CN107568744A - 热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‑甾醇颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法。该方法将大豆蛋白分散于去离子水中，调节分散液H，离心后对分散液进行加热处理和高压微射流处理，获得蛋白溶液；在高速剪切条件下向蛋白溶液中添加甾醇‐乙醇溶液，混合均匀；蛋白和甾醇混合液经超声均质后，蒸发除去乙醇，离心去除未包埋的甾醇和不溶性蛋白后，冷冻干燥得到大豆蛋白‐甾醇纳米颗粒干粉。本发明开发出一种新型的蛋白质修饰技术，用于生产粒径更小、稳定性更高的甾醇输送载体，操作简便，能够进行连续化生产，能够被广泛应用到甾醇功能豆奶的生产之中。

Description

热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白-甾醇颗粒 的方法

技术领域

本发明涉及甾醇，特别是涉及一种热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白-甾醇颗粒的方法，属于谷物副产物深加工技术领域。

背景技术

甾醇是广泛存在于植物细胞膜中的生物活性成分，具有降低胆固醇、抗炎和退热、抗癌、拮抗胆固醇，预防心血管疾病、促进动物生长和增进肌体健康等优秀生理作用，被誉为“生命的钥匙”。早在1999年，植物甾醇已经美国FDA批准可以将其添加至食品中，且该食品可以使用“有益健康”标签。同时，大量研究报告指出：每天摄入1.39g以上的植物甾醇酯或3.49g以上的植物甾烷醇酯能起到有效降血液胆固醇的效果。基于植物甾醇优秀的生理利用价值，且其不能在人体内合成，开发富含植物甾醇的功能性食品成为食品从业人员的研究热点。

游离的植物甾醇是脂溶性的，但其在油脂中溶解度不大，且极易结晶造成了使用上的困难。此外，较低的油溶性也使得植物甾醇的生物利用率较低。目前，基于植物甾醇的良好乳化性，不少学者尝试通过化学或者生物手段对植物甾醇进行酯化处理，以增强其油溶性，并将酯化后的植物甾醇应用于高脂食品之中。然而，油脂摄入过量对人体有多种不利影响，因此开发出种水溶性的植物甾醇载体，将其应用于乳制品、饮料、糖果等食品中，对于扩大甾醇在食品中的应用具有重要意义。

中国发明专利CN105124603A公布了一种通过反溶剂法制备的水溶性蛋白质-甾醇颗粒，该方法中以大豆蛋白、乳清蛋白和酪蛋白酸钠为主要原料，在高速剪切的条件下加入乙醇溶解的甾醇颗粒，通过均质和冻干制备蛋白质-植物甾醇颗粒。然而，在实际生产中，以乳饮料的制备为例，将甾醇添加至食品之后，通常需要经过高温杀菌以提高乳饮料的货架期。多数蛋白质热稳定性差，经120℃的高温处理之后会发生严重的絮凝、聚集等失稳现象，大大降低了食品的货架期。因此，为了提高甾醇运输载体的稳定性、将甾醇应用于更多的食品生产之中，仅仅关注其水溶性是不够的，还需要提高其稳定性，包括热稳定性和储藏稳定性。

发明内容

为了解决甾醇功能食品的稳定性问题，本发明的目的在于提供一种热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白-甾醇颗粒的方法；所得大豆蛋白-甾醇纳米颗粒小于126.9nm，甾醇包埋率达到80％以上，而且加热稳定性达到94.04％以上，储藏稳定性达到89.50％以上。

本发明以大豆蛋白主要原料，采用加热处理结合高压微射流技术进行处理制备出所需的蛋白溶液，反溶剂法加入植物甾醇，经过超声、旋蒸、离心、冷冻干燥得到稳定性高的大豆蛋白-甾醇颗粒；本发明发现，热处理结合高压微射流处理修饰大豆蛋白，为植物甾醇功能饮料提供更加稳定的运输载体，可以明显减小大豆蛋白-甾醇纳米颗粒粒径，提高甾醇包埋率，甾醇包埋率达到80％以上，并且显著提高大豆蛋白-甾醇纳米颗粒的加热稳定性和储藏稳定性。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白-甾醇颗粒的方法，包括如下步骤：

(1)将大豆蛋白分散于去离子水中，调节pH至6.0～8.0，搅拌，对大豆蛋白溶液进行热处理，热处理温度为80～120℃，热处理时间为10～30min，将热处理后的蛋白溶液迅速冷却至室温后，对蛋白溶液进行高压微射流处理，压强为80～120Mpa，处理次数为1～3次，获得蛋白溶液；

(2)将植物甾醇干粉分散于无水乙醇中，水浴条件下搅拌，获得甾醇-乙醇溶液；

(3)在高速剪切机剪切的条件下，向所述蛋白溶液中快速加入甾醇-乙醇溶液，混合均匀后进行超声处理，去除乙醇，去除不溶性蛋白和剩余甾醇，冷冻干燥后得到稳定型大豆蛋白-甾醇纳米颗粒。

为进一步实现本发明目的，优选地，步骤(1)中，采用水浴锅或高压蒸汽灭菌锅对大豆蛋白溶液进行热处理。

优选地，步骤(1)中，分别以g和mL为单位，将大豆蛋白按1:20～1:10料液比分散于去离子水中。

优选地，步骤(1)中，所述搅拌的时间为2～4h。

优选地，步骤(1)中，采用高压微射流均质机高对蛋白溶液进行高压微射流处理。

优选地，步骤(2)中，分别以g和mL为单位，将植物甾醇干粉按0.01:1～0.02:1分散于无水乙醇中。

优选地，步骤(3)中，甾醇-乙醇溶液与蛋白溶液的体积比为1：100～10:100。

优选地，步骤(3)中，高速剪切机剪切速率为8000～13000rpm，剪切时间为3～5min。

优选地，步骤(3)中，超声处理的功率为180～350W，处理时间为5～15min，时间间隔为50％～70％。

优选地，步骤(3)中，采用旋转蒸发去除乙醇，高速离心去除不溶性蛋白和剩余甾醇。

本发明中大豆蛋白-甾醇颗粒的加热稳定性采用120℃热处理15min前后粒径变化的百分比值表示，百分比值越大，加热稳定性越差，反之，加热稳定性高。

本发明将热处理和高压微射流处理结合用来修饰大豆蛋白，利用热处理条件导致大豆蛋白分子的结构展开、暴露出更多的疏水基团。这些疏水基团的增加可能会在反溶剂过程中促进形成更加结构更加紧密的颗粒，有效包埋疏水的活性物质，更好地抵御环境条件改变对颗粒的伤害，进而提高颗粒的稳定性。但考虑到热处理过程可能会导致大豆蛋白发生聚集，降低其溶解性。为了解决上述问题，本发明将热处理与高压微射流处理结合使用，通过高压微射流的均质作用将热处理过程中部分聚集的大豆蛋白重新分散，提高大豆蛋白的分散性。

微射流作为一种高效的蛋白质修饰方法，利用高压条件下的剪切力作用于蛋白质分子，使其结构发生变化，暴露出更多的疏水基团，可能与热处理对大豆蛋白的作用起到协同作用。通过本发明制备的大豆蛋白能够更好地包埋甾醇等疏水性物质、且具有良好的分散性，将为植物甾醇功能饮料提供更加稳定的运输载体。

本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：

(1)本发明利用蛋白质的热聚集特性，将高温处理与高压微射流处理结合，有效提高大豆蛋白的稳定性，并以反溶剂法将疏水的植物甾醇分散于水相中，制备出稳定性高的大豆蛋白-甾醇纳米颗粒、且克服了甾醇的疏水性问题；

(2)与现有工艺相比，该蛋白质-甾醇纳米颗粒经120℃高温处理后仍然具有较好的分散性和稳定性，且该蛋白质-甾醇颗粒以干粉状储藏三个月后仍然具有良好的复溶性，这一特性对其广泛应用到食品工业生产领域、提高食品的货架期具有重要意义；

(3)本发明所涉及的生产过程简便、快捷，不涉及有害的化学试剂，具有工业化和规模化的前景，适合于生产富集甾醇的功能性食品、药品等领域。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步描述，但实施例不构成对本发明保护范围的限定。

粒度和分散性测试方法：将实施例中制备的样品稀释至蛋白浓度约10mg/mL后，采用动态光散射法DLS测定纳米颗粒的平均粒径和分散性，结果取三次测定的平均值。

甾醇包埋率测定方法：采用气相色谱法测定甾醇包埋率，具体操作方法如下：

2.5mol/L氢氧化钾-乙醇溶液的配制：14.0g氢氧化钾溶解在10mL水中，冷至室温后，用乙醇稀释至100mL。

标准品溶液的配制：将β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、5α-胆甾烷标准品溶解在正己烷溶液中，配制成1mg/mL标准液。

样品的处理：准确称取20mg样品(精确至0.1mg)置于10mL血清瓶中，加入100μL上述5α-胆甾烷标准品溶液作为内标，再加入2mL氢氧化钾-乙醇溶液后加盖密封，剧烈振摇20s，置于70℃恒温水浴锅中皂化1h，反应结束后，待血清瓶冷却至室温后打开瓶塞，加1mL去离子水和3mL正己烷，密封后剧烈振摇3min，静置分层，将上层(正己烷层)转移至30mL锥形瓶中，水层用正己烷重复萃取3次，每次2mL，合并正己烷层，加入1g无水硫酸钠干燥，干燥后的正己烷萃取液用正己烷定容至10mL，GC测定。

气相色谱测定条件：HP-5柱，柱温300℃，进口温度330℃，检测器温度330℃，分流比5:1，氮气流量：0.5mL/min，上样量4μL。植物甾醇含量的定量计算：

采用以下公式对植物甾醇含量进行定量计算：

RRF＝(v_st/V_i)×(A_i/A_st)

A_ps＝(A_s×V_i×RRF)/A_i

A_b＝(A_ps/A_z)×100％

其中，RRF：相对响应因子；Vi：内标含量；Vst：标准品含量；Ai：内标峰面积；Ast：标准品峰面积；As：样品峰面积；Aps：样品中植物甾醇的含量；Az：样品中甾醇的总添加量；Ab：样品中植物甾醇的包埋率(％)。

加热稳定性测试方法：将实施例中制备的甾醇纳米颗粒进行加热处理，处理完后采用气相色谱法测定其甾醇含量，加热稳定性按以下公式计算：

加热稳定性(％)＝(1-热处理后纳米颗的粒甾醇含量/新鲜颗粒的甾醇含量)×100％

储藏稳定性测试方法：将实施例中制备的甾醇纳米颗粒冻干粉至于室温下储存两个月，之后测定其在醇含量，储藏稳定性按以下公式计算：

储藏稳定性(％)＝(1-热处理后纳米颗的粒甾醇含量/新鲜颗粒的甾醇含量)×100％。

对比实施例1

(1)将酪蛋白酸钠按1:10(w/v，g/mL)料液比分散于去离子水中，调节pH至7.0，室温条件下搅拌2h，获得所需的酪蛋白溶液；

(2)将植物甾醇干粉按0.02:1(w/v，g/mL)分散于无水乙醇中，水浴搅拌获得所需的甾醇-乙醇溶液；

(3)在高速剪切机以13000rpm速率剪切的条件下快速向酪蛋白溶液中按体积比0.5：10加入甾醇-乙醇溶液，混合4min后进行超声处理(功率240W，时间10min，间隔50％)，之后将混合液在45℃旋转蒸发10min去除乙醇，10000rpm离心10min去除不容性蛋白和剩余甾醇，冷冻干燥24h后即得大豆蛋白-甾醇纳米颗粒。

对比实施例2

一种高压微射流处理制备大豆蛋白-甾醇颗粒的方法，步骤如下：

(1)将大豆蛋白按1:10(w/v，g/mL)料液比分散于去离子水中，调节pH至7.0，室温15～30℃搅拌2h，在100Mpa的压强下过高压微射流一次，获得所需的大豆蛋白溶液；

(2)将植物甾醇干粉按0.02:1(w/v，g/mL)分散于无水乙醇中，水浴搅拌获得所需的甾醇-乙醇溶液；

(3)在高速剪切机以13000rpm速率剪切的条件下快速向酪蛋白溶液中按体积比0.5：10加入甾醇-乙醇溶液，混合4min后进行超声处理(功率240W，时间10min，间隔50％)，之后将混合液在45℃旋转蒸发10min去除乙醇，10000rpm离心10min去除不容性蛋白和剩余甾醇，冷冻干燥24h后即得90℃大豆蛋白-甾醇纳米颗粒。

实施例1

一种热处理结合高压微射流处理制备功能性大豆蛋白-甾醇颗粒的方法，步骤如下：

(1)将大豆蛋白按0.8:10(w/v，g/mL)料液比分散于去离子水中，调节pH至7.0，室温15～30℃搅拌2h，在90℃水浴锅中加热30min，迅速冷却至室温，在100Mpa的压强下过高压微射流一次，获得所需的蛋白溶液；

(2)将植物甾醇干粉按0.02:1(w/v，g/mL)分散于无水乙醇中，水浴搅拌获得所需的甾醇-乙醇溶液；

(3)在高速剪切机以13000rpm速率剪切的条件下快速向酪蛋白溶液中按体积比0.5：10加入甾醇-乙醇溶液，混合4min后进行超声处理(功率240W，时间10min，间隔50％)，之后将混合液在45℃旋转蒸发10min去除乙醇，10000rpm离心10min去除不容性蛋白和剩余甾醇，冷冻干燥24h后即得90℃大豆蛋白-甾醇纳米颗粒。

结果如表1：

表1

根据表1，与对比实施例1和2相比，实施例1中的大豆蛋白经过加热处理结合微射流处理后，大豆蛋白-甾醇纳米颗粒粒径明显变小为126.9nm，包埋率增加至80.30％，加热稳定性和储藏稳定性也有明显增长，表明热处理结合高压微射流处理在某种程度上能够提高大豆蛋白的甾醇包埋率和颗粒稳定性。

与对比实施例1相比，对比实施例2的加热稳定性和储藏稳定性分别提高了3.7％和6.2％，而实施例1则分别提高了8.06％和18.10％，表明经加热处理结合微射流处理的大豆蛋白-甾醇颗粒粒径比只经过微射流处理的大豆蛋白-甾醇颗粒具有更高的耐热稳定性和储藏稳定性。综合上述数据，单独的高压微射流处理能提高大豆蛋白的甾醇包埋能力和稳定性，但结合热处理和高压微射流处理之后的大豆蛋白明显具有更高的甾醇包埋能力和稳定性，体现二者对大豆蛋白分子的协同改善作用。由于热处理能够使大豆蛋白分子结构展开、疏水性集团暴露，而高压微射流处理能够使大豆蛋白分散性增加，结构发生改变，也能导致某些疏水氨基酸暴露，二者结合时对大豆蛋白的功能性质具有更明显的改善，可能表明热处理与高压微射流处理具有一定的协同作用。

现有技术CN105124603 A制备的甾醇-蛋白纳米颗粒粒径为189nm,本实施例1粒径仅为149.4nm，表明按照本发明的实施例能够制备粒径更小、分散性更高的甾醇纳米颗粒。此外，CN105124603 A中纳米颗粒放置三周后未出现结晶，即被判定为储藏稳定性良好。而按照本实施例制备出的甾醇纳米颗粒储藏三个月之后粒径变化较小，比CN105124603 A的测试方法更加科学严谨；经本发明方法测试，本实施例产品的储藏稳定性为89.50％，比现有技术CN105124603 A的77.60％提高很多。

实施例2

一种热处理结合高压微射流处理制备功能性大豆蛋白-甾醇颗粒的方法，步骤如下：

(1)将大豆蛋白按1:10(w/v，g/mL)料液比分散于去离子水中，调节pH至7.0，室温15～30℃搅拌2h，在高压灭菌锅锅中120℃加热20min，迅速冷却至室温，在100Mpa的压强下过高压微射流一次，获得所需的大豆蛋白溶液；

(2)将植物甾醇干粉按0.02:1(w/v，g/mL)分散于无水乙醇中，水浴搅拌获得所需的甾醇-乙醇溶液；

(3)在高速剪切机以13000rpm速率剪切的条件下快速向酪蛋白溶液中按体积比0.5：10加入甾醇-乙醇溶液，混合4min后进行超声处理(功率240W，时间10min，间隔50％)，之后将混合液在45℃旋转蒸发10min去除乙醇，10000rpm离心10min去除不容性蛋白和剩余甾醇，冷冻干燥24h后即得120℃大豆蛋白-甾醇纳米颗粒。

结果如表2：

表2

从表2可以看出，相比对比实施例，实施例2中的粒径降低为116.7nm，明显低于对比实施例(188.5nm和149.4nm)和现有技术CN105124603的171nm，表明经热处理和微射流处理的大豆蛋白能够与甾醇形成粒径更小的颗粒；对比实施例的甾醇包埋率分别为62.30％和69.80％，而实施例2的包埋率增加至85.20％，表明经本发明的处理之后大豆蛋白对甾醇的荷载率有明显增加。

此外，与对比实施例相比，实施例2制备的大豆蛋白-甾醇颗粒经过120℃热处理和三个月的储藏后仍然具有较小的粒径和分散相，显示出更高的加热稳定性变化和储藏稳定性变化，表明实施例2制备的大豆蛋白-甾醇颗粒具有更好的耐热稳定性和储藏稳定性，这对于工业上增加产品杀菌处理的稳定性和延长食品的货架期具有重要帮助。

实施例3

一种热处理结合高压微射流处理制备功能性大豆蛋白-甾醇颗粒的方法，步骤如下：

(1)将大豆蛋白按1:10(w/v，g/mL)料液比分散于去离子水中，调节pH至7.0，室温15～30℃搅拌2h，在120℃水浴锅中加热20min，迅速冷却至室温，在120Mpa的压强下过高压微射流一次，获得所需的大豆蛋白溶液；

(2)将植物甾醇干粉按0.02:1(w/v，g/mL)分散于无水乙醇中，水浴搅拌获得所需的甾醇-乙醇溶液；

(3)在高速剪切机以13000rpm速率剪切的条件下快速向酪蛋白溶液中按体积比0.5：10加入甾醇-乙醇溶液，混合4min后进行超声处理(功率240W，时间10min，间隔50％)，之后将混合液在45℃旋转蒸发10min去除乙醇，10000rpm离心10min去除不容性蛋白和剩余甾醇，冷冻干燥24h后即得90℃大豆蛋白-甾醇纳米颗粒。

检测结果如表3：

表3

表3可以看出，实施例3中的颗粒粒径仅为102.6nm，明显低于对比实施例1和2中的188.5和149.4nm，正式经热处理和微射流处理的大豆蛋白与甾醇形成的颗粒粒径更小。对比实施例1和2的甾醇包埋率分别为62.3％和69.80％，而实施例3的包埋率增加至93.30％，表明经本发明的处理之后大豆蛋白能够更好地包埋甾醇。此外，实施例3经120℃杀菌15min之后的加热稳定性为95.04％，储藏稳定性为91.50％，均远高于对比实施例1的85.90％和71.40％，表明实施例3制备的大豆蛋白-甾醇颗粒经过120℃热处理和三个月的储藏期后仍然具有较高的稳定性，这种耐热稳定性和储藏稳定性对于提高甾醇在食品工业中的应用、扩大甾醇功能食品的领域具有重要意义。

Claims (10)

1.热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将大豆蛋白分散于去离子水中，调节pH至6.0～8.0，搅拌，对大豆蛋白溶液进行热处理，热处理温度为80～120℃，热处理时间为10～30min，将热处理后的蛋白溶液迅速冷却至室温后，对蛋白溶液进行高压微射流处理，压强为80～120Mpa，处理次数为1～3次，获得蛋白溶液；

(2)将植物甾醇干粉分散于无水乙醇中，水浴条件下搅拌，获得甾醇‐乙醇溶液；

(3)在高速剪切机剪切的条件下，向所述蛋白溶液中快速加入甾醇‐乙醇溶液，混合均匀后进行超声处理，去除乙醇，去除不溶性蛋白和剩余甾醇，冷冻干燥后得到稳定型大豆蛋白‐甾醇纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用水浴锅或高压蒸汽灭菌锅对大豆蛋白溶液进行热处理。

3.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)中，分别以g和mL为单位，将大豆蛋白按1:20～1:10料液比分散于去离子水中。

4.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述搅拌的时间为2～4h。

5.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用高压微射流均质机高对蛋白溶液进行高压微射流处理。

6.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(2)中，分别以g和mL为单位，将植物甾醇干粉按0.01:1～0.02:1分散于无水乙醇中。

7.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)中，甾醇‐乙醇溶液与蛋白溶液的体积比为1：100～10:100。

8.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)中，高速剪切机剪切速率为8000～13000rpm，剪切时间为3～5min。

9.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)中，超声处理的功率为180～350W，处理时间为5～15min，时间间隔为50％～70％。

10.根据权利要求1所述的热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白‐甾醇颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用旋转蒸发去除乙醇，高速离心去除不溶性蛋白和剩余甾醇。