CN107551324A - 一种可缝合硬膜修补材料的制备及其应用 - Google Patents
一种可缝合硬膜修补材料的制备及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种可缝合硬膜修补材料的制备及其应用，属于生物材料和医疗卫生领域。本发明具体公开了一种可缝合硬膜修补材料的制备及其应用，步骤包括目的胶原蛋白的提取，致密层的制备，多孔层的制备，硬膜的冻干，交联和灭菌等过程。所得硬膜修补材料具有双层复合结构，机械性能高，可缝合，能有效防止脑脊液渗漏；本发明材料产品纯度高，且产品中致密层完整的保留了胶原蛋白的三股螺旋结构，生物活性强，生物相容性好，降解可控等优点，是一种良好的硬脑膜和脊柱膜的替代物。
Description
技术领域
本发明属于生物材料及医疗卫生领域，具体的涉及一种可缝合硬膜修补材料的制备及其应用。
背景技术
众所周知，硬脑膜和硬脊膜均为人体中不可缺少的部分，是维护生命的基本组成部分，硬脑膜是一种较为坚固的结缔组织薄膜，主要由成纤维细胞和胶原纤维组成，位于脑和脊髓膜结构的最外层，是保护脑组织的一道重要屏障，对于维护神经系统的结构及功能活动意义重大。硬脊膜由致密结缔组织构成，厚而坚韧，形成一长筒状的硬脊膜囊。上方附于枕骨大孔边缘，与硬脑膜相续，并借终丝附于尾骨。硬脊膜囊内有脑脊液、脊膜和31对脊神经根，每对脊神经根穿硬脊膜囊时被包被形成神经外膜，并与椎间孔周围的结缔组织紧密相连，起固定作用。
在日常生活中，硬膜缺损是脊柱外科与神经外科手术中经常遇到的临床问题，交通事故、工矿意外及战争等都会造成开放性颅骨损伤和脊柱受损，还有一些先天性脑膜缺损、肿瘤转移以及其他原因都会造成硬脑膜缺损，当出现上述缺损，就会进行手术修补。调研发现，目前医疗结构在手术过程中所使用的修补材料一般有以下几类，一种是来自于自体组织的修补材料，此种材料具有生物相容性好，免疫反应低等优点，但是来源有限，价格昂贵，一种是同种异体材料，其同样来源小，且免疫反应高，第三种是异种生物材料，其同样存在较高的免疫排斥反应，还有一种就是人工合成材料，其具有价格相对低廉，来源广泛等优点，但其缺点同样明显，比如与人体粘附性差，生物相容性差，能引起局部积液积累和炎症反应。
对于脊柱外科手术和神经外科手术来讲，积液渗漏始终是一大难题和安全隐患，一旦发生脑脊液渗漏现象，轻者引起神经损伤，伤口延迟愈合，并出现皮下积液、颅内感染等并发症；重者头皮或肌层的渗血可弥散到蛛网膜下隙刺激脑组织，引起发热、 头痛、无菌性炎症或脑膜刺激征；脑组织与头皮直接粘连愈合，增加了癫痫发生机会，甚至威胁患者生命。为了防止脑脊液渗漏，临床应用中会选择将修补材料进行缝合来降低渗漏风险，而上述的修补材料大多都不适合缝合，主要是因为其力学强度不够，缝合过程中易产生材料撕裂，无形中给患者造成痛苦，给家庭增加负担，因此亟待开发一种生物相容性好，来源广泛，成本低的可缝合硬膜修补材料。
胶原蛋白是生物高分子材料，又称胶原，是有三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质，三条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构，胶原这种特殊的三股螺旋结构保证了它良好的机械强度。胶原蛋白是动物结缔组织重要的蛋白质，约占其20%~30%，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白。胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。胶原蛋白因其良好的生物相容性、可降解性及生物活性，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛应用和关注，用胶原蛋白作为原料经相关过程和工艺处理，可得到用于临床手术中组织修复的优良材料，有鉴于此，本发明以胶原蛋白为基础材料结合其他功能性材料，提供了一种可缝合硬膜修补材料的制备方法及其应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种硬脑膜修补材料的制备及应用，具体技术方案如下：
1 选取富含胶原蛋白的组织，去除多余残留物后将其在-20℃的环境下冷冻至少6小时以上；将冻结后的组织进行切片处理；将切割好的组织，放入水中浸泡冲洗5~30min，沥去多余的水；配制磷酸盐缓冲液，完成后称取一定量的酶加入其中，充分混匀；
本发明中所描述的富含胶原蛋白的组织选自牛跟腱，牛蹄，牛皮，鱼皮，猪蹄和猪皮等组织；所述的磷酸盐缓冲液由NaCl、Na2HPO4和NaH2PO4组成或NaCl，Na2HPO4和KH2PO4组成，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L；pH值为5~7；所述的酶为胃蛋白酶，无花果蛋白酶，半胱胺酸蛋白酶及其他酸性蛋白酶的一种或几种；酶的浓度为0.001%~5%，作为一种优选方式的酶的浓度为0.01%~2%，更为优选的酶的浓度为0.05%~1%。
2 将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中，放入摇床内，在10~50℃下保持0.5~24h；其中组织与酶溶液的比例为0.01:100~20:100（按质量分数计），作为一种优选方式组织与酶溶液的比例为0.05:100~20:100，更为优选的组织与酶溶液的比例为0.1:100~10:100。
3酶灭活：从摇床内取出反应物过滤，用水冲洗过滤物几次，沥去多余水分，加入到预先配制好的盐溶液中，开启摇床，在10~50℃下保持0.5~5h；本发明中所述的盐溶液为硝酸钠，硝酸铵，硝酸钾，次氯酸钠，氢氧化钠，氢氧化钾中的一种或几种；浓度为0.01%~20%，优选的盐溶液的浓度为0.05%~10%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100，优选的反应物与盐溶液比例为0.5:100~20:100。
4病毒灭活：从摇床内取出反应物过滤，用水冲洗过滤物几次，沥去多余水分，再将固体加入到配制好的盐溶液中，开启摇床，设定温度15~40℃，培养20~60h；从摇床内取出培养物，调节ph为4~8，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白。所述的盐溶液为亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠，硫酸铵，硫酸钠，氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种，浓度为0.01%~20%，优选的盐浓度为0.05%~10%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100，优选的反应物与盐溶液比例为0.5:100~20:100。
5致密层制备：称取一定数量的上述胶原蛋白，加入到纯化水，搅拌使其均匀分散，用酸溶液调节pH至1.5~5.5，快速搅拌使其完全混匀；放离心机离心，离心参数为转速1000r/min~6000 r/min，时间5min~30min，离心完成后，弃上清液，将固体转移至模具中进行挤压，脱模，保留挤压面模具，即得到致密层。本过程中所述的胶原蛋白与纯化水的比例为0.01:100~50:100，作为一种优选方式胶原蛋白与纯化水的比例为0. 1:100~25:100，更为优选的胶原蛋白与纯化水的比例为0. 5:100~10:100；酸为盐酸、乳酸、醋酸、柠檬酸和硫酸中的一种或几种；制得致密层厚度为1mm~30mm。
6多孔层浆液制备: 称取一定数量的高分子材料，加入到纯化水，搅拌使其均匀分散，用酸溶液调节pH至3.5~6.5，快速搅拌使其完全混匀；将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液。本过程中所述的高分子材料为本发明所制得胶原蛋白，或市售的壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠，羧甲基纤维素钠中的至少一种，高分子材料与纯化水的比例为0.01:100~20:100，作为一种优选方式胶原蛋白与纯化水的比例为0.1:100~10:100，更为优选的胶原蛋白与纯化水的比例为0. 5:100~5:100；所用的酸为盐酸、乳酸、醋酸、柠檬酸和硫酸中的一种或几种；浆液厚度1mm~50mm。
7复合：将步骤（5）中的致密层，置于步骤（6）所制备的浆液中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干。
8 冻干完成后，取出产品，采用物理和/或化学方法交联，裁剪包装，灭菌，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料。本过程中产品物理交联方法为热交联；化学交联方法为甲醛，戊二醛，京尼平和EDC等；所采用的灭菌方式包括环氧乙烷灭菌，射线灭菌及高温灭菌，其中射线灭菌又分钴-60和电子束，灭菌计量为5KGy~40KGy。
由以上步骤所得可缝合硬膜修补材料具有明显的优点：
一、本发明所提供的可缝合硬膜修补材料由双层复合结构组成，一层为致密层（胶原蛋白基层），一层为多孔层（功能性材料层），其具有良好的力学性能，可缝合，能有效防止脑脊液的渗漏，降低并发症的发生；
二、本发明所提供的可缝合硬膜修补材料，具有三维孔径结构，低免疫原性和纯度高等优点；
三、本发明所提供的可缝合硬膜修补材料生物相容性好，可完全降解，可通过调节交联度及含量实现降解可控；
四、本发明所提供的可缝合硬膜修补材料与人体组织粘附性强，促进组织修复，由于多孔结构使得其具有超强的吸液能力，可促进止血，加快伤口愈合；
五、本发明所提供的可缝合硬膜修补材料，原料来源广泛，价格低，制备工艺简单，易产业化，是一种优良的可缝合硬膜组织修补材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，明显地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；
图1实施例1所得可缝合硬膜修补材料的圆二色谱分析图；
图2实施例6所得可缝合硬膜修补材料中样品一的拉伸性能图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1 选富含胶原蛋白的牛跟腱，剔除筋膜，在-20℃的环境下冷冻6小时，然后冻结后的组织进行切片处理；
称取牛跟腱切片200g，放入水中浸泡冲洗30min，沥去多余的水；同时配制0.05mol/L的磷酸盐缓冲液5L，调节ph为7，完成后称取5g胃蛋白酶加入其中，充分混匀；
2 将冲洗完成的牛跟腱切片加入上述酶溶液中，放入摇床内，在30℃下保持10h；其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为4:100；
3 酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到1%硝酸铵和0.4%氢氧化钠溶液中，溶液体积为10L，开启摇床，在50℃下保持0.5h；
4 病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到1.5%硫代硫酸钠溶液和1%氢氧化钾中，溶液体积为6L，开启摇床，在25℃下保持50h；
计时结束后，从摇床内取出培养物，调节ph为6，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；
5 致密层制备：称取60g胶原蛋白，加入到3L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至4.5，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀；
将搅拌完成的溶液放入离心瓶中，开启离心机，设定转速4000转/分钟，离心15分钟，完成后，弃上清液，将瓶中固体转移至不锈钢模具中，盖好不锈钢网板，开始挤压，直至厚度为10mm，除去不锈钢模具，保留不锈钢网板部分；
6 多孔层浆液制备: 称取30g自制胶原蛋白，加入到5L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的醋酸溶液调节pH至5.5，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为5mm；
7复合：将步骤（5）中的致密层，置于步骤（6）所制备的浆液中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干；
8 冻干完成后，取出产品，用甲醛气体进行交联后，裁剪为10cm×10cm大小，用双层包装，送辐照中心进行钴-60灭菌，灭菌剂量为：20KGy，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料；
9 圆二色谱检测
将所得样品进行圆二色谱检测，结果见图1，由圆二色谱谱图可知，在198nm左右有一个负吸收峰，在226nm左右有一个弱的正吸收峰，属于典型的三股螺旋构像特征。说明经电子束灭菌后的产品仍保持其完整的三螺旋结构，具有生物活性。
实施例2
1 选富含胶原蛋白的猪蹄，去除杂物，在-20℃的环境下冷冻12小时，然后冻结后的组织进行切片处理；
称取组织切片300g，放入水中浸泡冲洗20min，沥去多余的水；同时配制0.03mol/L的磷酸盐缓冲液10L，调节ph为6，完成后称取1g无花果蛋白酶加入其中，充分混匀；
2 将冲洗完成组织切片加入上述酶溶液中，放入摇床内，在20℃下保持5h；其中组织切片与酶溶液的比例为3:100；
3 酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到1%硝酸铵和0.4%次氯酸钠溶液中，溶液体积为50L，开启摇床，在20℃下保持5h；
4 病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到3%硫代硫酸钠溶液中，溶液体积为5L，开启摇床，在30℃下保持40h；
计时结束后，从摇床内取出培养物，调节ph为5，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；
5 致密层制备：称取100g胶原蛋白，加入到5L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用0.1%的醋酸溶液调节pH至3.5，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀；
将搅拌完成的溶液放入离心瓶中，开启离心机，设定转速3000转/分钟，离心5分钟，完成后，弃上清液，将瓶中固体转移至不锈钢模具中，盖好不锈钢网板，开始挤压，直至厚度为5mm，除去不锈钢模具，保留不锈钢网板部分；
6 多孔层浆液制备: 称取50g市售羧甲基壳聚糖，加入到5L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用0.1%的柠檬酸溶液调节pH至6.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为7mm；
7复合：将步骤（5）中的致密层，置于步骤（6）所制备的浆液中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干；
8 冻干完成后，取出产品，用戊二醛气体进行交联后，裁剪为5cm×10cm大小，用双层包装，环氧乙烷灭菌，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料。
实施例3
1 选取富含胶原蛋白的鱼皮，除去杂质，在-20℃的环境下冷冻40小时，然后冻结后的组织进行切片处理；
称取组织切片1000g，放入水中浸泡冲洗20min，沥去多余的水；同时配制0.05mol/L的磷酸盐缓冲液50L，调节ph为6，完成后称取25g半胱胺酸蛋白酶加入其中，充分混匀；
2 将冲洗完成的组织切片加入上述酶溶液中，放入摇床内，在35℃下保持8h；其中组织切片与酶溶液的比例为2:100；
3 酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到0.5%硝酸钠和1%氢氧化钾溶液中，溶液体积为50L，开启摇床，在40℃下保持1h；
4 病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到1.0%硫酸钠溶液和0.5%氢氧化钠溶液中，溶液体积为5L，开启摇床，在30℃下保持40h；
计时结束后，从摇床内取出培养物，调节ph为5，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；
5 致密层制备：称取40g胶原蛋白，加入到3L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的硫酸溶液调节pH至2.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀；
将搅拌完成的溶液放入离心瓶中，开启离心机，设定转速5000转/分钟，离心10分钟，完成后，弃上清液，将瓶中固体转移至不锈钢模具中，盖好不锈钢网板，开始挤压，直至厚度为20mm，除去不锈钢模具，保留不锈钢网板部分；
6 多孔层浆液制备: 称取100g市售透明质酸钠，加入到10L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的硫酸溶液调节pH至6.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为7mm；
7复合：将步骤（5）中的致密层，置于步骤（6）所制备的浆液中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干；
8 冻干完成后，取出产品，采用热交联的方式进行交联，裁剪为8cm×10cm大小，用双层包装，送辐照中心进行电子束灭菌，灭菌剂量为：40KGy，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料。
实施例4
1 选取富含胶原蛋白的牛皮，除去杂质，在-20℃的环境下冷冻60小时，然后冻结后的组织进行切片处理；
称取组织切片500g，放入水中浸泡冲洗15min，沥去多余的水；同时配制0.03mol/L的磷酸盐缓冲液5L，调节ph为5.5，完成后称取10g无花果蛋白酶加入其中，充分混匀；
2 将冲洗完成的组织切片加入上述酶溶液中，放入摇床内，在25℃下保持20h；其中组织切片与酶溶液的比例为10:100；
3 酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到0.5%次氯酸钠溶液中，溶液体积为40L，开启摇床，在30℃下保持2h；
4 病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到1.5% 硫酸钠溶液中，溶液体积为6L，开启摇床，在30℃下保持45h；
计时结束后，从摇床内取出培养物，调节ph为5.5，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；
5 致密层制备：称取200g胶原蛋白，加入到6L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的乳酸溶液调节pH至5.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀；
将搅拌完成的溶液放入离心瓶中，开启离心机，设定转速2000转/分钟，离心30分钟，完成后，弃上清液，将瓶中固体转移至不锈钢模具中，盖好不锈钢网板，开始挤压，直至厚度为15mm，除去不锈钢模具，保留不锈钢网板部分；
6 多孔层浆液制备: 称取50g市售羧甲基纤维素钠和50g市售羧甲基壳聚糖，分别加入到12L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的醋酸溶液调节pH至5.9，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为6mm；
7复合：将步骤（5）中的致密层，置于步骤（6）所制备的浆液中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干；
8 冻干完成后，取出产品，采用热交联的方式进行交联，裁剪为5cm×15cm大小，用双层包装，送辐照中心进行电子束灭菌，灭菌剂量为：30KGy，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料。
实施例5
1 选取富含胶原蛋白的牛蹄，除去杂质，在-20℃的环境下冷冻60小时，然后冻结后的组织进行切片处理；
称取组织切片500g，放入水中浸泡冲洗15min，沥去多余的水；同时配制0.03mol/L的磷酸盐缓冲液5L，调节ph为5.5，完成后称取10g无花果蛋白酶加入其中，充分混匀；
2 将冲洗完成的组织切片加入上述酶溶液中，放入摇床内，在25℃下保持15h；其中组织切片与酶溶液的比例为10:100；
3 酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到0.5%次氯酸钠溶液中，溶液体积为40L，开启摇床，在30℃下保持2h；
4 病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到1.5% 硫酸钠溶液中，溶液体积为6L，开启摇床，在30℃下保持45h；
计时结束后，从摇床内取出培养物，调节ph为5.5，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；
5 致密层制备：称取200g胶原蛋白，加入到6L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的乳酸溶液调节pH至5.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀；
将搅拌完成的溶液放入离心瓶中，开启离心机，设定转速2000转/分钟，离心30分钟，完成后，弃上清液，将瓶中固体转移至不锈钢模具中，盖好不锈钢网板，开始挤压，直至厚度为15mm，除去不锈钢模具，保留不锈钢网板部分；
6 多孔层浆液制备: 称取100g市售羧甲基纤维素钠，加入到12L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用1mol/L的醋酸溶液调节pH至5.9，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为6mm；
7复合：将步骤（5）中的致密层，置于步骤（6）所制备的浆液中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干；
8 冻干完成后，取出产品，采用热交联的方式进行交联，裁剪为5cm×15cm大小，用双层包装，送辐照中心进行电子束灭菌，灭菌剂量为：10KGy，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料。
实施例6
1 选取富含胶原蛋白的牛跟腱，除去杂质，在-20℃的环境下冷冻24小时，将冻结后的组织进行切片处理；
称取组织切片2000g，放入水中浸泡冲洗30min，沥去多余的水；同时配制0.02mol/L的磷酸盐缓冲液40L，调节ph为6.0，完成后称取15g半胱胺酸蛋白酶加入其中，充分混匀；
2 将冲洗完成的组织切片加入上述酶溶液中，放入摇床内，在28℃下保持20h；其中组织切片与酶溶液的比例为5:100；
3 酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到0.5%硝酸钾溶液和0.05%氢氧化钾溶液中，溶液体积为50L，开启摇床，在10℃下保持5h；
4 病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到0.5% 硫酸钠溶液和1氢氧化钠中，溶液体积为40L，开启摇床，在20℃下保持60h；
计时结束后，从摇床内取出培养物，调节ph为7，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；
5 致密层制备：称取1000g胶原蛋白，加入到50L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用0.1%的冰醋酸溶液调节pH至4.5，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀；
将搅拌完成的溶液放入离心瓶中，开启离心机，设定转速3500转/分钟，离心20分钟，完成后，弃上清液，将瓶中固体转移至不锈钢模具中，盖好不锈钢网板，开始挤压，直至厚度为5mm，除去不锈钢模具，保留不锈钢网板部分；
6 多孔层浆液制备:
浆液一
称取150g市售羧甲基纤维素钠，加入到10L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用0.5mol/L的醋酸溶液调节pH至5.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为3mm；
浆液二
称取100g步骤5中提取胶原蛋白，加入到5L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用0.1mol/L的硫酸溶液调节pH至6.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为4mm；
浆液三
称取50g市售海藻酸钠，加入到5L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用0.2mol/L的盐酸溶液调节pH至6.0，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为8mm；
浆液四
称取200g市售羟丁基壳聚糖，加入到8L纯化水中，搅拌使其均匀分散，用0.1%的乳酸溶液调节pH至6.5，升高搅拌速度快速搅拌使其完全混匀，将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液，浆液厚度为2mm；
7复合：将步骤（5）中的致密层均分为四组，分别置于步骤（6）所制备的浆液一、浆液二、浆液三和浆液四中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干；
8 冻干完成后，取出产品，浆液一样品采用热交联的方式进行交联，浆液二样品采用京尼平进行交联，浆液三样品采用戊二醛交联，浆液四样品采用EDC交联。完成后裁剪为8cm×8cm大小，用双层包装，样品一高温灭菌；样品二送辐照中心进行电子束灭菌，灭菌剂量为：5KGy；样品三环氧乙烷灭菌，样品四钴-60灭菌，灭菌剂量：40KGy，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料；
9 拉伸性能检测
将所得样品一，进行拉伸性能检测，结果见图2，结果显示其拉伸应力达到0.14MPa，完全能满足缝合要求。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可缝合硬膜修补材料的制备及应用，其特征在于制备过程包括一下步骤：
（1）选取富含胶原蛋白的组织，去除多余残留物后将其在-20℃的环境下冷冻至少6小时以上；将冻结后的组织进行切片处理；将切割好的组织，放入水中浸泡冲洗5~30min，沥去多余的水；配制磷酸盐缓冲液，完成后称取一定量的酶加入其中，酶的浓度为0.001%~5%，充分混匀；
（2）将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中，放入摇床内，在10~50℃下保持0.5~24h；其中组织与酶溶液的比例为0.01:100~50:100（按质量分数计）；
（3）酶灭活：从摇床内取出反应物过滤，用水冲洗过滤物几次，沥去多余水分，加入到预先配制好的盐溶液中，开启摇床，在10~50℃下保持0.5~5h；
（4）病毒灭活：从摇床内取出反应物过滤，用水冲洗过滤物几次，沥去多余水分，再将固体加入到配制好的盐溶液中，开启摇床，设定温度15~40℃，培养20~60h；从摇床内取出培养物，调节ph为4~8，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；
（5）致密层制备：称取一定数量的上述胶原蛋白，加入到纯化水，搅拌使其均匀分散，用酸溶液调节pH至1.5~5.5，快速搅拌使其完全混匀；放离心机离心，离心参数为转速1000r/min~6000 r/min，时间5min~30min，离心完成后，弃上清液，将固体转移至模具中进行挤压，脱模，保留挤压面模具，即得到致密层；
（6）多孔层浆液制备: 称取一定数量的高分子材料，加入到纯化水，搅拌使其均匀分散，用酸溶液调节pH至3.5~6.5，快速搅拌使其完全混匀；将浆液进行真空脱泡，后缓慢倒入不锈钢冻干模具中，得到多孔层浆液；
（7）复合：将步骤（5）中的致密层，置于步骤（6）所制备的浆液中，开启冻干机，设置冻干参数后开始冻干；
（8）冻干完成后，取出产品，采用物理和/或化学方法交联，裁剪包装，灭菌，即获得本发明所述的可缝合硬膜修补材料。
2.根据权利要1所述的制备过程步骤（1）中，其特征在于，所述的富含胶原蛋白的组织为牛跟腱，牛蹄，牛皮，鱼皮，猪蹄和猪皮等；所述的磷酸盐缓冲液由NaCl、Na2HPO4和NaH2PO4组成或NaCl，Na2HPO4和KH2PO4组成，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L；pH值为5~7。
3.根据权利要1所述的制备过程步骤（1）和（2）中，其特征在于，所述的酶为胃蛋白酶，无花果蛋白酶，半胱胺酸蛋白酶及其他酸性蛋白酶的一种或几种。
4.根据权利要1所述的制备过程步骤（3）中，其特征在于，所述的盐溶液为硝酸钠，硝酸铵，硝酸钾，次氯酸钠，氢氧化钠，氢氧化钾中的一种或几种；浓度为0.01%~20%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。
5.根据权利要1所述的制备过程步骤（4）中，其特征在于，所述的盐溶液为亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠，硫酸铵，硫酸钠，氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种，浓度为0.01%~20%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。
6.根据权利要1所述的制备过程步骤（5）中，其特征在于，所述的胶原蛋白与纯化水的比例为0.01:100~50:100；酸为盐酸、乳酸、醋酸、柠檬酸和硫酸中的一种或几种；制得致密层厚度为1mm~30mm。
7.根据权利要1所述的制备过程步骤（6）中，其特征在于，所述的高分子材料为本发明所制得胶原蛋白，或市售的壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠，羧甲基纤维素钠中的至少一种，高分子材料与纯化水的比例为0.01:100~20:100；所用的酸为盐酸、乳酸、醋酸、柠檬酸和硫酸中的一种或几种；浆液厚度1mm~50mm。
8.根据权利要1所述的制备过程步骤（8）中，其特征在于，本发明中产品物理交联方法为热交联；化学交联方法为甲醛，戊二醛，京尼平和EDC等；所采用的灭菌方式包括环氧乙烷灭菌，射线灭菌及高温灭菌，其中射线灭菌又分钴-60和电子束，灭菌计量为5KGy~40KGy。
9.根据权利要1所述的可缝合硬膜修补材料，其特征在于，所述的硬膜修补材料完整的保留了所用材料的结构，具有生物活性；具有三维孔径结构，机械强度高，可缝合，能有效减少积液渗漏，降低并发症，且降解可控，生物相容性好。
10.根据权利要1所述的可缝合硬膜修补材料，其特征在于，所述的可缝合硬膜修补材料，其可作为硬脑膜和脊柱膜等的替代品。
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