CN107541462B - 一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及应用方法，属于生物分离分析纯化仪器与基因检测技术领域。所述系统包括基底、微流控芯片、微型磁体、磁体阵列控制机构、加热部件、激发光产生部件、光学传感器、驱动器、可控稳压器、系统直流电源和单片；所述应用是采用所述系统进行核酸纯化，扩增及基因检测。所述系统及应用方法减小了核酸纯化‑‑‑扩增‑‑‑检测装置的体积，缩短了核酸检测周期，增大检测通量，减少用户操作复杂程度，且能够实现纯化，扩增及基因检测多种功能，可克服传统核酸检测设备体积巨大，检测耗时长以及操作复杂等问题。

Description

一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及应用方法

技术领域

本发明涉及一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及应用方法，属于生物分离分析纯化仪器与基因检测技术领域。

背景技术

目前，针对核酸的一体化检测及分析过程可广泛用于临床，防疫，以及公安刑侦等方面。传统的核酸纯化方式多采用离心法，吸附柱法固相提取等方案。离心法需要较大型离心设备，且操作时间较长，复杂度较高。吸附柱固相提取法需要较多阀及泵结构参与；且该方法均采用液体流通洗涤的方式实现纯化，造成试剂利用率不高等问题。

传统的核酸纯化及扩增检测方式多以实验室为基础，采用分离的核酸纯化及扩增模块完成，且不具有完善的自动化控制系统。故造成相关装置外设庞大，纯化--扩增自动化耗时长等问题。此类问题使得核酸分析无法达到检测的现场化，快速化，实时化等要求。

发明内容

为了克服传统核酸检测设备体积巨大，检测耗时长以及操作复杂等问题，本发明的目的在于提供一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及应用方法，所述系统及应用方法是一种基于微型磁体以及磁控自动化系统的核酸纯化--扩增--检测一体化系统及应用方法。

为实现本发明的目的，提供以下技术方案。

一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，所述系统包括基底、微流控芯片、微型磁体、磁体阵列控制机构、加热部件、激发光产生部件、光学传感器、驱动器、可控稳压器、系统直流电源和单片机。

其中，基底优选为弱磁性材料，弱磁性材料为柔性磁铁或吸附面大于等于 4cm×6cm，吸力小于等于2.5Kg的电磁铁。

微流控芯片设有多个通道用于核酸纯化，扩增及基因检测，每个通道中均由前向后依次设有如下功能区：微型磁体存放区、待检测样品区、洗涤区以及核酸释放扩增检测区，在所有功能区表层设有一层隔离层。本发明以微流控芯片通道前后方向为X轴方向，通道左右方向为Y轴方向，通道上下方向为Z轴方向。

微型磁体存放区中放置有微型磁体溶液。微型磁体是指尺寸为纳米至微米级别，以分子修饰可特异性吸附核酸分子的磁性物质，如特殊蛋白包被的磁粉、磁流体或Fe₃O₄/SiO₂复合纳米磁珠等，可采用现有技术中的通用方法制备；所述分子修饰为现有技术，根据不同核酸长度可选用不同的分子对微型磁体进行修饰，例如对于基因组核酸纯化，微型磁体溶液可采用文献《Fe₃O₄/SiO₂复合纳米磁珠制备技术的优化及用于DNA分离纯化的研究》，《北京化工大学》，2014中的制备方法制备的Fe₃O₄/SiO₂复合纳米磁珠溶液。

待检测样品区中放置有裂解酶和缓冲液。裂解酶用于裂解待检测样品中细胞，如Proteinase K；缓冲液用于为样品中细胞的裂解及核酸结合提供适合的盐浓度以及PH环境，具体参数由待检测样品的性质决定。待检测样品区还设有加样口用于加入待检测样品。

洗涤区数量为一个以上，每个洗涤区中放置有母液和杂质溶解剂。母液的酒精体积浓度在75％以上，用于防止核酸从微型磁体上脱落；杂质溶解剂为可溶解待测样品区裂解细胞中蛋白质的溶剂，可根据核酸和待检测样品中裂解酶和缓冲液的种类选取现有技术试剂盒中的杂质溶解剂，或采用核酸纯化标准试剂盒中的标准洗涤试剂。

核酸释放扩增检测区中放置有靶标基因荧光扩增试剂，用于将微型磁体上结合的核酸释放出来，进行扩增及与荧光试剂结合以实现检测。所述扩增试剂包括但不限于荧光环介导等温扩增技术(Lamp)扩增试剂或荧光聚合酶链式扩增(PCR)扩增试剂。荧光Lamp扩增试剂包括Lamp所需的4条～6条引物模板、酶、缓冲液和荧光试剂，具体根据待检测样品的性质在本领域常规技术中选择适用的试剂；荧光PCR扩增试剂包括PCR所需的2条引物模板、酶、缓冲液和荧光试剂，具体根据待检测取样品的性质在本领域常规技术中选择。

隔离层为与水不互溶，且不会对核酸及微型磁体有损伤的流体物质，优选为矿物油。

磁体阵列控制机构包括X轴方向移动机构，Z轴方向移动机构以及Y轴方向上放置的磁体阵列，是控制磁体阵列在微流控芯片上方沿通道X轴方向移动和Z轴方向移动的机构。磁体阵列由多个强磁体排列组成，每个强磁体对应一个微流控芯片的通道；强磁体为吸力不小于本发明所述弱磁性材料吸力3倍的电磁铁或永磁体。优选所述移动机构为丝杆或滑杆。

加热部件用于加热待检测样品区和核酸释放扩增检测区，以实现微型磁体与核酸的结合，核酸的扩增及与荧光试剂结合发光；优选为涡流线圈。

激发光产生部件用于激发核酸释放扩增检测区扩增后与荧光试剂结合的核酸产生荧光，激发光产生部件可采用如LED、加滤光片的LED、光栅或激光管等实现；本领域技术人员可根据核酸释放扩增检测区中荧光试剂的具体厂家型号选择激发光波长，例如，当荧光试剂为标准绿色荧光试剂时，激发光的波长为482nm。

光学传感器可采用光电倍增管、电荷耦合元件(CCD)或颜色传感器等，在光学传感器前端设有滤光片，用于读取荧光试剂的荧光量。本领域技术人员可根据荧光试剂决定滤光片通过的波长，例如，在标准绿色PCR荧光试剂的条件下，滤光片可选用516nm，带宽为10nm～20nm的滤光片。优选光学传感器为颜色传感器，读取荧光中颜色通道的数值，并实时计算输出相关荧光量，采用中国专利申请CN 103940793 A中所述颜色传感器及计算方法；所述计算方法适用于任意发射波长不小于500nm，不大于560nm的荧光试剂，但荧光试剂的吸收波长及发射波长必须为已知量。

驱动器具有驱动器信号输入端口、驱动器电源端口和驱动器信号输出端口。其中，驱动器信号输入端口通过导线连接单片机，驱动器信号输出端口通过导线连接磁体阵列控制机构，驱动器电源端口通过导线连接系统直流电源。驱动器的作用为放大单片机的输出功率，用以驱动磁体阵列控制机构。

可控稳压器具有可控稳压器信号输入端口，可控稳压器电源端口和可控稳压器信号输出端口。其中，可控稳压器信号输入端口通过导线连接单片机，可控稳压器信号输出端口通过导线连接激发光产生部件，可控稳压器电源端口通过导线连接系统直流电源。可控稳压器的作用为供给激发光产生部件的电源。

系统直流电源为本发明所述系统提供24V及3.3V两路直流电压。其中，24V 直流电通过导线分别连接磁体阵列控制机构、加热部件、激发光产生部件、光学传感器和驱动器，并为所述部分供给电能；3.3V直流电压通过导线连接单片机，为单片机运行供给电能。

单片机用于控制磁体阵列控制机构的移动、加热部件温度变化以及荧光量的采集，将采集到荧光量-时间对应关系与其内置的荧光-时间标准曲线进行比对，计算还原样品溶液中具体的靶标基因含量信息，具体可采用单片机结合相关预先置于存储ROM中的相关曲线比对，并进行结果输出。

本发明所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统各组成之间的连接关系如下：

微流控芯片固定放置于基底中央；在基底两侧X轴方向上分别设有X轴方向移动机构，每个X轴方向移动机构两端固定在基底上，两端之间的部分与一个Z轴方向移动机构底部进行滑动连，磁体阵列一端与一个Z轴方向移动机构底部上方连接，磁体阵列另一端与另一个Z轴方向移动机构底部上方连接，磁体阵列上固定排列有强磁体，强磁体与通道的位置和数量相对应，每个强磁体都位于其对应的通道正上方，磁体阵列控制机构经由驱动器与单片机相连，由单片机控制；加热部件位于待检测样品和核酸释放扩增检测区所在底部基底与微流控芯片之间，与单片机连接，单片机控制加热部件维持指定温度，单片机控制加热部件维持指定温度的方法为：比例-积分-微分控制算法(PID)；激发光产生部件经由可控稳压器与系统直流电源相连接，并由可控稳压器控制其激发光强度；可控稳压器与单片机IO引脚相连，受到单片机IO引脚的控制；光学传感器与单片机的通信协议端口(如IIC，SPI，USART)相连，将其获取的光学信号通过上述通讯协议中的一种传入单片机。激发光产生部件和光学传感器均与单片机进行通信，由单片机控制其执行动作，并向单片机传输其获得的信息。

一种本发明所述用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统的应用方法，所述方法步骤如下：

(1)将磁体阵列控制机构的X轴方向移动机构和Z轴方向移动机构与基底连接，将微流控芯片中各通道中的功能区添加好微型磁体和溶液试剂，然后将加注隔离层，固定放置于基底上；

(2)将磁体阵列与Z轴方向移动机构连接；

(3)将待检测样品由加样口注入待检测样品区，样品中的核酸被释放至待检测样品区的溶液试剂中，由于隔离层的阻断作用及隔离层与水性物质的不互溶性，待检测样品区的核酸分子不会进入其他功能区；

(4)单片机向磁体阵列控制机构发出控制指令，磁体阵列移动至微型磁体存放区顶端，且下降使强磁体和微型磁体之间的距离小于上升阈值；此时微型磁体受力如公式1所示：

F_U＞mg+F_D 公式1

其中，F_U表示微型磁体受强磁体的拉力，mg表示微型磁体所受重力，F_D表示微型磁体受基底为弱磁性材料时，弱磁性材料的吸力，当基底材料无弱磁性时，F_D取值为零；在公式1条件下微型磁体将被拉起，并向上移动；

由于液体之间表面张力的作用，微型磁体将停留于微型磁体存放区顶端，且不会进入贯通各通道及其他功能区的隔离层，此时下降磁体阵列，使强磁体与微型磁体之间的距离小于微型磁体拉起阈值，此时微型磁体受力如公式2所示：

F_U＞mg+F_D+F_z 公式2

其中，F_U表示微型磁体受强磁体的拉力，mg表示微型磁体所受重力，F_D表示微型磁体受基底为弱磁性材料时，弱磁性材料的吸力，当基底材料无弱磁性时，F_D取值为零，F_Z表示水和隔离层之间的表面张力。在公式2条件下微型磁体将被拉起，且进入隔离层；

微型磁体进入隔离层后，由于其自身亲水作用将聚成球状。此时移动磁体阵列，使其位于待检测样品区顶端，控制强磁体与微型磁体之间的距离在上升阈值与无限远之间往复运动，此时微型磁体被释放至待检测样品区的溶液试剂中，且受到变力作用，会在待检测样品区的溶液试剂内上下浮动，控制加热部件维持待检测样品区温度为所需温度，此时微型磁体可充分与待检测样品区中的核酸进行结合；优选控制加热部件维持待检测样品区温度为57±2℃，维持时间为10min；

(5)关闭加热部件，采用步骤(4)的方法将结合有核酸和蛋白质等杂质的微型磁体从待检测样品区中拉起，并释放至洗涤区使之上下浮动；微型磁体上结合的蛋白质等杂质在洗涤区中被清除，而核酸依然与微型磁体结合；当洗涤区大于一个时，采用步骤(4)的方法将结合有核酸和蛋白质等杂质的微型磁体从一个洗涤区中拉起，释放进入另一个洗涤区洗涤；

(6)采用步骤(4)的方法将洗涤除杂后，结合有核酸的微型磁体从洗涤区中拉起，并释放至核酸释放扩增检测区使之上下浮动，核酸将在此处从微型磁体中被释放到核酸释放扩增检测区中；

(7)移动磁体阵列控制机构，将核酸释放扩增检测区上方的强磁体移走，微型磁体由于其自身重力的作用，当基底为弱磁性材料时还有吸力的作用，位于核酸释放扩增检测区底部；此时单片机控制加热部件温度对核酸释放扩增检测区的温度进行控制，本领域技术人员可根据所采用的荧光Lamp扩增或荧光 PCR扩增选用合适的温度及循环次数；如采用荧光Lamp扩增，可将核酸释放扩增检测区加热至60℃～65℃；如采用变温荧光PCR扩增的方式，可控制温度在94℃～60℃～72℃三段内循环；核酸被扩增的同时产生荧光，相同时间内扩增产生荧光的强度与靶标核酸浓度成正比，此时光学传感器读取其中颜色通道的数值，并实时计算输出相关荧光量；

单片机具有简单数据处理能力，采用内置的荧光-时间标准曲线采集的荧光量-时间对应关系进行比对，即可计算还原样品溶液中具体的核酸量信息。

有益效果

1.本发明提供了一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及其应用方法，所述系统减小了核酸纯化---扩增---检测装置的体积，缩短了核酸检测周期，增大检测通量，减少用户操作复杂程度，且能够实现纯化，扩增及基因检测多种功能，可克服传统核酸检测设备体积巨大，检测耗时长以及操作复杂等问题。

2.本发明提供了一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及其应用方法，使用单片机对核酸纯化进行自动化操作，不需要手工干预；

3.本发明提供了一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及其应用方法，使用水油介质不互溶的特点作为纯化方案，使得仪器装置避免了大量的阀以及泵结构，简化了设备的结构及复杂性，降低生产及维护成本；

4.本发明提供了一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及其应用方法，采用磁体距离改变磁场变化，磁场变化控制微型磁体在流体中运动的方式，可在不摇晃，不震动的前提下使得微型磁体与流体充分混合，提高纯化效率。

附图说明

图1为实施例1中一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统的结构示意图。

图2为实施例1中微流控芯片中单个通道内核酸纯化--扩增--检测流程的示意图。

图3为实施例1中一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统的左视图。

其中，1—基底，2—通道，3—微型磁体存放区，4—待检测样品区，5—洗涤区，6—核酸释放扩增检测区，7—加样口，8—隔离层，9—微型磁体，10—X 轴方向移动机构，11—Z轴方向移动机构，12—磁体阵列，13—强磁体，14—加热部件，15—激发光产生部件，16—光学传感器，17—驱动器，18—可控稳压器，19—系统直流电源，20—单片机

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1

人体的溶血相关基因分别为E2，E23或E4型，不同类型基因型个体之间输血极有可能导致溶血等症状。本实施例即通过本发明所述一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统及其应用方法对人体溶血相关基因型进行判断。

一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，如图1～3所示所述系统包括基底1、微流控芯片、微型磁体9、磁体阵列控制机构、加热部件14、激发光产生部件15、光学传感器16、驱动器17、可控稳压器18、系统直流电源19和单片机20。

其中，基底1为贴有柔性磁铁的铝合金基底。

本实施例中所采用的微流控芯片结构如图1所示，其芯片体由四层亚克力 (PMMA)结构热键合而成；具有平行排列的五个通道2；每个通道2中均由前向后依次设有如下功能区：微型磁体存放区3、待检测样品区4、洗涤区5以及核酸释放扩增检测区6，如图2所示。核酸纯化，扩增及基因检测均在微流控芯片的各个通道2中完成。在所有功能区表层设有一层矿物油隔离层8。以微流控芯片通道2前后方向为X轴方向，通道2左右方向为Y轴方向，通道2上下方向为Z轴方向。每个通道2中的各功能区置有天根生化科技(北京)有限公司的基因组核酸提取试剂盒DP329中的相关试剂。

微型磁体9存放区3中放置有微型磁体9溶液为所述试剂盒DP329中的磁珠悬浮液G。

待检测样品区4中放置的裂解酶为Proteinase K，用于裂解待检测样品中细胞；缓冲液为裂解缓冲液GHL，为样品中细胞的裂解及核酸结合提供适合的盐浓度以及PH环境。待检测样品区4还设有加样口7用于加入待检测样品

洗涤区5数量为四个，洗涤区5中放置有天根生化科技(北京)有限公司的基因组核酸提取试剂盒DP329中的GDA及PWD试剂，所述GDA及PWD试剂属性为溶解剂。在前两个洗涤区5置有DP329试剂盒中的GDA试剂及母液，试剂与母液的体积比为1:4，后两个洗涤区5中置有DP329试剂盒中的PWD 试剂及母液，试剂与母液体积比为1:4；所述母液为体积浓度在96％以上的乙醇。

核酸释放扩增检测区6中放置有靶标基因荧光扩增试剂，用于将微型磁体9 上结合的核酸释放出来，进行扩增及与荧光试剂结合以实现检测。所述扩增试剂为荧光环介导等温扩增技术(Lamp)扩增试剂。荧光Lamp扩增试剂包括Lamp 所需的FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物、链置换型DNA聚合酶、所述试剂盒DP329中的TB缓冲液和荣研(中国)生产的LAMP法荧光检测试剂盒中的荧光试剂。

磁体阵列控制机构包括X轴方向移动机构10，Z轴方向移动机构11以及Y 轴方向上放置的磁体阵列12，是控制磁体阵列12在微流控芯片上方沿通道2的 X轴方向移动和Z轴方向移动机构11。磁体阵列12由五个强磁体13排列组成，每个强磁体13对应一个微流控芯片的通道2；强磁体13为吸力为0.5Kg，磁能积35MGOe的铷硼柱形磁体。所述移动机构为丝杆。

加热部件14为广州偲瑞电子科技有限公司销售的TEC-06303型加热制冷片，用于加热待检测样品和核酸释放扩增检测区6，以实现微型磁体9与核酸的结合，核酸的扩增及与荧光试剂结合发光。

激发光产生部件15为蓝色LED，激发光的波长为482nm，用于激发核酸释放扩增检测区6扩增后与荧光试剂结合的核酸产生荧光。

光学传感器16为TAOS公司生产的TCS3200D传感器，通过所述传感器，读取RGB三通道2的光学数值，并实时计算输出相关荧光量，采用中国专利申请CN 103940793 A中所述颜色传感器及计算方法计算得到荧光值。

驱动器17采用ULN2008驱动器，该驱动器17具有个3端口，分别为驱动器信号输入端口，驱动器电源端口和驱动器信号输出端口。驱动器信号输入端口通过导线连接单片机20，驱动器信号输出端口通过导线连接磁体阵列控制机构，驱动器电源端口通过导线连接系统直流电源19。

可控稳压器18为其输入电压24V，输出电压为0V～5V可控；可控稳压器 18具有个3端口，分别为可控稳压器信号输入端口、可控稳压器电源端口和可控稳压器信号输出端口。可控稳压器信号输入端口通过导线连接单片机20，可控稳压器输出端口通过导线连接激发光产生部件15，可控稳压器电源端口通过导线连接系统直流电源19。

系统直流电源19为国睿安泰信APS3005D双路直流稳压电源，所述直流电源在使用中的输出被调整至1路：24V；2路：3.3V。其中，24V直流电通过导线分别连接磁体阵列控制机构、加热部件14、激发光产生部件15、光学传感器 16和驱动器17，并为所述部分供给电能；3.3V直流电压通过导线连接单片机 20，为单片机20运行供给电能。

STM32F103VET6单片机20用于控制磁体阵列控制机构的移动、加热部件 14温度变化以及荧光量的采集，将采集到荧光量-时间对应关系与其内置的荧光 -时间标准曲线进行比对，计算还原样品溶液中具体的靶标基因含量信息，具体可采用单片机20结合相关预先置于存储ROM中的相关曲线比对，并进行结果输出。

本实施例所述系统各组成之间的连接关系如下：

微流控芯片固定放置于基底1中央；在基底1两侧X轴方向上分别设有X 轴方向移动机构10，每个X轴方向移动机构10两端固定在基底1上，两端之间的部分与一个Z轴方向移动机构11底部进行滑动连，磁体阵列12一端与一个Z轴方向移动机构11底部上方连接，磁体阵列12另一端与另一个Z轴方向移动机构11底部上方连接，磁体阵列12上固定排列有强磁体13，强磁体13与通道2的位置和数量相对应，每个强磁体13都位于其对应的通道2正上方，磁体阵列控制机构通过驱动器17与单片机20连接，由单片机20控制；加热部件 14位于待检测样品和核酸释放扩增检测区6所在底部基底1与微流控芯片之间，与单片机20连接；激发光产生部件15经由可控稳压器18与系统直流电源19 相连接，并由可控稳压器18控制其激发光强度；可控稳压器18与单片机20的IO引脚相连，受到单片机20的IO引脚的控制；光学传感器16与单片机20的通信协议端口(如IIC，SPI，USART)相连，将其获取的光学信号通过上述通讯协议中的一种传入单片机20。激发光产生部件15和光学传感器16均与单片机20进行通信，由单片机20控制其执行动作，并向单片机20传输其获得的信息。

一种本实施例所述用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统的应用方法，所述方法步骤如下：

(1)将磁体阵列控制机构的X轴方向移动机构10和Z轴方向移动机构11 与基底1连接，将微流控芯片中各通道2中的功能区添加好微型磁体9和溶液试剂，然后将加注隔离层8，固定放置于基底1上；

(2)将磁体阵列12与Z轴方向移动机构11连接；

(3)将待检测样品人体血液样本由加样口7注入待检测样品区4，样品中的核酸被释放至待检测样品区4的溶液试剂中，由于隔离层8的阻断作用及隔离层8与水性物质的不互溶性，待检测样品区4的核酸分子不会进入其他功能区；

(4)单片机20向磁体阵列控制机构发出控制指令，磁体阵列12移动至微型磁体9存放区3顶端，且下降使强磁体13和微型磁体9之间的距离小于上升阈值；此时微型磁体9受力如公式1所示：

F_U＞mg+F_D 公式1

其中，F_U表示微型磁体9受强磁体13的拉力，mg表示微型磁体9所受重力，F_D表示微型磁体9受基底1为弱磁性材料时，弱磁性材料的吸力，当基底 1材料无弱磁性时，F_D取值为零；在公式1条件下微型磁体9将被拉起，并向上移动；

由于液体之间表面张力的作用，微型磁体9将停留于微型磁体存放区3顶端，且不会进入贯通各通道2及其他功能区的隔离层8，此时下降磁体阵列12，使强磁体13与微型磁体9之间的距离小于微型磁体9拉起阈值，此时微型磁体 9受力如公式2所示：

F_U＞mg+F_D+F_z 公式2

其中，F_U表示微型磁体9受强磁体13的拉力，mg表示微型磁体9所受重力，F_D表示微型磁体9受基底1为弱磁性材料时，弱磁性材料的吸力，当基底 1材料无弱磁性时，F_D取值为零，F_Z表示水和隔离层8之间的表面张力。在公式2条件下微型磁体9将被拉起，且进入隔离层8；

微型磁体9进入隔离层8后，由于其自身亲水作用将聚成球状。此时移动磁体阵列12，使其位于待检测样品区4顶端，控制强磁体13与微型磁体9之间的距离在上升阈值与无限远之间往复运动，此时微型磁体9被释放至待检测样品区4的溶液试剂中，且受到变力作用，会在待检测样品区4的溶液试剂内上下浮动，控制加热部件14维持待检测样品区4温度为57±1℃，维持时间10min，此时微型磁体9可充分与待检测样品区4中的核酸进行结合；

如图3所示，图中A为核酸穿越隔离层8的临界区位置，B为核酸被拉起的临界区位置；

(5)关闭加热部件14，采用步骤(4)的方法将结合有核酸和蛋白质等杂质的微型磁体9从待检测样品区4中拉起，并释放至洗涤区5使之上下浮动；微型磁体9上结合的蛋白质等杂质在洗涤区5中被清除，而核酸依然与微型磁体9结合；洗涤区5有四个，采用步骤(4)的方法将结合有核酸和蛋白质等杂质的微型磁体9从一个洗涤区5中拉起，释放进入另一个洗涤区5洗涤；在每个洗涤区5控制微型磁体9上下浮动100次；

(6)采用步骤(4)的方法将洗涤除杂后，结合有核酸的微型磁体9从洗涤区5中拉起，并释放至核酸释放扩增检测区6使之上下浮动，核酸将在此处从微型磁体9中被释放到核酸释放扩增检测区6中，并采用荧光环介导等温扩增技术(Lamp)进行扩增。

微流控芯片的五个通道2，其中第一通道置有E4型基因扩增引物，第二通道置有E23型基因扩增引物，第三通道置有E2型基因扩增引物，第四通道置有 E4型基因及E4型基因引物作为阳性对照，第五通道置有蒸馏水，无引物，作为阴性对照；

(7)移动磁体阵列控制机构，将核酸释放扩增检测区6上方的强磁体13 移走，微型磁体9由于其自身重力的作用，当基底1为弱磁性材料时还有吸力的作用，位于核酸释放扩增检测区6底部；此时控制加热部件14温度对核酸释放扩增检测区6的温度进行控制，采用荧光Lamp扩增，将核酸释放扩增检测区 6加热至62℃，核酸被扩增的同时产生荧光，相同时间内扩增产生荧光的强度与靶标核酸浓度成正比，开启蓝色LED，光学传感器16实时读取其中颜色通道的数值，并实时计算输出相关荧光量；

扩增20min后，第一通道和第四通道现出大于基底1三倍强度的荧光。第二通道、第三通道和第五通道无荧光。说明样品中的E4型基因被扩增，故人体血液样本的溶血相关基因型为E4型。

以上所述，仅是本发明较佳的实施方式，并非对本发明的技术方案做任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例做任何简单修改，形式变化和修饰，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，其特征在于：所述系统包括基底(1)、微流控芯片、微型磁体(9)、磁体阵列控制机构、加热部件(14)、激发光产生部件(15)、光学传感器(16)、驱动器(17)、可控稳压器(18)、系统直流电源(19)和单片机(20)；

微流控芯片设有多个通道(2)，每个通道(2)中均由前向后依次设有如下功能区：微型磁体存放区(3)、待检测样品区(4)、洗涤区(5)以及核酸释放扩增检测区(6)，在所有功能区表层设有一层隔离层(8)；以微流控芯片通道(2)前后方向为X轴方向，通道(2)左右方向为Y轴方向，通道(2)上下方向为Z轴方向；

微型磁体存放区(3)中放置有微型磁体(9)溶液，微型磁体(9)是指尺寸为纳米至微米级别，以分子修饰可特异性吸附核酸分子的磁性物质；

待检测样品区(4)中放置有裂解酶和缓冲液，设有加样口(7)用于加入待检测样品；

洗涤区(5)数量为一个以上，每个洗涤区(5)中放置有母液和杂质溶解剂，母液的酒精体积浓度在75％以上，杂质溶解剂为溶解待测样品区裂解细胞中蛋白质的溶剂；

核酸释放扩增检测区(6)中放置有靶标基因荧光扩增试剂，所述扩增试剂包括但不限于荧光Lamp扩增试剂或荧光PCR扩增试剂；

隔离层(8)为与水不互溶，且不会对核酸及微型磁体(9)有损伤的流体物质；

磁体阵列控制机构包括X轴方向移动机构(10)，Z轴方向移动机构(11)以及Y轴方向上放置的磁体阵列(12)；磁体阵列(12)由多个强磁体(13)排列组成，每个强磁体(13)对应一个微流控芯片的通道(2)；强磁体(13)为吸力不小于弱磁性材料吸力3倍的电磁铁或永磁体；

在光学传感器(16)前端设有滤光片；

驱动器(17)具有驱动器信号输入端口、驱动器电源端口和驱动器信号输出端口；驱动器信号输入端口通过导线连接单片机(20)，驱动器信号输出端口通过导线连接磁体阵列控制机构，驱动器电源端口通过导线连接系统直流电源(19)；

可控稳压器(18)具有可控稳压器信号输入端口，可控稳压器电源端口和可控稳压器信号输出端口；可控稳压器信号输入端口通过导线连接单片机(20)，可控稳压器信号输出端口通过导线连接激发光产生部件(15)，可控稳压器电源端口通过导线连接系统直流电源(19)；

系统直流电源(19)为所述系统提供24V及3.3V两路直流电压；24V直流电通过导线分别连接磁体阵列控制机构、加热部件(14)、激发光产生部件(15)、光学传感器(16)和驱动器(17)；3.3V直流电压通过导线连接单片机(20)；

单片机(20)用于控制磁体阵列控制机构的移动、加热部件(14)温度变化以及荧光量的采集，将采集到荧光量-时间对应关系与其内置的荧光-时间标准曲线进行比对，计算还原样品溶液中具体的靶标基因含量信息，并进行结果输出；

所述系统各组成之间的连接关系如下：

微流控芯片固定放置于基底(1)中央；在基底(1)两侧X轴方向上分别设有X轴方向移动机构(10)，每个X轴方向移动机构(10)两端固定在基底(1)上，两端之间的部分与一个Z轴方向移动机构(11)底部进行滑动连接 ，磁体阵列(12)一端与一个Z轴方向移动机构(11)底部上方连接，磁体阵列(12)另一端与另一个Z轴方向移动机构(11)底部上方连接，磁体阵列(12)上固定排列有强磁体(13)，强磁体(13)与通道(2)的位置和数量相对应，每个强磁体(13)都位于其对应的通道(2)正上方，磁体阵列控制机构经由驱动器(17)与单片机(20)相连，由单片机(20)控制；加热部件(14)位于待检测样品和核酸释放扩增检测区(6)所在底部基底(1)与微流控芯片之间，与单片机(20)连接，单片机(20)控制加热部件(14)维持指定温度的方法为：比例-积分-微分控制算法；激发光产生部件(15)经由可控稳压器(18)与系统直流电源(19)相连接，并由可控稳压器(18)控制其激发光强度；可控稳压器(18)与单片机(20)的IO引脚相连，受到单片机(20)的IO引脚的控制；光学传感器(16)与单片机(20)的通信协议端口相连，将其获取的光学信号通过通讯协议中的一种传入单片机(20)；激发光产生部件(15)和光学传感器(16)均与单片机(20)进行通信，由单片机(20)控制其执行动作，并向单片机(20)传输其获得的信息。

2.根据权利要求1所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，其特征在于：基底(1)为弱磁性材料，弱磁性材料为柔性磁铁或吸附面大于等于4cm×6cm，吸力小于等于2.5Kg的电磁铁。

3.根据权利要求1所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，其特征在于：隔离层(8)为矿物油。

4.根据权利要求1所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，其特征在于：磁体阵列控制机构中所述移动机构为丝杆或滑杆。

5.根据权利要求1所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，其特征在于：加热部件(14)为涡流线圈。

6.根据权利要求1所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，其特征在于：光学传感器(16)为颜色传感器，读取荧光中颜色通道的数值，并实时计算输出相关荧光量。

7.根据权利要求2所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统，其特征在于：隔离层(8)为矿物油；

磁体阵列控制机构中所述移动机构为丝杆或滑杆；

加热部件(14)为涡流线圈；

光学传感器(16)为颜色传感器，读取荧光中颜色通道的数值，并实时计算输出相关荧光量。

8.一种如权利要求1～7任一项所述的用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统的应用方法，其特征在于：所述方法步骤如下：

(1)将磁体阵列控制机构的X轴方向移动机构(10)和Z轴方向移动机构(11)与基底(1)连接，将微流控芯片中各通道(2)中的功能区添加好微型磁体(9)和溶液试剂，然后将加注隔离层(8)，固定放置于基底(1)上；

(2)将磁体阵列(12)与Z轴方向移动机构(11)连接；

(3)将待检测样品由加样口(7)注入待检测样品区(4)；

(4)单片机(20)向磁体阵列控制机构发出控制指令，磁体阵列(12)移动至微型磁体存放区(3)顶端，且下降使强磁体(13)和微型磁体(9)之间的距离小于上升阈值；此时微型磁体(9)受力如公式1所示：

F_U＞mg+F_D 公式1；

F_U表示微型磁体(9)受强磁体(13)的拉力，mg表示微型磁体(9)所受重力，F_D表示微型磁体(9)受基底(1)为弱磁性材料时，弱磁性材料的吸力，当基底(1)材料无弱磁性时，F_D取值为零；在公式1条件下微型磁体(9)将被拉起，并向上移动；

微型磁体(9)将停留于微型磁体存放区(3)顶端，且不会进入贯通各通道(2)及其他功能区的隔离层(8)，此时下降磁体阵列(12)，使强磁体(13)与微型磁体(9)之间的距离小于微型磁体(9)拉起阈值，此时微型磁体(9)受力如公式2所示：

F_U＞mg+F_D+F_z 公式2；

F_U表示微型磁体(9)受强磁体(13)的拉力，mg表示微型磁体(9)所受重力，F_D表示微型磁体(9)受基底(1)为弱磁性材料时，弱磁性材料的吸力，当基底(1)材料无弱磁性时，F_D取值为零，F_Z表示水和隔离层(8)之间的表面张力；在公式2条件下微型磁体(9)将被拉起，且进入隔离层(8)；

移动磁体阵列(12)，使其位于待检测样品区(4)顶端，控制强磁体(13)与微型磁体(9)之间的距离在上升阈值与无限远之间往复运动，控制加热部件(14)维持待检测样品区(4)温度为所需温度；

(5)关闭加热部件(14)，采用步骤(4)的方法将结合有核酸和蛋白质等杂质的微型磁体(9)从待检测样品区(4)中拉起，并释放至洗涤区(5)使之上下浮动；微型磁体(9)上结合的蛋白质等杂质在洗涤区(5)中被清除，而核酸依然与微型磁体(9)结合；当洗涤区(5)大于一个时，采用步骤(4)的方法将结合有核酸和蛋白质等杂质的微型磁体(9)从一个洗涤区(5)中拉起，释放进入另一个洗涤区(5)洗涤；

(6)采用步骤(4)的方法将洗涤除杂后，结合有核酸的微型磁体(9)从洗涤区(5)中拉起，并释放至核酸释放扩增检测区(6)使之上下浮动，核酸将在此处从微型磁体(9)中被释放到核酸释放扩增检测区(6)中；

(7)移动磁体阵列控制机构，将核酸释放扩增检测区(6)上方的强磁体(13)移走，微型磁体(9)位于核酸释放扩增检测区(6)底部；单片机(20)控制加热部件(14)温度对核酸释放扩增检测区(6)的温度进行控制，核酸被扩增的同时产生荧光，相同时间内扩增产生荧光的强度与靶标核酸浓度成正比，光学传感器(16)读取其中颜色通道的数值，并实时计算输出相关荧光量；

单片机(20)具有简单数据处理能力，采用内置的荧光-时间标准曲线采集的荧光量-时间对应关系进行比对，即可计算还原样品溶液中具体的核酸量信息。

9.根据权利要求8所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统的应用方法，其特征在于：步骤(4)中，控制加热部件(14)维持待检测样品区(4)温度为57±2℃，维持时间为10min。

10.根据权利要求8所述的一种用于核酸纯化，扩增及基因检测的系统的应用方法，其特征在于：步骤(7)中采用荧光Lamp扩增，将核酸释放扩增检测区(6)加热至60℃～65℃；或

采用变温荧光PCR扩增，使核酸释放扩增检测区(6)温度在94℃～60℃～72℃三段内循环。

Images