CN107456466A - 神经保护性灵芝组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供治疗例如帕金森病和阿尔茨海默病的变性神经疾病的方法，包括给予灵芝提取物。本发明还提供通过对小胶质细胞施用灵芝提取物抑制所述细胞活化的方法。

Description

神经保护性灵芝组合物及其使用方法

本申请为分案申请，其原申请的申请日为2010年4月29日，申 请号为201080029152.4，名称为“神经保护性灵芝组合物及其使用方 法”。

相关专利申请的交叉引用

该申请要求享有2009年4月29日提交的美国临时申请No. 61/173,802的权益，其以引用的方式全文纳入本文。

背景技术

帕金森病(PD)是一种常见的神经变性疾病，导致运动缓慢、僵硬、 休息性震颤和平衡失调。随着所述疾病的发展，很多患者出现非运动性 症状，包括焦虑、沮丧、便秘和痴呆。

尽管有药物可以减轻PD症状，但是长期使用这些药物并不能够有 效地阻止PD的发展，并且带来使得削弱的副作用。因此很需要开发旨 在减缓甚至停止所述神经变性发展的神经保护性疗法。

遗憾的是，对例如PD的变性神经疾病发病机理所知有限阻碍了对 有效神经保护性疗法的开发。PD中神经元变性的病因和发病机理仍然未 知。多项证据支持这样的理论，即小胶质细胞的活化和炎性过程参与导 致进行性神经变性的级联事件(Kreutzberg,G.W.,1996,Trends Neurosci., 19:312-318；Miller,G.,2005,Science,308:778-781)。患有PD的患者的黑 质中的变性神经元的附近有很多活化的小胶质细胞(McGeer,P.L.etal., 1988,Neurology,38:1285-1291)。

小胶质细胞，中枢神经系统的常驻先天免疫细胞，在神经炎性过程 中起重要作用。小胶质细胞可被活化并通过两种机制引起神经毒性 (Block,M.L.et al.,2007,Nat.Rev.Neurosci.,8:57-69)。首先，小胶质细胞 能够通过以下机制启动神经元损伤：识别炎性触发因子例如LPS和其他 毒素(Gao,H.M.et al.,2002,J.Neurochem.,81:1285-1297)，被活化并且产 生神经毒性促炎因子和细胞因子。结果，这些因子能够耗尽DA神经元的抗氧化剂，损伤线粒体功能，抑制谷氨酸的再摄入(Persson,M.et al., 2005,Glia,51:111-120)，以及启动CNS组织损伤(Taupin,V.et al.,1997, European Journal ofImmunology,27:905-913)。此外，例如TNF-α的细 胞因子能够活化其他休眠的小胶质细胞，增强炎性反应，其导致ROS、 NO和超氧自由基自动参与形成高度氧化的过氧亚硝酸盐(peroxynitrite)(Mosley,R.L.et al.,2006,Clin.Neurosci.Res.,6:261-281； Tansey,M.G.et al.,2007,Exp.Neurol.,208:1-25)。SN中的TNF依赖的 小胶质细胞活化通过NADPH氧化酶的活化而产生氧化应激环境 (Mander,P.K.et al.,2006,The Journal ofImmunology,176:1046-1052)。

已证明IL-1β通过破坏血脑屏障参与CNS炎症的发展，破坏血脑屏 障使白细胞容易渗入CNS(Gao,H.M.et al.,2002,J.Neurochem., 81:1285-1297；Wen,L.L.et al.,2007,Exp.Neurol.,205:270-278)。NO是 膜透性的，NO过度积累能够与超氧化物反应形成过氧亚硝酸盐，其能 够攻击并修饰蛋白质、脂质和DNA并且耗尽抗氧化防御系统(Persson,M. etal.,2005,Glia,51:111-120；Taupin,V.et al.,1997,European Journal of Immunology,27:905-913)。大量源自小胶质细胞的ROS，例如超氧化物， 不能有效地穿越细胞膜，这使得这些细胞外ROS不太可能到达多巴胺能 神经元并引发神经元内的毒性事件，然而，超氧化物能够在细胞外空间 迅速地与NO反应形成更稳定的氧化物，其能够容易地穿过细胞膜并破 坏邻近神经元的细胞内组分(Mosley,R.L.et al.,2006,Clin.Neurosci. Res.,6:261-281)。

所有这些因子都能够活化一个关键的转录因子——NF-κB，其能够 上调导致神经元死亡的促凋亡基因(Baeuerle,P.A.and Heknel,T.,1994, Annu.Rev.Immunol.,12:141-179；Delhase,M.et al.,2000,Nature (London),406:367-368)。

第二，小胶质细胞响应神经元损伤而变得过度活化，这随后对邻近 神经元具有毒性(Block,M.L.and Hong,J.S.,2005,Prog.Neurobiol., 76:77-98；Teismann,P.et al.,2003,Mov.Disord.,18)，导致神经元死亡的 持续循环。

多项研究发现损伤的DA神经元释放基质金属蛋白3(MMP3)(Kim, Y.S.et al.,2005,J.Neurosci.,25:3701-3711)、α-突触核蛋白(α-synuclein) (Zhang,W.et al.,2005,The FASEB Journal,19:533-542)和神经黑色素 (neuromelanin)(Kim,Y.S.et al.,2005,J.Neurosci.,25:3701-3711；Zecca, L.et al.,2003,Trends Neurosci.,26:578-580)，这些物质看来会激活小胶质 细胞并且引起PD中的神经元变性。所有这些事件形成导致进行性神经 元变性的恶性循环。

灵芝(Ganoderma lucidum)被广泛用作促进健康的可选药物。研 究表明从灵芝中提取的组分有药理学作用，包括免疫调节、抑制炎症并 且清除自由基。此外，已经发现灵芝提取物具有抗肿瘤作用(例如，美国 专利No.6,613,754；7,135,183)。

然而，还没有报道灵芝能够减弱小胶质细胞对外源或内生刺激的炎 性应答并且/或者保护多巴胺能神经元不变性。

发明内容

本发明提供使用灵芝提取物治疗变性神经疾病(例如帕金森病 (PD))的材料和方法。根据本发明，灵芝提取物被发现具有神经保护 性。在一个具体的实施方案中，根据本发明可使用灵芝提取物抑制小胶 质细胞的活化。

在一个实施方案中，灵芝提取物的保护效应可归因于灵芝抑制通过 LPS和暴露于MPP+的细胞膜两者产生小胶质细胞源毒性因子(NO、 TNF-α、IL-1β和超氧化物)的能力。因此，灵芝根据本发明能够用于治 疗变性神经疾病。

在一方面，本发明提供抑制黑质中小胶质细胞活化的方法。在一个 优选的实施方案中，该方法包括将有效量的灵芝提取物给予需要该治疗 的受试者。

有利地，灵芝的副作用很小，使得其适于人长期使用。

因此，本发明提供用于治疗患有变性神经疾病的患者的方法，包括 给予有需要的所述患者有效量的灵芝提取物。

序列说明

SEQ ID NO:1是本发明的白细胞介素-1β(IL-1β)的正向引物。

SEQ ID NO:2是本发明的白细胞介素-1β(IL-1β)的反向引物。

SEQ ID NO:3是本发明的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的正向引物。

SEQ ID NO:4是本发明的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的反向引物。

附图说明

图1A-D显示用OX-42标记的大鼠小胶质细胞的形态学。将大鼠小 胶质细胞用载体孵育24小时(a,100×；b,400×)，用LPS 0.25μg/ml孵育 24小时(c,100×；d,400×)。注意小胶质细胞在用LPS处理后变成变形虫 样形态。比例尺表示100μm。

图2显示LPS和MPP⁺处理的MES 23.5细胞膜(CF)对小胶质细胞的 活化效应。通过测量TNF-α、IL-1β、NO和超氧化物的水平来确定小胶 质细胞的活化。

图3显示灵芝对LPS或CF刺激的一氧化氮(NO)产生的效应。将培 养物用载体或指定浓度的灵芝处理30分钟，然后用0.25μg/ml LPS或 150μg/ml CF(对照)处理。收集培养物上清液并分析NO。数据表示为相 对于对照组的倍数增加并且以一式三份进行的两个试验的平均值±S.D 示出：*p<0.01，与LPS处理的培养物相比；**p<0.05，与CF组相比，。

图4显示灵芝对LPS或CF引发的超氧化物产生的效应。将培养物 用载体或指定浓度的灵芝处理30分钟，然后用0.25μg/ml LPS或 150μg/ml CF(对照)处理。用SOD分析试剂盒-WST来测量超氧化物产 生。数据表示为相对对照组的倍数增加。结果是一式三份测定的平均值 ±SD，并且是两个独立实验的代表值：*p<0.001，与LPS处理的对照 相比；**p<0.05，与CF组相比。

图5A-B显示灵芝对LPS或CF诱导的TNF-α和IL-1β释放的效应。 将培养物用载体或指定浓度的灵芝处理30分钟，然后用0.25μg/ml LPS 或150μg/ml CF(对照)处理。如材料和方法部分所述确定TNF-α和IL-1β 水平。数据表示一式两份进行的两个试验的平均值±S.D：*p<0.05，** p<0.001，对对照组。#p<0.001，##p<0.001，对对照组。

图6A-B显示灵芝对小胶质细胞中的各种炎性细胞因子的mRNA水 平的效应。提取总RNA继而对其进行实时PCR。数据表示为对照组(LPS 或CF组)的百分比，其从平均阙循环值计算并且表示为平均值±S.D。 将一组实验的RNA样本一式三份进行测定。制备来自不同组培养物的独 立RNA制品，并将其用于复制分析，所述分析产生类似的结果。

图7显示小胶质细胞对MPP⁺诱导的MES 23.5细胞培养物中[³H]多 巴胺摄入下降的效应。如材料和方法部分所述评估[³H]多巴胺的摄入。 用载体(对照)和MPP⁺100μm处理所述培养物，并且用灵芝400μg/ml 预处理特定组。数据表示为多巴胺摄入的百分比并且以平均值±S.D表 示。一式两份的实验产生相似的定性结果：*p<0.001，与对照相比，**p <0.05，与MPP+处理的MES培养物相比，#p<0.001。

图8显示LPS活化的小胶质细胞对MES 23.5细胞培养物中[³H]多巴 胺摄入的下降的效应。用载体(对照)和LPS 0.25μg/ml处理所述培养 物，并且用灵芝400μg/ml预处理特定组。数据表示为多巴胺摄入的百 分比并且以平均值±S.D表示：*p<0.05，与对照相比；#p<0.01，与LPS 组相比。

具体实施方式

本发明提供使用灵芝提取物治疗变性神经疾病的材料和方法。根据 本发明，灵芝提取物被发现具有神经保护性。在一个具体的实施方案中， 可根据本发明使用灵芝提取物用于治疗神经变性疾病，例如，帕金森病 (PD)、阿尔茨海默病(AD)和/或抑制小胶质细胞的活化。

在一个实施方案中，灵芝提取物的保护效应可归因于灵芝抑制小胶 质细胞源毒性因子产生的能力。这些因子可以是，例如，NO、TNF-α、 IL-1β和/或超氧化物。因此，由于活化的小胶质细胞被认为是神经元变 性的原因，因此可根据本发明使用灵芝提取物来治疗变性神经疾病。

在一个方面，本发明提供抑制黑质中的小胶质细胞活化的方法。在 一个优选的实施方案中，该方法包括将有效量的灵芝提取物给予需要这 种治疗的受试者。

因此，本发明提供治疗患有变性神经疾病的患者的方法，包括给予 所述患者有效量的灵芝提取物。

有利地，灵芝的副作用很小，使得其适于人长期使用。灵芝提取物 可通过，例如，热水提取和醇提取来制备。

在一个实施方案中，通过低温提取用甲醇从灵芝的子实体制备灵芝 提取物。在一个具体的实施方案中，以灵芝的子实体计多糖的收率为约0.6％(w/w)，而麦角甾醇的收率为约0.35％(w/w)。

根据本发明，灵芝提取物被发现通过减少小胶质细胞源NO、TNF-α、 IL-1β和超氧化物的产生而显著抑制小胶质细胞的活化(图3、4和5)。 灵芝以浓度依赖的方式减少由小胶质细胞活化诱导的NO、TNF-α、IL-1β 和超氧化物的水平。灵芝提供的小胶质细胞抑制被TNF-α和IL-1β的 mRNA表达(与其减少TNF-α和IL-1β产生的能力一致)进一步证实。

除了抑制小胶质细胞活化，灵芝还能用于通过阻止由小胶质细胞诱 导的神经变性而保护多巴胺能神经元。在PD中，黑质细胞变性伴随小 胶质细胞活化，甚至是小胶质细胞活化在前，黑质细胞变性在后，所述 小胶质细胞活化可能是由环境或内部毒性反应引发的。小胶质细胞活化 (由LPS诱导)能够引发神经变性，并且小胶质细胞能够使MPP⁺诱导 的多巴胺能神经变性恶化。有利地，使用灵芝可以逆转小胶质细胞源损 伤，并且DA摄入显著增加(图7和8)。在MPP⁺模型中，灵芝的保护 性功能对于神经元-神经胶质共培养物或MES23.5细胞共培养物没有差 异。

因此，本发明提供通过给予有效量的灵芝提取物来抑制小胶质细胞 活化的方法。与所述小胶质细胞接触的灵芝提取物的浓度优选超过100 μg/ml，更优选超过200μg/ml，最优选超过400μg/ml。

本发明还提供治疗变性神经疾病的方法，包括将有效量的灵芝提取 物给予有需要的患者。

可根据本发明治疗的患者可以是向其提供用灵芝提取物治疗的任何 生物，包括哺乳动物。可从所公开的化合物和治疗方法受益的哺乳动物 种类包括但不限于猿、黑猩猩、、猩猩、人、猴；以及驯化动物(即宠物)， 例如马、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。有利地，本发明可长期用 于保护性目的或者用于治疗已经形成的疾病和病症。

可根据本发明用灵芝提取物治疗的变性疾病、失调和病症的实例包 括但不限于神经和神经变性疾病和病症，例如帕金森病、阿尔茨海默病、 肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化、周围神经病、带状孢疹、中风、 外伤；神经学手术的各种神经变性后果；精神分裂症；癫痫、唐氏综合 症和特纳综合征。

前述可根据本发明治疗的疾病和病症清单并非是穷举性或限制性 的，而是对这样的变性神经疾病和病症的举例。

本发明的另一方面提供包含灵芝提取物的组合物。所述组合物还可 以包括可药用的载体、添加剂或赋形剂。灵芝提取物和其他组分的比例 可由所述提取物的溶解性和化学特性、选择的给药途径和标准医疗实践 来确定。

治疗有效量会随着待治疗的病症、其严重程度、欲使用的治疗方案 和所用试剂的药物代谢动力学以及待治疗的患者而变化。

可根据用于制备可药用组合物的已知方法来配制本发明的灵芝提取 物。制剂在很多广为人知并且本领域技术人员容易得到的资料来源中有 描述。例如，Remington’sPharmaceutical Science(Martin E W[1995] Easton Pa.,Mack Publishing Company,19^th ed.)描述了可与本发明结合 使用的制剂。

适于肠胃外给药的制剂包括，例如水性无菌注射溶液，其可包含抗 氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，它们使所述制剂与目的接受对象的血 液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。所 述制剂可存在于单剂量或多剂量容器中，例如密封安剖和小瓶，并且可 储存在仅需注射用无菌液体载体(例如水)的冷冻干燥(冻干)条件下。临时注射溶液和悬浮液可从无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应理解，除 了上文具体提及的组分，本发明的制剂还可包含本领域常规的与目的剂 型有关的其他试剂。

本发明的灵芝提取物还可按照中医实践来配制。对治疗具体疾病、 病症或失调有效的所述制剂的组成和剂量将取决于由标准临床技术确定 的疾病、病症或失调的性质。

可将处方量的中药容易地制成适于给予人或动物的任意形式的药 物。合适的形式包括，例如，酊剂、煎剂和干燥提取物。这些可口服摄 入，通过静脉注射施用或通过黏膜施用。所述活性成分还可配制为胶囊 剂、粉剂、pallets、锭剂、栓剂、口服溶液剂、经巴氏消毒的胃肠悬浮 注射剂、少量或大量注射剂、冻粉注射剂、经巴氏消毒的粉末注射剂等。 所有上述方法都是本领域技术人员已知的、在书中有描述的并且是中草 药从业者通常使用的。

酊剂是通过将草药悬浮于酒精溶液例如果酒或白酒中制备的。在一 段时间的悬浮后，可每天2次或3次，每次一茶匙给予所述液体(所述 酒精溶液)。

煎剂是一种常见形式的草药制剂。其通常在陶罐中制备，但也在玻 璃、搪瓷或不锈钢容器中制备。可将所述制剂在水中浸泡一段时间然后 煮沸，继而慢炖直到水量减少例如一半。

提取物是草药必要组分的浓缩制品。通常通过将草药悬浮在合适选 择的溶剂中来从所述草药提取必要组分，所述溶剂一般是水、乙醇/水混 合物、甲醇、丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有机溶剂。可 通过浸解、渗滤、再渗滤、逆流提取、涡轮提取的方法，或者通过二氧 化碳超临界(温度/压力)提取来进一步促进提取过程。过滤除去草药残 渣之后，可将所提取的溶液进一步蒸发浓缩以得到软浸膏(流浸膏 (extractum spissum))并且/或者最终得到干燥的提取物——流浸膏， 干燥方法可以是喷雾干燥、真空箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥。可将 软浸膏或干燥提取物再溶于合适的液体中至给药需要的浓度，或者加工 为例如片剂、胶囊剂或注射剂等形式。

本文提及的或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开出版物 都以引用的方式全文纳入本文，包括所有的图和表，引用的程度是它们 不与本说明书的明确教导矛盾。

材料和方法

材料

灵芝提取物由PuraPharm公司(中国广西)慷慨提供。所述提取物 使用甲醇和低温提取技术由子实体制备。使用的提取物由多糖和麦角甾 醇的含量界定。以灵芝的子实体计多糖的收率为0.6％(w/w)，而麦角甾 醇的收率为0.35％。将灵芝在磷酸盐缓冲的盐水中溶解。从Gibco(Grand Island,NY)获得细胞培养试剂，并且从PerkinElmer Life Science(Boston, MA)购买[3H]多巴胺(DA)。脂多糖和格里斯试剂从Sigma(St.Louis,MO) 购买。抗大鼠CD11b的单克隆抗体(OX-42)从Serotec(Oxford,UK)购买。 Diaclone(Besancon,FRA)提供大鼠TNF-α检测ELISA试剂盒，而超氧 化物分析试剂盒-WST和大鼠IL-1βELISA试剂盒分别从Dojindo, Kyushu,JP和IBL(Gunma,JP)购买。实时PCR试剂由Takara(Tokyo,JP) 提供。

小胶质细胞和MES 23.5细胞的培养物

从实验动物中心提供的12-24小时大的Wistar大鼠的脑中分离并纯 化小胶质细胞(Le,W.D.et al.,2001,J.Neurosci.,21:8447-8455)。简要地， 将脑切开并且除去脑膜之后，将组织切碎并用胰蛋白酶(溶于0.1M磷酸 盐缓冲液的0.25％胰蛋白酶-EDTA)在37℃下消化20分钟，用火焰磨光 的巴斯德吸管磨碎并通过200μM的尼龙细胞滤器过滤。在800rpm下 离心5分钟后，将所述组织悬浮于含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中， 并且接种至75cm²瓶中，密度为每瓶5×10⁵/ml细胞。接种两周之后，将 所述瓶在180rpm下震荡4小时，收集漂浮的细胞并在800rpm下离心5 分钟。将所述细胞重悬浮并铺板至96孔板以进行进一步实验处理。

多巴胺能细胞系MES 23.5是由休斯顿贝勒医学院神经病学系 (department ofNeurology,Baylor College of Medicine,Houston)的 Wei-dong Le教授赠送的。所述MES23.5细胞由大鼠胚胎中脑细胞与鼠 N18TG2成神经细胞瘤细胞的体细胞融合产生(Crawford,G.D.et al., 1992,J.Neurosci.,12:3392-3398)。MES 23.5细胞表现出SN致密带(zona compacta)的发育神经元的很多特性，并且对于这样的初始研究有一些 益处，包括比原代培养物具有更大的同质性，并且对自由基介导的细胞 毒性和钙依赖的细胞死亡都敏感。将MES 23.5细胞以10⁴细胞/cm²的密 度接种在聚赖氨酸预包被的24孔板上，并在95％空气/5％CO₂的加湿 培养箱中在添加有Sato组分(Sato’s components)的DMEM中培养。 将一些培养的MES 23.5细胞与小胶质细胞共培养。

为了研究活性小胶质细胞与MES 23.5细胞的相互作用，将小胶质细 胞和MES23.5细胞在24孔培养板上共培养。简要地，将纯化的小胶质 细胞以1×10⁴/孔的密度铺板，1天后以2:1的比例(MES 23.5：小胶质细 胞)加入MES 23.5细胞。在含有2％热灭活的胎牛血清的Sato条件培 养基(Sato’s conditioned medium)中培养所述共培养物。将小胶质细胞 或MES 23.5细胞的培养物单独地或者一起用作为阳性对照的脂多糖 (LPS,0.25μg/ml)、灵芝提取物(50-400μg/ml)或MES 23.5细胞膜组分(150 μg/ml)处理24小时(Le,W.D.et al.,2001,J.Neurosci.,21:8447-8455)。

免疫细胞化学

如之前所述将多聚甲醛固定的细胞培养物进行免疫染色(Gao,H.M. et al.,2002,J.Neurosci.,22:782-790)。用单克隆抗体OX-42将小胶质细胞 染色。简要地，用3％H₂O₂将细胞培养物处理15分钟，然后用合适的 正常血清封闭，之后在4℃用在抗体稀释液中稀释的第一抗体孵育过夜 (Gao,H.M.et al.,2002,J.Neurosci.,22:782-790)。在用合适的生物素化第 二抗体孵育并随后用ABC试剂孵育后，通过用3,3’-二氨基联苯胺(DAB) 显色显现结合的复合物。用Nikon倒置显微镜记录图像。

MES 23.5细胞膜部分的制备

使MES 23.5细胞接触MPP+10μM 24小时后，将其收集在包含0.25 M蔗糖、100mMPBS、1mM MgCl₂、1mM EDTA和2μM蛋白酶抑制 剂PMSF的缓冲液中，并用玻璃-特氟纶均化器(glass-teflon homogenizer)将其均化(Le,W.D.et al.,2001,J.Neurosci., 21:8447-8455)。然后将均化物在4℃，8000×g下离心10分钟以除去天然 核部分。将上清液在4℃，100000×g下再次离心60分钟。将沉淀均化 并悬浮在培养基中，用作神经元膜部分。

高亲和[3H]多巴胺摄入分析

用1ml Krebs-Ringer缓冲液(16mM NaH₂PO₄,16mM Na₂HPO₄, 119mM NaCl,4.7mMKCl,1.8mM CaCl₂,1.2mM MgSO₄,1.3mM EDTA和5.6mM葡萄糖；pH 7.4)洗涤每孔中的细胞。然后将所述细胞用 Krebs-Ringer缓冲液(10μl/孔)中的10nM[3H]多巴胺在37℃孵育30分 钟(Gao,H.M.et al.,2002,J.Neurosci.,22:782-790)。在接受多巴胺和1 mM诺米芬新(nomifensine，10μl/孔，一种神经元高亲和多巴胺摄入抑 制剂)的平行孔中测量多巴胺的非特异摄入。之后，用冰冷的 Krebs-Ringer缓冲液(1ml/孔)洗涤所述细胞三次，并用1NNaOH(0.5ml/ 孔)裂解。将所述裂解液与3ml的闪烁液(scintillation fluid)混合过夜后，用Perkin Elmer 1450LSC发光计数器(Waltham,USA.)测定放射性。 特异摄入可通过减去对于总活性的非特异计数来确定。

NO分析

通过用Griess试剂检测释放的NO代谢物(硝酸盐和亚硝酸盐)来 对NO的产生进行定量(Mayer,A.M.,1998,Medicina(B Aires), 58:377-385)。暴露于LPS/细胞部分24小时后，收集细胞培养物样本并 通过离心制备无细胞的样本。在室温下将所述培养基用相同体积的 Griess试剂孵育10分钟，之后以合适的标准在LP-400ELISA酶标仪 (DiagnosticsPasteur，Marne-la-Coquette,France)中测量540nm下的吸 光率。

TNF-α、IL-1β和超氧化物分析

类似于NO样本制备样本，并且根据制造商的说明使用兔TNF-α试 剂盒、兔IL-1βELISA试剂盒和超氧化物分析试剂盒-WST测定这些因 子的产生。测量在450nm下进行。

RNA分离和实时PCR

根据制造商的说明书使用RNAprep试剂盒从原代小胶质细胞中提 取总RNA。按照制造商推荐的方法将RNA用随机9mer引物引导并使 用AMV逆转录酶通过逆转录(RT)转变为cDNA(Schell,J.B.et al.,2007, J.Neuroimmunol.,189:75-87；Liu,B.et al.,2000,J.Pharmacol.Exp.Ther., 293:607-617)。然后将得到的cDNA在20μl的反应体系中用含有终浓度 为1×SYBR Green(Molecular Probes)和0.2μM目的引物组的SYBR Premix Ex Taq进行实时PCR。将所述PCR混合物在DNAengine Opticon 2(MJ research；Waltham,MA)上运行。在最初10秒95℃变性步骤后， 所述反应以95℃5s，60℃30s和80℃1s进行35个循环。进行解链曲 线分析以确保从所述反应中得到的产物具有相同并且合适的解链温度。 使用的具体引物在表1中中列出(Schell,J.B.et al.,2007,J. Neuroimmunol.,189:75-87)。目标转录物的定量是基于校准曲线的。以“看 家”基因β-肌动蛋白为内对照基因。通过相应的β-肌动蛋白数据将测试 基因数据标准化。

表1.用于IL-1β和TNF-α扩增的引物和条件

统计学分析

数据表示为平均值±S.D。使用SPSS 11.5以方差分析(ANOVA)继而 以LSD事后检验来评估统计学显著性。p<0.05的值被认为是统计学显 著的。

应理解本文描述的实施例和实施方案仅是出于描述的目的，依照所 述实施例和实施方案的各种修改或改变是可被本领域技术人员预见的， 并且包括在本申请的精神和范围内。

实施例1—LPS和MPP+处理的多巴胺能细胞膜诱导的小胶质细胞 活化

为了建立神经变性中的小胶质细胞活化模型，在小胶质细胞培养物 或者多巴胺能神经元(MES23.5细胞系)与小胶质细胞的共培养物中使用 LPS和MPP⁺处理的多巴胺能细胞膜作为刺激物。

通过使用单克隆抗体OX-42对CR3补体受体染色来显现小胶质细 胞。小胶质细胞培养物的纯度为～95％。非活化的小胶质细胞表现出分支 形状或者双极或多极突起(图1a和b)。活化的小胶质细胞表现出变形虫 样形态(图1c和d)。

在众多神经毒性因子中，NO、TNF-α、IL-1β和超过氧化物可能是 由小胶质细胞活化引发的多巴胺能神经变性的主要调节因子。LPS-诱导 的小胶质细胞活化通过以下被表征：测量TNF-α和IL-1β水平(充分记 载的反映小胶质细胞活化的两种细胞因子)，以及由活化的小胶质细胞释 放的一些活性氧簇(ROS、NO和超氧化物)的水平。

未经刺激的小胶质细胞产生很少量的细胞因子。接触LPS(0.25 μg/ml)之后，小胶质细胞培养物中的TNF-α和IL-1β的水平升高6-11倍， 而NO和超氧化合物的水平升高最多达5-11倍(图2)。

由于MES 23.5细胞仅在MPP⁺处理后活化小胶质细胞，因此检测了 经MPP⁺处理的MES 23.5细胞膜部分(CF)的活化作用。与MPP⁺处理的 细胞膜部分(150μg/ml)孵育之后，TNF-α和IL-1β产生显著升高4-10倍 (图2)。还测量了经MPP+膜部分处理的小胶质细胞培养物的培养基中 的NO和超氧化物的水平，并且发现它们升高了2-10倍(图2)。

没有MPP⁺或者用灵芝处理的初始膜与MPP⁺膜部分相比仅具有极 少的活化作用。

实施例2—灵芝防止来源于小胶质细胞的促炎因子和ROS的产生

小胶质细胞可因活化而产生细胞因子(20-22)。为了阐释灵芝神经保 护活性的基本机制，研究了灵芝对小胶质细胞源炎性细胞因子和ROS的 水平的作用。用不同剂量的(50～400μg/ml)灵芝将小胶质细胞培养物预处 理30分钟，之后使其接触LPS或MPP⁺处理的CF。

如图3和4所示，低剂量(50μg/ml)的灵芝具有最小的抑制效应，而 用较高剂量(100-400μg/ml)的灵芝预处理以浓度依赖方式强效地降低由 LPS或CF引起的NO和SOD的增加。

在相同浓度下，灵芝还显著地降低了接触LPS和用MPP⁺处理的CF 后的TNF-α和IL-1β的释放(图5)。

实施例3—灵芝在小胶质细胞存在或不存在时防止MPP⁺诱导的多 巴胺能神经变性

为了评估炎症介导的神经毒性，使多巴胺能MES23.5神经元在存在 或不存在小胶质细胞共培养物的条件下接触100μM MPP⁺或0.25μg/ml LPS 24小时，并且使用[3H]DA摄入分析评估神经毒性。

对于单独的MES23.5神经元，接触MPP⁺导致[3H]DA摄入显著下 降约66％，而对于MES23.5和小胶质细胞共培养物，发现下降约74％ (图6)。

用400μg/ml灵芝预处理显著地防止了MPP⁺诱导的[3H]DA摄入 下降，在存在和不存在小胶质细胞共培养物的情况下分别仅下降约35％ 和38％。

实施例4—灵芝在小胶质细胞存在下防止LPS诱导的多巴胺能变性

当使神经元-小胶质细胞共培养物接触0.25μg/ml LPS 24小时时， [3H]DA摄入与共培养物相比显著降低约50％(图7)。用400μg/ml灵 芝预处理同样显著减弱LPS诱导的[3H]DA摄入降低(有灵芝时损失 22％，无灵芝时损失50％)。

实施例5—灵芝抑制由LPS和MPP⁺处理的膜增加的TNF-α和IL-1β 表达

促炎因子的合成在几个水平上受调控。尽管转录后、翻译和翻译后 机制均起重要作用，然而基因转录似乎是主要的调节点。TNF-α和IL-1β mRNA的表达水平在对照细胞中几乎检测不到，但是却被LPS和CF显 著提高。

100～400μg/ml灵芝预处理以剂量依赖的防止抑制TNF-α和IL-1β 的表达。400μg/ml灵芝的较高剂量提供90％的防护(图8)。

应理解本文描述的实施例和实施方案是出于举例的目的，依据所述 实施例和实施方案的各种修改或变化是本领域技术人员可以预见的，并 且包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 培力（香港）健康产品有限公司

<120> 神经保护性灵芝组合物及其使用方法

<130> PURA.102X

<150> 61/173,802

<151> 2009-04-29

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

ccgtggacct tccaggatga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

gggaacgtca cacaccagca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 3

ccaccacgct cttctgtcta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

agggtctggg ccatagaact 20

Claims (20)

1.一种治疗变性神经疾病的方法，包括将有效量的灵芝(Ganoderma lucidum)提取物给予有需要的受试者。

2.权利要求1的方法，其中所述灵芝提取物是通过低温提取从灵芝的子实体中得到的。

3.权利要求2的方法，其中得到以灵芝的子实体计约0.6％(w/w)的多糖产率。

4.权利要求2的方法，其中得到以灵芝的子实体计约0.35％(w/w)的麦角甾醇产率。

5.权利要求1的方法，其中所述受试者是人。

6.权利要求1的方法，其中炎症减轻。

7.权利要求6的方法，其中所述炎症是神经炎症。

8.权利要求1的方法，其中TNF-α产生减少。

9.权利要求1的方法，其中IL-1β产生减少。

10.权利要求1的方法，其中活性氧簇的产生减少。

11.权利要求1的方法，其中一氧化氮的产生减少。

12.权利要求1的方法，其中超氧化物的产生减少。

13.权利要求1的方法，其中所述变性神经疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化、周围神经病、带状孢疹、中风、精神分裂症、癫痫、唐氏综合症和特纳综合征。

14.权利要求13的方法，其中所述变性神经疾病是帕金森病或阿尔茨海默病。

15.一种抑制黑质中的小胶质细胞活化的方法，包括将所述小胶质细胞与有效量的灵芝提取物接触。

16.权利要求15的方法，其中所述灵芝提取物的有效量为超过100μg/ml。

17.权利要求15的方法，其中所述灵芝提取物是通过低温提取从灵芝子实体中产生的。

18.权利要求15的方法，其中TNF-α产生减少。

19.权利要求15的方法，其中IL-1β产生减少。

20.一种组合物，包含灵芝提取物和可药用载体。