CN107532149A - 通过各成分基本上同时孵育和通用载体以分离细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了靶向生物体的快速和有效的分离方法。

Description

通过各成分基本上同时孵育和通用载体以分离细胞

与相关申请的交叉引用

本申请将作为优先申请列入35U.S.C.119(e)部分，从前的临时申请(美国申请号621121,259，2015年2月26日提交；621157,601，2015年5月6日提交；621174,687filed June12,2015年6月12日提交)均以参考文献的形式参与本文。

技术领域

本发明是关于改进标记和/或分离靶物体的技术，用大小不同的粒子，如磁性纳米粒子，结合于感兴趣的物体，使之可以合适的方法被进一步修饰或提取。本发明同时也相关于改进和简化间接标记的分离过程，间接标记分离是指细胞或其它物体首先用特异分子比如抗体标记，然后再用通用载体颗粒标记，后者则与已同细胞结合的抗体联接。本发明公开了改进标记分离过程的新方法，使其容易操作，节省时间，并因为减少了所用试剂而显著降低了消耗。此外，本方法也可应用于要求较少步骤的自动分离过程。

背景技术

为了方便描述本发明所属的技术，我们引用了一些文献和专利文件，以参考文献的方式并入本文。

目前有许多制造、分析以及实验室的方法和流程涉及特异结合体系的相互作用。很多实验室和临床检验都基于此相互作用，称作“生物特异”亲和反应。此反应常用于生物样品的诊断检查，或一系列靶物质的分离，特别是细胞、病毒、蛋白质、核酸等类似的生物体。尽可能达到结合体的快速和有效的特异结合至关重要。有效的结合反应依赖于传统的化学变量，如温度、浓度和物质间的亲和力。由于在生物体系中常见到需要分离的特异结合对中一方的浓度很低，采用高亲和力的结合体系至关重要。

有各种方法用于标记、分离和分析所感兴趣的靶物质，大都基于目标物质和标记物之间特异的复杂结合。从液体或游离体系中分离含有细小颗粒或珠粒的结合物可以利用重力来实现，比如静置或离心。即目标物质可以与能改变其密度的复合物结合，使其可通过重力或离心力达到分离。较常见的是用磁性颗粒结合目标物质以使其能用磁梯度来收集。

磁性颗粒技术以及它们在免疫和其他生物特异亲和反应中的应用是众所周知的。参见美国专利(No.4,554,088)和Immunoassays for Clinical Chemistry(147－162页,Hunter et al,eds.George Churchill Livingston，Edinburgh,1983)。通常任何能促进磁力或重力分离的材料都可用于分离标记。然而，利用磁性原理的方法则为优选。因为通过这些方法可以达到高质量的回收和纯度，使其适合于从混合的细胞群中除去或分离稀有细胞。这种分离包括但不局限于从骨髓或外周血中富集CD34⁺干细胞或免疫细胞，从母体血液中分离胎儿细胞，分离转染的细胞，以及从各种混合细胞群体中去除或分离肿瘤细胞。分离可以通过阳性选择或阴性去除，或二者相结合来完成，这种分离方法回收的细胞可用于许多目的，包括进一步的分析或治疗应用(例如，将细胞群重新注入患者)。

用于分离生物物质的磁性颗粒通常分为两大类。第一类包括可永久磁化或铁磁性的颗粒；第二种包括仅在磁场存在时显示磁性能的颗粒，后者被称为磁响应颗粒。材料的磁响应行为有时被描述为超顺磁性。然而，铁磁性的材料，例如磁性氧化铁，当制成直径为约30nm或更小的晶体时，亦可呈现超顺磁性，相反，铁磁材料的较大晶体在暴露于磁场之后则保持留永久磁性，并且由于颗粒之间较强的相互作用而倾向于聚集。

磁性颗粒可以被分类为大(约1.57－50μm)，小(约0.7－1.5μm)和胶体或纳米颗粒(<200nm)，后者也称为铁磁流体或铁磁流体样颗粒，并具有许多经典铁磁流体的性质(Liberti,et al,777－790页，E.Pelezzetti(Ed).“Fine Particle Science andTechnology”,Kluwer Acad.Publishers，Netherlands)。小磁性颗粒在涉及生物特异亲和反应的分析中非常有用，因为其表面容易包被生物功能性聚合物(如蛋白质)，提供较高的表面积和合理的反应动力学。专利文献中已描述了范围为0.7－1.5μm的磁性颗粒(美国专利第3,970,518，4018886，4230685，4267234，4452773，4,554,088，和4,659,678)。这些颗粒中的某些被公布作为免疫试剂中有用的固体支持物。除了上述的小磁性颗粒之外，还有一类也具有超顺磁性能的大磁性颗粒(1.5－50μm)。这样的材料包括Ugelstad的发明(美国专利号4,654,267)和由Dynal的产品(Oslo,Norway，现可由Invitrogen提供，是ThermoFisher Scientific的一部分)。次聚合物颗粒是在合成后，经由颗粒膨胀过程将磁铁晶体嵌入其中制成。相同尺寸其它材料的颗粒通常是在合成材料的同时加入分散的磁铁晶体，致使磁铁晶体被滞留在基质材料中，从而使颗粒获得磁性。在这两种情况下，所得颗粒都具有超顺磁性，去除磁场后容易分散。与磁性胶体或纳米颗粒不同，这种颗粒和小磁性颗粒一样，由于每个颗粒含有磁性材料物质，很容易用简单的实验室磁体分离。因此，分离可在低至几百高斯gauss/cm到约1.5kiloguass/cm的范围中进行。

另一方面，基于理论计算，胶体磁性颗粒(低于大约200nm)的分离则需要相当高的磁梯度－约在100kilogauss/cm范围，因为胶体磁性颗粒的扩散能量、较小的磁性质量/粒子比例和较大的磁力拖动。尽管如此，Liberti(未发表的结果)发现它们可以在低至7－10kGauss/cm的磁场中被分离。基于这一观察，作者认为这些胶体磁性颗粒在磁场中会形成纳米颗粒磁链，显著改变了其质量，从而使理论计算无意义。

Owen在美国专利4,795,698号中涉及聚合物覆盖的亚微米胶体超顺磁性颗粒。'698专利描述了通过将磁性物质沉淀于生物活性聚合物以制造这种颗粒。所得颗粒的结构，本文称之为单次颗粒，是一种微聚体，其中一个或多个直径约5－10nm的铁磁微晶体嵌入在直径大约50nm的颗粒中。在长达几个月的观察期中，这些颗粒呈现明显的水悬浮倾向。Molday(美国专利号4,452,773)发表了与Owen等的'698专利中所述的性质相似的材料，由碱化的Fe³⁺/Fe²⁺和高浓度的葡聚糖而形成铁矿石和其它氧化铁。以这种方式生产的材料具有胶体性质。该生产过程已由Miltenyi Biotec GmbH(Bergisch Gladbach，Germany)商业化。其产品已证实在细胞分离试验中非常有用。

Liberti等人描述了用于生产超顺磁胶体颗粒(也被称为铁磁流体)的另一种方法，(美国专利第5,597,531和6,551,843号)。与'698专利中描述的颗粒不同，后者的颗粒是通过将生物活性聚合物直接包被于预先形成的超顺磁性晶体上而制备的，该超顺磁性晶体通过声能被分散至准稳定的晶体簇，大小约25－120nm。所得到的颗粒，本文中称之为直接包被或DC颗粒，表现出比Owen或Molday等的纳米颗粒显示更大的磁力矩，虽然总体尺寸都大致相同。

磁分离技术是利用磁场产生力量以将铁磁体与流体介质分离。然而，胶体超顺磁性颗粒的悬浮态的特性和它们相对较弱的磁响应性，需要使用高梯度磁分离(HGMS)技术，以将这些颗粒与它们所分散的流体介质分离。在HGMS系统中，磁场的梯度，即空间参数对于悬浮颗粒性能的影响比该点磁场强度的影响更大。HGMS可用于分离各种生物物质，包括真核和原核细胞、病毒、核酸、蛋白质和碳水化合物。

在迄今已知的方法中，可被分离的生物物质应具备至少一种决定簇能够被靶向试剂特异的识别和结合，靶向试剂可以是抗体、抗体片段、特异性结合蛋白(例如蛋白A、蛋白G、链霉亲和素)、凝集素等类似物。

HGMS系统可分为两大类。一类分离系统使用的磁路位于分离室或容器的外部，通过设置的极片产生磁梯度。这种外部分离器(或开放磁场梯度分离器)的实例在美国专利第5,186,827中说明。在“827专利”描述的几个实例中，必需的磁场梯度是通过将永久磁体定位在非磁性容器的外周而产生，磁体的相似磁极处于磁场相对的结构。在这种系统中测试介质内磁场梯度的范围受到磁体的强度和磁体间距离的限制。因此，外部梯度系统产生的梯度有一定的限制。

另一种类型的HGMS分离系统则将铁磁收集结构直接设置在测试介质内，以便1)加强施加的磁场强度，2)在测试介质内建立磁场梯度。在一种已知类型的内源性HGMS系统中，细线，例如钢丝绒或纱布，被包装在一个柱子内并设置在磁体边或磁偶极子内。磁场存在时，按照众所周知的物理原理，从电线表面起始将产生非常高的磁梯度，使悬浮的磁性颗粒被吸引并附着于其上。电线所产生的磁梯度与电线直径成反比，即电线直径越大，磁力越小。内部梯度系统的一个缺点是使用的钢丝绒，纱布材料，微珠或其他类似物可能通过毛细管作用捕获周围测试介质中的非磁性物质，尤其是在线相交处内外和相邻微珠之间的间隙内。已经有各种覆盖方法用于这种内部梯度柱子(美国专利号4,375,407和5,693,539)，然而因为系统中表面积较大，吸附作用使得回收仍然是个难题。因此，如果需要回收低浓度物质，内部梯度系统则不可取。另外，要自动化此分离过程不仅难度较大也很昂贵。

相比之下，HGMS系统的外部梯度细胞分离提供几点便利。首先，可用简单的实验室用品，如试管、离心管、甚至是血液采集管(用于采血)。再者，如果用美国专利第5,186,827中描述的四极/六极装置和第5,466,574的相对偶极配置，当外部磁梯度存在时，原则上细胞可以有效地形成单层，使细胞洗涤和随后的操作也因此而方便。此外，从试管或类似容器中回收细胞成为一个简单有效的过程。

一些重要变量可影响磁性分离的效率以及磁性标记细胞的回收率和纯度。考虑如下：分离细胞的数量，细胞上表面决定簇的密度，每个细胞的磁负荷，与磁性材料非特异性结合的倾向，细胞磁性载荷的方法，容器的形状，容器表面的组成和介质的粘度。因此，磁分离细胞方法的优化不是一个简单或微不足道的任务。

在上述中，分离细胞时一个非常重要的考虑是磁性标记步骤采用的方法。有两个选择：直接或间接标记。在直接标记中，通常是单克隆抗体(mAb)或其他特异结合体直接偶联于磁性纳米颗粒，其随后与细胞混合物一起孵育。通过混合(大磁性颗粒的情况下)或扩散(铁磁流体材料)，磁性颗粒将特异地附着于靶细胞。对于诸如Dynabeads的大磁性颗粒，这种反应通常需要30分钟以获得足够的磁性负载。对于胶体磁性纳米颗粒或铁磁流体，此类反应需要10－20分钟。

或者，靶物质也可以通过包括至少两个步骤的间接方式进行磁性标记。第一步是将细胞与mAb或偶联于小分子如生物素化的mAb孵育。然后第二步将已有mAb标记的细胞与通用标记磁性颗粒孵育，如山羊抗小鼠磁性颗粒或链霉亲和素磁性颗粒。已知如果第一步孵育中用1.0μg/mL mAb，细胞浓度为1.0×10⁶－10⁸细胞/mL，则标记在约20分钟时饱和。另外，在相似的细胞浓度时如用5.0μg/mL mAb，则可在5分钟内达到足够的标记。在任一种情况下，在加入通用标记磁性试剂之前通常需要通过离心(称为“洗涤”)从细胞孵育混合物中除去第一步中未结合的mAb，以防止通用标记磁性颗粒与游离的mAb或游离的生物素化的mAb交联。

在诸如Dynabeads大磁性颗粒情况下，必须要有mAb“洗涤”步骤以防止形成颗粒－mAb－颗粒的大的干扰聚集体。否则这种聚集体不仅对分离产生负面影响，而且会将细胞滞留在聚集体内。相反，用胶体磁性材料，比如Liberti在专利'531和'843中所公布的材料，发现当mAb的标记浓度不是过量时则不需要去除未结合的mAb(Liberti等，美国专利号5186827)。不必清除未结合的mAb是非常显著的优点，它避免了难以自动化并需要大量时间来操做去除mAb的过程。此外，它使得间接标记法比直接法更有吸引力，因为只需要合成或制备一个磁共轭体，即通用标记纳米磁性颗粒。使用这一原理生产的一系列细胞分离试剂盒可从STEMCELL Technologies，Inc.(Vancouver，BC)购得。

尽管此间接分离法有不必去除过量mAb的优点，该方法确实包括两个温育步骤，在大多数情况下为10－15分钟的mAb孵育(通常为15分钟)，然后是10－15分钟的磁标记过程。如用胶体大小的磁性纳米颗粒，其在无洗涤步骤时作用最佳，并在开放磁场梯度分离器中进行的分离，则需要额外加10－15分钟的时间以实现有效分离。因此细胞需要经历至少30分钟，通常40分钟的处理。即使在0℃下完成整个磁性细胞分离过程，由于长时间的处理也会造成细胞损伤。此外，缩短处理时间所产生的经济效益在手动或自动化过程的流量方面是相当明显的。在细胞实验中如可以在更短的时间内，达到更高的细胞活力和更高的流量，对所有研究人员、科学家、技术人员、实验室、以及大学和研究机构来说，均具有巨大的经济和科学价值，而且很容易设想－可影响到许多科学领域如：肿瘤学、血液学、基因组学和广泛的细胞生物科学。

缩短分离时间以及提高磁分离效率的一种方法是增强细胞的磁负荷或在大分子靶标时增强目标和磁体的相互作用。当采用磁分离效率较高的胶体磁性纳米粒子时，一种增强靶上磁性负载的方法是使未结合的磁性纳米颗粒聚集到已与细胞结合的纳米粒子上，称作“控制的聚集”(美国专利号6,623,982)。此磁负载的增强是通过构建与纳米颗粒表面偶联两个受体来实现的：例如链霉亲和素和针对靶细胞的特异mAb。充分的孵育使纳米颗粒通过mAb与靶细胞结合，然后加入含有两个或更多个生物素的第二成分，如在本实例中，通过生物素－链霉亲和素的反应使游离的纳米颗粒与结合于细胞上的纳米颗粒相聚合。通过该过程，拥有低密度受体的细胞将携带更多的磁性并且容易用开放磁场梯度分离装置回收。如果加入的“交联”试剂是双价或多价的去硫生物素，由于去硫生物素和生物素对链霉亲和素的亲和力有着巨大差异，通过加入生物素可以容易地将聚集反应逆转。由此建立了一个体系，一方面使用增加磁负载来获取通常可能不被检测的细胞，另一方面因为此过程的可逆性，细胞的进一步分析也不会因为过量的磁性纳米颗粒的存在而受到影响。

增加靶物质磁载荷的另一种方法是促使磁性颗粒和细胞的相对移动。此设想已由Kreuwel等完成(美国专利号6,764,859)。其将磁化梯度装置置于带有磁性颗粒的容器附近，引起磁性颗粒在溶液中的移动，从而导致靶物质与磁性颗粒的碰撞以达到磁载荷。Terstappen等(美国专利号6,551,843)发表了细胞磁标记的方法。一是用离心的方法使细胞通过有特异性mAb的胶体磁性材料(铁磁流体)，或者将混合物加入四极磁性装置中，铁磁流体会径向移动至管壁。需要注意的是在用离心增强磁性加载的过程中，因为铁磁流体需要非常高的离心力来沉淀，细胞也会很快被离心出液体。在引用的四极磁性装置示例中，铁磁流体通过细胞混合液的流动大约需要15分钟来完成。

使用四极分离器以增强靶物体的磁性载荷有几个缺点，其一是所需的时间长。其二，当铁磁流体穿过混合物移动到容器壁时，有些细胞有可能没有机会接触到铁磁颗粒。因此，引导细胞－磁性颗粒相互作用的相对运动也导致了靶细胞不在磁性纳米颗粒附近的结果。在下面给出的实例中，我们将显示有更好的方法来完成靶物质和磁性纳米颗粒的相对运动以较快地增强磁性载荷。

发明内容

从使用充分改良的有利于细胞分离的铁磁流体样物质(70－280nm磁性胶体)的广泛实验中，我们经常发现采用间接磁性标记方法分离细胞其细胞产率和纯度高于直接标记法。然而，间接磁性标记分离法通常需要两次孵育(靶向标记和通用标记)和两次离心(用于有效去除剩余的靶向mAb)，使得该方法比mAb或靶向识别分子直接耦合于磁性颗粒显得困难、耗时和不易自动化。我们还发现针对已经用mAb标记的细胞，磁性标记在室温下孵育20分钟可至最大结合，尽管根据所需的产率通常10分钟也足够。在0℃时，则需要更长的反应时间。为了在较短时间内以最小量的铁磁标记流体(过量的磁性物质会增加非特异性结合等负面影响)来实现最大化的磁性标记，我们建立并优化了磁体/混合方案，缩短了孵育时间，从室温20分钟变为5分钟，即使是在0℃时操作。

我们进一步惊喜的发现在间接标记方案中，如果降低用于标记细胞的mAb的浓度，并且最小化mAb分子上被通用铁磁流体标记载体识别的决定簇数，那么所有的成分(细胞、标记mAb和通用标记铁磁流体)可以混合在一起同时孵育，随之进行磁分离，其结果与间接标记过程的两步法孵育加上mAb洗涤相同。换句话说，我们发现多个标记反应(mAb与细胞表面决定簇，通用标记铁磁分子与游离mAb，以及通用标记铁磁分子与细胞表面结合的mAb)可以基本上同时进行，并可达到分离高产率和高纯度的靶生物。而且，如果将磁/混合方案用于这些同时反应的成分，并以磁分离这种混合物的能力来确定效果，最大标记通常可以在0℃、5分钟内完成。因此，我们在此公布一种方法将通常需要25－30分钟完成的过程减至仅需5分钟。

这些发现可以有效地将任何间接免疫磁性细胞分离转化为相关的直接标记过程，然而间接法在所有可能的情况下都完全避免了直接标记时制作特定mAb－磁性纳米颗粒共轭物的需要。使用这种方法，可以制备针对小分子如生物素或针对有限数量的靶向mAb分子上的抗原决定簇的通用磁标记试剂。在制作针对细胞标记抗体的通用磁标记试剂时，显然只针对抗体Fc区的有限数目的决定簇为最佳。需要说明的是，通用标记试剂中的纳米粒子不需要一定是磁性的，并且实用于其他各种应用。

这些发现以及其中变量可针对具体应用进行调整和量身定制的特性，将使细胞分离的自动化变得更简单，节省了时间，降低了成本，并可提供分离的细胞，这是之前的系统所不能及的。

在其它应用中，本文所阐述的合适试剂的同时搭配在直接标记时也显示了优势。一个重要的例子是June等的工作(美国专利号8,637,307)。他证明了当用基因工程重组的表达抗CD3或CD2以及CD28抗体的细胞与T细胞共同孵育时可以非常有效地诱导多克隆T细胞增殖－June和其同事精致展示的与免疫治疗相关的重要现象。Sheffold和Assenmacher美国专利申请第2014/0087462号综述了此“307专利的发展过程，表明上述能引起多克隆T细胞增殖的抗体分子可被连接到平坦或球形表面，后者可以是各种直径和表面特性。他们进一步证明了由Molday工艺制做的纳米颗粒，当将抗CD3和CD28任何一种或两种抗体同时连接到单个此铁－葡聚糖微球体上，或将带有相应抗体的微球恰当混合时，能成为非常有效的T细胞增殖刺激物。而更直接，经济和通用的刺激T细胞的手段将是使用本发明中所述的方法，即将CD3和CD28抗体以及适当的通用标记剂同时与T细胞孵育。这样可使用适当比例的CD3、CD28抗体以及其他任何相关的mAb，从而使必需的T细胞受体的反应和聚集在原位同时发生。例如，如果使用两种识别不同亚型抗CDs的抗体进行刺激，并且使用两种不同的通用标记载体，其中每种具有不同的特异性，例如抗亚型1或亚型2，则可以容易地确定两种不同的mAb－纳米颗粒的潜在刺激优势。

一方面，本发明提供了生成生物共轭物的有效方法，其包括以下步骤：(i)在生物相容性培养基中基本上同时组合各种反应成分，(a)具有至少一种特征决定簇的靶生物，(b)至少一种靶向剂，此靶向剂应包含多个结合单元，每个结合单元至少有一个结合位点和一个识别位点，靶向剂可有效地通过至少一个结合位点特异地结合于靶生物的至少一个决定簇，以形成靶生物的标记，(c)纳米颗粒标记载体应含有至少一个与已标记的生物体复合体识别位点特异结合的区域，从而形成生物缀合物。(ii)将含有靶生物、靶向剂和标记载体的培养物在如下条件中培养(温度约0－44℃，时间约3－30分钟)以促使形成生物共轭物。本发明中纳米颗粒标记载体的物理特性使其形成的生物共轭物易与培养基区分。此外，靶向剂的每个结合单元约有1－10个识别位点，并且每个纳米颗粒标记载体有约1,000－8,000个结合部位，使标记载体结合部位的数目比靶向剂平均所有结合单位识别位点的总数至少大两倍。

另一方面，本发明提供了形成激活T细胞生物缀合物的方法。在生物相容性培养基中基本上同时混合CD3⁺细胞(T细胞)，抗CD3抗体，抗CD28抗体和结合了抗Fc抗体的磁性纳米颗粒，其中CD3和CD28抗体的浓度约为0.05－1.5μg/ml，抗Fc抗体－磁性纳米颗粒的浓度等于或大于CD3抗体的浓度。随后此包含CD3⁺细胞，抗CD3、CD28抗体和Fc抗体－磁性纳米颗粒的混合培养体在温度(10－42℃)和时间(5－30分钟)的条件下孵育以促进形成激活的T细胞生物缀合物。然后，将此混合物置于磁场梯度以促成活化T细胞生物共轭物的聚集体。最后，停止磁场梯度对混合物的作用，将形成的活化T细胞生物共轭聚集体分散在新的培养基中。

进一方面，本发明提供了从混合细胞群体分离感兴趣的、至少应有一个特异决定簇的细胞亚群的方法。所述方法包括在生物相容性培养基中，基本上同时加入混合细胞群，至少一种靶向剂，每种靶向剂包含多个结合单元，每个结合单元至少有一个结合位点和识别位点，此靶向剂有效地通过至少一个结合位点与细胞亚群的特征决定簇结合，从而形成标记的细胞。加入的纳米颗粒标记载体应有至少一个结合部分的，其特异性地结合于靶向剂的至少一个识别位点从而形成包含细胞亚群的生物缀合物。此混合反应在非磁性容器中进行，容器壁与培养混合物接触，培养混合物包含混合细胞群、靶向剂和纳米颗粒标记载体。孵育温度约0－37℃，时间约3－30分钟，以促进生物缀合物的形成。靶向剂的每个结合单元约有1－10个识别位点，并且每个纳米颗粒标记载体有约1,000－8,000个结合部位，使纳米颗粒标记载体上结合部位的数目比靶向剂平均所有结合单位的识别位点的总数至少大两倍。

具体实施方式

现在将参考以下描述中的某些优选实例进一步阐述本发明：

在改进免疫磁性细胞分离的过程中，通过常说的“间接”免疫磁性分离我们遇到了一些非常惊人的结果。间接过程是指首先将靶细胞与靶向剂(通常为mAb)一起孵育，这个标记步骤后的第二个步骤是将靶向剂再与通用标记载体连接，在我们的情况下此通用标记载体是指含有适当标记分子并可以与靶向剂结合的磁性纳米颗粒。通过该“间接”或两步法标记的细胞可以容易地通过暴露于合适的磁场被回收。这种间接方法的优点众所周知，特别有利的是一种通用标记载体可适用于一系列相关的靶向剂(通常为mAb)，以进行任何所需的分离。除了仅需要制备一种磁性纳米颗粒的明显经济优点之外，不需要制备各种mAb－纳米颗粒共轭物也是通用标记载体的另一个显著优点，因为这是一个昂贵且耗时的过程，也是低效和浪费使用mAb，况且存储和使用mAb相比于纳米颗粒偶合物更容易。因此，能提高间接免疫磁性分离或任何其他间接标记方法有巨大的科学，临床和经济意义。

在间接标记的过程中，mAb通常与细胞混合物一起孵育15－20分钟，往往用过量的mAb以确保标记足够的细胞表面决定簇被，并使足够的通用标记磁性颗粒可以随之附着于细胞上以达到有效的磁分离。在理想的情况下，清楚的目标是用恰当量的磁性通用标记纳米颗粒以保证靶细胞在磁梯度中的有效分离和回收。这样做不仅有良好的经济意义，有助于保持细胞的完整性，还益于收获的靶细胞的后续操作，例如分析、培养、特异性激活等。另外，尽可能地将通用标记纳米磁性载体颗粒连接到细胞上也可以避免在有许多非细胞结合的磁性颗粒中收集靶细胞。过多的未结合载体颗粒会干扰细胞，并使随后的操作更困难。

考虑到这些目的，以及简化间接细胞分离过程的愿望，我们首先检查了细胞的磁荷载，并优化了应用铁磁流体样物质的过程。我们的目标是用开放磁场梯度分离器，最大限度地减少通用标记载体的用量，同时最大限度地提高细胞的磁标记。请注意，这里发表的优化方法利用开放磁场梯度分离器，磁梯度限于12－14kGauss/cm。根据多次使用125－135nm的链霉亲和素铁磁流体(SAFF)的经验，此载体依据Liberti等发表的改良方案制备(专利'531和'843)，通常用8－10μg的SAFF以分离1－2×10⁷标记的细胞。设想此颗粒有直径约120nm近似球形的磁铁矿晶体核心和约10nm的蛋白质/聚合物表层，从铁和碳的分析数据计算出，1μg SAFF含有约2×10⁸纳米粒子。当靶向1×10⁷个细胞时，通常使用10μg的SAFF，相当于每个细胞面对200个SAFF纳米颗粒。即使SAFF的量几乎不改变细胞悬浮液的外观(SAFF为黑色)，200个纳米颗粒/细胞也似乎过多。此数字在用磁梯度分离时显得尤其多，因为即使用少至1－3个SAFF纳米颗粒也会有10倍多的细胞可被收获。

表1列出了室温下SAFF与细胞结合的动力学实验结果。可以看出，孵育至少在20分钟内不会发生饱和反应。在希望的0℃，SAFF的结合反应甚至会更慢。从表中可以看出，按照这些实验使用的条件，如果仅与铁磁流体孵育10分钟，则将丢失约10％的靶细胞。

表I.磁性孵育时间和磁性标记细胞在23℃时的分离

实验条件：用1μg/ml的生物素－抗CD3mAb抗体标记1.0ml细胞(10⁸细胞/ml)，孵育10分钟，洗除多余的mAb，然后在1ml细胞中加入50μg(15μl)SAFF，再孵育10分钟，稀释10倍至10⁷细胞/mL，并在四极中分离10分钟。请留意，需要用较高浓度的SAFF以在约10分钟的温育条件下获得较高的产量。

如上所述，已有各种用于增强SAFF负载的磁性“孵育”方案。应当注意Terstappen('843)和Kreuwel('859)等使用的方案有一些固有的限制。在'843文章中，磁性结合的增强是在四极分离器中进行，从而径向拉动铁磁流体。这样做有两个负面后果。首先，在四极分离器中，径向分离源于几何考虑，磁性颗粒向外移动时被稀释，从而使中心区域的细胞缺少磁性纳米颗粒，这样对于细胞标记只有负面影响。加之，在径向磁场中长时间的孵育使许多细胞周围缺少磁性标记颗粒。在Kreuwel'859中，磁性颗粒从容器的一侧运动到另一侧，也会造成细胞在磁梯度相反侧缺乏磁性标记颗粒。

为了避免上述问题，我们设计了一种增强磁荷载的改良方案。这是通过在磁梯度中操作含有SAFF和生物素－mAb标记细胞(即用生物素－mAb预先标记细胞并洗涤)的试管来完成，磁体度用有南北极含钕铁硼(NdFeB)的连接磁块形成(0.5”×0.5”×2.0”，间隙为3.0”)。操作时将样品管从极面移动到另一极面，而不转动试管－即重新定向，使得当试管转换极向时铁磁流体在管内从一侧流向另一侧。通过调整试管在靠近极面时停留的时间(30,、45、60和90秒)和SAFF的剂量(2、4、5和6μg/10⁷细胞)以找到使约50％细胞在四极装置中可被分离的条件。实验的总孵育时间为5分钟。这些实验确定了当用2μg SAFF一起孵育时，若停留的时间为45秒，可以分离44％的细胞(输入10⁷个细胞)。进一步的测定用40秒的停留时间，总时间320秒(4个N－S周期)，每10⁷靶细胞用2μg SAFF，并加上各种额外的操作以观察磁分离回收细胞的百分数是否可以增加。表II显示了这些实验的结果。

表II.各种磁性和非磁性操作对SAFF与细胞结合的影响¹

¹细胞浓度为10⁷/ml，SAFF剂量是2μg/ml，总体操作时间是320秒

从表II的结果我们清楚的知道，对于反应中用的纳米颗粒的大小和磁敏感性(典型的目前常与开放式分离器一起使用的胶体材料)，40秒的极面停留时间以使纳米颗粒从容器的一侧运动到另一侧(管侧并无的明显可见的铁磁颗粒聚集)所提供的磁性孵育，以及尤其重要的在每个极面停留之间震动混匀以重新悬浮未结合的铁磁颗粒，显著的增强了磁性标记，这点通过分离标记细胞的百分比可以看出(70％对38％)。利用这种方法也可以很容易的找到适用于较大的或具有更大磁化率的磁性颗粒的条件，如适当的磁力，停留时间和混合方法，以增强磁载荷。值得注意的是对照管在没有任何操作和磁场存在的条件下，仅收获约一半的细胞，显示了该方法的有效性。重要的是要注意对于特定的磁梯度，导致铁磁胶体在溶液中移动的极面停留时间很大程度上取决于磁场的强度和形状，混合物的温度、粘度以及细胞的浓度。因此很明显，对于特定的磁性设置和测试系统，实验是最佳的方法以确定极面停留的时间。

使用这种方法将收获70％的靶细胞，并且每10⁷个靶细胞仅使用2μg的SAFF，相当于每个细胞给予约60个纳米颗粒。如果只有一个SAFF颗粒与一个mAb结合，则这些结果表明仅需要很少的mAb，况且SAFF可以与多个mAb结合。因此，这些结果提出了一个问题：间接标记过程(两步法)到底需要多少mAb即可以达到有效分离，接着第二个问题：如果用于初级标记的mAb浓度可以显着降低，同样通用标记载体的量也可不需要太大。如果mAb上仅存在有限数量的供通用标记载体结合的决定簇，那么在间接方法操作时是否可以将所有组分一起混合在同一个体系中来完成？换句话说，是否可以将包含靶细胞的细胞混合物与合适的mAb(其上仅提供有限的通用标记载体的结合位点)和通用标记载体基本上同时混合？还有，三种反应同时发生(mAb与靶细胞结合、SAFF结合游离的mAb和SAFF结合已与细胞结合的mAb)的动力学是否有利甚或有优势，使孵育时间降低并且分离质量改善？再者，通用标记载体与多价mAb形成聚集物的潜能(例如SAFF－mAb－SAFF)会是共体系同时反应的负面因素吗？

我们发现，只要靶向成分(例如mAb)上通用标记载体结合位点的数量相当低，就可以通过同时混合所有组分来完成高效的间接免疫磁性标记或分离程序。我们进一步发现，当没有任何额外的磁操作时，标记反应动力学惊人的有利，同时对反应混合物进行如上所述的磁操作则更为有利。下面显示的实例以磁性靶细胞分离为测试标准，证明了同时混合培养仅用约5分即可有效完成反应，而常规操则需要与mAb孵育15分钟，再与通用标记载体孵育10－15分钟，即使除外mAb洗涤的步骤，总处理时间也需要25－30分钟。此外也发现，加入反应组分的顺序似乎并不重要，即mAb与细胞结合，随后加入通用标记载体，或在与通用标记载体混合的细胞中加入mAb。在后一种情况下，由于细胞和通用标记载体混合时不会发生反应，有时会优选这种方法，因为在加入mAb和发生任何反应之前可以进行良好的混合。然而，基于研究中使用的各种成分的体积，发现有利的方法是先将标记mAb(通常为5－20μl)加入管中，随后立即加入细胞并混合，最后加入通用标记载体纳米颗粒并混合。

反应也可以在混合mAb和细胞30－60秒后再加入通用标记载体纳米颗粒的情况下进行。注意的是，在其它应用的情况下如果希望标记的靶细胞用于其它目的，通用标记载体或纳米颗粒并不需要是磁性颗粒。以下，我们将把这种由磁场介导的通过混合孵育促进同时反应的间接标记法称作为同时标记和磁混合(SLAMM)。为了进一步促进标记和保存试剂，SLAMM的好处还在于可以用比磁力分离时高5至10倍的细胞浓度。很显然，反应物的浓度越高，反应发生得越快。

然而，增加反应物浓度的选择将取决于期望结果和所分离的混合物的参数。我们所描述的SLAMM分离，是指孵育和分离在同一细胞浓度下进行，称作为SLAMM。也或者可将样品在分离前稀释5倍或10倍，这种分离被分别称为SLAMM－5和SLAMM－10。所提供的示例说明了SLAMM操作步骤的效果和相关的重要参数。

以下定义将有助于理解本发明所使用的方法：

“基本上同时”是关于将目标生物，靶向剂和合适的标记载体一起混合时用的术语，是指其中的这些成分在同一生物相容性培养基中组合的时间是同时或几乎同时，使得生物缀合物可以在原位形成。其中一种方法是将靶向剂加入到含有靶生物和标记载体的培养基中以引发反应。另一种利用基本上同时以组合所需成分在原位形成生物缀合物的方法是在短时间内，5分钟或更短，将标记载体加入到已含有靶向剂和目标生物的培养基内，最好是在混合靶向试剂和目标生物后1分钟内加入标记载体，从而促使生物缀合物的形成，并避免靶向剂和标记载体之间可能的交联或聚团。

术语“生物相容性培养基”是指本发明中靶生物和其它试剂赖于维持活性形式或存活的液体。优选的生物相容性组合应是含有缓冲剂－如Tris、磷酸或HEPES，和盐离子的溶液。通常盐离子的浓度与生理水平相似。生物相容的培养基也可以包含稳定剂和防腐剂。

术语“标记载体”由“标记载体单元”组成，在本文是指粘附有蛋白质或其它分子的材料，其有结合位点可特异的与某些类别的分子(通常为大分子)共有的特定分子识别位点结合，或者是标记物载体带有可以和其他大分子偶联的特殊分子。通常用于此类应用的结合对包括亲和素－生物素，链霉亲和素－生物素，1类抗2类Fc的抗体－2类抗体(其中物种2类抗体通常称为靶向或一级抗体，而1类抗体被称为二级抗体，例如由二级抗体山羊抗小鼠Fc和一级抗体小鼠mAb组成的特异性结合对)。标记载体通常包含各种尺寸和性质的固体支持物，使具有结合位点的分子可以粘附其上。如大家熟知的技术，结合到诸如微量滴定孔表面的大分子如亲和素，链霉亲和素，中性亲和素和二级抗体可与靶向剂形成结合对。类似地，将这些大分子附着到颗粒上以形成通用标记载体，在本领域中也是众所周知。

术语“目标生物”在本文中是指生物或医学上关注的各种物质，包括真核和原核细胞，细胞器，病毒，蛋白质，核酸，碳水化合物，配体或包含核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物的复合分子。如果物质含有至少一个能够被受体或配体识别结合的决定簇，则此物质可通过本文所述的方法分离。如果目标生物是细胞，则在本文中称为“靶细胞”。

术语“特征决定簇”在文中是指目标生物分子的一个区域，其可以与靶向剂特异结合，参与并决定目标生物结合的选择性。从根本上说，决定簇是目标生物分子被靶受体或靶向剂识别的接触区域，它包括的物质如抗原、半抗原和其他复合分子(如碳水化合物、糖蛋白等)。

术语“靶向剂”在文中是指对目标生物特征决定簇有特异性亲和力的任何物质或任何类物质，以尽量排除其它物质。通常优选mAb作为靶向剂；然而也有其它靶向剂，包括多克隆抗体、抗体片段、非抗体受体、配体、链霉亲和素或亲和素标记试剂、半抗原标记试剂和荧光标记抗体(例如phycoerythrin或fluorescein isothiocyanate的缀合物)。

术语“特异结合对”在本文描述的是相互具有特殊特异性一对分子，其在正常条件下的配对结合优先于其它分子。特异性结合对的实例如抗体与其识别的抗原决定簇，配体(例如激素等)与受体，亲和素/链霉亲和素与生物素，凝集素与碳水化合物，以及互补核苷酸序列的结合。显而易见，对于本领域技术人员而言，各种其它决定簇－特异的结合物质之间的组合也可利用本发明的方法。在本发明的情况中，特异结合对可由标记物表面相关分子的“结合位点”和相应靶抗原的“识别位点”结合形成。

术语“磁响应材料”在本文中用于指永久磁化的颗粒和仅可在磁场中时获取磁性的颗粒，后者在本文中称为“磁响应颗粒”。显示磁响应行为的材料时常被称之为超顺磁的。然而，某些铁磁材料(例如磁性氧化铁)，当晶体大小在直径约为30nm或更小时可以被确定为具有磁响应性。相反，较大晶体的铁磁材料在暴露于磁场之后则保持永久磁铁特性，并且随之容易聚集。已有磁响应胶体磁铁存在，参见Owen等人的美国专利号4,795,698，其中描述了由聚合物包被的亚微米大小磁铁颗粒，呈现胶体的特性。

术语“抗体”在文中包括免疫球蛋白，单克隆或多克隆抗体，免疫反应性免疫球蛋白片段，嵌合抗体，半抗原和抗体片段，以及其他与抗体等同的分子，其可特异性的结合于感兴趣的抗原决定簇(例如TCR/CD3复合物或CD28)。抗体可以是灵长类(例如人源化的)、小鼠类、小鼠人类、小鼠－灵长类的或嵌合体，可以是完整的分子或分子片段(例如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'₂片段)，可以是完整分子和/或分子片段的多聚体或聚集体。抗体可以自然产生，也可以通过免疫接种，合成和遗传工程人为制备。用于T细胞扩增的优选抗体片段需要能够交联其靶抗原的那些分子，例如二价片段F(ab)'₂。或者本身不能将其靶抗原交联的抗体片段(例如Fab片段)可与二级抗体结合使用，后者可通过交联抗体片段从而交联靶抗原。市场中已有许多抗人CD3的mAb，例如用美国各种培养物保存中心(ATCC)的杂交瘤细胞制备的OKT3抗体和mAb G19－4。

术语“刺激的”和“活化的”在文中指由于与细胞表面区域充分交联而诱导的细胞生物化学或形态学的显著变化状态。例如以T细胞而言，活化是指T细胞被充分刺激以诱导其细胞增殖或分泌细胞因子。

术语“富集”在本文是指增加生物样品中靶细胞与总细胞的比例。在使用外周血为起始物质时，评估浓缩程度时应不计数红细胞。使用本发明的方法，循环上皮细胞相对于白细胞的富集可以达到至少2,500倍，优选的可以至5,000倍，甚或更高到10,000倍的程度(Allard等人，Clin Cancer Res Oct 15,2004,10:6897)。

以下实例用以说明本发明的某些实际方案，但其并不以任何方式限制本发明。

例1

使用抗CD3(+/-生物素)和SAFF或山羊抗小鼠Fc铁磁流体分离T细胞的SLAMM-5结果

CD3mAb得自Tonbo Biosciences(San Diego，CA)。利用常规技术和SetarehBiotech(Eugene，OR)的生物素延伸试剂制备了两种生物素标记的mAb缀合物，并通过Sigma(St.Louis，MO)的HABA/亲和素测定法确定每个mAb分别具有0.7和4.0生物素。第三个生物素化的CD3mAb来自于Ancell Corporation(St.Paul，MN)，其中生物素/mAb的比例为10:1。培养生长的T细胞系HPB-MLT作为靶细胞来源。收获细胞，测试活力并将细胞重悬于适当的中性pH、等渗、并与铁磁流体相容的缓冲液中。

将山羊抗小鼠Fc(Southern Biotech，Birmingham，AL)或链霉亲和素(ProZyme，Hayward，CA)偶联到135nm的铁磁流体，合成了两种通用纳米标记颗粒。基于链霉亲和素铁磁流体(SAFF)的生物素结合能力，并假定一个链霉亲和素分子只能结合一个生物素－mAb，该SAFF制剂可结合大于1mg mAb/mg铁磁流体。

广泛的初步实验发现，在约1－5×10⁷靶细胞/ml的细胞浓度时进行SLAMM反应比较方便。并且因为孵育反应时各成分加入的不同顺序都会产生相同的结果，则最佳的加样顺序考虑应以方便各成分的体积以促进其有效混合而定。因此，先将mAb或生物素化mAb(最小体积)加于试管(Eppendorf，1.5mL圆锥形)中，再快速加入细胞悬浮液并充分混合，然后加入一定体积相应的铁磁流体缀合物并充分混合。在一些实验中，在添加铁磁流体共轭物之前，使mAb－细胞混合物静置30秒，然而这种方法对结果并没有明显的影响。在所有成分混合后立即将样品置于分离的循环中：置于磁场梯度中和没有磁场梯度时的涡旋混合。因此，将试管放置在小块NdFeB稀土磁体(0.5”x 0.5”x 0.5”，N52级)的极面40秒，立即移开并涡旋混合，然后放再回到极面。以40秒的间隔重复这些循环至5,7或10分钟。SLAMM完成后，将样品立即用缓冲液稀释5倍，混匀，置于四极分离器中10分钟。为了定量，回收的上清液用Countess自动细胞计数器(Life Technologies(Carlsbad，CA))以计数未收集的细胞，收集的细胞则通常用显微镜检查。这些实验的结果列于表III。

表III.用生物素mAb－链霉亲和素铁磁流体(SAFF)和小鼠抗体－山羊抗小鼠Fc铁磁流体(G@mFcFF)间接SLAMM-5方法的分离效率¹

¹细胞以5x 10⁷细胞/ml的浓度进行SLAMM，1x 10⁷浓度分离。

表III的前三行显示了在SLAMM方法种mAb的生物素价态的影响结果。用于此实验的mAb生物素化至每抗体分子约有0.7、4.0和10个生物素。数据显示，较高价的mAb生物素化通常具有更低的结合效率。

假定每个mAb药物的10个生物素“消耗”或占据更多的链霉亲和素结合位点，则两个因素可能会降低分离效率：(1)可能形成mAb－链霉亲和素的大的聚合体，其可能不会随后与细胞结合，或(2)mAb可能在这样的聚合体中丢失，不能用于标记细胞。也不排除有其他的解释。对于0.7生物素缀合的mAb(第3行)，预期的细胞回收率较高，因为没有交联的可能性；另一方面，30％mAb因为没有生物素而不能被SAFF结合。这似乎可以解释了它较低的分离效率。第10行是第3行实验的重复，具有相同的结果。第10和11行表现出相同的分离效率，即使第11行的mAb水平较高。然而，第11、12和13行表明，在较高的mAb浓度时，当SAFF从5μg增加到10μg，然后在15μg时，分离效率提高到90％以上。并且在使用10和15μg SAFF的实验中，未收集的细胞已没有磁性。

从上述表III中，生物素－mAb在0.7、4.0和10时生物素缀合物的磁结合效率分别为83％，78％和64％。一个可能的解释是，在较高的生物素/mAb比率时，存在SAFF－mAb－SAFF交联或聚集的更多机会，其导致复合物消耗了mAb，从而限制了可用于靶向目的mAb量。仔细分析4:1生物素－mAb的结果，当SAFF的量从5μg降至4μg(第8列，第6、8行)时，分离效率从82％降至36％。此分离效率的下降可以通过将SLAMM增加到10分钟来补偿一些(第7行)。

表III的最后一行显示了鼠－山羊抗小鼠Fc－铁磁流体(G@mFcFF)共同分离系统的结果。结果显示，使用G@mFcFF的SLAMM产生优异的分离效果。还要注意，在无磁性混合(第10列)，已有80％的靶细胞被分离。

除了实例1所示的实验之外，也在红细胞(RBC)的存在时进行了若干实验以测定血细胞比容水平对分离的影响，从而确定SLAMM方法是否适合于从全血或稀释的全血中分离靶细胞。对于高达15％的血细胞比容，SLAMM孵育5分钟的分离结果比没有RBC低约5－7％。实验中mAb的水平等同与表I中的较低水平，即0.3μg/ml细胞，而且也可将磁力分离的时间延长到15分钟以改进效果。这些观察结果表明，间接方法时各种成分同时混合(mAb、通用标记载体和细胞混合物)同时孵育可以在RBC存在时进行，而且mAb、通用标记载体和磁分离过程诸因素的浓度和条件均可进一步优化(如适当增加试剂浓度)以获得令人满意的产率。

例2

用SLAMM-5方法从人血白细胞层分离CD3⁺细胞

用5mL健康年轻成年男性的外周血液制备白细胞层，并重新悬浮至1mL。从裂解的试样中确定回收了2.5×10⁷外周血细胞(PBMC)，红细胞压积为25％。然后我们将该样品分成0.5mL等分，每份加入0.15μg生物素化抗CD3(0.7生物素/Ig)和22μg SAFF，立即涡旋混合，然后用按照SLAMM方法孵育5分钟。将混合物稀释5倍，并在四极中分离10分钟。之后除去上清液，将磁回收的细胞重新悬浮于新鲜的缓冲液中以进行下一轮分离。重复该分离步骤，目视检查表明回收的细胞似乎没有RBC。用PE偶合的抗CD3抗体(Tonbo 15Biosciences，SanDiego，CA)来标记回收的细胞，洗除未结合的试剂，用流式细胞仪(Amnis Flowsight，Seattle，W A)进行分析。流式细胞分析确定回收的CD3⁺细胞的平均纯度为97.4％，回收率为19％。应考虑PBMC预测约占30％，此回收率侧相当于在白细胞中63％的产率。鉴于大约30％的抗－CD3mAb是未标记的，这样的产率已是相当合理。可以预计如果有较高水平的生物素缀合(如2－3/Ig)将会提高产量，并且试剂的进一步优化也将有助于更大的回收率。该示例说明了本文所述的SLAMM方法的潜力及其固有的优点。值得注意的是整个过程－从制备血液白细胞层到最终回收CD3⁺细胞仅用不到40分钟。而且如果向最初的血液样品中添加密度增强剂，会使白细胞层中RBC的污染降低，因此可以减少的回收细胞的洗涤过程，从而进一步缩短从RBC中提取CD3⁺靶细胞需要的时间。

非常重要需要注意的是，这里描述的结果不仅仅是样品接受磁分离操作的缘故，其中贯穿了基本机制。表III为此作了最好的解释，其展示了用间接细胞分离法时各组分基本上同时混合孵育而没有使用磁力/涡旋的实验结果(参见最后一列)。这些结果是在磁分离前仅用5分钟的总孵育时间。生物素－链霉亲和素系统分离效率约在15-66％范围，mAb-G@mFcFF方法效率为80％。这些结果令人惊奇，因为单独的mAb孵育通常需要15－20分钟，并且以这些实验中使用的mAb的浓度(0.27－0.55μg/ml)可能应需要更长时间。

这些结果表明有可能存在促进这些反应的基本机制。我们探讨的一个方向是本着这个问题：磁性纳米颗粒的存在会以谋种方式增加成分在反应中的结合吗？这个探讨是由显微镜观察到的磁性纳米颗粒的一些奇怪现象提示的。例如，我们制备的稳定铁磁流体聚集体几乎不能用光学显微镜观察到，而我们观察到了这些聚集体的协调振荡运动。这不禁要问：是否仅是存在铁磁流体会导致分子水平的混合。为了检查这种情况发生的可能性，我们进行了实验以研究mAb与T细胞的结合动力学是否受铁磁流体的影响。将T细胞与抗CD3混合，并加入用非特异性蛋白质包被的铁磁流体。样品被分为两份，一份进行上述的40秒的磁场/涡旋混合，另一份则留在实验台上远离任何磁梯度。对照组是只有mAb和细胞混合物而没有磁性纳米颗粒的样品，也放置于实验台上没有任何磁梯度。间隔(0,4,6,8,10,15和20分钟)取出每个混合物的样品，用缓冲液稀释5倍，离心除去未结合的mAb，并用荧光标记的山羊抗小鼠抗体处理。通过定量荧光可确定相应的结合动力学。各样品结果完全相同，表明在反应中单独存在铁磁流体不会改变mAb与T细胞的结合。

我们表明这种同时孵化方案是有益的有多方面的原因。在mAb－G@mFcFF系统中，当mAb与细胞结合时，Fc区域以空间有利的方式呈现在细胞表面。接近该结合的mAb的G@mFcFF纳米颗粒与Fc区域相碰的机会为1/2，而与溶液中的游离的mAb碰撞机会是1/3。此外，结合的mAb被固定到靶细胞上可能旋转较少，有助于结合动力学的增强，因此，细胞结合的mAb可能有利于该特定标记物的结合。先与G@mFcFF结合的mAb也具有结合细胞抗原的立体化学优势，因为mAb的抗原结合区被设定在远离纳米颗粒位置。当SAFF与生物素－mAb上的生物素结合时，使mAb保持有利的取向，即Fab部分伸出而远离纳米颗粒，这将促进有效的相互作用。可能还有其他机制在起作用，我们仅提供这些可能是很多中的几个。

SLAMM方法提供了几个重要的优点，包括节省时间和减少试剂使用。因此，通过去除制备目标特异性标记载体试剂所需的努力以及SLAMM在标记和分离特定目标方面提供的效率，该方法具有超越阳性选择的广泛应用。SLAMM会是阴性选择的理想方法，在这种情况下，除了所需的细胞，所有其它细胞在分离期间被结合并去除。这种方法常用于需要分离幼稚细胞时，即未被分离过程改变或活化的细胞。例如，如果需要幼稚CD4⁺辅助细胞群体，PBMC可与针对所有非幼稚CD4⁺细胞的混合mAbs孵育，随后用通用标记磁性纳米颗粒靶向这些mAbs以进行磁性分离。这种混合mAbs在本领域皆知，通常包括能与CD8、CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD66b、CD123、TCRγ/δ、CD235a和CD45RO结合的mAb组成。在需要幼稚CD8⁺细胞的时，将PBMC与含有针对CD4、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ和CD235a的mAb混合物一起孵育，然后将其通过适当的通用标记磁性纳米颗粒进行分离。同样，SLAMM方法可应用于从外周血细胞和骨髓细胞分离其它各种细胞群体和亚群包括CD34⁺干细胞，CD19⁺B细胞，CD14⁺单核细胞，CD15⁺粒细胞和CD56⁺自然杀伤细胞。

当将SLAMM应用到上述系统中以靶向去除许多细胞类型时，有几种策略可被采纳。合适的生物素化的mAb的混合物(3－5生物素/Ig)可与链霉亲和素铁磁流体同时加入到细胞悬液中，或者也可以将mAb在加入链霉亲和素铁磁流体之后加入混合物，因为后者与细胞不会发生反应。同样也可以使用非生物素化系统，例如铁磁流体含有抗小鼠Fc mAb，其靶向Fc区域上两个或四个决定簇。如果保证铁磁流体有足够的容量，并且mAb－铁磁流体聚集体的形成最小，以这种方式则原位形成的铁磁流体纳米粒子将与使用的特定mAbs有同样的多特异性。或者，可以将每种mAb和适当量的铁磁流体依次配制到混合物中，然后进行磁性操作以促进缀合物的形成，直到所有的mAb加入。此外，SLAMM方法可以应用于细胞浓度变化很大的反应，从5个靶细胞/ml到高达1×10⁸个靶细胞/ml。因此，SLAMM方法适用于富集少见的细胞群体，包括CD34⁺干细胞和血循环中的上皮性肿瘤细胞。血循环肿瘤细胞的分离可用针对来自实体瘤细胞而不是造血起源细胞表达的标志的mAb来实现，比如上皮细胞粘附分子(EpCAM或CD326)、乳腺球蛋白(mammaglobin)、细胞表面波形蛋白(Cell－surfacevimentin，CSV)和其他细胞表面标志(Sieuwerts等，J Natl.Cancer Inst.(2009),101(1):61-66)。

如前所述，在快速混合的前提下，SLAMM方法似乎不会被关键试剂(即细胞样品，mAb和通用标记载体)加入的顺序而改变。另一方面，很显然在某些情况下，在反应开始之前先将细胞样品和通用标记载体充分混合可能更有利。通用标记载体与细胞的非特异性结合(例如与Fc受体间的相互作用)很容易通过熟知的方法以避免，包括使用合适的细胞缓冲液或预先用血浆和FcR－特异性抗原与细胞共同培养，这样混合好的样品可随时加入合适的mAb。或者也可以将样品等分，与不同的mAb混合，从而使同一细胞样品可用于分离不同的特异性细胞。在任一种情况下，样品将遵循SLAMM方法处理并置于磁梯度分离模块进行分离回收，以及随后的洗涤步骤，并根据需要来获取阳性或阴性标记的细胞群体。

如表III所示，在相对高的靶细胞浓度下进行SLAMM具有利用物体作用规律和碰撞概率的优点。在生物素－链霉亲和素系统中，每个靶向mAb与1－4个生物素分子缀合。如前所述，理想的mAb－生物素缀合物应该是将生物素置于Fab'片段中与抗原结合位点相对的分子末端。有各种方法来做到这点，其中如上所述，将生物素置于Fab'连接臂的铰链巯基上。

通用标记载体的第二抗体，例如针对靶向mAb Fc区的抗体，可有多种选择。高亲和力的山羊、绵羊、驴等抗Fc的抗体很容易获得，还有针对Fc决定簇和同种亚型特异的大鼠mAb。使用亚型特异性通用标记载体的优点是分离的细胞随后还可用不同亚型特异性的抗体以进行标记鉴定。再次明确基于前面所述原理，理想的通用标记载体将包含上述抗体的Fab片段，其与标记颗粒连接的方式应使此Fab片段的抗原结合位点远离颗粒。

从这个实例可以看出，因为孵化时间大大降低，SLAMM的快速性可以提高现有系统的效率。此外，经济的使用mAb使SLAMM方法显示了成本和性能方面的显著优势。SLAMM消除了其他方案中不必要的步骤，比如在加入通用标记载体之前洗涤细胞以去除上清液中的mAb，因此，SLAMM系统为细胞分离提供了最有效的使用mAb的方法。

例3

使用SLAMM分离临床规模CD3⁺细胞的预测实例

在过去几年中逐渐清楚免疫系统的细胞可被调节和/或改装以攻击和破坏肿瘤细胞(参见Lizee等，Annu Rev Med 2013,64:71－90)。基于最近这种应用对几种血液肿瘤治疗的成功，以及将这种方法扩展到实体肿瘤治疗的潜力，需要有快速和相对便宜的系统可用于大规模(临床规模)的细胞分离。经济地使用mAb和磁性试剂使SLAMM成为这种细胞分离的理想方法。

SLAMM可以很直接的用于任何需要设计T细胞(CD3⁺细胞)的地方。以约1.0L含10¹⁰细胞的血浆分离产物开始，第一步是去除血小板(已知其会干扰免疫磁性分离)，可以通过以适当的离心力进行离心而完成，或采用熟知的膜分离技术(如离心膜过滤：FreseniusKabi AG and Fresenius Kabi USA，Lake Zurich,IL USA)。之后将细胞重新悬浮于80ml的适当缓冲液中，加入FcR封闭剂(此FcR封闭剂应不与之后的通用标记载体反应)、DNA酶(DNAse)、蛋白质如人血清白蛋白(HSA)，以及其它已知的可降低非特异性结合的适当试剂。向该细胞悬浮液中加入通用标记载体铁磁液(或合适的磁性材料)。磁性颗粒表面应结合有抗Fc的Fab片段，此Fab片段与磁性颗粒连接部位应远离其与Fc结合的部位。理想的Fab或Fab'片段应只与Fc决定簇结合，并且具有同种亚型特异性。而且Fab或Fab'片段可以来自各类生物，也可以是mAb，如大鼠抗－小鼠Fc。纳米颗粒－抗Fc mAb复合物的设计将使其不与FcR封闭试剂相互作用，以消除非特异性的纳米颗粒－细胞结合。将纳米颗粒－抗Fc mAb复合物以相对浓缩的形式加入到80ml的细胞中，例如5ml/4mg铁磁流体(根据表III所示的结果)，充分混合，然后加入30μg抗CD3mAb和一定体积的缓冲液使得细胞悬浮液的最终体积为100ml。这些组分和随后的SLAMM的混合可以在尺寸为约直径2.5cm和高19cm的圆柱形软塑料管中进行，可以能容纳100ml。这样的容器应是无菌并且与用于制备无血小板细胞悬液的无菌容器相匹配。软塑料圆管的优点是可以将其放置于磁梯度中，使磁流体沿一个方向移动以进行SLAMM过程，而且易于重新分配，即在磁极作用之后混合铁磁流体。再分配或混合可以仅通过适当移动置于磁装置中的试管来实现。这种方式使SLAMM方法可以用于相对较大体积的样本。显然，也可以采用各种其它的容器和铁磁分离手段，最重要的原则是保持内容物的无菌性。

鉴于本实例中SLAMM方法的批次性质，分离最好是分批进行，以便均一地对待每个细胞悬浮液。分离时经SLAMM处理的样品将流入分离室，其尺寸大约为15cm×30cm×0.7cm，细胞会被磁力吸附于15cm或30cm的表面。在流入分离室期间，样品将以1:3稀释，使得最终体积接近300mL，细胞浓度约3×10⁷细胞/ml，其中CD3⁺靶细胞约为1×10⁷细胞/ml－此条件可达到优异的细胞产量和纯度。当细胞进入分离室之后，将分离室与外部尺寸为23cm×35cm的磁性梯度板接触。现有的各种熟知的可吸附磁性颗粒的磁性梯度装置均适用于本发明。

该实例从10¹⁰细胞中，预期将分离出约3×10⁹CD3⁺细胞。如果细胞在分离室内以3×10⁷细胞/ml的浓度，体积为约300mL，则在深度为7mm的分离室里，1.0cm²的表面收集的体积为700μl，这意味着该体积中有近2.1×10⁷个细胞，其中大约30％预期是T细胞(6.3×10⁶个细胞)。基于理论计算和实验观察，单层磁标记细胞约为1.4×10⁶细胞/cm²，在这个例子中平均有大约4.5层细胞。根据夹带的非特异细胞的水平，其可通过在梯度场存在时填充和排空分离室来洗除，因为靶细胞会仍被磁力吸附在分离室表面上，细胞因此可能不需要进一步的纯化。从模型系统的初步实验可以看出，在缓冲液洗涤循环期间，弯液面的“擦洗”已可以达到足够的细胞纯度。或者，收集室可以从磁梯度中移开，重新细胞悬浮并再次分离。如果细胞在吸附面没有被包埋，并且需要最小的洗涤缓冲液以除去分离室内非靶细胞，该过程可以在不到25分钟内完成。假设去除血小板并将细胞重新配制到合适的起始条件可在15分钟内完成，则可以在不到1小时内分离T细胞，这比当前的竞争系统快得多。

这里所介绍的SLAMM程序其时间节省，成本节省，试剂节省和多功能性等特征均具有极大的研究和商业价值。细胞分离时节省了时间会改善细胞活力、保持细胞完整性以及达到更高的产量－一个重要的经济因素。试剂的节省也是相当可观的，因为这里mAb的使用量显著低于普通间接方法中的用量，而且也低于大多数用mAb－纳米粒子共轭物直接标记的试验用量－加之其耗时的缀合过程。例如，典型的mAb－铁磁流体结合物需要约10μg的铁磁流体和约3μg的mAb来制备试剂。从表III可以看出，这里介绍的SLAMM方法可以使用少于10倍的mAb。鉴于mAb的昂贵特点，这确实是一个重要的成本节省环节。

前面提到的另一个优势是，本文从本质上表明，间接分离方法(至少包括两步)可以原位转化为等效的直接法，并且完全避免了传统两步附育的需要，也没有洗除mAb的过程(Liberti美国专利号5,186,827)。此外，同时组合所有试剂(靶向mAb，通用标记载体和细胞混合物)是非常有利的，因为各结合对均处于立体和化学有利的取向中以促进有效的反应。基于这些发现，最好是在构建靶向试剂和通用标记载体时应考虑到立体－化学的特性而设计。在本文所述的关于山羊抗小鼠Fc通用标记铁磁流体的实施例中，mAb与细胞结合以形成具有非常有利取向的Fc区的结合靶。我们有理由相信可以制备出更有效的试剂。例如，在生物素－链霉亲和素系统中，如果用Fab'构建体代替完整的mAb，使该Fab'的铰链巯基连接于延伸的连接臂再于生物素偶合，这样Fab'结合细胞决定簇后所形成的结构取向将有利于其与链霉亲和素通用标记载体结合。在用抗Fc抗体与载体颗粒偶联时，非常希望通过各种常用的化学方法将Fab'(或含有合适的化学物质的Fab)经由铰链巯基偶联到颗粒上。以这种方式制备的通用标记载体颗粒，其抗Fc的结合位点都处在非常有利的方向和位置，使得该颗粒和已与细胞结合的mAb的碰撞产生高反应率。从这些原理可以看出，合成和构建试剂时如考虑其立体和化学因素会使反应中使用的所有结合对受益。

应当清楚的是，用于此基本上同时反应中用以标记细胞或其它物体的靶向成分和通用标记载体不应仅限于磁性纳米颗粒。有各种其他方法用某些分子来标记靶细胞，以增加或降低细胞的密度，加上荧光，或提供一些其它修饰。排除制备直接共轭物，本文所述的至少一些原理显然是有优势的，即使不使用磁混合增强反应。显然尽管如此，混合同时反应仍可以使用，并且由于其在空间和化学结构方面的有利性，动力学优点，节省时间和经济性等特点而有优势。

例4

使用同时加入mAb和通用标记载体以在体外刺激T细胞的预测实例

June等(美国专利号8,637,307)表明，携带抗CD3、或抗CD2以及CD28激活剂的改装细胞可以非常有效地诱导多克隆T细胞扩增。Sheffold和Assenmacher(美国2014/0087462A1)评述了'307专利发明的进展，当上述刺激剂附着在平面或球形表面时可引起多克隆T细胞增殖，其中后者可具有各种直径和表面特性。他们进一步表明，当抗CD3或CD28各自或同时被连接到按Molday方法(美国专利号4,452,773)制备的葡聚糖－铁纳米粒子上时，此颗粒则常用作T细胞增殖剂，不论是连接到单一的铁－葡聚糖颗粒，或者是带有相应抗体的微球混合物。刺激细胞更直接，经济和通用的手段将是使用本发明的方法，即将特异结合CD3和CD28的试剂以及适当的通用标记载体同时加入到T细胞中。以这种方式，可以使用抗CD3和CD28抗体以及任何其它相关的mAb的组合，从而导致必需的T细胞刺激在原位发生。

实现这一目的的一个方法是将T细胞样品与通用标记载体如铁磁流体混合，后者偶联了针对抗体Fc区决定簇的大鼠mAb，即可识别小鼠Fc区2－4个位点或足够低数量的决定簇的通用标记载体，这使铁磁流体－mAb的聚集被消除或最小化。显然，也可以选择使用适当的多克隆抗体，并且该方法也不局限于抗Fc或与抗体结合的通用标记载体(例如本文所用的链霉亲和素－生物素系统也很有效)。鉴于加入的通用标记载体和T细胞之间并无反应，紧接着它们的混合合之后，或之后的某个间隔，将加入适当比例的抗CD3和CD8的mAb使之与T细胞反应，并与通用标记载体铁磁流体反应，后者以复合物的形式将与T细胞反应。另一种方法是使用不同亚型的同种抗CD3和抗CD28抗体，将其分别与具有单个mAb同种亚型特异性的通用标记载体配对，从而有效地在原位产生两种不同的纳米颗粒，每一种只针对一种抗CD的抗体。基于Sheffold和Assenmacher报道，以此方法使用适当比例的mAbs将诱导T细胞活化。由于这些方法的简单性和通用性，以及试剂的GMP考虑(所有试剂可以过滤灭菌)，对于生产者和使用者都可以实现显著的成本降低，并且该示例还向用户提供了前所未有的自由度。

例5

用抗CD3和CD28mAb以及大鼠抗小鼠IgG1铁磁流体的SLAMM刺激CD3⁺细胞

用OptiPrep方法(Axis Shield，Dundee，Scotland)从人血液中分离PBMC。将全血与Optiprep混合(10ml血液/1.25ml Optiprep)，1,500rcf离心30分钟。收取PBMC层重悬浮为10⁷细胞/mL并移入T25培养瓶中。加入抗CD3和CD28的mAb，其为IgG1同种亚型(TonboBiosciences，San Diego，CA，每种抗体终浓度为0.1μg/ml)，随之加入含有大鼠抗小鼠IgG1的通用标记载体铁磁流体(终浓度为10μg/mL)。将一半样品置于磁梯度中经过的三个循环的磁力混合(30秒)和间隔中的搅拌，这有助于T细胞活化所需的磁性共轭体的形成；样品的另一半则没有磁性混合。为了确定T细胞含量，使用流式细胞术(Flow Sight，Millipore，Billerica，MA)检测PBMC中CD3标志物的存在。基于该分析，将细胞混合物稀释于含有IL-2(100IU/mL，Gibco，Gaithersburg，MD)的ImmunoCult XF T细胞扩增培养基(StemCell，Vancouver，British Columbia，Canada)至T细胞的终浓度为10⁶细胞/ml。同时根据产品说明，用ImmunoCult的人CD3/CD28T细胞激活剂(StemCell，Vancouver，British Columbia，Canada)以激活PBMC。

用抗CD25-PE mAb(Ancell，Bayport，MN)标记的流式细胞术测定，在第0天时人PBMC含有0.79％的CD25⁺细胞，第3天来自磁性混合样品的细胞75.4％是CD25⁺，并且扩增了3倍，第7天达到93.3％，扩增了5倍，这与ImmunoCult激活的样品数据相当。非磁性混合刺激的PBMC样品与磁性混合样品相比则呈现较低的活化和扩增速率。

尽管上面已经对本发明的某些优选实例进行了描述和具体的例证，但并不意味将本发明局限于这些实例。在不脱离如所附权利要求中阐述的本发明的范围和原则的情况下，可对其进行各种调整。

而且，在附带的权利要求中(以原始和修改的形式)使用“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”的过渡性术语定义了权利要求范围，例如有未被提及的附加要求元素或步骤，或被排除在的权利要求的范围之外。术语“包含”旨在包容性的或开放性，并不排除任何额外的未被叙述的元素、方法、步骤或材料。术语“由…组成”则排除权利要求中规定以外的元素、步骤或材料，并且在权利要求的成分中，与指定材料相随的杂质是常见的。术语“基本上由…组成”限制了权利要求范围于特定的、以及那些不影响权利要求所保护的发明的基本和新特征的要素、步骤或材料。支助的混合金属氧化物催化剂，其制备和使用方法可在其他实例中由任何过渡性术语“包括”，“基本上由…组成”和“由…组成”更具体地定义。

Claims (36)

1.一种形成生物共轭物的方法，所述方法包括：

(i)基本上同时在生物相容性培养基中组合(a)具有至少一种特征决定簇的靶生物，(b)至少一种靶向剂，每种靶向剂包含多个结合单元，每个结合单元至少有一个结合位点和一个识别位点，所述的靶向剂可有效地通过至少一个结合位点特异结合于靶生物的至少一个决定簇，以产生标记的靶向生物体，和(c)纳米颗粒标记载体，其具有至少一个结合部位可特异地结合于标记生物体的至少一个识别位点，从而形成生物缀合物，由于所述的纳米颗粒标记载体的物理性能使所形成的生物缀合物可以与培养基分离。所述的靶向剂每个结合单元具大约有1－10个识别位点，每个纳米颗粒标记载体有约1,000－8,000个结合部位，所述纳米颗粒标记载体上结合部位的数目比培养基中靶向剂所有结合单位上的识别位点的平均总数目至少大两倍；和

(ii)使包含所述靶生物，靶向剂和纳米颗粒标记载体的培养基保持可有效促进生物缀合物形成的温度和时间的温育条件，所述温度在0－44℃范围内，所述时间在3－30分钟。

2.根据权利要求1的方法，其中所述靶生物选自真核细胞、原核细胞、细胞成分、病毒和蛋白质。

3.根据权利要求1的方法，其中所述靶向剂包含至少一种可特异结合于所述靶生物特征决定簇的抗体。

4.根据权利要求3的方法，其中所述抗体是单克隆抗体(mAb)。

5.根据权利要求3的方法，其中所述抗体是特异性结合对的成员，所述纳米颗粒标记载体是所述特异性结合对的另一个成员，所述生物缀合物的形成源于此特异性结合对成员之间的结合。

6.根据权利要求1的方法，其中混合培养在孵育条件下一步完成。

7.根据要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒标记载体包括磁响应材料。

8.根据权利要求7所述的方法，还包括将所述培养物置于磁场梯度以引起所述生物缀合物的聚集。

9.根据权利要求8所述的方法，还包括终止所述培养物暴露于所述磁场梯度，然后将所述聚集的生物共轭物重新分散在培养基中。

10.根据权利要求1的方法，其中所述标记载体包含荧光物质。

11.根据要求1所述的方法，其中所述的培养基有预定密度，并且所述标记载体包括密度不同于所述预定密度的材料。

12.根据权利要求11，其中所述的标载体的密度高于所述的预定密度。

13.根据权利要求11，其中所述的标记载体的密度低于所述的预定密度。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶生物包含真核细胞，在所述培养基中的浓度为5至1×10⁸细胞/ml。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶生物选自外周血细胞和骨髓细胞群和亚群，有CD34⁺干细胞、CD3⁺T细胞、CD4⁺T辅助细胞、CD8⁺T细胞毒细胞、CD19⁺B细胞、CD14⁺单核细胞、CD15⁺粒细胞、CD56⁺自然杀伤细胞以及循环肿瘤细胞。

16.以权利要求15所述的方法，其中所述靶生物选自CD34⁺干细胞、CD3⁺T细胞、CD4⁺T辅助细胞、CD8⁺T杀伤细胞、CD56⁺自然杀伤细胞和循环肿瘤细胞。

17.根据权利要求1的方法，其中所述靶向剂选自针对CD34、CD3、CD4、CD8、CD19、CD14、CD15、CD20、CD22、CD24、CD28、CD56、EPCAM、波形蛋白和乳腺球蛋白的组。

18.根据权利要求17的方法，其中所述靶向剂选自靶向CD34、CD3、CD4、CD8和CD56的组。

19.根据权利要求1的方法，其中所述纳米颗粒标记载体的结合区域选自亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、抗小鼠Fc、抗小鼠IgG1、蛋白A、蛋白G、抗－藻红蛋白(PE)和抗－异硫氰酸荧光素(FITC)。

20.根据权利要求19，其中所述纳米颗粒标记载体的所述结合区域选自亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、抗小鼠IgG1。

21.根据权利要求1的方法，其中所述生物缀合物由CD3⁺细胞(T细胞)、包含抗CD3⁺mAb的靶向剂、和标记载体组成，标记载体包含与抗-Fc抗体结合的纳米颗粒。

22.根据权利要求21，还包括将所述物质暴露于磁场梯度以引起所述生物共轭物的聚集。

23.根据权利要求22所述，还包括终止所述物质暴露于所述磁场梯度，然后将所述聚集的生物共轭物分散在所述培养基中。

24.根据权利要求1的方法，存在于所述培养基中的每种靶向剂其上存在3－5个识别位点。

25.根据权利要求1的方法，其分批进行。

26.一种聚集两个或更多个细胞表面受体以实现所述细胞活化的方法：通过基本上同时组合的方法由所述受体、两种或更多种mAbs以及通用标记纳米颗粒之间相结合以形成生物缀合物。

27.一种形成激活T细胞生物缀合物的方法，所述方法包括：

(i)在生物相容性培养基，将CD3⁺细胞(T细胞)，抗CD3抗体，抗CD28抗体和结合了抗-Fc抗体的磁性纳米颗粒基本上同时混合，抗CD3和CD28抗体在所述培养基中的浓度约为0.05－1.5μg/ml范围，所述培养基中结合了抗－Fc抗体的磁性纳米颗粒的浓度应等于或大于抗CD3抗体的浓度；

(ii)使包含所述CD3⁺细胞，抗CD3抗体，抗CD28抗体和结合了Fc抗体的磁性纳米颗粒的培养物在能效促进刺激T细胞生物缀合物形成的温度和时间条件下孵育，所述温度在10－42℃，时间在5－30分钟范围内；

(iii)将所述培养基放置于磁场梯度中以形成刺激T细胞生物缀合物的聚合物；

(iv)终止上述培养物在所述磁场梯度中的暴露，然后重新悬附所述被刺激的T细胞生物共轭聚集体以使其分散在所述培养基中。

28.一种从混合细胞群体分离感兴趣的细胞亚群的方法，所述细胞亚群应有至少一种特征确定簇，所述方法包括：

(i)基本上同时在生物相容性培养基中组合混合细胞群体，至少一种靶向剂，每种靶向剂包含多个结合单元，每个结合单元至少有一个结合位点和一个识别位点，所述的靶向剂可有效地通过至少一个结合位点特异性结合于细胞亚群的至少一个决定簇，从而产生了被标记的细胞，并有纳米颗粒标记载体，其具有至少一个结合部位可特异地结合于标记生物体的至少一个识别位点，从而形成包含所述细胞亚群的生物缀合物，所述组合在非磁性容器中进行，所述培养基与容器壁接触，所述的靶向剂每个结合单元具大约有1－10个识别位点，每个纳米颗粒标记物有约1,000－8,000个结合部位，所述纳米颗粒标记物上结合部位的数目比培养基中靶向剂所有结合单位上的识别位点的平均总数目至少大两倍；和

(ii)使包含所述混合细胞群，靶向剂和通用标记载体的培养基处于能有效促进所述生物缀合物形成的温度和时间的孵育条件，所述温度约在0－37℃的范围内，所述时间在3－30分钟；

(iii)将包含形成的生物共轭体的容器定位在开放式高梯度磁场发生器附近，可通过操作以将所述形成的生物共轭物吸附到所述容器表面并将所述生物缀合物固定于其上；

(iv)除去固定的生物共轭物以外的容器内容物；

(v)回收形成的生物缀合物，其包含所述感兴趣的细胞亚群。

29.根据权利要求28所述的方法，还包括在所述形成固定的生物共轭物步骤之后和在所述的回收步骤之前，用洗涤溶液洗涤固定的生物共轭物以从其中洗除参入的非磁性物质。

30.根据权利要求29所述，还包括在所述洗涤除去步骤之后并且在所述回收步骤之前，用生物相容培养基代替所述洗涤溶液，然后从所述容器壁表面释放所述固定化的生物缀合物，释放的生物缀合物将分散在置换的培养基中。

31.根据权利要求30所述的方法，在回收步骤之前重复所述洗涤，更新液体和释放步骤多次。

32.根据权利要求31所述的方法，回收步骤包括用置于容器外部的高梯度磁场的影响将形成的生物共轭物固定在容器壁表面。

33.根据权利要求28所述，其中所述细胞亚群选自外周血和骨髓的细胞群体和细胞亚群，有CD34⁺干细胞、CD3⁺T细胞、CD4⁺T辅助细胞、CD8⁺T细胞毒细胞、CD19⁺B细胞、CD14⁺单核细胞、CD15⁺粒细胞、CD56⁺自然杀伤细胞以及循环肿瘤细胞。

34.根据权利要求28的方法，其中所述靶向剂选自针对CD34、CD3、CD4、CD8、CD19、CD14、CD15、CD20、CD22、CD24、CD28、CD56、EPCAM、波形蛋白和乳腺球蛋白的组。

35.根据权利要求28的方法，其中所述纳米颗粒标记载体的所述结合区域选自亲和素、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、抗小鼠IgG1、蛋白A、蛋白G，抗－PE和抗－FITC。

36.根据权利要求28的方法，其中所述细胞群是CD3⁺T细胞，所述靶向剂是抗CD3抗体，所述纳米颗粒标记载体的结合部分是抗－Fc抗体。