CN107488146A - 异紫堇碱衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异紫堇碱的化学结构衍生物（见式），通过NICD的氨基与芳基异氰酸酯、羧酸、酰氯的羰基酰胺化缩合反应或NICD与芳香氨基通过固体光气的对称酰胺化缩合反应制备得到，该类化合物具有一定的体内外抗癌活性，可以作为癌症预防和治疗药物应用。式其中式化学结构中：
Description
技术领域
本发明涉及天然产物化合物的化学结构衍生，属于有机合成化学领域，具体的讲，本发明涉及一种异紫堇碱的化学结构衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
阿朴啡类生物碱分布于20多个科的100多种植物中，是重要的植物次生代谢产物，该类化合物大都具有显著的药理活性，如抗氧化、抗血小板凝聚、抗惊厥、抗痉挛、抗疟疾、抗原虫、抗脊髓灰质炎病毒、细胞毒性、抗帕金森病等。异紫堇碱（又名异紫堇定碱，英译名：异可利定，英文名：isocorydine）是一种典型的阿朴菲类生物碱，广泛分布于秃疮花（参见ZL201310107231.8）、紫金龙、地不容、延胡索、南天竹、白线薯、黄连、岩白菜等植物中。
研究表明异紫堇碱能够明显降低CD133+阳性或EpCAM标志的肿瘤干细胞的比例，并能显著降低CD133+细胞的成球和克隆形成能力，体内研究显示异紫堇碱可以降低CD133+的致瘤能力，异紫堇碱能够显著降低肝癌细胞株中的侧群细胞的比例，并呈剂量依赖性显著下调耐药蛋白ABCG2的表达，异种移植瘤模型证实异紫堇碱在体内能选择性的减少侧群细胞诱导的肿瘤的体积和重量。联合用药表明异紫堇碱可以增强肝癌细胞株对于多柔比星的药物敏感性，起到耐药逆转作用。研究表明，异紫堇碱具有靶向肝癌侧群细胞或肝癌干细胞活性并具有耐药逆转活性，是一种很有潜力的治疗肝癌的化学治疗药物（Sun H F, HouH L, Lu P, et al. Isocorydine Inhibits Cell Proliferation in HepatocellularCarcinoma Cell Lines by Inducing G2/M Cell Cycle Arrest and Apoptosis. PLoSONE, 2012, 7(5): e36808.；Lu P, Sun H F, Zhang L X, et al. Isocorydine Targetsthe Drug-Resistant Cellular Side Population through PDCD4-Related Apoptosisin Hepatocellular Carcinoma. Mol Med, 2012, 18(7): 1136-1146.）。但异紫堇碱对于各种肝癌细胞的肿瘤生长抑制活性有限，IC50值均大于200 μM。因此，专利申请人对异紫堇碱进行化学结构衍生和抗癌活性筛选研究得到的8-氨基-异紫堇碱（本专利申请中命名为NICD，参见ZL 201210340250.0），抗癌活性大幅度提高，研究表明NICD能够选择性作用于肿瘤细胞的IGF2BP3，GADD45A等关键靶标以及CD133+为标记的肿瘤干细胞，同时可以下调耐药药泵蛋白ABCG2、ABCB1的表达，具有多药耐药逆转和索那菲尼的协同增效作用，有抗肝癌新药开发前景。专利申请人首次通过NICD的靶向干预，建立了肿瘤多药耐药、肿瘤干细胞和肿瘤转移侵袭三者之间的相互关系，使一种药物解决三个肝癌治疗中的关键核心问题成为可能（Lijuan Chen, Hua Tian, Meng Li, Chao Ge, et al. Derivate isocorydineinhibits cell proliferation in hepatocellular carcinoma cell lines byinducing G2/M cell cycle arrest and apoptosis, Tumour Biol, 2016, 37: 5951-5961.；Meng Li, Lixing Zhang, Chao Ge, et al, An isocorydine derivative (d-ICD) inhibits drug resistance by downregulating IGF2BP3 expression inhepatocellular carcinoma. Oncotarget, 2015, 6(28): 25149-25160.）。但鉴于NICD的化学结构中客观存在对氨基酚化学结构片段，造成NICD在水溶液中不能长期存放，容易氧化降解，稳定性存在缺陷，另外与现代靶向抗癌药物相比其抗癌活性还有进一步优化的可能。
索那菲尼（Sorafenib，结构式见图 1）是目前唯一成功上市的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗标准疗法无效或不能耐受的晚期肝癌，是晚期肝癌治疗的金标准。索那菲尼虽然可以有效延长HCC患者的整体生存时间（2个月），但是其服用后所产生的药物毒副作用，耐药性等会严重影响到患者的生活质量和治疗效果，另外其高昂的费用也是大多数患者所无法承担的。化合物35（其结构式见图 1）可作为络氨酸激酶受体蛋白c-KIT激酶的II型抑制剂，可以有效抑制c-KIT激酶和c-KIT的T670I突变体，对GISTs癌细胞系GIST-T1和GIST-5R显示出强的抗增殖作用（Binhua Li, Aoli Wang, Juan Liu, et al. Discoveryof N-((1-(4-(3-(3-((6,7- Dimethoxyquinolin-3-yl)oxy)phenyl)ureido)-2-(trifluoromethyl)phenyl)piperidin-4-yl)methyl)propionamide (CHMFL-KIT- 8140)as a Highly Potent Type II Inhibitor Capable of Inhibiting the T670I“Gatekeeper” Mutant of cKIT Kinase. J Med Chem, 2016, 59(18): 8456-8472.）。奥拉帕尼（Olaparib，结构式见图1）是一种选择性的PARP1/2抑制剂，用于治疗BRCA突变的肿瘤，比如卵巢癌、胸腺癌、前列腺癌，此外，奥拉帕尼抑制ATM缺陷的肿瘤细胞具有选择性，说明奥拉帕尼可作为治疗ATM突变的淋巴肿瘤的潜在药物。
图 1 化合物结构式
专利申请人借鉴现代药物设计理念和计算机辅助药物设计，采用分子对接模拟优化发现在异紫堇碱的C-8位引入氨基后，继续在8位氨基上进行进一步的化学结构优化，参照索那菲尼、化合物35以及奥拉帕尼的药效团模型，设计具有抗癌活性的系列化合物，可以显著提高异紫堇碱类化学结构衍生物的抗癌活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异紫堇碱的化学结构衍生物（见式），该异紫堇碱化学结构衍生物的显著特征在于其结构母核的C-8位被含氮的化学基团取代产生。
式
其中：
。
本发明提供的异紫堇碱衍生物（式Ⅰ）的合成制备方法，通过以下方法合成：
制备方法一、NICD与芳基不同取代的异氰酸酯发生缩合反应形成脲基官能团而制备得到：将异氰酸酯加入到NICD的有机溶剂溶液中，搅拌，发生缩合反应，反应完全后将反应液加入冰水中，用碱水调节溶液偏碱性，二氯甲烷萃取，回收溶剂，产物纯化得到目标化合物。
制备方法二、NICD与羧酸或酰氯发生缩合反应形成酰胺官能团而制备得到：将羧酸或酰氯中的一种加入到NICD的有机溶剂溶液中，加入缩合催化剂，搅拌发生缩合反应，反应完全后，二氯甲烷萃取，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物。
制备方法三、步骤A：NICD与芳香胺在有机溶剂中通过固体光气或光气，进行共聚合反应形成脲基官能团而制备得到：将芳基胺，固体光气和缩合催化剂加入到NICD的有机溶剂溶液中，搅拌进行缩合反应。反应完全后，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物。
步骤B：将制备方法三步骤A中的反应产物溶解在有机溶剂，加入碱水或质子酸，搅拌反应，进行保护集团的的水解反应，反应完全后，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物。
步骤C：将酰氯加入到制备方法三步骤B的反应产物的有机溶剂溶液中，搅拌反应形成氨基酰化保护，反应完全后，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物。
本发明的另一个目的在于提供异紫堇碱衍生物及其药学上可接受的盐类的应用，尤其作为抗癌药物的应用。
本发明中涉及所合成有机化合物的纯化方法指本领域技术人员所熟悉的柱色谱纯化，液液萃取纯化或重结晶等常规有机物纯化方法中的一种或几种。
本发明制备方法一中的异氰酸酯优选4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯，2,4-二氯苯异氰酸酯，4-甲基苯异氰酸酯，4-甲基硫代苯异氰酸酯，2-氯苯异氰酸酯，2-甲基苯异氰酸酯，4-三氟甲基苯异氰酸酯，4-氟苯异氰酸酯中的一种。
本发明制备方法二中羧酸或酰氯优选4-氯-3-三氟甲基苯甲酸，4-氯-3-三氟甲基苯甲酰氯，反式肉桂酸，反式肉桂酰氯，(2E)-4-二甲基氨基-2-丁烯酸，(2E)-4-二甲基氨基-2-丁烯酰氯，烟酸，烟酰氯，5-[(3,4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酸，4-(4-甲基-1-哌嗪基甲基)-苯甲酸中的一种。
本发明制备方法三步骤A中的缩合催化剂优选三乙胺，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或N,N-二异丙基乙胺(DIPEA) 中的一种。
本发明中采用化学结构衍生方法合成的异紫堇碱衍生物的化学结构均通过HR-ESI-MS，NMR等多种谱学手段证明为目标化合物。
本发明中部分异紫堇碱衍生物通过体内外抗癌活性研究证明具有较好的抗癌活性，可以作为肿瘤的化学预防和治疗药物的应用。
本发明的优点在于：
通过异紫堇碱的化学结构改造，较大幅度的提高了该类化合物的体内外抗癌活性；同时改善了该类化合物的脂水分配系数，提高该类化合物的成药性；有效保护对氨基苯酚结构片段的化学不稳定性，有效改善该类化合物的体内药代动力学行为，有利于增强该类化合物的体内药理活性。
通过定向设计合成的异紫堇碱衍生物具有明确的靶向性，尤其对于Wnt/β-catenin，Ki-67，C-Myc以及Vimentin等抗癌药物作用靶点。
化合物COM33对于荷鼠H22肝癌的昆明种小白鼠的体内肿瘤抑制率达到73.8%，并且对小鼠的体重没有显著影响，说明通过异紫堇碱C-8位的化学结构修饰，可以显著提高该类化合物的体内抗癌活性。
通过本发明的结构改造得到一系列异紫堇碱的类似物，丰富了阿朴菲类生物碱的结构库，为该类化合物的药物筛选提供大量的先导化合物。
附图说明
图1 异紫堇碱主要衍生物化学结构和临床一线抗肝癌药物索那菲尼化学结构。
图2 异紫堇碱衍生物对肝癌细胞HepG2细胞的生长抑制作用。
图3 异紫堇碱衍生物对宫颈癌细胞Hela细胞的生长抑制作用。
图4 异紫堇碱衍生物对胃癌细胞MGC-803细胞的生长抑制作用。
图5 FICD对6种肿瘤细胞的生长抑制作用（其中FICD的浓度分别为：0，5，10，20，40μg/mL，六株不同的细胞分别为：U251、Hela、MGC-803、MAD-MB-231、SMMC-7721、HepG2）。
图6 FICD对于HepG2的生长抑制作用曲线和索那菲尼的协同增效作用。（A、FICD对于HepG2的生长具有剂量和时间依赖关系；B、C、D为FICD与索那菲尼的联合用药对于HepG2的生长抑制作用）。
图7 FICD及FICD与索那菲尼联合用药对于HepG的凋亡诱导作用（A：空白组采用0.1% DMSO、B：2.5 μg/mL、C：5 μg/mL、D：20 μg/mL、E：索那菲尼：4 μg/mL、F：联合用药组：4μg/mL 的索那菲尼 + 5 μg/mL的FICD）。
图8 FICD及FICD与索那菲尼联合用药对于HepG的凋亡诱导作用（见图7）的统计结果。
图9 流式细胞术检测FICD及联合索那菲尼处理HepG2引起的细胞周期分布情况（A、空白对照，B、索那菲尼组：5μg/mL；C、FICD：10 μg/mL；D、联合用药组：5μg/mL的FICD +10μg/mL的索那菲尼）。
图10 流式细胞术检测FICD及联合索那菲尼处理HepG2引起的细胞周期分布情况（见图9）的统计结果。
图11 激光共聚焦检测FICD对于HepG2的凋亡诱导作用。
图12 FICD处理肝癌细胞HepG2各组蛋白表达量变化（PBS为空白组；索那菲尼组：4μg/mL；FICD低剂量组：5μg/mL；FICD中剂量组：10μg/mL； FICD高剂量组：20μg/mL；联合用药组组：4μg/mL的索那菲尼组+10μg/mL的FICD）。
图13 FICD对于荷H22小鼠的体内肿瘤生长抑制作用(其中生理盐水为空白对照组，索那菲尼为阳性对照组，均采用腹腔注射给药方式，FICD高剂量组：150 mg/Kg，FICD中剂量组：100 mg/Kg，FICD低剂量组：50 mg/Kg；联合用药组：索那菲尼的用药剂量为50 mg/Kg)。
图14 FICD对于荷H22小鼠的体内肿瘤生长抑制作用（见图13）的数据统计结果，**表示P<0.01，具有极显著差异。
图15 不同给药方式FICD对于荷H22小鼠的体内肿瘤生长抑制作用(其中生理盐水为空白对照组，腹腔注射给药方式组，其中高剂量组：150 mg/Kg，中剂量组：100 mg/Kg，低剂量组：50 mg/Kg；灌胃给药组，其中高剂量组：150 mg/Kg，中剂量组：100 mg/Kg，低剂量组：50 mg/Kg)。
图16 不同给药方式FICD对于荷H22小鼠的体内肿瘤生长抑制作用（见图15）的数据统计结果，**表示P<0.01，具有极显著差异。
图17 COM33处理肝癌细胞HepG2各组蛋白表达量变化（生理盐水为空白组，索那菲尼组：4μg/mL；COM33低剂量组：3μg/mL；COM33中剂量组：6μg/mL；COM33高剂量组：12μg/mL；联合用药组：4μg/mL的索那菲尼组+6μg/mL的COM33）。
图18 COM33对于荷H22小鼠的体内肿瘤生长抑制作用(其中PBS为空白对照组；索那菲尼为阳性对照组：剂量为50 mg/Kg；COM33高剂量组：100 mg/Kg；COM33低剂量组：50 mg/Kg；联合用药组：50 mg/Kg索那菲尼+50 mg/Kg的COM33，各组均采用腹腔注射给药方式)。
图19 COM33对于荷H22小鼠的体内肿瘤生长抑制作用（见图18）的数据统计结果，**表示P<0.01，具有极显著差异。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，通过以下实施例进行说明，但本专利并不仅限于实施例。
实施例1：8-(N-(3'-三氟甲基-4'-氯-苯基))-脲基-异紫堇碱（FICD）的合成。
将NICD化合物（0.7915 g，2.23 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0°C以下。另取4-氯-3-三氟甲基苯基异氰酸酯（0.5822 g，2.63 mmol），加入50 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0°C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇=6：2：1，得到目标化合物FICD 0.9278 g，产率72.3%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(3'-三氟甲基-4'-氯-苯基))-脲基-异紫堇碱：白色粉末状固体，HR-ESI-MSm/z 578.1670 [M+H]+ (计算值C28H28ClF3N3O5为578.1651), 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ6.68 (1H, s, H-3), 2.40-2.48 (2H, J = 17.2, 2.8 Hz, H-4), 2.68-2.72 (2H, dd,J = 17.2, 2.8Hz, H-5), 2.15 (1H, t, J = 14.4, 3.2 Hz, H-6a), 3.38 (1H, d,H-7a), 3.68(1H, d, H-7b), 7.52 (1H, s, H-9), 2.45 (3H, s, N-CH3), 3.86 (6H, s,1-OCH3, 2-OCH3), 3.68 (3H, s, 10-OCH3), 7.68(1H, s, H-2'), 7.34(1H, d, H-5'),7.58(1H, d, H-6'); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 154.1, 152.7, 151.6, 149.6,145.0, 142.4, 138.0, 137.6, 132.2, 131.8, 131.8, 126.4, 125.2, 124.8, 123.2,122.9, 122.3, 117.1, 112.5, 111.6, 62.2, 61.4, 56.2, 55.9, 52.5, 43.9, 29.7,28.6。
实施例2：8-(N-(3',4'-二氯-苯基))-脲基-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.0906 g，0.25 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0°C以下。另取3,4-二氯苯基异氰酸酯（0.0480 g，0.25 mmol），加入50 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0°C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 =6：2：1，得到目标化合物8-(N-(3',4'-二氯-苯基))-脲基-异紫堇碱0.0825 g，产率46.9%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(3',4'-二氯-苯基))-脲基-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z544.1386 [M+H]+ (计算值C27H28Cl2N3O5为544.1401), 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.70(1H, s, H-3), 2.20-2.26 (2H, J = 17.2, 2.8 Hz, H-4), 2.66-2.80 (2H, dd, J =17.2, 2.8Hz, H-5), 2.15 (1H, t, J = 14.4, 3.2 Hz, H-6a), 3.22 (1H, d,H-7a),3.43(1H, d, H-7b), 7.60 (1H, s, H-9), 2.52 (3H, s, N-CH3), 3.89 (6H, s, 1-OCH3, 2-OCH3), 3.70 (3H, s, 10-OCH3), 7.20(1H, s, H-2'), 7.26-7.28(2H, m, H-5', H-6'); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 154.1, 151.5, 149.5, 143.2, 142.4,138.2, 132.6, 130.4, 129.8, 128.4, 128.3, 126.2, 125.3, 125.2, 121.1, 120.9,118.7, 111.6, 110.6, 62.4, 62.2, 56.2, 55.9, 52.5, 43.5, 29.7, 28.8。
实施例3：8-(N-对甲基苯基)-脲基-11-O-对甲基苯甲酰基-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.3032 g，0.85 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0 °C以下。另取4-甲苯基异氰酸酯（0.1137 g，0.85 mmol），加入50 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0°C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 = 6：2：1，得到目标化合物8-(N-对甲基苯基)-脲基-11-O-对甲基苯甲酰基-异紫堇碱0.1628 g，产率30.7%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-对甲基苯基)-脲基-11-O-对甲基苯甲酰基-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 645.2645 [M+Na]+ (计算值C36H38N4NaO6为645.2684), 1H-NMR (400 MHz,CDCl3): δ 7.55 – 7.40 (m, 2H), 7.33 (s, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.13 (d, J = 6.9Hz, 2H), 6.93 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 6.61 (s, 1H), 3.87 – 3.80 (m, 4H), 3.68(dd, J = 30.1, 23.6 Hz, 6H), 3.08 (s, 2H), 3.05 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 2.99 (s,1H), 2.79 (d, J = 14.0 Hz, 3H), 2.47 (s, 3H), 2.35 (s, 3H), 2.29 (s, 3H),1.99 (s, 1H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 153.3, 150.9, 150.1, 145.1, 136.8,134.8, 133.9, 133.6, 132.8, 131.4, 129.6, 129.0, 127.8, 126.3, 126.2, 123.3,120.2, 118.7, 112.4, 107.7, 62.2, 61.2, 56.0, 55.5, 52.6, 43.9, 28.7, 26.9,20.9, 20.7。
实施例4：8-(N-(4'-甲硫醚-苯基))-脲基-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.1425 g，0.40 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0°C以下。另取4-甲基硫代苯基异氰酸酯（0.072 g，0.41 mmol），加入50 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0 °C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 =6：2：1，得到目标化合物8-(N-(4'-甲硫醚-苯基))-脲基-异紫堇碱0.0920 g，产率43.9%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(4'-甲硫醚-苯基))-脲基-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z522.2066 [M+H]+ (计算值C28H32N3O5S为522.2057), 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 1H-NMR(400 MHz, CDCl3): δ 7.16 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.08 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 6.96(s, 1H), 6.69 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.65 (s, 3H), 3.33 (d, J =13.3 Hz, 1H), 3.18 – 3.04 (m, 1H), 2.95 (dd, J = 11.2, 5.6 Hz, 1H), 2.70 (dd,J = 34.2, 13.8 Hz, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 2.07 (dd, J = 23.8, 10.4Hz, 2H)；13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 154.7, 151.4, 149.4, 142.9, 142.3, 136.1,132.5, 129.8, 128.7, 128.3, 125.7, 125.4, 120.9, 120.6, 111.5, 110.5, 62.3,62.2, 60.4, 56.2, 55.9, 52.5, 43.5, 29.7, 28.9, 16.8。
实施例5：8-(N-(2'-氯-苯基))-脲基-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.1039 g，0.29 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0 °C以下。另取2-氯苯基异氰酸酯（0.30 mL，0.51 mmol），加入20 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0 °C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 = 6：2：1，得到目标化合物8-(N-(2'-氯-苯基))-脲基-异紫堇碱0.0116 g，产率3.9%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(2'-氯-苯基))-脲基-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z510.1790 [M+H]+ (计算值C27H29ClN3O5为510.1790)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.32 –7.22 (m, 3H), 7.02 (s, 1H), 6.95 (td, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H),4.14 (dd, J = 14.3, 7.2 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.93(s, 3H), 3.72 (s, 3H),3.54 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 3.33 – 3.21 (m, 1H), 3.12 (d, J = 11.2 Hz, 1H),3.00 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 2.75 (dd, J = 16.5, 2.4 Hz, 1H), 2.58 (s, 3H),2.30 (t, J = 13.6 Hz, 1H), 2.06 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 1.35 – 1.21 (m, 2H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 154.1, 151.6, 149.9, 142.5, 135.3, 129.5, 128.8,127.7, 125.4, 125.1, 125.1, 123.4, 122.3, 121.1, 120.6, 120.5, 111.6, 111.1,110.9, 62.5, 62.2, 56.3, 55.9, 52.6, 43.5, 29.7, 29.6。
实施例6：8-(N-(2'-氯-苯基))-脲基-11-O-(2''-氯-苯甲酰基)-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.1039 g，0.29 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0 °C以下。另取2-氯苯基异氰酸酯（0.30 mL，0.51 mmol），加入20 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0°C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 = 6：2：1，得到目标化合物8-(N-(2'-氯-苯基))-脲基-11-O-(2''-氯-苯甲酰基)-异紫堇碱0.1661 g，产率43.0%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(2'-氯-苯基))-脲基-11-O-(2''-氯-苯甲酰基)-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 685.1588 [M+Na]+ (计算值C34H32Cl2N4NaO6为685.1591);1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.12 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.40 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.32 –7.25 (m, 1H), 7.25 – 7.10 (m, 4H), 7.01 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.7Hz, 1H), 6.68 (s, 1H) , 3.93 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.67 (s,3H), 3.19 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 3.03 (dd, J = 10.8, 5.2 Hz, 1H), 2.86 (d, J =11.8 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.27 – 2.09 (m, 2H), 2.07 (s, 1H), 1.28 (t, J =7.1 Hz, 1H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 171.2, 152.9, 152.4, 151.5, 150.5,145.8, 135.9, 134.4, 132.7, 129.3, 129.1, 128.8, 127.8, 127.6, 127.3, 127.0,124.2, 123.4, 123.2, 122.9, 122.8, 122.5, 120.9, 120.7, 113.4, 107.7, 62.4,61.2, 60.4, 56.4, 55.9, 52.7, 43.8, 28.5。
实施例7：8-(N-(2'-甲基-苯基))-脲基-11-O-(2''-甲基-苯甲酰基)-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.1031 g，0.29 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0°C以下。另取2-甲苯基异氰酸酯（0.50 mL，0.65 mmol），加入20 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0°C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 = 6：2：1，得到目标化合物8-(N-(2'-甲基-苯基))-脲基-11-O-(2''-甲基-苯甲酰基)-异紫堇碱0.1110 g，产率61.6%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(2'-甲基-苯基))-脲基-11-O-(2''-甲基-苯甲酰基)-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 623.2848 [M+H]+ (计算值C36H39N4O6为623.2864)；1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.28 (s, 2H), 7.21 (s, 4H), 7.05 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 6.94 (d,J = 6.7 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 3.78 (d, J = 7.2 Hz,4H), 3.61 (ddd, J = 40.2, 29.7, 14.7 Hz, 4H), 3.31 – 2.82 (m, 6H), 2.57 (s,3H), 2.26 (d, J = 16.0 Hz, 6H), 2.18 (s, 3H), 1.28 (s, 1H); 13C NMR (101 MHz,CDCl3) δ 153.2, 145.4, 139.1, 138.9, 138.3, 129.0, 128.8, 128.5, 126.2,125.0, 124.1, 123.3, 122.9, 120.6, 120.3, 119.2, 117.0, 116.8, 115.8, 62.2,61.3, 55.9, 55.6, 52.6, 46.2, 43.8, 29.8, 28.6。
实施例8：8-(N-(4'-三氟甲基-苯基))-脲基-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.1307 g，0.37 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0 °C以下。另取4-三氟甲基苯基异氰酸酯（0.10 mL，0.70 mmol），加入20 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0 °C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 =6：2：1，得到目标化合物8-(N-(4'-三氟甲基-苯基))-脲基-异紫堇碱0.0181 g，产率9.1%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(4'-三氟甲基-苯基))-脲基-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z544.2050 [M+H]+ (计算值C28H29F3N3O5为544.2054)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.51(s, 3H), 7.28 (s, 2H), 7.05 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.92 (s,3H), 3.73 (s, 3H), 3.47 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 3.24 (m, 1H), 3.09 (m, 1H),2.93 (m, 1H), 2.75 (d, J = 16.9 Hz, 1H), 2.53 (s, 3H), 2.29 – 2.15 (m, 2H),1.27 (s, 1H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 154.0, 151.7, 149.8, 142.6, 141.8,136.6, 129.5, 126.2, 126.2, 125.3, 122.9, 121.0, 120.4, 118.6, 111.6, 110.6,62.6, 62.2, 56.3, 55.9, 52.5, 43.3, 29.7, 29.6。
实施例9：8-(N-(4'-三氟甲基-苯基))-脲基-11-O-(4''-三氟甲基-苯甲酰基)-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.1307 g，0.37 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0 °C以下。另取4-三氟甲基苯基异氰酸酯（0.10 mL，0.70 mmol），加入20 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0°C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 =6：2：1，得到目标化合物8-(N-(4'-三氟甲基-苯基))-脲基-11-O-(4''-三氟甲基-苯甲酰基)-异紫堇碱0.1193 g，产率44.5%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(4'-三氟甲基-苯基))-脲基-11-O-(4''-三氟甲基-苯甲酰基)-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 731.2286 [M+H]+ (计算值C36H33F6N4O6为731.2299)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.73 (s, 1H), 7.56 (dd, J = 29.4, 17.9 Hz, 4H), 7.37(d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.28 (s, 2H), 6.62 (s, 1H), 3.90 – 3.78 (m, 4H), 3.64 –3.49 (m, 6H), 3.04 – 2.96 (m, 3H), 2.82 – 2.72 (m, 3H), 2.51 (s, 3H), 2.28 –2.19 (m, 2H), 2.13 – 2.08 (m, 1H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 152.7, 151.2,150.2, 145.1, 142.3, 140.3, 133.5, 132.7, 126.5, 125.9, 125.6, 125.3, 124.4,124.1, 123.0, 122.9, 122.6, 119.5, 117.9, 112.4, 107.5, 62.1, 61.4, 55.9,55.7, 52.6, 43.8, 29.7, 28.5。
实施例10：8-(N-(4'-氟-苯基))-脲基-11-O-(4''-氟-苯甲酰基)-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.1338 g，0.38 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷中，溶液在冰盐水中冷却至0°C以下。另取4-氟苯基异氰酸酯（0.10 mL，0.70 mmol），加入20 mL的二氯甲烷中使化合物溶解，冷却至0 °C以下，机械搅拌下点滴加入上述NICD溶液中，机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。用氨水调解上述反应溶液的pH值，分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，石油醚：乙酸乙酯：甲醇 = 6：2：1，得到目标化合物8-(N-(4'-氟-苯基))-脲基-11-O-(4''-氟-苯甲酰基)-异紫堇碱0.1527g，产率64.5%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-(N-(4'-氟-苯基))-脲基-11-O-(4''-氟-苯甲酰基)-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 631.2354 [M+H]+ (计算值C34H33F2N4O6为631.2363)；1H-NMR (400 MHz,Acetone-d 6 ): δ 7.59 (dt, J = 8.7, 7.3 Hz, 5H), 7.07 (dt, J = 11.2, 8.9 Hz,4H), 6.80 (s, 1H), 3.93 – 3.88 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.68 (d,J = 6.7 Hz, 1H), 3.45 (s, 3H), 3.36 (dd, J = 14.6, 2.7 Hz, 1H), 3.13 (s, 2H),3.05 – 2.98 (m, 1H), 2.79 (dd, J = 12.5, 3.2 Hz, 1H), 2.68 (dd, J = 17.7, 5.0Hz, 1H), 2.50 (s, 3H), 1.29 (s, 2H); 13C-NMR (101 MHz, Acetone-d 6 ): δ 151.8,151.3, 150.1, 148.2, 135.9, 134.3, 133.2, 129.2, 127.9, 124.4, 121.9, 120.1,115.2, 115.1, 115.0, 114.9, 112.6, 107.5, 62.9, 60.5, 55.6, 55.6, 52.7, 43.3,30.1, 29.8。
实施例11：8-N-(3'-三氟甲基-4'-氯-苯甲酰基)-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.3573 g，1.00 mmol）溶解在20 mL DMF中，另取4-氯-3-三氟甲基苯甲酸（0.2236 g，1.00 mmol），HBTU（0.3852 g，1.02 mmol），DIPEA（0.1 mL）加入50 mL的DMF中使化合物溶解，将NICD溶液加入带搅拌的上述溶液中，40 ℃水浴下机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，浓缩至100 mL，再以250×3 mL蒸馏水萃取三次，浓缩有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯：甲醇 = 8：1，得到目标化合物8-N-(3'-三氟甲基-4'-氯-苯甲酰基)-异紫堇碱0.3001 g，产率53.2%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-N-(3'-三氟甲基-4'-氯-苯甲酰基)-异紫堇碱：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/ z 563.1541 [M+H]+ (计算值C28H27ClF3N2O5为563.1555)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.68(s, 1H), 7.58(d, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.34(d, 1H), 6.68 (s, 1H), 3.86 (s,6H), 3.68 (s, 3H),3.58(m, 1H), 3.38 (m, 1H), 2.68-2.72 (dd, J = 17.2, 2.8Hz,2H), 2.40-2.48 (dd, J = 17.2, 2.8 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.15 (t, J = 14.4,3.2 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 164.1, 152.7, 151.6, 149.6, 145.0,142.4, 138.0, 137.6, 132.2, 131.8, 131.8, 126.4, 125.2, 124.8, 123.2, 122.9,122.3, 117.1, 112.5, 111.6, 62.2, 61.4, 56.2, 55.9, 52.5, 43.9, 29.7, 28.6。
实施例12：8-N-反式肉桂酰基-异紫堇碱的合成。
将NICD化合物（0.3653 g，1.03 mmol）溶解在20 mL DMF中，另取反式肉桂酸（0.1914 g，1.29 mmol），HBTU（0.4397 g，1.16 mmol），DIPEA（0.1 mL）加入50 mL的DMF中使化合物溶解，将NICD溶液加入带搅拌的上述溶液中，40 ℃水浴下机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，浓缩至100 mL，再以250×3 mL蒸馏水萃取三次，浓缩有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯：甲醇 = 8：1，得到目标化合物8-N-反式肉桂酰基-异紫堇碱0.4565 g，产率91.5%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-N-反式肉桂酰基-异紫堇碱具有以下谱学数据：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/ z 487.2219 [M+H]+ (计算值C29H31N2O5为487.2227)；1H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ): δ7.75 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 15.7 Hz,1H), 7.61 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 7.2 Hz,1H), 7.27 – 7.22 (m, 1H), 7.04 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.06 (q, J= 7.1 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.42 (dd, J = 13.8,3.4 Hz, 1H), 3.36 – 3.24 (m, 2H), 2.82 (m, J = 29.3, 2H), 2.71 (s, 3H), 2.42(t, J = 13.4 Hz, 1H), 1.29 (s, 1H), 1.20 (t, J = 7.1 Hz, 1H); 13C-NMR (101MHz, Acetone-d 6 ): δ 164.4, 152.0, 148.9, 143.3, 142.9, 142.3, 140.6, 135.2,129.6, 128.9, 128.6, 128.0, 127.8, 127.01, 125.13, 123.6, 121.9, 118.5,111.4, 110.4, 110.2, 62.1, 61.3, 59.8, 55.7, 55.4, 52.1, 41.8, 27.3。
实施例13：8-N-[2-氟-5-(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酰胺基异紫堇碱的合成
将NICD化合物（0.4186 g，1.17 mmol）溶解在20 mL DMF中，另取2-氟-5-(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基苯甲酸（0.3090 g，1.14 mmol），HBTU（0.4495 g，1.18 mmol），DIPEA（0.1 mL）加入50 mL的DMF中使化合物溶解，将NICD溶液加入带搅拌的上述溶液中，40 ℃水浴下机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，浓缩至100 mL，再以250×3 mL蒸馏水萃取三次，浓缩有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯：甲醇 = 8：1，得到目标化合物8-N-[2-氟-5-(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酰胺基异紫堇碱0.4565 g，产率60.1%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-[2-氟-5-(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酰胺基异紫堇碱具有以下谱学数据：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 637.2445 [M+H]+ (计算值C36H34FN4O6为637.2457)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.73 (s, 1H), 8.46 (d, J = 6.9 Hz, 1H),8.36 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 8.16 (dd, J = 7.3, 2.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 2H), 7.44– 7.39 (m, 1H), 7.36 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.12 (dd, J = 11.5, 8.6 Hz, 1H),6.72 (s, 1H), 4.34 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.27(dd, J = 13.7, 3.3 Hz, 1H), 3.23 – 3.14 (m, 1H), 3.05 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz,1H), 2.92 (dd, J = 20.7, 8.6 Hz, 1H), 2.71 (d, J = 14.8 Hz, 2H), 2.50 (s,4H), 2.23 (t, J = 13.3 Hz, 1H), 2.05 (s, 1H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 1H); 13CNMR (100 MHz, CDCl3): δ 161.8, 160.8, 160.6, 158.3, 151.4, 149.1, 145.6,142.6, 142.4, 134.6, 133.7, 132.2, 131.6, 129.7, 129.5, 128.7, 128.3, 127.2,125.7, 124.9, 123.7, 121.5, 121.3, 120.6, 116.8, 116.5, 111.4, 109.0, 62.2,56.2, 55.9, 52.6, 43.6, 37.8, 29.7, 28.9。
实施例14：8-N-烟酰胺基-异紫堇碱的合成
将NICD化合物（0.4179 g，1.17 mmol）溶解在20 mL DMF中，另取烟酸（0.1358 g，1.14mmol），HBTU（0.4489 g，1.18 mmol），DIPEA（0.1 mL）加入50 mL的DMF中使化合物溶解，将NICD溶液加入带搅拌的上述溶液中，40 ℃水浴下机械搅拌90 min，TLC检测反应终点，停止反应。分别加入100×3 mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相，浓缩至100 mL，再以250×3 mL蒸馏水萃取三次，浓缩有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯：甲醇 = 8：1，得到目标化合物8-N-烟酰胺基-异紫堇碱0.5462 g，产率69.1%。化合物通过MS和NMR技术检测为目标化合物。
8-N-烟酰胺基-异紫堇碱具有以下波谱学数据：：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z476.2186 [M+H]+ (计算值C27H30N3O5为476.2180)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.48 (s,1H), 7.40 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.96(s, 1H), 6.64 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.65 (s, 3H), 3.33 (d, J =13.3 Hz, 1H), 3.18 – 3.04 (m, 1H), 2.95 (dd, J = 11.2, 5.6 Hz, 1H), 2.70 (dd,J = 34.2, 13.8 Hz, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 2.07 (dd, J = 23.8, 10.4Hz, 2H)；13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ164.4, 152.0, 148.9, 143.3, 142.9, 142.3,140.6, 135.2, 129.6, 128.9, 128.6, 128.0, 127.8, 127.01, 125.13, 123.6,121.9, 118.5, 62.1, 61.3, 59.8, 55.7, 55.4, 52.1, 41.8, 27.3。
实施例15：8-N-(苯基)-脲基-异紫堇碱的合成
将NICD化合物（2.3198 g，6.52 mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.0753 g，0.62 mmol）、三乙胺（1 mL）中溶解在200 mL二氯甲烷，溶解得到NICD的混合溶液；将固体光气（0.7542 g，2.52 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷，将上述带搅拌的NICD混合溶液缓慢加入通入N2的固体光气溶液中，0 ℃ 冰水浴下搅拌反应3 h；再将溶解有苯胺（0.5 mL，5.90 mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.0751 g，0.62 mmol）、三乙胺（1 mL）的200 mL二氯甲烷缓慢加入上述通入N2，带搅拌的反应混合溶液中，0 ℃ 冰水浴下搅拌反应2 h，滴加完成后，升至室温搅拌反应2 h后加水猝灭反应，以300 mL蒸馏水萃取三次，浓缩有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离萃取物得到8-N-(苯基)-脲基-异紫堇碱1.9742 g，产率56.1%。
8-(N-苯基)-脲基-异紫堇碱具有以下谱学数据：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z476.2186 [M+H]+ (计算值C27H30N3O5为476.2180)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.75 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.52(d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 15.7 Hz, 1H),6.79 (s, 1H), 4.14 (dd, J = 14.3, 7.2 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.93(s, 3H),3.72 (s, 3H), 3.54 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 3.33 – 3.21 (m, 1H), 3.12 (d, J =11.2 Hz, 1H), 3.00 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 2.75 (dd, J = 16.5, 2.4 Hz, 1H),2.58 (s, 3H), 2.30 (t, J = 13.6 Hz, 1H), 2.06 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 1.35 –1.21 (m, 2H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 154.1, 151.6, 149.9, 142.5, 135.3,129.5, 128.8, 127.7, 125.4, 125.1, 125.1, 123.4, 122.3, 121.1, 120.6, 120.5,111.6, 111.1, 110.9, 62.5, 62.2, 56.3, 55.9, 52.6, 43.5, 29.7, 29.6。
实施例16：8-[3-三氟甲基-4-(4-甲基氨基甲酸叔丁酯基)哌啶]苯基酰脲基异紫堇碱的合成
第一步：取2-氯-5-硝基三氟甲苯（0.4106 g，1.83 mmol）、K2CO3（0.5078 g，3.68mmol）溶解在50 mL DMF中，再向其中加入哌啶-4-甲基氨基甲酸叔丁酯（0.3013 g，1.41mmol），100 ℃下搅拌8 h，反应完成后冷却至室温，真空除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯，用300 mL水和盐水萃取三次，MgSO4干燥，浓缩有机相，回收有机溶剂，得到粗制硝基苯产物，为浅黄色固体。将约0.5 g粗硝基苯产物溶于50 mL甲醇溶液中，加入0.1324 g Pd / C钯碳，室温，0.25 MPa压力下，将反应混合物在氢气高压反应釜中搅拌3小时，反应完成后通过硅藻土过滤。将滤液浓缩，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离得到1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)哌啶-4-甲基)氨基甲酸叔丁酯0.3124 g，产率59.5%。
1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)哌啶-4-甲基)氨基甲酸叔丁酯具有以下谱学数据：浅白色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 374.2038 [M+H]+ (计算值C18H27F3N3O2为374.2050); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.92 (d, J =2.6 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 8.4, 2.5 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H),3.94(brs, 2H), 3.06(t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.95 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 10.9 Hz, 2H),1.70 (d, J = 11.4 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.38 (dd, J = 11.6, 3.0 Hz, 2H),1.25 (s, 1H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 156.1, 144.5, 142.8, 125.3, 118.8,113.3, 79.10, 54.1, 46.4, 36.2, 30.5, 28.4。
第二步：将NICD化合物（2.3235 g，6.53 mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.0753 g，0.62mmol）、三乙胺（1 mL）中溶解在200 mL二氯甲烷，溶解得到NICD混合溶液；将固体光气（0.7537 g，2.54 mmol）溶解在50 mL二氯甲烷，将上述带搅拌的NICD混合溶液缓慢加入通入N2的固体光气溶液中，0 ℃ 冰水浴下搅拌反应3 h；再将溶解有1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)哌啶-4-甲基)氨基甲酸叔丁酯（2.1862 g，5.86 mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.0751g，0.62 mmol）、三乙胺（1 mL）的200 mL二氯甲烷缓慢加入上述通入N2，带搅拌的反应混合溶液中，0 ℃ 冰水浴下搅拌反应2 h，滴加完成后，升至室温搅拌反应2 h后加水猝灭反应，以300 mL蒸馏水萃取三次，浓缩有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离萃取物得到8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基叔丁酯基甲酸酰胺-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱2.5978g，产率58.7%。
8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基叔丁酯基甲酸酰胺-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱具有以下谱学数据：浅白色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 756.3571 [M+H]+ (计算值C39H49F3N5O7为756.3579)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.48 (s, 1H), 7.40 (d, J =7.6 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.64 (s,1H), 4.83 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 3.26 (d, J =11.7 Hz, 1H), 2.99 (m, 3H), 2.91 – 2.74 (m, 4H), 2.62 (dd, J = 21.2, 15.1 Hz,3H), 2.48 (dd, J = 19.5, 9.3 Hz, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.07 – 1.95 (m, 1H), 1.62(m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.36 – 1.21 (m, 2H). 13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ 156.4,154.7, 151.2, 149.1, 148.1, 142.2, 135.5, 129.9, 128.9, 127.6, 127.4, 125.9,125.4, 125.0, 124.6, 123.6, 122.3, 120.8, 118.1, 111.4, 110.3, 79.3, 63.2,62.2, 62.1, 56.0, 55.8, 53.8, 52.5, 46.3, 43.5, 37.3, 36.2, 30.4, 29.7, 28.9,28.4。
实施例17：8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱（COM33）的合成。
将 8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基叔丁酯基甲酸酰胺-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱（1.4590 g，1.93 mmol）溶于含有4 M的HCl乙酸乙酯（5 mL）中，搅拌1 h，加入氨水调解至pH值中性，过滤，得到目标化合物8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱1.1618 g，产率91.2%。
8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱具有以下谱学数据：浅白色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 656.3039 [M+H]+ (计算值C34H41F3N5O5为656.3054)；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.03 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.75 (dd, J =8.8, 1.9 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 4.02(dd, J = 12.9, 2.0 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.81 – 3.75 (m, 2H),3.71 (s, 3H), 3.58 (dd, J = 13.5, 3.1 Hz, 2H), 3.47 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 3.45(s, 1H), 3.41 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 3.18 (s, 4H), 3.08 (d, J = 14.1 Hz, 2H),2.95 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 2.52 (t, J = 13.4 Hz, 1H), 2.01 (d, J = 11.4 Hz,5H), 1.67 (d, J = 10.7 Hz, 2H); 13C-NMR (101 MHz, CD3OD): δ 156.2, 154.6,150.3, 145.4, 143.3, 140.4, 128.1, 127.6, 127.0, 126.6, 126.4, 125.7, 124.3,123.7, 122.7, 120.7, 118.4, 112.6, 111.4, 63.9, 62.3, 56.8, 56.6, 56.2, 53.5,45.4, 42.4, 34.2, 30.1, 29.0, 26.9。
实施例18：8-[3-三氟甲基-4-(4-甲基氨基甲酸丙酯基)-哌啶]苯基酰脲基异紫堇碱的合成
将8-[3-三氟甲基-4-(4-氨甲基)哌啶]苯基酰脲基异紫堇碱（4.1372 g，6.19 mmol）溶解在60 mL DMF中，机械搅拌，点滴加入到0.6 mL新蒸馏的丙酰氯中，反应2 h，将反应液倒入200 mL冰水中，用氨水将上述反应产物的pH值调至8左右，300 mL氯仿萃取三次，合并有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离萃取物得到8-[3-三氟甲基-4-(4-甲基氨基甲酸乙酯基)哌啶]苯基酰脲基异紫堇碱2.0218，产率48.6%。
8-[3-三氟甲基-4-(4-甲基氨基甲酸丙酯基)哌啶]苯基酰脲基异紫堇碱具有以下谱学数据：浅白色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 712.3308 [M+H]+ (计算值C37H45F3N5O6为712.3322)；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ 7.81 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 7.59(d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), ,3.84 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.43 - 3.36 (m, 2H), 2.99 (dd, J =13.5, 3.1 Hz, 2H), 2.65 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.35 (s, 1H), 2.24(d, J = 4.7 Hz, 1H), 2.12 (m, 4H), 2.08 (dd, J = 14.1, 3.2 Hz, 2H), 1.86 (t,J = 6.3 Hz, 3H), 1.67 (t, J = 13.4 Hz, 1H), 1.20 (m, 5H), 1.01 (t, J =8.0,2.0 Hz, 3H)。13C-NMR (101 MHz, DMSO-d 6 ): δ 173.3, 153.9, 151.5, 148.1, 147.1,143.1, 141.4, 137.7, 129.4, 127.3, 126.6, 126.3, 125.8, 125.6, 125.3, 123.8,123.1, 123.0, 120.4, 116.4, 111.9, 109.5, 62.9, 61.7, 56.26, 56.2, 54.1,52.7, 44.5, 44.1, 40.6, 40.4, 40.2, 40.0, 39.8, 39.6, 39.4, 35.9, 30.8, 30.2,29.0, 10.6。
实施例19：8-N-[3'-三氟甲基-4'-(4''-氨基甲酸叔丁酯基-哌啶)-苯基]-脲基异紫堇碱的合成
第一步：取2-氯-5-硝基三氟甲苯（0.4098 g，1.83 mmol）、K2CO3（0.5187 g，3.79mmol）溶解在50 mL DMF中，再向其中加入哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯（0.3047g，1.44 mmol），100 ℃下搅拌8 h，反应完成后冷却至室温，真空除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯，用300mL水和盐水萃取三次，MgSO4干燥，浓缩有机相，回收有机溶剂，得到粗制硝基苯产物，为浅黄色固体。将约0.5 g粗硝基苯产物溶于50 mL甲醇溶液中，加入0.1324 g Pd / C钯碳，室温，0.25 MPa压力下，将反应混合物在氢气高压反应釜中搅拌3 h，反应完成后通过硅藻土过滤。将滤液浓缩，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离得到1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)哌啶-4-甲基)氨基甲酸叔丁酯0.3029 g，产率56.9%。
1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯具有以下谱学数据：浅黄色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 382.1718 [M+Na]+ (计算值C17H24F3N3NaO2为382.1713);1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.15 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 2.5 Hz, 1H),6.78 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 4.54 (s, 1H), 3.64 (dd, J = 65.1, 5.5 Hz,2H), 2.90 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 2.72 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 1.95 (d, J = 11.0Hz, 2H), 1.54 (ddd, J = 14.9, 11.8, 3.8 Hz, 3H), 1.46 (s, 9H). 13C NMR (101MHz, CDCl3) δ 155.30, 143.75, 143.51, 125.24, 122.53, 118.59, 113.03, 79.19,53.06, 47.70, 33.22, 28.43。
第二步：将NICD化合物（0.2324 g，0.65 mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.0075 g，0.06mmol）、三乙胺（1 mL）中溶解在50 mL二氯甲烷，溶解得到NICD混合溶液；将固体光气（0.0754 g，0.25 mmol）溶解在20 mL二氯甲烷，将上述带搅拌的NICD混合溶液缓慢加入通入N2的固体光气溶液中，0 ℃ 冰水浴下搅拌反应3 h；再将溶解有1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯（0.2186 g，0.57 mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.0075 g，0.06 mmol）、三乙胺（1 mL）的50 mL二氯甲烷缓慢加入上述通入N2，带搅拌的反应混合溶液中，0 ℃ 冰水浴下搅拌反应2 h，滴加完成后，升至室温搅拌反应2 h后加水猝灭反应，以300 mL蒸馏水萃取三次，浓缩有机相，回收有机溶剂，硅胶柱色谱分离萃取物得到8-N-[3'-三氟甲基-4'-(4''-氨基甲酸叔丁酯基-哌啶)-苯基]-脲基异紫堇碱0.2568 g，产率58.3%。
8-N-[3'-三氟甲基-4'-(4''-氨基甲酸叔丁酯基-哌啶)-苯基]-脲基异紫堇碱具有以下谱学数据：棕色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 742.3430 [M+H]+ (计算值C38H47F3N5O7为742.3422); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.51 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.34 (d, J= 6.1 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.95 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 4.64 (s,1H), 3.81 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.55 (s, 3H), 3.33 (s, 1H), 3.23 (d, J =11.5 Hz, 2H), 3.04 (s, 2H), 2.81 (d, J = 31.8 Hz, 4H), 2.60 (dd, J = 22.6,12.0 Hz, 4H), 2.31 (s, 3H), 1.99 (t, J = 13.0 Hz, 1H), 1.86 (s, 2H), 1.41 (s,9H). 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 155.5, 154.7, 151.2, 148.9, 147.4, 142.2,135.9, 129.8, 128.8, 127.6, 127.3, 126.1, 125.4, 125.0, 124.5, 123.4, 122.3,120.7, 117.9, 111.3, 110.2, 79.3, 62.1, 62.0, 55.9, 55.8, 52.8, 52.4, 50.2,47.6, 43.4, 33.0, 29.6, 28.9, 28.4。
实施例20：8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨基-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱的合成。
将 8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨基叔丁酯基甲酸酰胺-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱（0.1459 g，0.19 mmol）溶于含有4 M的HCl乙酸乙酯（1 mL）中，搅拌1 h，加入氨水调解至pH值中性，过滤，得到目标化合物8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱0.1162 g，产率90.6%。
8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱具有以下谱学数据：浅白色粉末状固体，HR-ESI-MS m/z 642.2891 [M+H]+ (计算值C33H39F3N5O5为642.2898)；1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ 7.91 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.63 (dd, J =8.6, 2.0 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 4.00(d, J = 10.9 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.80 – 3.72 (m, 2H), 3.70(s, 3H), 3.61 – 3.53 (m, 2H), 3.50 – 3.37 (m, 3H), 3.28 – 3.21 (m, 2H), 3.17(s, 3H), 3.11 – 2.97 (m, 4H), 2.87 (dd, J = 22.0, 10.9 Hz, 2H), 2.51 (t, J =13.4 Hz, 1H), 2.07 (d, J = 9.9 Hz, 2H), 1.81 (qd, J = 11.2, 2.9 Hz, 2H); 13CNMR (101 MHz, CD3OD) δ 155.0, 153.2, 149.0, 146.0, 144.00, 141.9, 137.3,126.9, 126.2, 125.3, 124.9, 122.9, 122.6, 122.3, 121.4, 119.3, 116.8, 111.2,110.1, 68.1, 62.5, 60.9, 55.4, 55.2, 52.2, 51.8, 41.0, 30.5, 29.8, 27.6,27.4, 25.6。
实施例21：异紫堇碱衍生物抗癌活性筛选研究。
采用MTT法，将测试样品溶液加入到癌细胞贴壁生长的96孔板中，培养一定时间，测定化合物对于初筛人类癌细胞株的生长抑制作用，确定化合物的抗癌活性。化合物编号按照实施例编号，索那菲尼作为阳性对照药物。
具体方法如下：
1、活性筛选人类癌细胞株：人宫颈癌Hela细胞株，人肝癌细胞株HepG2，人胃癌细胞株MGC-803，人乳腺癌细胞株MAD-MB-231，人肝癌细胞株SMMC-7721，人脑胶质瘤U251由兰州大学临床前药理研究室提供。
2、细胞培养：细胞培养箱设置均为37℃，5% CO2和饱和湿度条件，细胞在此条件下进行培养，细胞培养基为DMEM完全培养基养基，其中包含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素。
3、MTT细胞增殖检测：
3.1、将癌细胞经0.25%胰酶消化后，800 rpm 离心5 min，洗涤制备单细胞悬液，计数后稀释成5 × 103/100 μL，接种96孔细胞培养板（3孔重复），过夜贴壁培养；
3.2、贴壁 24 h后，弃完全培养基，用100 μL不同浓度的待测样品溶液按照浓度梯度依次加入96孔版中，继续孵育24 h、48 h、72 h；
3.3、弃培液，加入0.5 mg/mL的MTT稀释后的工作液，放入培养箱孵育4 h；
3.4、弃培液，加入100 μL的DMSO，放于摇床低速震荡10 min，利用酶标仪490 nm波长下测定每孔的分光光度值。按公式：生长抑制率=（对照组OD值 - 实验组OD值）/对照组OD值进行统计分析，计算肿瘤细胞生长抑制率。
结果见表1。
表1 异紫堇碱衍生物对HepG2、Hela和MGC-803三株癌细胞的生长抑制作用（IC50：μM）
* 注：实施例编号对应化合物编号
从上表中可以看出化合物1（FICD）、化合物17（COM33）和化合物18具有较好的抗癌活性，尤其化合物17，其对三种肿瘤细胞的IC50均低于10 μM。
实施例22：异紫堇碱及其典型代表衍生物对三种不同肿瘤细胞的生长抑制作用。
按实施例21中MTT方法，将测试样品溶液加入到癌细胞贴壁生长的96孔板中，培养一定时间，测定化合物对于初筛3株人类癌细胞株的生长抑制作用，确定化合物的抗癌活性，并绘制生长抑制曲线。活性测试化合物、化学结构及化合物编号见附图1：异紫堇碱（ICD），8-氨基-异紫堇碱（NICD），8-(N-(3'-三氟甲基-4'-氯-苯基))-脲基-异紫堇碱（FICD），8-(N-(3'-三氟甲基-4'-(4''-氨甲基-哌啶)-苯基))-脲基-异紫堇碱（COM33），异紫堇二酮（TICD），索那菲尼（Sorafenib）是目前临床唯一治疗晚期肝癌的分子靶向治疗药物，作为阳性对照药物。
结果见表2和附图2，附图3和附图4。
表2 异紫堇碱衍生物对HepG2、Hela和MGC-803三株癌细胞的生长抑制作用（IC50：μM）
研究结果表明在异紫堇碱的衍生物中COM33对于3株癌细胞的生长抑制作用最强，具有比索那菲尼更强的抗癌活性，同时说明专利申请人通过对原料异紫堇碱的化学结构优化和抗癌活性筛选，异紫堇碱衍生物的抑瘤活性得到逐步提高和成药性的逐渐改善。
实施例23：FICD对于肝癌细胞抗癌作用机制研究。
1、FICD对肿瘤细胞的生长抑制作用和索那菲尼的协同增效作用。
按实施例21中MTT检测方法，检测化合物FICD对于脑胶质瘤U251、卵巢癌Hela、胃癌细胞MGC-803、肝癌细胞SMMC-7721、肝癌细胞HepG2以及乳腺癌细胞MAD-MB-231的肿瘤细胞生长抑制作用。结果见附图5，表明FICD在10-40μg/mL浓度范围内，对以上6种肿瘤细胞均具有一定的生长抑制活性。其中人肝癌HepG2细胞的影响尤其最为显著。
实验研究表明：FICD对人的不同癌细胞株的增值均有不同程度的影响，其中FICD对人肝癌HepG2细胞的抑制最为显著，在10到40μg/mL浓度范围内，FICD对于不同肿瘤细胞的抑制作用具有剂量和时间依赖关系。作用48 h后，FICD对不同细胞的IC50值分别为HepG2：10.10±1.20μg/mL、U251：16.80±0.28μg/mL、：Hela：18.60±0.29μg/mL、MGC-803：15.60±2.40μg/mL、MDA-MB-231：14.20±0.66μg/mL。
研究表明，FICD对于肝癌细胞的IC50在10-20μM，FICD作用24 h后，可以诱导HepG2的凋亡，并且其抑制肿瘤细胞的生长具有时间和剂量依耐关系，随时间的延长抑制率明显的上升，随用药浓度的增加抑制率逐渐升高。同时FICD与索那菲尼具有协同增效作用（见附图6，表3）。
表3 FICD与索那菲尼联合用药对于HepG2生长抑制的协同增效作用（IC50：μg/mL）及协同倍数。
注：S表示为索那菲尼。
2、FICD对肝癌细胞的凋亡诱导作用。
2.1、Annexin V和PI 双染色法测定FICD对肝癌细胞的凋亡诱导作用：
方法：取处于对数生长期的HepG2细胞，PBS洗涤两遍，用0.25%的胰酶消化，细胞计数，接种于6孔板，1.25×105/孔，贴壁培养过夜，第2 d加不同浓度的FICD,继续培养24 h，收集细胞，用预冷的PBS洗涤三遍，贴壁的细胞用不含EDTA的胰酶消化，合并两次的溶液，离心，用预冷的PBS再次洗三遍，加入400μL含5μL的V-FITC和10μL的PI室温避光孵育，30 min后流式细胞仪检测。
结果见附图7和附图8，实验研究表明：经FICD和索那菲尼单药处理后细胞的凋亡率与对照组相比，升高为11.93%和29.33%，联合用药组凋亡率升高更为明显，达到63.73%，与单药组相比具有显著性差异（P < 0.05）。
2.2、FICD对于HepG2细胞周期的影响检测：
方法：收集用FICD和索那菲尼不同浓度处理的HepG2细胞，用PBS洗两遍，贴壁的加入无EDTA的0.25%的胰酶消化，1200 r/min 10min 弃去上清，加入2 mL预冷的PBS洗三遍。加入1mL预冷（-20℃）70%乙醇到细胞沉淀中，吹打均匀，与4℃固定过夜。第2 d，离心收集HepG2细胞，加入2 mL预冷的PBS洗三遍，加入500 μL的PBS含50μg/mL溴化乙锭（PI)，100 μg/mL的RNaseA，4℃避光孵育30 min。流式细胞仪上机检测，结果见附图9和附图10。
AnneixnV-FITC及PI双染色测定细胞周期，实验检测空白对照组、索那菲尼、10μg/mL的FICD组以及联合用药组对HepG2细胞的影响。与空白对照组相比较，索那菲尼组在细胞周期G0/G1期明显的增加、而S期明显的减少。FICD给药组组细胞在G2/M期明显的增加，G0/G1期减少。联合用药组在G0/G1期减少，在S期减少，均差异显著，具有统计学意义。
2.3、激光共聚焦扫描显微镜检测FICD及与索那菲尼联合用药对于HepG2的凋亡诱导作用。
方法：收集用不同浓度的FICD、索那菲尼、两者联合用药组处理HepG2细胞48 h的细胞培养液，贴壁的细胞用0.25%胰酶消化，弃去胰酶，加PBS，前后两次溶液混合，1000 r/min 离心5 min，弃去上清液，PBS洗涤3遍，将细胞沉淀重悬于Binding Buffer，加人l0μL的FITC -Annen V染色液，轻轻吹打均匀，避光反应，加人PI染色15 min，离心，弃上清，用PBS再次洗涤三遍，将细胞沉淀涂于载玻片上片，用无荧光的缓冲甘油封片，立即用激光共聚焦扫描显微镜进行观察并拍照，波长为488 nm和560 nm。同时以不加 AnneixnV-FITC及PI的细胞作为阴性对照。
结果见附图11，激光共聚焦扫描显微镜Anneixn V-FITC及PI双染色实验研究表明：空白组红绿色均没有染色，只有在光学显微镜下能看到，细胞形态正常，细胞膜完整，FICD处理组、索那菲尼组及联合用药组出现各个期间的细胞凋亡，细胞形态也发生变化，细胞核呈现波纹状和部分皱缩，随后变为致密浓染的颗粒状荧光。染色质高度凝集边缘化。联合用药组有的裂解为碎块产生凋亡小体。
3、Western blotting法检测FICD处理人肝癌HepG2细胞后蛋白表达的影响。
方法：蛋白样品的凝胶电泳。配胶：依照分离胶的配方，将所有的组分加入小烧杯中，轻轻的摇晃混匀，避免气泡的产生，用1 mL的枪快速的加到玻璃板缝隙中，之后用双蒸馏水封闭，防止氧化。30 min后分离胶凝固，倒掉上面的双蒸水，用滤纸吸干水分，配置5%的浓缩胶，TEMED最后加载到玻璃板中，将1.0 mm梳子插入到浓缩胶中，室温放置30 min。轻轻垂直将梳子小心拔掉，用微量进样器吸取20μL各组处理过的蛋白样品，等体积的上样缓冲液，等体积含3μL的Marker的上样缓冲液，分别加入到上样孔中，电极插上之后，电泳仪打开，在75V下跑胶30 min，等到溴酚蓝到达分离胶时，电压换成120V跑2 h。转膜：依据胶的大小，裁剪大小合适的PVDF膜，放入甲醇溶液中1 min，捞出和剪好的滤纸一起放在提前预冷的转膜缓冲液中浸泡。按从上往下为海绵垫、三层滤纸、胶、三层滤纸、海绵垫的顺序放入转膜槽中然后加入预冷的转膜缓冲液。四周多放几个冰袋，防止外界的环境过热，插上电极，恒流200A转膜2.5小时。封闭和孵育抗体：将转好的膜裁剪成需要的条带，放入到5%脱脂奶粉的封闭液中，置于摇床上室温低速摇动1 h。将一抗用封闭液稀释，吸取相对应的抗体加入到自封袋中，然后将PVDF膜放入抗体稀释液中，排净自封袋中的气泡，封口，放于4℃冰箱过夜。第二天从自封袋中取出膜，放置在干净的培养皿中，加入TBST溶液在低速摇床上洗涤三次，每次10 min，用适量的5%的脱脂奶粉稀释二抗，吸取相对应的抗体加入到自封袋中，然后将PVDF膜放入抗体稀释液中，排净自封袋中的气泡，封口，放于室温孵育2 h。取出膜用TBST洗涤三次，每次持续10 min。显影、定影：先将化学发光用的A液和B液按照体积1：1混合，PVDF膜放置在暗盒上的保鲜膜上，然后将配制好的发光试剂缓慢滴在PVDF膜上，每个膜上大约100 μL，反应2 min，用滤纸吸去膜周围多余的化学发光试剂，保鲜膜覆盖于膜的另一侧。将裁剪大小合适的胶片盖在膜上面，关闭暗盒盖子，曝光的时间根据光带的强弱调节，曝光结束后打开暗合盖，取出胶片置于显影液中，看到有条带出现时，拿出胶片用蒸馏水冲洗，再置于定影液中3 min后蒸馏水洗干净，晾干，结果见附图12。
与空白组相比较，索那菲尼组、FICD高剂量组和联合用药组肝癌细胞的癌蛋白C-Myc、与细胞生长相关蛋白Ki-67、细胞周期相关蛋白CylinD1、β-Catenin蛋白的表达均明显的减少，具有显著性差异（P < 0.01)，说明FICD具有诱导肝癌细胞发生凋亡，阻滞肿瘤细胞生长和引起细胞骨架蛋白显著降低作用，可能通过Wnt/β-Catenin信号通路发挥肿瘤生长抑制作用。索那菲尼和FICD单用组Vimentin显著升高，表明细胞发生上皮间皮转化（EMT），肝癌细胞干细胞特性增强，但联合用药组Vimentin没有表达，说明细胞发生EMT的有效逆转。肝癌干细胞特性降低，耐药性降低，不利于肝癌细胞的转移和侵袭，显著提高了索那菲尼的抗癌活性和耐药逆转。
实施例24： FICD对荷腹水型肝癌H22诱导实体瘤昆明种小白鼠的体内肿瘤生长抑制作用。
本实验的目的在于研究FICD单药及与索那菲尼联合用药以及FICD不同给药方式下，FICD对于荷腹水型肝癌H22诱导实体瘤昆明种小白鼠的体内抑制肿瘤生长作用，具体研究方案如下：
试验方法：
1 实验瘤株及动物：H22肝癌细胞株由兰州大学基础医学院药理教研室/甘肃省中药新药临床前研究重点实验室提供，定期腹腔接种传代保种。昆明种小白鼠（18.0 - 22.0 g）由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
2 肿瘤模型建立及分组方法：将腹腔接种H22肿瘤细胞7 d后生长良好的第三代小鼠颈椎脱臼处死，置75%酒精中浸泡10min，腹腔注射无菌生理盐水3 mL后从腹腔抽出的乳白色瘤细胞腹水，用无菌生理盐水配制成肿瘤细胞悬液（细胞数为1.5×107 mL-1），取80只昆明种小白鼠，每只小鼠左腋窝皮下接种0.2 mL。肿瘤细胞接种后24 h后按体重随机分成8组，每组10只，分别为：生理盐水模型组、索那菲尼为阳性对照组，给药剂量为50 mg/kg，FICD治疗组为3组，给药剂量按高剂量150 mg/kg，中剂量为100 mg/kg，低剂量组为50 mg/kg，联合用药组3组，每组50 mg/kg剂量的索那菲尼加FICD的高中低3个剂量，其中高中低剂量按FICD单独治疗组联合。给药方式均采用腹腔给药。
3.实验结果：造模第2 d，连续给药10 d，第11 d停药后次日小鼠颈椎脱臼处死，剥离完整肿瘤组织，称量湿重，计算肿瘤抑制率公式如下：抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重 × 100%。
表4 FICD及FICD与索那菲尼联合用药对于荷H22昆明种小白鼠的体内肿瘤生长抑制作用 （n = 10 ）
注释：**表示极显著差异，P < 0.01%；高剂量：150 mg/Kg；中剂量：100 mg/Kg；低剂量：50 mg/Kg；索那菲尼组和联合用药组索那菲尼的剂量都为50 mg/Kg。
结果见附图13和附图14以及表4，研究表明：FICD单独给药或FICD与索那菲尼联合用药组对于H22的体内作用与模型对照均具有显著性差异，抑瘤率均大于40%，且联合用药组大幅度提高FICD的抑制作用，具有鲜明的协同增效作用。50 mg/Kg剂量的索那菲尼和150mg/Kg 的FICD联合用药可以使索那菲尼的抑瘤率从55.8%提高到70.6%。
实施例25： FICD对荷腹水型肝癌H22诱导实体瘤昆明种小白鼠的体内抑制肿瘤生长作用。
本实验的目的在于采用不同给药方式（灌胃和腹腔注射给药）研究FICD对于荷腹水型肝癌H22诱导实体瘤昆明种小白鼠的体内抑制肿瘤生长作用，探讨FICD在小鼠体内的吸收情况，研究FICD的成药性和给药方式的选择，具体研究方案如下：
试验方法：参照实施例24试验方法。结果见附图15和附图16以及表5。
表5 不同给药方式FICD对于荷H22昆明种小白鼠的体内肿瘤生长抑制作用 （n =10）
注释：**表示极显著差异，P < 0.01%；高剂量：150 mg/Kg；中剂量：100 mg/Kg；低剂量：50 mg/Kg。
研究表明：FICD不论灌胃给药还是腹腔注射给药，150 mg/Kg、100 mg/Kg、50 mg/Kg 三个给药剂量的肿瘤抑制率均在40%以上，与模型对照相比具有显著性差异。给药方式之间没有统计学差异，表明FICD口服给药吸收良好。
实施例26： Western blotting法检测COM33对人肝癌HepG2细胞蛋白表达活性的影响
方法：采用实施例23中3所示Western blotting法，检测COM33作用于HepG2细胞引起的蛋白差异表达情况。
与空白对照组相比较索那菲尼组、COM33高剂量组和联合用药组肝癌细胞的C-Myc、Ki-67、CylinD1、β-Catenin蛋白的表达均明显的减少（见附图17），具有显著性（P <0.01)，说明COM33具有诱导肝癌细胞发生凋亡，阻滞肿瘤细胞生长和引起细胞骨架蛋白显著降低作用，可能通过Wnt/β-Catenin信号通路发挥肿瘤生长抑制作用。Vimentin在各组中均有表达，联合用药组相对于索那菲尼组，Vimentin的表达有显著降低作用，表明COM33与索那菲尼有协同增效作用和耐药逆转作用。
实施例27： COM33对荷腹水型肝癌H22诱导实体瘤昆明种小白鼠的体内肿瘤生长抑制作用
方法：采用实施例24的H22的小白鼠河流模型监理方法造模，采用腹腔注射给药方式，测定COM33对于H22模型鼠的体内肿瘤生长抑制活性。
表6 COM33对于荷H22昆明种小白鼠的体内肿瘤生长抑制作用 （n = 10）
注：给药方式：腹腔注射，给药剂量：阳性对照索那菲尼组(50 mg/Kg)、COM33高剂量组（100 g/Kg）、 COM33低剂量组（50 mg/Kg），联合用药组（索那菲尼：50 mg/Kg+ COM33：50mg/Kg）。
研究表明：索那菲尼的肿瘤抑制率为56.5%，且通过前后3批的实验验证，索那菲尼的肿瘤抑制率比较稳定，说明申请人采用H22这种快速生长的肿瘤模型可以评价异紫堇碱衍生物的体内肿瘤生长抑制作用。索那菲尼的安全窗相对有限，如果提高索那菲尼的给药剂量（50 mg/Kg以上），索那菲尼的毒副作用就会明显出现，发生实验动物的死亡情况（结果见附图18和附图19以及表6）。
COM33单独给药或COM33与索那菲尼联合用药组对于H22的体内肿瘤生长抑制作用与模型对照均具有显著性差异，抑瘤率均大于40%，且联合用药可以使索那菲尼的抑瘤率从56.5%提高到66.5%，表明COM33对于索那菲尼的体内肿瘤抑制作用具有加和或协同增效作用。高剂量COM33对于肿瘤的生长抑制率可以达到73.8%，其抑瘤率显著高于阳性对照药索那菲尼，且该化合物对于老鼠体重的影响较小，表明COM33具有较好的体内肿瘤抑制作用，毒副作用作用较小，药学特征明显优于临床一线治疗药物索那菲尼，具有新药开发前景。
Claims (8)
1.一种异紫堇碱衍生物，其特征在于该衍生物的结构见式，
式
其中式中：
。
2.如权利要求1所述的衍生物，其特征在于式中R2 = H，X = N，Y = C，n1 = 1。
3.如权利要求1所述的衍生物，其特征在于式中R2 = H，X = N，Y = C，n1 = 1，Z = N，n2=1。
4.如权利要求1所述衍生物的制备方法，其特征在于通过以下方法合成制备：
制备方法一、NICD与芳基不同取代的异氰酸酯发生缩合反应形成脲基官能团而制备得到：将异氰酸酯加入到NICD的有机溶剂溶液中，搅拌，发生缩合反应，反应完全后将反应液加入冰水中，用碱水调节溶液偏碱性，二氯甲烷萃取，回收溶剂，产物纯化得到目标化合物；
制备方法二、NICD与羧酸或酰氯发生缩合反应形成酰胺官能团而制备得到：将羧酸或酰氯中的一种加入到NICD的有机溶剂溶液中，加入缩合催化剂，搅拌发生缩合反应，反应完全后，二氯甲烷萃取，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物；
制备方法三、步骤A：NICD与芳香胺在有机溶剂中通过固体光气或光气，进行共聚合反应形成脲基官能团而制备得到：将芳基胺，固体光气和缩合催化剂加入到NICD的有机溶剂溶液中，搅拌进行缩合反应，反应完全后，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物；
步骤B、将制备方法三步骤A中的反应产物溶解在有机溶剂，加入碱水或质子酸，搅拌反应，进行保护集团的水解反应，反应完全后，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物；
步骤C、将羧酸或酰氯加入到制备方法三步骤B的反应产物的有机溶剂溶液中，搅拌反应形成氨基酰化保护，反应完全后，回收溶剂，反应物进行纯化，得到目标化合物。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于制备方法一中异氰酸酯选自4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯、2,4-二氯苯异氰酸酯、4-甲基苯异氰酸酯、4-甲基硫代苯异氰酸酯、2-氯苯异氰酸酯、2-甲基苯异氰酸酯、4-三氟甲基苯异氰酸酯、4-氟苯异氰酸酯中的一种。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于制备方法二中羧酸或酰氯选自4-氯-3-三氟甲基苯甲酸、4-氯-3-三氟甲基苯甲酰氯、反式肉桂酸、反式肉桂酰氯、(2E)-4-二甲基氨基-2-丁烯酸、(2E)-4-二甲基氨基-2-丁烯酰氯、烟酸、烟酰氯、5-[(3,4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酸，4-(4-甲基-1-哌嗪基甲基)-苯甲酸中的一种。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于制备方法三步骤A中的缩合催化剂选自三乙胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或N,N-二异丙基乙胺中的一种。
8.如权利要求1所述衍生物及其药学上可接受的盐类作为抗癌药物的应用。
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