CN107475197B - 一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，具体为：在加入无菌采血袋的抗凝剂中添加80～120ng/ml环孢素A，在羟乙基淀粉溶液沉降剂中添加30～70ng/ml环孢素A，于密封的低氧工作站内进行造血干细胞的全程提取过程；所述低氧工作站设有两侧独立的操作台和一个转移闸，两侧操作台氧气浓度设置为3～8％，一侧操作台温度设为3～10℃，用于进行包括试剂的配制和分装、脐带血的转移、脐带血造血干细胞的冻存，另一侧操作台温度设为18～25℃，用于进行包括脐带血的沉降、脐带血的分浆、分浆后的离心。本发明方法可提取获得数量更多、状态更原始、增殖和分化能力更强的造血干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及脐带血造血干细胞的提取方法，具体涉及一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)是一小群具有高度自我更新和多向分化潜能的造血前体细胞。目前已证实HSC至少能分化成12个系列的血细胞及其它细胞，包括红细胞、粒细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞、血小板、淋巴总细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞，以及骨髓中的成骨细胞及成纤维细胞。所以，造血干细胞移植是治疗恶性血液性疾病和某些免疫疾病的重要手段。目前，用于临床的造血干细胞主要来源于骨髓和脐带血。
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后才残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近年研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植。与非血缘骨髓移植相比，脐带血移植具有以下优点：(1)脐带血来源丰富；(2)采集方便，对产妇和胎儿无任何损害；(3)与非血缘骨髓库不同，脐带血是以实物的形式保存，不会被供者拒绝；(4)寻找HLA相合脐带血所需时间短，可根据患者需要及时进行移植；(5)脐带血中免疫细胞不成熟，移植后急、慢性GVHD的发生率低且严重程度较轻，可耐受较大的HLA差异，故脐带血库较骨髓库需要较少的供者；(6)脐带血中各种病毒感染的机会较小，移植后病毒性疾病发生率低。
然而，目前脐带血用于临床存在不足之处，其中最关键的技术瓶颈是脐带血血量有限，细胞数量少，此外，正常的造血干细胞驻留在骨髓、脐带血、胎盘的低氧环境中，但目前几乎所有的造血干细胞研究都是在非生理条件的环境空气(即常氧)中进行的，其中包括造血干细胞的分离和提取，然而暴露在环境空气中会造成非生理学氧气应激(EPHOSS，extraphysiologic oxygen shock/stress)，当细胞内氧气浓度突然升高，细胞内多种活性氧(ROS)增高，正常细胞对氧化应激做出反应，导致P53积累于线粒体基质，触发线粒体通透性转换孔(mPTP)开启，使得膜电化学梯度瓦解，凋亡因子释放入细胞质中，最终导致细胞凋亡，会降低造血干细胞的收集和扩增过程的细胞得率，同时会促进干细胞的分化。综上，传统方法收集到的造血干细胞数量是严重低于实际含量的，且原始性低，大大限制了其在成人移植上的应用。
因此，如何从脐带血中提取到数量更多、状态更原始、增殖能力更强的造血干细胞是解决上述问题的关键，也是目前行业内亟待解决的技术问题。
发明内容
针对传统脐带血造血干细胞提取方法存在的弊端，申请人进行研究及改进，提供一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，该方法可提取获得数量更多、状态更原始、增殖和分化能力更强的脐带血造血干细胞。
为了解决上述问题，本发明采用如下方案：
一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：在加入无菌采血袋的抗凝剂中添加80～120ng/ml环孢素A，在羟乙基淀粉溶液沉降剂中添加30～70ng/ml环孢素A，于密封的低氧工作站内进行造血干细胞的全程提取过程；所述低氧工作站设有两侧独立的操作台和一个转移闸，两侧操作台氧气浓度设置为3～8％，一侧操作台温度设为3～10℃，用于进行试剂的配制和分装、脐带血的转移、脐带血造血干细胞的冻存，另一侧操作台温度设为18～25℃，用于进行脐带血的沉降、脐带血的分浆、分浆后的离心。
作为优选，于操作前3小时打开所述低氧工作站，将所使用试剂、耗材和设备进行氧气浓度和温度平衡。
更优选地，在进行所述氧气浓度和温度平衡的过程中，将75％医用酒精放入所述转移匣，将DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液放入温度设为3～10℃的所述操作台，将羟乙基淀粉溶液放入温度设为18～25℃的操作台，将耗材放入3～10℃的所述操作台。
更优选地，在进行所述氧气浓度和温度平衡的过程中，将所述试剂和耗材的包装或封盖打开，以排除包装或腔体内多余的氧气。
作为优选，所述抗凝剂中添加100ng/ml环孢素A，所述羟乙基淀粉溶液沉降剂中添加50ng/ml环孢素A。
作为优选，两侧所述操作台氧气浓度设置为5％，其中一侧所述操作台温度设为5℃，另一侧操作台温度设为20℃。
作为优选，所述脐带血的沉降步骤和所述脐带血的分浆步骤在二联袋中进行，所述脐带血的分浆步骤采用血液分浆夹。
作为优选，所述血浆的离心步骤具体参数为：1800rpm/min，离心10min。
具体地，所述转移闸用于所述操作台之前的物料传递，所述操作台与外界的物料传递，将操作期间产生的废弃物转移出所述低氧工作站。
作为优选，每100ml所述抗凝剂中含40mg肝素、0.9g氯化钠、10mg环孢素A，其余为无菌超纯水；每100ml所述羟乙基淀粉溶液(Hespan)沉降剂中含有0.9g氯化钠、6g羟乙基淀粉(Hetastarch)、5mg环孢素A，其余为无菌超纯水。
本发明的有益技术效果在于：
1.本发明创造性地将低氧工作站运用脐带血造血干细胞提取全过程，提供了一个严格模拟生物体内的稳定低氧环境(分为左右两个操作台和中间一个转移匣，两侧操作台独立制冷和送风，氧气浓度设置为5％，模拟脐带血的生理氧压)，可精确控制站内气体浓度、温度和湿度，并拥有ISO4级HEPA过滤系统，达到十级洁净程度，将试剂的配制和分装、脐带血的转移、冻存以及脐带血的沉降、分浆、血浆的离心等不同步骤的操作定位于不同的温控区域内(分别优选为20℃和5℃)，提前开启低氧工作站并放置相应试剂、耗材和设备进行氧气浓度和温度平衡，最大程度地克服了脐带血造血干细胞因短暂高氧产生的非生理氧压应激(EPHOSS)。
2.本发明在抗凝剂和沉降剂中添加特定比例(分别优选为100ng/ml和50ng/ml)的环孢素A，环胞素A作为mPTP的抑制剂能够保证在短暂处于空气常氧的脐带血造血干细胞避免发生EPHOSS反应，从而减少了脐带血造血干细胞的凋亡数目或减缓了造血干细胞的凋亡进程，增加了可用于移植的造血干细胞数目。
本发明为脐带血造血干细胞的提取了提供一个完全模拟生物体内的低氧环境，并克服因短暂高氧产生的非生理氧压应激(EPHOSS)，与现有方法相比，可提取获得数量更多、状态更原始、增殖和分化能力更强的造血干细胞，解决了造血干细胞在成人移植应用上的限制难题。
附图说明
图1实施例低氧工作站的结构示意图。
图2实施例二联袋的结构示意图。
图3实施例血液分浆夹示意图。
图4为实施例冻存袋结构示意图。
图5为实施例流式检测图谱。
图6为实施例成集落鉴定的集落形成图一。
图7为实施例成集落鉴定的集落形成图二。
图8为实施例成集落鉴定的集落形成图三。
图9为实施例成集落鉴定的集落形成图四。
图中：1、左侧操作台；2、右侧操作台；3、转移匣；4、控制面板；5、操作口；7、主袋；8、转移袋；9、进液管；10、挂孔；11、转移管；12、滚夹；13、塑料板；14、挂钩；15、手柄；16、冻存袋；17、鲁尔固定接头；18、滚夹；19、进样口；20、密封区。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特殊说明，以下实施例所使用试剂、耗材和设备均为市售通用产品。
所用试剂、耗材和设备：羟乙基淀粉(Hetastarch)、羟乙基淀粉溶液(Hespan)、肝素、环孢素A、DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液、75％医用酒精、封口膜、2ml一次性无菌注射器、50ml一次性无菌注射器、25ml移液管、二联袋、50ml离心管、EP管、低氧工作站、低温高速离心机、血浆分浆夹。
脐带血来源：脐带血来源于宿迁市妇幼保健院妇产科产妇捐赠，捐赠者事先签署知情同意书和捐赠协议，捐赠对象家族中无遗传性疾病和先天性疾病史；年龄20～36周岁，妊娠34～42周，非双胎、多胎、试管婴儿；妊娠期血液检测地中海贫血、肝功能、乙肝、丙肝抗体、艾滋病毒抗体、梅毒、巨细胞病毒及其他传染病毒感染，无接受器官和组织移植；孕期无妊娠合并症及并发症，近1年未接受过输血；产前体温正常、胎膜早破未超过24小时，无感染，无胎盘早剥、脐带畸形。
实施例1实验准备
1.1低氧工作站的设置
低氧工作站的结构示意图如图1所示。低氧工作站(购自Ruskinn公司)模拟生物体内环境，可精确控制站内气体浓度、温度和湿度，并拥有ISO4级HEPA过滤系统，达到十级洁净程度。低氧工作站工作区分为左右2个操作台(左侧操作台1、右侧操作台2)，以及中间的1个转移匣3，两个操作台之间的物料传递和操作台与外界的物料传递都可以经过转移匣完成。
本实验所有无菌操作均通过操作口5在低氧工作站中进行，实验前3小时打开低氧工作站，通过控制面板4设置氧气浓度为5％，左侧操作台温度为5℃，右侧操作台温度为20℃，对相应试剂、耗材和设备进行氧气浓度和温度平衡。无菌操作包括试剂的配制或分装、设备与耗材的准备和具体的实验操作。
1.2试剂的配制或分装
1.2.1抗凝剂：在低氧工作站左侧操作台中配制抗凝剂，每100ml抗凝剂中含40mg肝素、0.9g氯化钠、10mg环孢素A及无菌超纯水。
选取容量为200ml的无菌采血袋，每袋平均注入30ml抗凝剂。检查采血袋的完整性和气密性，将其放入冰箱，4℃保存，备用。
1.2.2羟乙基淀粉溶液(Hespan)：在低氧工作站左侧操作台中配制羟乙基淀粉溶液。100ml羟乙基淀粉溶液(Hespan)中含有0.9g氯化钠、6g羟乙基淀粉(Hetastarch)、5mg环孢素A。
1.2.3其他试剂配制和分装：
在低氧工作站左侧操作台中进行其他试剂的配制或分装。如75％医用酒精、DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液。配制或分装完成后，用封口膜封好，检查气密性，放入医用冷藏冰箱保存。实验前3小时取出，放入低氧工作站，其中，75％医用酒精放入转移匣，DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液放入左侧操作台，特别的，Hespan放入右侧操作台，20℃进行温度平衡。
1.3耗材的准备
实验前3个小时，将足量的各类试剂耗材经医用酒精对其表面包装消毒后放入低氧工作站的左侧操作台1上。所有耗材，如移液管、离心管、注射器、EP管、二联袋、冻存袋、降温冰袋等在实验前都打开包装或封口，平衡氧浓度3小时。
实施例2脐带血的采集
产前准备好含抗凝剂的无菌采血袋，胎儿娩出后，立即穿刺脐带静脉采集脐带血。脐带血采集在胎儿娩出2min内完成。脐带血的采集量超过60ml为合格。检查采集袋的完整性，确保无液体泄漏。采集好的脐带血放置于保温箱，保温箱中温度控制在2～10℃。运输至实验室。若不能立即处理，可将脐带血放置于4℃医用保存箱暂存。脐带血于采集完成后24小时内处理完毕。
实施例3脐带血的处理
二联袋和血液分浆夹的结构示意图分别如图2、图3所示。
3.1脐带血的转移：将二联袋的所有滚夹12关闭。用50ml无菌注射器将脐带血从采血袋吸出，通过进液管9转移至二联袋的主袋7中。将二联袋转移至右侧操作台。移取相应体积的Hespan，通过转移管11加入至脐带血中(脐带血体积∶Hespan体积＝4∶1)，同时轻摇使其充分混匀。
3.2脐带血的沉降：将二联袋主袋7通过挂孔4竖直悬挂于操作台壁的挂钩上，静置约1h，观察脐带血的沉降效果；沉降过程中可见脐带血被分为两层，上层黄色为有核细胞和血浆层，下层为红细胞层。
3.3脐带血的分浆：将血液分浆夹手柄15扣在挂钩14上。沉降完成后，取下二联袋，将二联袋主袋放置在血液分浆夹的两块塑料板13中间。打开两个滚夹12，缓慢松开血液分浆夹的手柄15，此时两块塑料板13向中间靠拢，压出上层的血浆层通过转移管11进入转移袋8中，红细胞层留在主袋7中。
3.4离心：提前设置好离心机使用温度为4℃。将移出的血浆细胞悬液从转移袋8转移至50ml离心管中，1800rpm/min，离心10min。留取细胞沉淀加上层血浆共21.5ml，重悬胞沉淀，混匀后，用移液管吸取1.5ml细胞悬液转移至1个1.5ml EP管中，用于检测并计算有核细胞总量、流式检测、成集落鉴定。
实施例4脐带血造血干细胞的冻存
冻存袋结构示意图如图4所示。
4.1将上述离心管转移至左侧操作台1。检查冻存袋，去除外包装后，用挤压法及目测检查法检查冻存袋是否有漏气，确保所用的冻存袋的密封、完整性。
4.2关闭滚夹12，用20ml的无菌注射器抽取最终的20ml的造血干细胞悬液，从进样口19缓慢推入造血干细胞进入冻存袋16中，推完后，松开滚夹12，将冻存袋竖立起来，拧开鲁尔固定接头17的螺帽，用手轻轻挤压，将里面的空气进行排出。
4.3关闭滚夹12，用无菌注射器移取5ml DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液，将注射器连接到注射泵上，设置好注射泵的推注速度(30ml/h)，将冻存袋16夹在两个降温冰袋之间，从进样口缓慢推注冻存液进入冻存袋16中，边推边轻柔按压冰袋，确保冻存液与造血干细胞进行充分混匀，持续约10min。
4.4推开滚夹12，在冻存袋16接口的密封区20处预留一段约1ml的造血干细胞，用高频热合机进行两段的封口，每段最少含200ul细胞悬液，然后放置入外包装袋中，并用手压式封口机对外包装袋进行二次封装，保证样本的完整性，不泄露。
4.5将冻存袋转移至程序降温仪进行降温，降温程序如下：
第1步样本温度维持20.0℃；
第2步以1.0℃/min降温至-6.0℃
第3步以25.0℃/min降温至-50.0℃
第4步以10.0℃/min升温至-14.0℃
第5步以1.0℃/min降温至-45.0℃
第6步以10.0℃/min降温至-90.0℃
第7步结束
4.6将冻存袋转移至液氮罐，深低温长期保存。
实验结果及分析
1.有核细胞回收率
对照脐血处理前与处理后的有核细胞总量(共测试5例)，如表1所示，测得有核细胞总量回收率平均在85％左右。
表1 有核细胞总量回收率、CD34+细胞含量分析
2.流式检测
CD34分子在造血干/祖细胞上表达的发现，是现今评估临床造血干细胞移植的有利工具。而流式细胞术计数CD34+细胞因具有快速、简便、可定量等特点，广泛应用于移植物中造血干/祖细胞的数量的检测。本发明采用流式细胞术鉴定CD34+细胞占脐带血中有核细胞总量的比例来验证实验结果(共测试5例)。如表1所示，经分析，从低氧条件下获取的脐带血有核细胞中，CD34阳性细胞占比平均为0.66±0.16％，而一般常氧条件下CD34阳性细胞获取率为0.39±0.12％。结果提示，本发明方法与常规方法相比显著提高了CD34阳性细胞的获取率。
上述第5例样本CD34阳性细胞流式分析数据如表2所示。
表2 CD34阳性细胞流式分析数据
如图5所示为流式检测图谱，其中，A：CD45/侧向角散射(SSC)，显示含红细胞、碎片在内的所有细胞，设定R1门：包括所有CD45+及CD45dim+，以确定CD45阈值，R5为淋巴细胞。B：CD34/SSC，显示R1门内细胞，设定R2门：包括所有CD34+及SSC从低到中等强度的细胞。C：CD45/SSC，显示Ri+R2门内细胞，设定R3门：确认CD34+细胞位于CD45弱阳性与SSC低的区域。D：前向角散射(FSC)/SSC，选取R1+R2+R3门内细胞，R4用于去除细胞碎片和聚集血小板的影响。以上参照血液病治疗与移植国际联合会方案ISHAGE方案设门策略。
3.成集落测试(Colony Forming Unit，CFU)
CFU检测是唯一一种可以直接衡量个体造血干细胞扩增潜能的检测，一份脐血中的CFU总数是用来预测脐带血移植后的血细胞复苏及存活的最佳单一参数。
在包含生长因子和添加物的半固体培养基中接种有核细胞，接种量为1×105。放入低氧培养箱，氧气浓度设置为5％，温度设置为37℃。每天定时观察，于第6天开始有集落形成，第14天看到集落形成良好，数目多，且明显。结果提示，本实施例提取的脐血造血干细胞在体外有良好的增殖和分化能力。
集落形成图参见图6、图7、图8和图9。
图6：CFU-E(集落形成单位-红系)(40×)；
图7：BFU-E(集落形成单位-爆红系)(40×)；
图8：CFU-GM(集落形成单位-粒细胞-巨噬细胞)(40×)；
图9：CFU-GEMM(集落形成单位-粒细胞-红系-巨噬细胞-巨核细胞)(40×)。
表3 集落计数结果统计
集落鉴定参考加拿大STEM CELL公司《人造血干/祖细胞形成集落的鉴定》。
以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部改动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。
Claims (10)
1.一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：在加入无菌采血袋的抗凝剂中添加80～120ng/ml环孢素A，在羟乙基淀粉溶液沉降剂中添加30～70ng/ml环孢素A，于密封的低氧工作站内进行造血干细胞的全程提取过程；所述低氧工作站设有两侧独立的操作台和一个转移闸，两侧操作台氧气浓度设置为3～8％，一侧操作台温度设为3～10℃，用于进行试剂的配制和分装、脐带血的转移、脐带血造血干细胞的冻存，另一侧操作台温度设为18～25℃，用于进行脐带血的沉降、脐带血的分浆、分浆后的离心。
2.根据权利要求1所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：于操作前3小时打开所述低氧工作站，将所使用试剂、耗材和设备进行氧气浓度和温度平衡。
3.根据权利要求2所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：在进行所述氧气浓度和温度平衡的过程中，将75％医用酒精放入所述转移匣，将DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液放入温度设为3～10℃的所述操作台，将羟乙基淀粉溶液放入温度设为18～25℃的操作台，将耗材放入3～10℃的所述操作台。
4.根据权利要求2所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：在进行所述氧气浓度和温度平衡的过程中，将所述试剂和耗材的包装或封盖打开，以排除包装或腔体内多余的氧气。
5.根据权利权要求1所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：所述抗凝剂中添加100ng/ml环孢素A，所述羟乙基淀粉溶液沉降剂中添加50ng/ml环孢素A。
6.根据权利权要求1所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：两侧所述操作台氧气浓度设置为5％，其中一侧所述操作台温度设为5℃，另一侧操作台温度设为20℃。
7.根据权利要求1所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：所述脐带血的沉降步骤和所述脐带血的分浆步骤在二联袋中进行，所述脐带血的分浆步骤采用血液分浆夹。
8.根据权利要求1所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：所述血浆的离心步骤具体参数为：1800rpm/min，离心10min。
9.根据权利要求1所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：所述转移闸用于所述操作台之前的物料传递，所述操作台与外界的物料传递，将操作期间产生的废弃物转移出所述低氧工作站。
10.根据权利要求1所述的在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：每100ml所述抗凝剂中含40mg肝素、0.9g氯化钠、10mg环孢素A，其余为无菌超纯水；每100ml所述羟乙基淀粉溶液沉降剂中含有0.9g氯化钠、6g羟乙基淀粉、5mg环孢素A，其余为无菌超纯水。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 214000 fifteenth level house, Fuan mansion 727, Jiefang South Road, Wuxi, Jiangsu. Applicant after: Hilary Stem Cell Technology Co., Ltd. Address before: 214000 fifteenth level house, Fuan mansion 727, Jiefang South Road, Wuxi, Jiangsu. Applicant before: Jiangsu Xi Rui stem cells technology company limited |
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| GR01 | Patent grant | ||
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