实施例5、CAR-PSCA-DAP10 T细胞体外识别杀伤肿瘤的效应

体外比较GFP T(空白对照)、CAR-PSCA T(阴性对照)、CAR-PSCA-DAP10 T细胞对肺癌细胞的识别杀伤功能，肿瘤细胞选用A549-GL带荧光素酶的人肺腺癌细胞系。实验方法如实施例4所述。

结果显示，CAR-PSCA-DAP10 T对肿瘤细胞A549-GL的体外杀伤效率都显著高于CAR-PSCA T细胞，在E：T(即Effector T细胞与Target靶细胞的比例)很小的情况下， CAR-PSCA-DAP10细胞也能表现出很强的肿瘤杀伤活性，显著高于CAR-PSCA T细胞(见图4(A)和图4(B))，表明：DAP10-胞内段结构域对CAR T细胞杀伤功能的显著增强作用并不局限于单一肿瘤靶点Mesothelin。

实施例6、CAR-Mes-DAP10 T细胞与CAR-Mes-41BB-CD28体外识别杀伤肿瘤效应的比较

体外比较GFP T(空白对照)、CAR-Mes T(阴性对照)、CAR-Mes-DAP10 T(可简称PSCA-DAP10)，CAR-Mes-41BB-CD28 T细胞对肺癌细胞的识别杀伤功能，肿瘤细胞选用A549-GL带荧光素酶的人肺腺癌细胞系和过表达Mesothelin抗原的H460+Mes-GL人肺癌细胞系。实验方法如实施例4所述。

结果显示，在两种细胞系中，CAR-Mes-DAP10 T和CAR-Mes-41BB-CD28 T细胞的杀伤功能均显著高于CAR-Mes T细胞，而CAR-Mes-DAP10 T和CAR-Mes-41BB-CD28 T细胞的杀伤效率则基本相当，但由于DAP10基因片段小，不影响转染效率和CAR载体可塑性，则 DAP10共刺激分子比41BB共刺激分子在CAR T细胞应用中具有更高的应用价值。(图5(A) 和图5(B))

实施例7、CAR-GPC3-DAP10细胞对肝癌细胞的体外杀伤效应及比较

体外比较GFP T(空白对照)、CAR-GPC3 T(阴性对照)、CAR-GPC3-DAP10 T， CAR-GPC3-41BB-CD28 T细胞对肝癌细胞的识别杀伤功能，肿瘤细胞选用带荧光素酶的 HepG2-GL和HC04-GL的人肝细胞癌细胞系和HC04人肝脏细胞系。实验方法如实施例4所述。

结果显示，在两种细胞系中，CAR-GPC3-DAP10 T和CAR-GPC3-41BB-CD28 T细胞的杀伤功能均显著高于CAR-GPC3 T细胞(现有技术中的CAR-GPC3-CD28-CD3ζ T细胞，简称G28z)，而CAR-GPC3-DAP10 T和CAR-GPC3-41BB-CD28 T细胞的杀伤效率则基本相当，进一步印证实施例6：DAP10共刺激分子比41BB共刺激分子在CAR T细胞应用中具有更高的应用价值。(图6(A)和图6(B))

实施例8、CAR-Mes-DAP10 T细胞与肿瘤细胞共培养后的细胞因子分泌

1)将2×10⁵个肿瘤细胞A549-GL每孔接种于24孔培养板，过夜贴壁培养，再将阳性细胞数目达1×10⁵个的GFP T(空白对照)、CAR-Mes T(阴性对照)、CAR-Mes-DAP10 T、CAR-Mes-DAP10*3 T、CAR-Mes-DAP10*9 T构建细胞(如实施例3所制备)与A549-GL细胞以E：T＝1:2混合，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养；

2)共培养18小时后，取GFPT、CAR-Mes T、CAR-Mes-DAP10 T、CAR-Mes-DAP10*3 T、CAR-Mes-DAP10*9 T细胞分别与肿瘤细胞共培养的培养基上清液，通过ELISA检测白介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)、颗粒酶B(GZMB)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 水平，结果分别如图7(A)、7(B)、7(C)和7(D)所示；

3)CAR-Mes-DAP10、CAR-Mes-DAP10*3、CAR-Mes-DAP10*9 T细胞分泌免疫效应因子白介素2、干扰素γ、颗粒酶B、GM-CSF(CAR-Mes-DAP10)的水平显著高于CAR-Mes T细胞，这说明DAP10胞内结构域能大幅提高CAR T细胞白介素2、干扰素γ、颗粒酶B、 GM-CSF分泌，可明显促进T细胞增殖和肿瘤杀伤作用。

实施例9、CAR-Mes-DAP10 T细胞体内识别杀伤肿瘤

1)将5×10⁵个A549-GL细胞移植入NOD/SCID IL2rg-/-免疫缺陷小鼠腹股沟皮下，构建肺癌小鼠模型；

2)肿瘤移植3天后，分别在肺癌小鼠模型中静脉注射GFP阳性细胞数为3×10⁶个的GFP T、CAR-Mes T、CAR-Mes-41BB-CD28 T、CAR-Mes-DAP10 T细胞，加上不注射细胞的NC 空白对照组，共五个实验组，每组设置四个重复；

3)于肿瘤移植后第36天将小鼠全部处死，剥离肿瘤块，并分析记录肿瘤重量和体积(分别如图8(A)和图8(B))，将肿瘤块研磨过筛网制成单细胞悬液，通过流失细胞术检测肿瘤浸润的T细胞比例(如图9)。

结果表明，CAR-Mes-DAP10 T细胞和CAR-Mes-41BB-CD28 T细胞在肺癌肿瘤异种移植模型中可显著缩小肿瘤体积，提示CAR-Mes-DAP10 T细胞对肿瘤细胞较高的杀伤效率，且能够克服肿瘤微环境对T细胞的抑制作用。相比之下，CAR-Mes T细胞在肺癌肿瘤异种移植模型中则难以缩小肿瘤(相对于NC和GFPT对照组)。对肿瘤浸润T细胞的分析表明， CAR-MesT细胞在肿瘤中存在非常稀少(总T细胞比例小于1％)，而CAR-Mes-DAP10 T细胞存在比例显著升高(总T细胞比例大于3％，图9)；这些结果说明：DAP10胞内结构域能够提升T细胞在肿瘤微环境中的增殖存活能力，克服肿瘤微环境的抑制作用，从而增强CAR T细胞体内的肿瘤杀伤效果。

实施例10、对比CAR-Mes-41BB-DAP10 T和CAR-Mes-41BB T细胞体外识别杀伤肿瘤的效应

体外比较GFP T(空白对照)、CAR-Mes-41BB T(阴性对照)、CAR-Mes-41BB-DAP10 T细胞对肺癌细胞的识别杀伤功能，肿瘤细胞选用A549-GL和H460+Mes-GL带荧光素酶的人肺腺癌细胞系。实验方法如实施例4所述，结果如图10(A)和10(B)所示。

通过体外连续杀伤比较GFP T(空白对照)、CAR-Mes T、CAR-Mes-41BB T、CAR-Mes-DAP10 T细胞的持续性肿瘤杀伤效应，肿瘤细胞系选用A549-GL带荧光素酶的人肺腺癌细胞系。通过将GFP T、CAR-Mes T、CAR-Mes-41BB T、CAR-Mes-DAP10 T细胞分别以E:T＝1：2三次与肿瘤细胞共培养24小时后，通过酶标仪检测每次共培养后CAR T细胞杀伤肿瘤细胞的百分比，如图10(C)(荧光素酶检测法如实施例4所述)。

结果显示，CAR-Mes-41BB-DAP10 T和CAR-Mes-DAP10 T细胞对肿瘤细胞A549-GL的体外杀伤效率都显著高于CAR-Mes T、CAR-Mes-41BB T细胞，且体外连续杀伤实验中， CAR-Mes-DAP10 T的持续杀伤能力更强。则表明含DAP10的CAR T细胞可进一步增强CAR T细胞的肿瘤免疫杀伤效应，尤其是长期、多次的持续性杀伤作用，显示含DAP10的CAR T 细胞在人体内肿瘤杀伤中具有更高的应用价值。

实施例11、对比CAR-GPC3-41BB-DAP10 T和CAR-GPC3-41BB T细胞对肝癌细胞的体外杀伤效应

体外比较GFP T(空白对照)、CAR-GPC3-41BB T(阴性对照)、CAR-GPC3-41BB-DAP10T细胞对肝癌细胞的识别杀伤功能，肿瘤细胞选用带荧光素酶标记的HepG2-G L和HC04-GL人肝细胞癌细胞系。实验方法如实施例4所述。

结果显示，在两种细胞系中，CAR-GPC3-41BB-DAP10 T细胞的杀伤功能均显著高于CAR-GPC3-41BB T细胞(图11(A)和图11(B))，即进一步证明整合DAP10共刺激分子可有效增强CAR T细胞的肿瘤杀伤作用。

实施例12、CAR-GPC3-DAP10 T细胞体内识别杀伤肿瘤

1)将5×10⁵个HepG2-GL细胞移植入NOD/SCID IL2rg-/-免疫缺陷小鼠腹股沟皮下，构建肝癌小鼠模型；

2)肿瘤移植3天后，分别在肝癌小鼠模型中静脉注射GFP阳性细胞数为3×10⁶个的GFP T、CAR-GPC3 T、CAR-GPC3-DAP10 T细胞，共三个实验组，每组设置四个重复；

3)于肿瘤移植后第36天将小鼠全部处死，剥离肿瘤块，并分析记录肿瘤体积(如图12)。

结果表明，CAR-GPC3 T、CAR-GPC3-DAP10 T细胞在肺癌肿瘤异种移植模型中可显著缩小肿瘤体积，而CAR-GPC3-DAP10 T细胞效果更优于CAR-GPC3 T细胞，提示 CAR-Mes-DAP10 T细胞对肝癌等肿瘤细胞有较高的杀伤效率。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品、用途及其使用方式，但本发明并不局限于上述详细用途和使用方式，即不意味着本发明必须依赖上述详细用途和使用方式才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司

<120> 一种增强T细胞抗肿瘤活性的核酸分子

<130> 2017

<141> 2017-09-30

<150> 2017100547591

<151> 2017-01-24

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8280

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240

attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600

tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660

ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720

accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780

gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020

gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080

ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140

ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200

ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260

aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320

tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380

caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440

aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500

aaagtaagac caccgcacag caagcggccg gccgcgctga tcttcagacc tggaggagga 1560

gatatgaggg acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca 1620

ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg 1680

ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg 1740

tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac 1800

aatttgctga gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc 1860

aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg 1920

gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt 1980

tggagtaata aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga 2040

gaaattaaca attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa 2100

gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt 2160

aacataacaa attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta 2220

ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca 2280

ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata 2340

gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatcggca 2400

ctgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg 2460

ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca 2520

aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga 2580

cagcagagat ccagtttggt tagtaccggg cccgctctag tcgaggtcga cggtatcgat 2640

aagctcgctt cacgagattc cagcaggtcg agggacctaa taacttcgta tagcatacat 2700

tatacgaagt tatattaagg gttccaagct taagcggccg ctgaaagacc ccacctgtag 2760

gtttggcaag ctagcaggat tgtttatctt aggaggcatg cttactgtta aaagacagga 2820

tatgtttgaa gtggcttctg agaaaaatgg ttaagaaaat tatgacttaa aaatgtgaga 2880

gattttcaag tatattaatt tttttaactg tccaagtatt tgaaattctt atcatttgat 2940

taacacccat gagtgatatg tgtctggaat tgaggccaaa gcaagctcag ctaagaaata 3000

ctagcacagt gctgtcggcc ccgatgcggg actgcgtttt gaccatcata aatcaagttt 3060

atttttttaa ttaattgagc gaagctggaa gcagatgatg aattagagtc aagatggctg 3120

catgggggtc tccggcaccc acagcaggtg gcaggaagca ggtcaccgcg agagtctatt 3180

ttaggaagca aaaaaacaca attggtaaat ttatcacttc tggttgtgaa gaggtggttt 3240

tgcccaggcc cagatctgaa agtgctctac tgagcaaaac aacacctgga caatttgcgt 3300

ttctaaaata aggcgaggct gaccgaaact gaaaaggctt tttttaacta tctgaatttc 3360

atttccaatc ttagcttatc aactgctagt ttgtgcaaac agcatatcaa cttctaaact 3420

gcattcattt ttaaagtaag atgtttaaga aattaaacag tcttagggag agtttatgac 3480

tgtattcaaa aagtttttta aattagcttg ttatcccttc atgtgataac taatctcaaa 3540

tactttttcg atacctcaga gcattatttt cataatgact gtgttcacaa tctttttagg 3600

ttaactcgtt ctctctttgt gattaaggag aaacactttg atattctgat agagtggcct 3660

tcattttagt atttttcaag accacttttc aactactcac tttaggataa gttttaggta 3720

aaatgtgcat cattatcctg aattatttca gttaagcatg ttagttggtg gcataagaga 3780

aaactcaatc agatagctag ctgcagtaac gccattttgc aaggcatgga aaaataccaa 3840

accaagaata gagaagttca gatcaagggc gggtacatga aaatagctaa cgttgggcca 3900

aacaggatat ctgcggtgag cagtttcggc cccggcccgg ggccaagaac agatggtcac 3960

cgcagtttcg gccccggccc gaggccaaga acagatggtc cccagatatg gcccaaccct 4020

cagcagtttc ttaagaccca tcagatgttt ccaggctccc ccaaggacct gaaatgaccc 4080

tgcgccttat ttgaattaac caatcagcct gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct 4140

tcccgagctc tataaaagag ctcacaaccc ctcactcggc gcgccagtcc tccgattgac 4200

tgagtcgccc ggatccgcga gctttgttta aacgcgatcg cgaaaattgt cgctcctgtc 4260

aaacaaactc ttaactttga tttactcaaa ctggctgggg atgtagaaag caatccaggt 4320

ccagctagca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 4380

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 4440

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 4500

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 4560

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 4620

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 4680

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 4740

ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 4800

cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 4860

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 4920

gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 4980

cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 5040

tacaagtaac tcgagcggcg gaattcgtcg agggacctaa taacttcgta tagcatacat 5100

tatacgaagt tatacatgtt taagggttcc ggttccacta ggtacaattc gatatcaagc 5160

ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 5220

atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg 5280

cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 5340

aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa 5400

cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc 5460

ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg 5520

ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt 5580

ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt 5640

cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc 5700

cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc 5760

gataccgtcg acctcgatcg agacctagaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 5820

gcagctacca atgctgattg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt 5880

ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 5940

cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat 6000

atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca gaactacaca 6060

ccagggccag ggatcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt 6120

gagcaagaga aggtagaaga agccaatgaa ggagagaaca cccgcttgtt acaccctgtg 6180

agcctgcatg ggatggatga cccggagaga gaagtattag agtggaggtt tgacagccgc 6240

ctagcatttc atcacatggc ccgagagctg catccggact gtactgggtc tctctggtta 6300

gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa 6360

taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac 6420

tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagcat gtgagcaaaa 6480

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 6540

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 6600

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 6660

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 6720

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 6780

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 6840

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 6900

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 6960

actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 7020

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 7080

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 7140

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 7200

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 7260

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 7320

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 7380

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 7440

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 7500

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 7560

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 7620

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 7680

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 7740

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 7800

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 7860

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 7920

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 7980

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 8040

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 8100

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 8160

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 8220

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 8280

<210> 2

<211> 1550

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtttaaacat gcttctcctg gtgacaagcc ttctgctctg tgagttacca cacccagcat 60

tcctcctgat cccaagccag gtacagctgc agcagtcagg tccaggactc gtgacgccct 120

cgcagaccct ctcactcacc tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc aacagtgcta 180

cttggaactg gatcaggcag tccccatcga gaggccttga gtggctggga aggacatact 240

acaggtccaa gtggtataac gactatgcag tatctgtgaa aagtcgaatg agcatcaacc 300

cagacacatc caagaaccag ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg 360

ctgtgtatta ctgtgcaaga ggaatgatga cttactatta cggtatggac gtctggggcc 420

aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggaa ttctaggatc cggtggcggt ggcagcggcg 480

gtggtggttc cggaggcggc ggttctcagc ctgtgctgac tcagtcgtct tccctctctg 540

catctcctgg agcatcagcc agtctcacct gcaccttgcg cagtggcatc aatgttggtc 600

cctacaggat atactggtac cagcagaagc cagggagtcc tccccagtat ctcctgaact 660

acaaatcaga ctcagataag cagcagggct ctggagtccc cagccgcttc tctggatcca 720

aagatgcttc ggccaatgca ggggttttac tcatctctgg gctccggtct gaggatgagg 780

ctgactatta ctgtatgatt tggcacagca gcgctgctgt gttcggagga ggcacccaac 840

tgaccgtcct ctccggaatt ctagaacaac agggtgcggc cgcaattgaa gttatgtatc 900

ctcctcctta cctagacaat gagaagagca atggaaccat tatccatgtg aaagggaaac 960

acctttgtcc aagtccccta tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg ctggtggtgg 1020

ttgggggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg 1080

tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc 1140

ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc 1200

gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc 1260

agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac 1320

gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt 1380

acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg 1440

agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg 1500

acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg cgcgatcgcg 1550

<210> 3

<211> 1550

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtttaaacat gcttctcctg gtgacaagcc ttctgctctg tgagttacca cacccagcat 60

tcctcctgat cccaagccag gtacagctgc agcagtcagg tccaggactc gtgacgccct 120

cgcagaccct ctcactcacc tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc aacagtgcta 180

cttggaactg gatcaggcag tccccatcga gaggccttga gtggctggga aggacatact 240

acaggtccaa gtggtataac gactatgcag tatctgtgaa aagtcgaatg agcatcaacc 300

cagacacatc caagaaccag ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg 360

ctgtgtatta ctgtgcaaga ggaatgatga cttactatta cggtatggac gtctggggcc 420

aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggaa ttctaggatc cggtggcggt ggcagcggcg 480

gtggtggttc cggaggcggc ggttctcagc ctgtgctgac tcagtcgtct tccctctctg 540

catctcctgg agcatcagcc agtctcacct gcaccttgcg cagtggcatc aatgttggtc 600

cctacaggat atactggtac cagcagaagc cagggagtcc tccccagtat ctcctgaact 660

acaaatcaga ctcagataag cagcagggct ctggagtccc cagccgcttc tctggatcca 720

aagatgcttc ggccaatgca ggggttttac tcatctctgg gctccggtct gaggatgagg 780

ctgactatta ctgtatgatt tggcacagca gcgctgctgt gttcggagga ggcacccaac 840

tgaccgtcct ctccggaatt ctagaacaac agggtgcggc cgcaattgaa gttatgtatc 900

ctcctcctta cctagacaat gagaagagca atggaaccat tatccatgtg aaagggaaac 960

acctttgtcc aagtccccta tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg ctggtggtgg 1020

ttgggggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg 1080

tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc 1140

ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc 1200

gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc 1260

agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac 1320

gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt 1380

acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg 1440

agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg 1500

acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg cgcgatcgcg 1550

<210> 4

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccaagcc aggtacagct gcagcagtca ggtccaggac tcgtgacgcc ctcgcagacc 120

ctctcactca cctgtgccat ctccggggac agtgtctcta gcaacagtgc tacttggaac 180

tggatcaggc agtccccatc gagaggcctt gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc 240

aagtggtata acgactatgc agtatctgtg aaaagtcgaa tgagcatcaa cccagacaca 300

tccaagaacc agttctccct gcagctgaac tctgtgactc ccgaggacac ggctgtgtat 360

tactgtgcaa gaggaatgat gacttactat tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 420

acggtcaccg tctcctcagg aattctagga tccggtggcg gtggcagcgg cggtggtggt 480

tccggaggcg gcggttctca gcctgtgctg actcagtcgt cttccctctc tgcatctcct 540

ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg cgcagtggca tcaatgttgg tccctacagg 600

atatactggt accagcagaa gccagggagt cctccccagt atctcctgaa ctacaaatca 660

gactcagata agcagcaggg ctctggagtc cccagccgct tctctggatc caaagatgct 720

tcggccaatg caggggtttt actcatctct gggctccggt ctgaggatga ggctgactat 780

tactgtatga tttggcacag cagcgctgct gtgttcggag gaggcaccca actgaccgtc 840

ctctccggaa ttctagaaca acagggtgcg gccgcaattg aagttatgta tcctcctcct 900

tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 960

ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggggga 1020

gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1080

aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1140

acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1200

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1260

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1320

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1560

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1620

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactg 1659

<210> 5

<211> 1778

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gtttaaacat gcttctcctg gtgacaagcc ttctgctctg tgagttacca cacccagcat 60

tcctcctgat cccaagccag gtacagctgc agcagtcagg tccaggactc gtgacgccct 120

cgcagaccct ctcactcacc tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc aacagtgcta 180

cttggaactg gatcaggcag tccccatcga gaggccttga gtggctggga aggacatact 240

acaggtccaa gtggtataac gactatgcag tatctgtgaa aagtcgaatg agcatcaacc 300

cagacacatc caagaaccag ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg 360

ctgtgtatta ctgtgcaaga ggaatgatga cttactatta cggtatggac gtctggggcc 420

aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggaa ttctaggatc cggtggcggt ggcagcggcg 480

gtggtggttc cggaggcggc ggttctcagc ctgtgctgac tcagtcgtct tccctctctg 540

catctcctgg agcatcagcc agtctcacct gcaccttgcg cagtggcatc aatgttggtc 600

cctacaggat atactggtac cagcagaagc cagggagtcc tccccagtat ctcctgaact 660

acaaatcaga ctcagataag cagcagggct ctggagtccc cagccgcttc tctggatcca 720

aagatgcttc ggccaatgca ggggttttac tcatctctgg gctccggtct gaggatgagg 780

ctgactatta ctgtatgatt tggcacagca gcgctgctgt gttcggagga ggcacccaac 840

tgaccgtcct ctccggaatt ctagaacaac agggtgcggc cgcaattgaa gttatgtatc 900

ctcctcctta cctagacaat gagaagagca atggaaccat tatccatgtg aaagggaaac 960

acctttgtcc aagtccccta tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg ctggtggtgg 1020

ttgggggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg 1080

tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc 1140

ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc 1200

gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc 1260

agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac 1320

gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt 1380

acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg 1440

agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg 1500

acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg cttcgaactg tgcgcacgcc 1560

cacgccgcag ccccgcccaa gaagatggca aagtctacat caacatgcca ggcaggggcc 1620

tgtgcgcacg cccacgccgc agccccgccc aagaagatgg caaagtctac atcaacatgc 1680

caggcagggg cctgtgcgca cgcccacgcc gcagccccgc ccaagaagat ggcaaagtct 1740

acatcaacat gccaggcagg ggcacgcgtg cgatcgcg 1778

<210> 6

<211> 2204

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gtttaaacat gcttctcctg gtgacaagcc ttctgctctg tgagttacca cacccagcat 60

tcctcctgat cccaagccag gtacagctgc agcagtcagg tccaggactc gtgacgccct 120

cgcagaccct ctcactcacc tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc aacagtgcta 180

cttggaactg gatcaggcag tccccatcga gaggccttga gtggctggga aggacatact 240

acaggtccaa gtggtataac gactatgcag tatctgtgaa aagtcgaatg agcatcaacc 300

cagacacatc caagaaccag ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg 360

ctgtgtatta ctgtgcaaga ggaatgatga cttactatta cggtatggac gtctggggcc 420

aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggaa ttctaggatc cggtggcggt ggcagcggcg 480

gtggtggttc cggaggcggc ggttctcagc ctgtgctgac tcagtcgtct tccctctctg 540

catctcctgg agcatcagcc agtctcacct gcaccttgcg cagtggcatc aatgttggtc 600

cctacaggat atactggtac cagcagaagc cagggagtcc tccccagtat ctcctgaact 660

acaaatcaga ctcagataag cagcagggct ctggagtccc cagccgcttc tctggatcca 720

aagatgcttc ggccaatgca ggggttttac tcatctctgg gctccggtct gaggatgagg 780

ctgactatta ctgtatgatt tggcacagca gcgctgctgt gttcggagga ggcacccaac 840

tgaccgtcct ctccggaatt ctagaacaac agggtgcggc cgcaattgaa gttatgtatc 900

ctcctcctta cctagacaat gagaagagca atggaaccat tatccatgtg aaagggaaac 960

acctttgtcc aagtccccta tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg ctggtggtgg 1020

ttgggggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg 1080

tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc 1140

ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc 1200

gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc 1260

agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac 1320

gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt 1380

acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg 1440

agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg 1500

acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg cttcgaactg tgcgcacgcc 1560

cacgccgcag ccccgcccaa gaagatggca aagtctacat caacatgcca ggcaggggcc 1620

tgtgcgcacg cccacgccgc agccccgccc aagaagatgg caaagtctac atcaacatgc 1680

caggcagggg cctgtgcgca cgcccacgcc gcagccccgc ccaagaagat ggcaaagtct 1740

acatcaacat gccaggcagg ggcctgtgcg cacgcccacg ccgcagcccc gcccaagaag 1800

atggcaaagt ctacatcaac atgccaggca ggggcctgtg cgcacgccca cgccgcagcc 1860

ccgcccaaga agatggcaaa gtctacatca acatgccagg caggggcctg tgcgcacgcc 1920

cacgccgcag ccccgcccaa gaagatggca aagtctacat caacatgcca ggcaggggcc 1980

tgtgcgcacg cccacgccgc agccccgccc aagaagatgg caaagtctac atcaacatgc 2040

caggcagggg cctgtgcgca cgcccacgcc gcagccccgc ccaagaagat ggcaaagtct 2100

acatcaacat gccaggcagg ggcctgtgcg cacgcccacg ccgcagcccc gcccaagaag 2160

atggcaaagt ctacatcaac atgccaggca ggggcgcgat cgcg 2204

<210> 7

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccaagcc aggtacagct gcagcagtca ggtccaggac tcgtgacgcc ctcgcagacc 120

ctctcactca cctgtgccat ctccggggac agtgtctcta gcaacagtgc tacttggaac 180

tggatcaggc agtccccatc gagaggcctt gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc 240

aagtggtata acgactatgc agtatctgtg aaaagtcgaa tgagcatcaa cccagacaca 300

tccaagaacc agttctccct gcagctgaac tctgtgactc ccgaggacac ggctgtgtat 360

tactgtgcaa gaggaatgat gacttactat tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 420

acggtcaccg tctcctcagg aattctagga tccggtggcg gtggcagcgg cggtggtggt 480

tccggaggcg gcggttctca gcctgtgctg actcagtcgt cttccctctc tgcatctcct 540

ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg cgcagtggca tcaatgttgg tccctacagg 600

atatactggt accagcagaa gccagggagt cctccccagt atctcctgaa ctacaaatca 660

gactcagata agcagcaggg ctctggagtc cccagccgct tctctggatc caaagatgct 720

tcggccaatg caggggtttt actcatctct gggctccggt ctgaggatga ggctgactat 780

tactgtatga tttggcacag cagcgctgct gtgttcggag gaggcaccca actgaccgtc 840

ctctccggaa ttctagaaca acagggtgcg gccgcaattg aagttatgta tcctcctcct 900

tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 960

ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggggga 1020

gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1080

aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1140

acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1200

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1260

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1320

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1560

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1620

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactg 1659

<210> 8

<211> 1737

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccaagcc aggtacagct gcagcagtca ggtccaggac tcgtgacgcc ctcgcagacc 120

ctctcactca cctgtgccat ctccggggac agtgtctcta gcaacagtgc tacttggaac 180

tggatcaggc agtccccatc gagaggcctt gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc 240

aagtggtata acgactatgc agtatctgtg aaaagtcgaa tgagcatcaa cccagacaca 300

tccaagaacc agttctccct gcagctgaac tctgtgactc ccgaggacac ggctgtgtat 360

tactgtgcaa gaggaatgat gacttactat tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 420

acggtcaccg tctcctcagg aattctagga tccggtggcg gtggcagcgg cggtggtggt 480

tccggaggcg gcggttctca gcctgtgctg actcagtcgt cttccctctc tgcatctcct 540

ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg cgcagtggca tcaatgttgg tccctacagg 600

atatactggt accagcagaa gccagggagt cctccccagt atctcctgaa ctacaaatca 660

gactcagata agcagcaggg ctctggagtc cccagccgct tctctggatc caaagatgct 720

tcggccaatg caggggtttt actcatctct gggctccggt ctgaggatga ggctgactat 780

tactgtatga tttggcacag cagcgctgct gtgttcggag gaggcaccca actgaccgtc 840

ctctccggaa ttctagaaca acagggtgcg gccgcaattg aagttatgta tcctcctcct 900

tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 960

ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggggga 1020

gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1080

aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1140

acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1200

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1260

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1320

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1560

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1620

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactgt tcgaactgtg cgcacgccca 1680

cgccgcagcc ccgcccaaga agatggcaaa gtctacatca acatgccagg caggggc 1737

<210> 9

<211> 1796

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

cgcgatcgca cgcgtttcga agcgaggggg cagggcctgc atgtgaaggg cgtcgtaggt 60

gtccttggtg gctgtactga gaccctggta aaggccatcg tgccccttgc ccctccggcg 120

ctcgcctttc atcccaatct cactgtaggc ctccgccatc ttatctttct gcagttcatt 180

gtacaggcct tcctgagggt tcttccttct cggctttccc cccatctcag ggtcccggcc 240

acgtctcttg tccaaaacat cgtactcctc tcttcgtcct agattgagct cgttatagag 300

ctggttctgg ccctgctggt acgcgggggc gtctgcgctc ctgctgaact tcactctgga 360

gcgataggct gcgaagtcgc gtggtggggc atagggctgg taatgcttgc gggtgggccc 420

ggggcggcgg ggagtcatgt tcatgtagtc actgtgcagg agcctgctcc tcttactcct 480

cacccagaaa ataataaagg ccactgttac tagcaagcta tagcaagcca ggactccccc 540

aaccaccacc agcacccaaa agggcttaga aggtccggga aataggggac ttggacaaag 600

gtgtttccct ttcacatgga taatggttcc attgctcttc tcattgtcta ggtaaggagg 660

aggatacata acttcaattg cggccgcttt acccggagac agggagaggc tcttctgcgt 720

gtagtggttg tgcagagcct catgcatcac ggagcatgag aagacgttcc cctgctgcca 780

cctgctcttg tccacggtga gcttgctgta gaggaagaag gagccgtcgg agtccagcac 840

gggaggcgtg gtcttgtagt tgttctccgg ctgcccattg ctctcccact ccacggcgat 900

gtcgctggga tagaagcctt tgaccaggca ggtcaggctg acctggttct tggtcagctc 960

atcccgggat gggggcaggg tgtacacctg tggttctcgg ggctgcccgc cggatccacc 1020

gccagagcta cctccgccgc acggtgggca tgtgtgagtt ttgtcacaag atttgggctc 1080

gctcgagacg gtgaccaggg ttccttgacc ccagaacccc cccgttttac aataatagac 1140

ggcagtgtcc tcagcacgca ggctgttcat ctgcaggtag gctgtgtttt tggatgtgtc 1200

tgcgcttata gtggcacggc cctggaactt cgggacaaat tcagtgtcac cattctcagg 1260

atcaatccat gcaacccatt ccaggccctt accaggggcc tgacgcaccc agtgtatata 1320

gtagtcttta atgttgaagc cagaagctgc gcaggacaaa cggagtgagc cccctggctg 1380

cacaaggcca cccccagact ccaccagctg aacctctgag ctgccgccac ctccggagcc 1440

gcctccggag ccaccgccgc tagtactgcc ttttatctcc accttggtcc cctgtccgaa 1500

cgtgaatggg ctactactcc actgctgaca gtaataggtg gcgaaatctt ccggctgcag 1560

actgctaatg gtgagggtga agtctgtccc agacccggag ccactgaacc tagaagggac 1620

gccagaagcc agtttggatg tgtcatagat gagtcttttg ggagcttttc ctggtttctg 1680

ctggtaccag tgaatgaatc ttacacttga actggcactg caggtgatgg tgaccctatc 1740

ccccacagag gcggacaaag agcttggaga ttgggtcagc tgaatgtcgt ttaaac 1796

<210> 10

<211> 1862

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gtttaaacga cattcagctg acccaatctc caagctcttt gtccgcctct gtgggggata 60

gggtcaccat cacctgcagt gccagttcaa gtgtaagatt cattcactgg taccagcaga 120

aaccaggaaa agctcccaaa agactcatct atgacacatc caaactggct tctggcgtcc 180

cttctaggtt cagtggctcc gggtctggga cagacttcac cctcaccatt agcagtctgc 240

agccggaaga tttcgccacc tattactgtc agcagtggag tagtagccca ttcacgttcg 300

gacaggggac caaggtggag ataaaaggca gtactagcgg cggtggctcc ggaggcggct 360

ccggaggtgg cggcagctca gaggttcagc tggtggagtc tgggggtggc cttgtgcagc 420

cagggggctc actccgtttg tcctgcgcag cttctggctt caacattaaa gactactata 480

tacactgggt gcgtcaggcc cctggtaagg gcctggaatg ggttgcatgg attgatcctg 540

agaatggtga cactgaattt gtcccgaagt tccagggccg tgccactata agcgcagaca 600

catccaaaaa cacagcctac ctgcagatga acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct 660

attattgtaa aacggggggg ttctggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcgagcgagc 720

ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgcgg cggaggtagc tctggcggtg 780

gatccggcgg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 840

tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 900

ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 960

tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 1020

agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 1080

agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc 1140

cttacctaga caatgagaag agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt 1200

gtccaagtcc cctatttccc ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttgggg 1260

gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga 1320

gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc 1380

ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca 1440

gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct 1500

ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc 1560

gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg 1620

aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc 1680

ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct 1740

acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgcctgtg cgcacgccca cgccgcagcc 1800

ccgcccaaga agatggcaaa gtctacatca acatgccagg caggggcacg cgtgcgatcg 1860

cg 1862

<210> 11

<211> 2012

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gtttaaacga cattcagctg acccaatctc caagctcttt gtccgcctct gtgggggata 60

gggtcaccat cacctgcagt gccagttcaa gtgtaagatt cattcactgg taccagcaga 120

aaccaggaaa agctcccaaa agactcatct atgacacatc caaactggct tctggcgtcc 180

cttctaggtt cagtggctcc gggtctggga cagacttcac cctcaccatt agcagtctgc 240

agccggaaga tttcgccacc tattactgtc agcagtggag tagtagccca ttcacgttcg 300

gacaggggac caaggtggag ataaaaggca gtactagcgg cggtggctcc ggaggcggct 360

ccggaggtgg cggcagctca gaggttcagc tggtggagtc tgggggtggc cttgtgcagc 420

cagggggctc actccgtttg tcctgcgcag cttctggctt caacattaaa gactactata 480

tacactgggt gcgtcaggcc cctggtaagg gcctggaatg ggttgcatgg attgatcctg 540

agaatggtga cactgaattt gtcccgaagt tccagggccg tgccactata agcgcagaca 600

catccaaaaa cacagcctac ctgcagatga acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct 660

attattgtaa aacggggggg ttctggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc tcgagcgagc 720

ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgcgg cggaggtagc tctggcggtg 780

gatccggcgg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 840

tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 900

ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 960

tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 1020

agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 1080

agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc 1140

cttacctaga caatgagaag agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt 1200

gtccaagtcc cctatttccc ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttgggg 1260

gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga 1320

gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc 1380

ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca 1440

gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct 1500

ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc 1560

gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg 1620

aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc 1680

ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct 1740

acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgcttcga actgtgcgca cgcccacgcc 1800

gcagccccgc ccaagaagat ggcaaagtct acatcaacat gccaggcagg ggcctgtgcg 1860

cacgcccacg ccgcagcccc gcccaagaag atggcaaagt ctacatcaac atgccaggca 1920

ggggcctgtg cgcacgccca cgccgcagcc ccgcccaaga agatggcaaa gtctacatca 1980

acatgccagg caggggcacg cgtgcgatcg cg 2012

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 12

Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr

1 5 10 15

Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly

20

<210> 13

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60

ccaggcaggg gc 72

<210> 14

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagatg ttgtgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120

gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 180

cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240

cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300

aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 360

gttcctccta cgttcggatc ggggaccaag ctggaaataa aaggtggagg cggttcaggc 420

ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgcag gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg 480

gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt cgggctacac atttactgac 540

tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct gtgcatggcc taaaatggat tggagctctt 600

gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcaaggc cacactgact 660

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720

gccgtctatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaagg gactctggtc 780

actgtctctg caattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga gaagagcaat 840

ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct 900

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 960

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440

ccccctcgc 1449

<210> 15

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagatg ttgtgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120

gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 180

cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240

cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300

aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 360

gttcctccta cgttcggatc ggggaccaag ctggaaataa aaggtggagg cggttcaggc 420

ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgcag gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg 480

gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt cgggctacac atttactgac 540

tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct gtgcatggcc taaaatggat tggagctctt 600

gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcaaggc cacactgact 660

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720

gccgtctatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaagg gactctggtc 780

actgtctctg caattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga gaagagcaat 840

ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct 900

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 960

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440

ccccctcgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1500

ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1560

ggaggatgtg aactg 1575

<210> 16

<211> 1528

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagatg ttgtgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120

gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 180

cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240

cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300

aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 360

gttcctccta cgttcggatc ggggaccaag ctggaaataa aaggtggagg cggttcaggc 420

ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgcag gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg 480

gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt cgggctacac atttactgac 540

tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct gtgcatggcc taaaatggat tggagctctt 600

gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcaaggc cacactgact 660

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720

gccgtctatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaagg gactctggtc 780

actgtctctg caattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga gaagagcaat 840

ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct 900

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 960

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440

ccccctcgct tcgaactgtg cgcacgccca cgccgcagcc ccgcccaaga agatggcaaa 1500

gtctacatca acatgccagg caggggcc 1528

<210> 17

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagatg ttgtgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120

gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 180

cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240

cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300

aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 360

gttcctccta cgttcggatc ggggaccaag ctggaaataa aaggtggagg cggttcaggc 420

ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgcag gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg 480

gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt cgggctacac atttactgac 540

tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct gtgcatggcc taaaatggat tggagctctt 600

gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcaaggc cacactgact 660

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720

gccgtctatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaagg gactctggtc 780

actgtctctg caattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga gaagagcaat 840

ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct 900

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 960

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1020

ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1080

cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagga gtaagaggag caggctcctg 1140

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1200

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1260

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1320

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1380

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1440

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1500

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1560

gccctgcccc ctcgc 1575

<210> 18

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagatg ttgtgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120

gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 180

cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240

cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300

aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 360

gttcctccta cgttcggatc ggggaccaag ctggaaataa aaggtggagg cggttcaggc 420

ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgcag gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg 480

gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt cgggctacac atttactgac 540

tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct gtgcatggcc taaaatggat tggagctctt 600

gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcaaggc cacactgact 660

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720

gccgtctatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaagg gactctggtc 780

actgtctctg caattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga gaagagcaat 840

ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct 900

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 960

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440

ccccctcgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1500

ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1560

ggaggatgtg aactgttcga actgtgcgca cgcccacgcc gcagccccgc ccaagaagat 1620

ggcaaagtct acatcaacat gccaggcagg ggc 1653

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞内结构域包括DAP10蛋白的胞内段序列。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述DAP10蛋白的胞内段序列如SEQ ID NO:12所示；

优选地，所述胞内结构域包括1～9个、优选1～3个DAP10蛋白的胞内段序列；

优选地，所述胞内结构域包括通过串联方式连接在一起的两个或更多个DAP10蛋白的胞内段序列；

优选地，所述胞内结构域还包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；

优选地，所述胞内共刺激信号传导域选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD28、4-1BB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、CD27、CD28、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D或CD83中的任意一种或至少两种的组合，优选为TLR2、4-1BB或CD28中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述能够结合抗原的胞外结构域是指所述抗原的受体胞外段，或者所述抗原的特异性抗体的单链可变片段；

优选地，所述抗原是肿瘤抗原和/或肿瘤相关辅助细胞抗原；

优选地，所述肿瘤抗原和/或肿瘤相关辅助细胞抗原选自5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、PSCA、GPC3、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190minor bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、BCMA、CD123、PD-1、PD-L1/2、TIM3、LAG3、A2ARA2AR、B7H3、B7H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4、VISTA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD44v6、B7-H3、CD117、IL-13Ra2、IL-11Ra、PRSS21、VEGFR2、路易斯抗原、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、NCAM、CAIX、EphA2、GM1、sLe、TGS5、HMWMAA、OAcGD2、叶酸受体β、CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、淋巴细胞抗原6复合物、LY6K、OR51E2、TARP、ETS、SPA17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、ERG、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、SART3、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、FCRL5、IGLL1、NY-Eso-1或NY-Eso-B中的任意一种或至少两种的组合；

进一步优选地，所述抗原是PCSA、Mesothelin或GPC3抗原中的任意一种或至少两种的组合；更进一步优选地，所述胞外结构域为特异性识别抗原Mesothelin、PSCA或GPC3的受体胞外段和/或抗体；

优选地，所述跨膜结构域为胞外段受体对应的跨膜结构域或胞内段共刺激信号分子对应的跨膜结构域，优选为CD28跨膜区。

3.编码如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的核酸或与其具有至少80％同一性，优选至少90％同一性的核酸。

4.一种嵌合抗原受体表达细胞，其中引入了如权利要求3所述的核酸；优选地，所述细胞为免疫效应细胞，进一步优选为T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

5.制备如权利要求4所述的嵌合抗原受体表达细胞的方法，其包括将如权利要求7所述的核酸引入细胞的步骤；优选地，所述细胞为免疫效应细胞，进一步优选为T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

6.一种重组载体，其包含有权利要求3所述的核酸；优选地，所述载体为重组克隆载体、重组真核表达质粒或重组慢病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为重组慢病毒载体；

优选地，所述重组克隆载体包括pUC18、pUC19、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述真核表达质粒包括pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX或pDC315中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述重组慢病毒载体包括重组腺病毒载体、重组腺相关病毒载体、重组逆转录病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体或重组痘苗病毒载体中的任意一种或至少两种的组合。

7.一种重组病毒，其包含如权利要求6所述的重组载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到的重组病毒；

优选地，一种嵌合抗原受体T细胞，其通过将如权利要求7所述的重组病毒转染到T细胞中表达；

优选地，如权利1或2所述的嵌合抗原受体、如权利要求3所述的核酸、如权利要求6所述的重组载体或如权利要求7所述的重组病毒用于扩增CAR T细胞。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、如权利要求3所述的核酸、如权利要求4所述的嵌合抗原受体表达细胞或如权利要求6所述的表达载体，以及任选的药学上可接受的辅料。

9.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、如权利要求3所述的核酸、如权利要求4所述的嵌合抗原受体表达细胞或如权利要求6所述的表达载体在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病或肿瘤的药物中的用途；

优选地，所述肿瘤为实体瘤和/或血液瘤，优选为白血病、肝癌或肺癌。

10.一种治疗患有自身免疫性疾病和/或与肿瘤抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，其包括对所述受试者施用有效量的包含权利要求8所述的药物组合物的药物；

优选地，所述肿瘤为实体瘤和/或血液瘤，优选为白血病、肝癌或肺癌。