CN107525918A - 一种苏丹红ⅰ的化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种苏丹红ⅰ的化学发光检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107525918A CN107525918A CN201710726766.1A CN201710726766A CN107525918A CN 107525918 A CN107525918 A CN 107525918A CN 201710726766 A CN201710726766 A CN 201710726766A CN 107525918 A CN107525918 A CN 107525918A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sudan red
- detection kit
- chemiluminescence
- red
- chemiluminescence detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- JBTHDAVBDKKSRW-UHFFFAOYSA-N chembl1552233 Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1N=NC1=C(O)C=CC2=CC=CC=C12 JBTHDAVBDKKSRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 66
- 229940073450 sudan red Drugs 0.000 title claims description 62
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 title claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 30
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 22
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 11
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 11
- AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonyl-2,6-dimethylphenoxy]carbonylacridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C=1C(C)=C(OC(=O)C=2C3=CC=CC=C3[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C3C=CC=CC3=2)C(C)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 9
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 Pyridine ester Chemical class 0.000 claims description 4
- KQFCNGKUXYNDPF-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutyl]-(4-methylphenyl)sulfonylcarbamoyl]acridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(=O)C=1C2=CC=CC=C2[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C2C=CC=CC2=1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KQFCNGKUXYNDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Substances C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- FHNINJWBTRXEBC-UHFFFAOYSA-N Sudan III Chemical compound OC1=CC=C2C=CC=CC2=C1N=NC(C=C1)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 FHNINJWBTRXEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 description 2
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 description 2
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 2
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 2
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 2
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 2
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 2
- 235000012730 carminic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N diazene Chemical compound N=N RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000071 diazene Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 2
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- JBTHDAVBDKKSRW-FMQUCBEESA-N Sudan II Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1\N=N\C1=C(O)C=CC2=CC=CC=C12 JBTHDAVBDKKSRW-FMQUCBEESA-N 0.000 description 1
- RCTGMCJBQGBLKT-UHFFFAOYSA-N Sudan IV Chemical compound CC1=CC=CC=C1N=NC(C=C1C)=CC=C1N=NC1=C(O)C=CC2=CC=CC=C12 RCTGMCJBQGBLKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000987 azo dye Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 239000010721 machine oil Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OCC(N)(CO)CO ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
- G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
- G01N2446/90—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids characterised by small molecule linker used to couple immunoreagents to magnetic particles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种苏丹红Ⅰ化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：吖啶酯标记物、偶联有抗原或抗体的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。本发明试剂盒操作简单方便，反应条件温和，发光值稳定，受外界条件影响少；与现有技术相比，具有灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及食品安全检测技术，具体涉及一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
苏丹红(Sudan)是一种人工合成的亲脂性偶氮类染料，主要包括苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种类型，常作为一种工业染料，主要用于机油、蜡和鞋油等的染色。食品加工过程中，苏丹红因其鲜亮的红色常被不法商家添加到食品中，以增加食品的色泽，增进人们的食欲，其中以苏丹红Ⅰ最为常见。苏丹红Ⅰ的化学成分中含有一种叫萘的化合物，该物质具有偶氮结构，由于这种化学结构的性质决定了它具有致癌性。研究表明，苏丹红染料会导致鼠类患癌，其代谢产物苯胺可直接作用于人体肝细胞，从而引起中毒性肝病，肝脏是苏丹红I产生致癌性的主要靶器官，此外还可引起膀胱、脾脏等脏器的肿瘤。长期摄入苯胺可造成人体的神经系统损害，国际癌症研究机构将其列为三类致癌物。1995年欧盟禁止将苏丹红作为食用色素在食品中添加，我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)也不允许在食品中添加苏丹红。因此，对苏丹红进行高效检测对于保障食品尤其乳制品的安全具有十分重要的意义。
目前用于检测苏丹红Ⅰ的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法、胶体金法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。其中，高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法需要大型精密仪器，繁琐耗时，检测费用高昂，检测样本有限，不适应大批量样本的检测；CN 101261271 A（2008.9）公开了一种苏丹红免疫层析试纸检测方法，该方法使用胶体金进行标记，而胶体金标记检测是以肉眼可见的颜色进行表征，误差较大，且操作繁琐，流程较多，更易出现误差，灵敏度低等缺点；CN 11844926 A（2006.10）公开了一种检测苏丹红的酶联免疫试剂盒及方法，该试剂盒采用酶联免疫方法进行检测，酶联免疫分析法存在灵敏度低、不易实现全自动化、检测时间长等的缺点；CN 202057602 U（2011.11）公开了一种苏丹红发光酶联免疫分析试剂盒，该试剂盒采用辣根过氧化物酶作为标记物，采用辣根过氧化物酶进行标记的缺点是酶促受环境影响大：如消毒液、酸碱度、离子都会对其造成影响，稳定性较弱，从而影响测定结果。
本发明以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。
吖啶取代物作为化学发光标记物用于免疫分析具有许多优越性，主要有：①化学反应简单、快速、无需催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光；②背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；③发光类型为闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；④吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，可提高系统整体灵敏度；⑤易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑥标记物稳定，不受环境氧化剂的影响，在2-8℃下可保存数月之久。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。
磁分离免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体而建立的一种新型免疫检测方法，该方法可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简便、灵敏度更高、反应快速、稳定、准确地定量测定苏丹红Ⅰ的磁微粒化学发光测定试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光试剂盒及其组成，包括以下组分：吖啶酯标记的抗原或抗体、偶联有抗原或抗体的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A以及化学发光激发液B。
所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等；其中，吖啶酯标记的抗原或抗体的比例为5-100:1。
所述的吖啶酯标记缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.05-0.50 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
所述的磁微粒可直接与苏丹红Ⅰ抗体或抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记苏丹红Ⅰ抗体或抗原。
所述的校准品由6个不同浓度的校准品溶液组成，校准品溶液具体由苏丹红Ⅰ抗原和校准品缓冲液组成。
所述的苏丹红Ⅰ6个不同校准品浓度梯度为0 ng/mL、0.05 ng/mL、0.5 ng/mL、5ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。
所述的校准品缓冲液是含有0.5-5.0% BSA 和0.1-0.5% PC300的Tris-HCl缓冲液。
所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2的质量分数为0.05-5%，HNO3浓度为0.05-2.5 mol/L；化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100浓度为0.05-2.0 mol/L，NaOH浓度为0.05-1.0 mol/L。
所述的清洗液是pH 7.0-9.0、浓度为5-50 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含浓度为0.05-0.50 mol/L的NaCl及0.01-0.25% Tween-20。
本发明检测试剂盒采用的原理是竞争法，具体是通过样本中的抗原与系统中的抗原竞争结合特异性抗体，利用吖啶酯反应产生的光子以检测产物浓度。
本发明具有以下优点：
1. 本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时采用吖啶酯标记技术进行检测以建立一种检测苏丹红Ⅰ的直接化学发光试剂盒。吖啶酯具有分子量小、背景发光低、信噪比高、发光效率高、标记稳定、可提高系统整体灵敏度的明显优势。
2. 本发明对样本前处理要求低，样本在提取、稀释等处理后即可用于检测，并可实现大批量自动化检测。
综上，本发明试剂盒操作简单方便，具有发光值稳定、灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
具体实施方式
本发明提供一种苏丹红Ⅰ的化学发光试剂盒及其组成，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种苏丹红Ⅰ的化学发光试剂盒，该试剂盒包括：吖啶酯标记物、偶联有抗原或抗体的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。
本发明试剂盒以磁分离化学发光技术作为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。
实施例1：试剂盒1的组建及其制备
1. 试剂盒1组建
组建一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
吖啶酯标记的苏丹红Ⅰ抗体；
羧基磁珠偶联的苏丹红Ⅰ抗原；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
苏丹红Ⅰ系列校准品溶液，浓度分别为：0 ng/mL、0.05 ng/mL、0.5 ng/mL、5 ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL；
清洗液，具体为pH 7.2、浓度为25 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含浓度为0.15 mol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
2. 偶联有苏丹红Ⅰ抗原的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL的0.1 mol/L MES（pH 5.0）缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200 μL的MES缓冲液（pH 5.0），涡旋。
（2）加入20 μL（20 μg）的苏丹红Ⅰ抗原，涡旋，于旋转反应器上，室温孵育30分钟。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺），涡旋，于旋转反应器上，室温孵育2小时。
（4）去上清，加入200 μL清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（5）用含1% BSA缓冲液进行封闭，反复封闭4次，每次10 min。将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的苏丹红Ⅰ抗体的制备
（1）将一定量的苏丹红Ⅰ抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换3次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 10.1、浓度为0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取一定量的吖啶酯，选用化学发光标记物为NSP-DMAE-NHS，溶于无水二甲基甲酰胺DMF中，配成浓度为6.5 mmol/L的吖啶酯溶液。
（3）将经透析后的苏丹红Ⅰ抗体置于一离心管中，加入一定体积的6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与抗体的摩尔比值为10:1，加入200 μL标记缓冲液，室温下反应1 h。加入10 g/L赖氨酸100 μL，继续反应15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液0.1 mol/L的PBS（pH 6.3）平衡并淋洗层析柱。分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装冰冻保存。
4. 苏丹红Ⅰ校准品的制备
用含有2% BSA 和0.25% PC300的Tris-NaCl缓冲液将苏丹红Ⅰ纯品配制成标示浓度为0ng/mL、0.05 ng/mL、0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的一系列校准品。
5. 化学发光激发剂的制备
（1） 化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2的质量分数为1.5%，HNO3浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100浓度为0.1 mol/L，NaOH浓度为0.35 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
实施例2：试剂盒2的组建及其制备
1. 试剂盒2的组建
组建一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
吖啶酯标记的苏丹红Ⅰ抗原；
羧基磁珠偶联苏丹红Ⅰ抗体；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
苏丹红Ⅰ系列校准品溶液，浓度分别为：0 ng/mL、0.05 ng/mL、0.5 ng/mL、5 ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL；
清洗液，具体为pH 7.2、浓度为25 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含浓度为0.15 mol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
2. 偶联有苏丹红Ⅰ抗体的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL的0.1 mol/L MES（pH 6.0）缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200 μL的MES（pH 6.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15 μL（15 μg）苏丹红Ⅰ抗体，涡旋，于旋转反应器上，室温孵育30分钟。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺），涡旋，于旋转反应器上，室温孵育2小时。
（4）去上清，加入200 μL清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（5）用含1% BSA缓冲液进行封闭，反复封闭4次，每次10 min。将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的苏丹红Ⅰ抗原的制备
（1）将一定量的苏丹红Ⅰ抗原置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析过夜，标记缓冲液是pH 9.8、浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取一定量的吖啶酯，选用化学发光标记物为NSP-DMAE-NHS，溶于无水二甲基甲酰胺DMF中，配成浓度为6.5 mmol/L的吖啶酯溶液。
（3）将经透析后的苏丹红Ⅰ抗原置于一离心管中，加入一定体积的6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与抗原的摩尔比值为20:1，加入200 μL标记缓冲液，室温下反应1 h。加入10 g/L赖氨酸100 μL继续反应15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ag与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液0.1 mol/L的PBS（pH 6.3）平衡并淋洗层析柱。分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装冰冻保存。
4. 苏丹红Ⅰ校准品的制备
用含有2% BSA和0.25% PC300的Tris-HCl缓冲液将苏丹红Ⅰ纯品配制成标示浓度为0ng/mL、0.05 ng/mL、0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的一系列校准品。
5. 化学发光激发剂的制备：
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2 的质量分数为1.5%，HNO3浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100浓度为0.1 mol/L，NaOH浓度为0.35 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
实施例3：实际样本中苏丹红Ⅰ的检测
本发明苏丹红Ⅰ定量检测试剂盒的使用操作程序如下：
1. 样本前处理
称取1g待测样品（如豆瓣酱、辣椒酱、辣椒粉等）于10 mL离心管中；加入1 mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液和5 mL乙腈作为提取液，涡旋振荡10 min； 4000 r/min离心10 min，取上清；加入2 mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液和2 mL正己烷作为提取液，涡旋振荡4 min；4000 r/min离心10 min，取上清；加入样品稀释液按1:20的体积比进行稀释；取稀释后的溶液进行检测。
（2）样品稀释液为pH 值为 7.2的磷酸缓冲液，其中含有10%甲醇，0.1% TritonX-100。
2. 试剂盒的检测
（1）将待测样本100 μL、偶联磁微粒混悬液150 μL、吖啶酯标记物150 μL，依次加入反应管中，振荡混匀，37℃孵育15 min。
（2）分离，清洗5次。
（3）将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（4）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中苏丹红Ⅰ的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例4：性能指标检测结果
（1）试剂盒的灵敏度
对零标准溶液进行20次重复测试，取零标准溶液测定的平均值加上3倍的标准偏差，即为本试剂盒的灵敏度。本试剂盒对苏丹红Ⅰ的灵敏度为0.05 ng/mL。
（2）试剂盒的特异性
与苏丹红Ⅰ结构或功能相似的竞争药物：靛蓝、胭脂红、苋菜红、柠檬黄。按试剂盒步骤操作，分别加入苏丹红Ⅰ、靛蓝、胭脂红、苋菜红、柠檬黄，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物的50%抑制浓度。交叉反应率即为抗体对苏丹红Ⅰ的IC50与抗体对苏丹红Ⅰ竞争物的IC50之比的百分数。结果显示：本试剂盒对苏丹红Ⅰ具有较高的特异性，对与苏丹红Ⅰ结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于，包括：吖啶酯标记的苏丹红Ⅰ抗体、偶联有苏丹红Ⅰ抗原的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。
2.根据权利要求1所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
3.根据权利要求1所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的吖啶酯标记的是苏丹红Ⅰ抗体。
4.根据权利要求1所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与苏丹红Ⅰ抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记苏丹红Ⅰ抗原。
5.根据权利要求1所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品是以含有0.5-5.0% BSA和0.1-0.5% PC300的Tris-HCl缓冲液为基质，加入苏丹红Ⅰ纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
6.根据权利要求1所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。
7.一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于，包括：吖啶酯标记的苏丹红Ⅰ抗原、偶联有苏丹红Ⅰ抗体的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。
8.根据权利要求7所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
9.根据权利要求7所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的吖啶酯标记的是苏丹红Ⅰ抗原。
10.根据权利要求7所述的一种苏丹红Ⅰ的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与苏丹红Ⅰ抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记苏丹红Ⅰ抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710726766.1A CN107525918A (zh) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | 一种苏丹红ⅰ的化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710726766.1A CN107525918A (zh) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | 一种苏丹红ⅰ的化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107525918A true CN107525918A (zh) | 2017-12-29 |
Family
ID=60681901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710726766.1A Pending CN107525918A (zh) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | 一种苏丹红ⅰ的化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107525918A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1844926A (zh) * | 2006-05-10 | 2006-10-11 | 北京望尔生物技术有限公司 | 检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法 |
| CN102115451A (zh) * | 2010-12-22 | 2011-07-06 | 南京大学 | 一种可直接标记的苏丹红i号及其制备方法和应用 |
| CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
| CN102928406A (zh) * | 2011-08-09 | 2013-02-13 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 检测苏丹红的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用 |
| CN104849469A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-19 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测ngal含量的试剂盒及其制备方法 |
| CN105759061A (zh) * | 2016-02-26 | 2016-07-13 | 厦门大学附属中山医院 | 基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒 |
-
2017
- 2017-08-23 CN CN201710726766.1A patent/CN107525918A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1844926A (zh) * | 2006-05-10 | 2006-10-11 | 北京望尔生物技术有限公司 | 检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法 |
| CN102115451A (zh) * | 2010-12-22 | 2011-07-06 | 南京大学 | 一种可直接标记的苏丹红i号及其制备方法和应用 |
| CN102928406A (zh) * | 2011-08-09 | 2013-02-13 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 检测苏丹红的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用 |
| CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
| CN104849469A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-19 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测ngal含量的试剂盒及其制备方法 |
| CN105759061A (zh) * | 2016-02-26 | 2016-07-13 | 厦门大学附属中山医院 | 基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Peltomaa et al. | Competitive upconversion-linked immunoassay using peptide mimetics for the detection of the mycotoxin zearalenone | |
| Xu et al. | Development of quantum dot-linked immunosorbent assay (QLISA) and ELISA for the detection of sunset yellow in foods and beverages | |
| CN103588872B (zh) | 一种维生素d合成抗原、其制备方法及应用 | |
| CN103018458B (zh) | 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒 | |
| WO2007121668A1 (fr) | Réactif de chimiluminescence directe pour séparation magnétique, et méthode de dosage immunologique utilisant le réactif | |
| CN110850091B (zh) | 用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针与成套试剂 | |
| CN107831314A (zh) | 一种n‑中端骨钙素化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN103792356A (zh) | 检测伏马毒素的elisa试剂盒的制备及检测方法 | |
| CN103091494B (zh) | 黄曲霉毒素m1的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法 | |
| CN105651992A (zh) | 三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒及其应用 | |
| CN108195785A (zh) | 一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法 | |
| CN109884021A (zh) | 一种量子点标记的thc包被抗原、其制备方法及利用其检测食品中大麻含量的方法 | |
| CN104101661B (zh) | 一种食品中苏丹红的快速检测方法 | |
| CN107843734A (zh) | 一种性激素结合球蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 | |
| CN107688016A (zh) | 一种黄曲霉毒素m1的化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN101643436A (zh) | 一种苏丹红半抗原与抗原及其制备方法与应用 | |
| CN101419230A (zh) | 一种邻苯二甲酸二异辛酯的酶联免疫检测方法 | |
| CN107478827A (zh) | 一种伏马毒素的化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN109298178A (zh) | 基于免疫磁珠的心脏肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）时间分辨荧光免疫分析试剂盒 | |
| CN107490574A (zh) | 一种三聚氰胺的化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN107478824A (zh) | 一种莱克多巴胺的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 | |
| CN107525918A (zh) | 一种苏丹红ⅰ的化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN105301244B (zh) | 检测酸性橙的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN107561269A (zh) | 一种沙丁胺醇的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 | |
| Helsingius et al. | Solid-phase immunoassay of digoxin by measuring time-resolved fluorescence. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20171229 |