CN107434826A

CN107434826A - 一种高表达Slit2D2‑HSA蛋白的酵母细胞及应用

Info

Publication number: CN107434826A
Application number: CN201610363047.3A
Authority: CN
Inventors: 李华顺; 任宝永
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2017-12-05
Anticipated expiration: 2036-05-26
Also published as: CN107434826B

Abstract

本发明提供了一种高表达Slit2D2‑HSA蛋白的酵母细胞及应用，具体地本发明公开了一种具有显著抗肿瘤活性的Slit2D2‑HAS融合蛋白，并且经过多重密码子优化获得了能够在酵母中高表达的Slit2D2‑HAS融合蛋白密码子序列。该经过优化的密码子序列能够在酵母细胞中高效表达。

Description

一种高表达Slit2D2-HSA蛋白的酵母细胞及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种高表达Slit2D2-HSA蛋白的酵母细胞及应用。

背景技术

肿瘤是机体细胞异常生长造成的疾病，近30年来恶性肿瘤的发病率一直呈上升趋势。根据《世界癌症报告》，世界每年新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。中国新增癌症病例约占全球的20％，癌症死亡病例约占全球25％。根据《2015中国肿瘤登记年报》报告,中国每天新增肿瘤病例8550例,每分钟有6人诊断为癌症、有5人死于癌症,肺癌、胃癌、肝癌等实体瘤已成为发病与死亡率最高的癌症。肿瘤已然成为影响国民健康的重大类疾病，给患病家庭和社会带来沉重负担。

Robo是一次跨膜的受体蛋白,在哺乳动物中，已经克隆到4个Robo基因。从物种进化的角度看，Robo1,2,3的胞外部分非常的保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个FibronectinIII型重复序列组成。Robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：CC0,CC1,CC2,CC3。Robo4的结构与其它三个家族成员有很大的不同，它的胞外只有2个Ig样功能区和3个Fibronectin III型重复序列；胞内也只有CC0和CC2两个区域。Robos胞外的IgG domains被认为是与配体Slit结合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。目前，已完成slit2与Robo相互作用区域蛋白质的机构解析，发现slit2的第二个结构域D2与Robo1的Ig1结合，进而启动信号传导。近年来发现Slit及其受体Robo调节肿瘤细胞的迁移、炎症细胞的迁移、血管内皮细胞的迁移，与肿瘤细胞及炎症疾病的发展密切相关。因此，有望基于Slit开发新的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高表达Slit2D2-HSA蛋白的酵母细胞及应用。

本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的

同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，

且所述多肽具有肿瘤抑制活性；

(C)将SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、

缺失或添加而形成的，且保留肿瘤抑制活性的衍生多肽。

本发明的第二方面，提供了一种分离的经密码子优化的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白；并且所述多核苷酸选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为酵母细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为保藏号为CCTCC NO:M 2016246的酵母细胞株。

本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白的用途，用于制备治疗或预防肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述用途还包括用于制备治疗或预防肿瘤转移的药物。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了PCR鉴定结果，泳道1:PCR扩增产物(2500bp)；MK:DL5000加DNA Marker。

图2显示了pPICZaA-Slit2D2-HAS质粒图谱，MK:DL 5000DNA Marker；泳道1-6:PCR扩增产物(2400bp)，阳性克隆:2-6。

图3显示了酵母重组质粒转化DH5a菌落PCR鉴定结果。

图4显示了酵母基因组PCR鉴定结果，泳道1-5:克隆1-5基因组DNA的PCR产物(About 2500bp)；N:X33基因组DNA(阴性对照)；P:pPICZaA-Slit2D2-HSA质粒(阳性对照)；MK:DL 5000DNA Marker。

图5显示了SDS-PAGE检测结果。

图6显示了，Western blot检测结果，泳道1-5:诱导72h后克隆1-5的培养液上清(浓缩10倍)；N:阴性对照(X33)；P:抗-His标签western blot阳性对照；MK:分子量标记。

图7显示了融合蛋白纯化结果，泳道A:上柱样本；泳道B:流穿液；泳道C:50mM咪唑-1洗脱；泳道D:50mM咪唑-2洗脱；泳道E:500mM咪唑-1洗脱；泳道F:500mM咪唑-2洗脱；泳道G:500mM咪唑-3洗脱；泳道H:500mM 咪唑-2(未还原型)；MK:分子量标记。

图8显示了终产品的检测结果，泳道A:Slit2D2-HSA蛋白(未还原型)；泳道B:Slit2D2-HAS蛋白(还原型)；MK:分子量标记。

图9显示了slit2D2-HAS融合蛋白对MDA-MB-231肿瘤细胞系迁移活性的抑制结果。

图10显示了slit2D2-HAS融合蛋白对SMMC7721肿瘤细胞系迁移活性的抑制结果。

图11显示了slit2D2-HAS融合蛋白对MCF-7/ADR肿瘤细胞系迁移活性的抑制结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种具有显著抗肿瘤活性的Slit2D2-HAS融合蛋白，并且经过多重密码子优化获得了能够在酵母中高表达的Slit2D2-HAS融合蛋白密码子序列，并对高表达Slit2D2-HSA蛋白的酵母细胞株进行了保藏，分类命名为巴斯德毕赤酵母ATCG-STRAIN-01(Pichia pastoris ATCG-STRAIN-01),保藏号为CCTCC NO:M2016246，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心，保藏日期为2016年5月4日。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

根据本发明人的深入研究，设计和发明了Slit2D2-HSA融合蛋白，并利用哺乳动物细胞HEK-293表达，显示了较好的抑制肿瘤转移作用，具体内容可参见申请号为CN201510236886.4的中国发明专利申请和申请号为PCT PCT/CN2015/080523的国际专利申请。但动物哺乳细胞表达系统其用于生产制备时，生产成本较高。因此寻找更低成本且能保持蛋白样品活性的表达系统，是降低生产成本的关键。酵母表达系统是研究真核蛋白表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质。与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比，酵母表达系统操作简单，成本低廉，可大规模进行发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。

本发明主要利用基因工程方法基因转化酵母细胞、筛选能够稳定且高表达Slit2D2-HSA融合蛋白的酵母细胞，使其适用于后续低成本、高密度发酵制备Slit2D2-HSA融合蛋白。

Slit蛋白

Slit是一类分泌性糖蛋白，分子量约为200kD，哺乳类动物中克隆到的Slit基因有三个，分别命名为Slit1,Slit2和Slit3。它的结构由N-端的信号肽，4个富含亮氨酸的重复序列(LRRs)以及多个EGF样的重复序列(在果蝇中是7个，在脊椎动物中是9个)组成；研究表明，其中的LRRs是Slit蛋白和受体Robo的结合区域。Slit蛋白通过结合受体Robo发挥功能。Robo是一次跨膜的受体蛋白,在哺乳动物中，已经克隆到4个Robo基因。从物种进化的角度看，Robo1,2,3的胞外部分非常的保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个FibronectinIII型重复序列组成。Robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：CC0,CC1,CC2,CC3。Robo4的结构与其它三个家族成员有很大的不同，它的胞外只有2个Ig样功能区和3个Fibronectin III型重复序列；胞内也只有CC0和CC2两个区域。Robos胞外的IgG结构域被认为是与配体Slit结合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。slit2与Robo相互作用区域蛋白质的机构解析发现slit2的第二个结构域D2与Robo1的Ig1结合，启动信号传导(Morlot,Hemrika et al.2007,Hohenester 2008,Seiradake,von Philipsborn et al.2009)。

近年来，趋化因子受体(CXC chemokinereceptor-4，CXCR4)及其配体基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-I,SDF-I)相互作用形成的反应轴SDF-1/CXCR4在肿瘤侵袭和转移中的作用越来越受到人们的关注，趋化因子CXCL12和CXCR4结合后，能够导致肌动蛋白聚合和细胞伪足形成，使癌细胞突破基底膜发生侵袭，同时促使癌细胞的运动和远处转移，从而产生趋化运动和侵袭反应。这一系列作用与SDF-1剂量正相关，并已被证明SDF-1参与乳腺癌、前列腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、纤维素肉瘤、卵巢癌、髓母细胞瘤、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤等癌症的局部侵袭和器官特异性转移。

也有研究发现：45％的乳腺癌DU4475细胞中表达ROBO1，20％的乳腺癌DU4475细胞中表达ROBO2；35％MDA-MB-231细胞表达ROBO1，21％MDA-MB-231细胞表达ROBO4。SDF-1可以通过CXCR4/CXCL12信号通路诱导乳腺癌细胞迁移、侵袭，但该过程可以被slit2所抑制，同时也可抑制其细胞粘附行为。；其它研究也证明，Slit2(30pM或100pM)能够有效抑制SDF-1(10nM)诱导下的肿瘤迁移。

融合蛋白及其制备

在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具有式Ia或Ib所述结构，即含有包括Slit2D2的蛋白元件和HSA蛋白元件的融合蛋白。一个代表性的例子是Slit2D2-HSA。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的融合蛋白”是指融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

本发明融合蛋白或其元件(如Slit2D2)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的SlitD2-HSA融合蛋白的氨基酸序列如下：

LHCPAACTCSNNIVDCRGKGLTEIPTNLPETITEIRLEQNTIKVIPPGAFSPYKKLRRIDLSNNQISELAPDAFQGLRSLNSLVLYGNKITELPKSLFEGLFSLQLLLLNANKINCLRVDAFQDLHNLNLLSLYDNKLQTIAKGTFSPLRAIQTMHLAQNPFICDCHLKWLADYLHTNPIETSGARCTSPRRLANKRIGQIKSKKFRCSGGGGSGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH*(SEQ ID NO.:1)

经过多重密码子优化，经过优化的特别适宜在酵母细胞中表达的SlitD2-HSA融合蛋白的编码多核苷酸序列如下：

TTGCATTGTCCAGCAGCTTGTACTTGTTCTAACAACATCGTCGATTGCAGAGGTAAAGGTTTGACAGAAATCCCAACCAACTTGCCAGAAACCATTACCGAAATCAGATTGGAGCAGAACACCATTAAGGTTATTCCACCAGGCGCTTTTTCCCCATACAAGAAATTGAGAAGGATCGACTTGTCCAACAACCAAATCTCCGAATTGGCTCCAGACGCTTTTCAAGGTCTAAGATCTTTGAACTCCTTGGTCCTATACGGTAACAAGATCACCGAATTGCCAAAGTCATTGTTCGAAGGTCTATTCTCCTTGCAGTTGTTGTTGTTGAACGCCAACAAGATCAATTGCTTGAGAGTTGACGCTTTCCAAGACTTGCACAACTTGAACTTGTTGAGCCTATACGACAACAAGTTGCAGACTATCGCTAAAGGCACTTTCTCTCCATTGAGAGCTATTCAAACCATGCACTTGGCTCAAAACCCATTCATTTGCGATTGCCATTTGAAATGGTTGGCCGATTACTTGCACACTAACCCAATTGAAACTTCAGGAGCTAGGTGTACTAGTCCAAGAAGATTGGCTAACAAGAGAATCGGTCAGATCAAGTCCAAGAAGTTCAGATGTTCAGGCGGTGGAGGTTCAGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGAGGTTCAGACGCTCATAAATCAGAAGTTGCTCATAGATTCAAGGACTTGGGAGAAGAAAACTTCAAGGCTTTGGTGTTGATCGCTTTTGCACAATACTTGCAGCAGTGTCCATTCGAAGATCACGTCAAATTGGTCAACGAAGTCACAGAATTTGCTAAAACTTGCGTTGCCGACGAATCAGCCGAAAATTGCGATAAGTCCTTGCATACTTTGTTCGGCGATAAGTTGTGCACAGTTGCTACTTTGAGGGAAACTTACGGAGAAATGGCAGATTGTTGCGCTAAACAAGAACCAGAAAGGAACGAGTGCTTCTTGCAACATAAGGACGATAACCCAAACTTGCCAAGATTGGTTAGACCAGAAGTTGACGTTATGTGTACAGCATTTCACGATAACGAGGAGACCTTCTTGAAGAAATACCTATACGAGATCGCCAGGAGACATCCATATTTCTACGCTCCAGAGTTGTTGTTCTTCGCTAAAAGATACAAGGCCGCTTTTACCGAATGTTGTCAAGCAGCAGATAAAGCAGCTTGCTTGTTGCCAAAGTTGGACGAATTGAGAGACGAAGGTAAAGCTTCTTCCGCTAAACAAAGGTTGAAGTGCGCTTCATTGCAAAAGTTCGGAGAAAGAGCTTTTAAAGCTTGGGCAGTAGCTAGATTGTCACAAAGATTCCCAAAAGCCGAATTTGCCGAAGTTTCCAAATTGGTCACCGACTTGACTAAAGTTCATACCGAGTGTTGCCACGGAGATTTGTTGGAGTGCGCAGACGATAGAGCAGATTTGGCCAAATACATTTGCGAGAACCAGGATTCCATCTCCTCTAAGTTGAAGGAGTGTTGCGAAAAGCCATTGTTGGAAAAGTCCCATTGCATTGCAGAAGTTGAAAACGACGAAATGCCAGCAGATTTGCCATCTTTGGCAGCAGATTTCGTTGAATCTAAGGACGTTTGCAAGAACTACGCCGAAGCTAAAGACGTTTTCTTGGGCATGTTCCTATACGAATACGCTAGAAGACATCCAGATTACTCCGTTGTCTTGTTGTTGAGATTGGCTAAGACCTACGAGACTACTTTAGAGAAGTGTTGCGCAGCAGCAGATCCACACGAGTGTTACGCTAAAGTTTTCGACGAATTCAAGCCATTGGTTGAAGAACCACAGAACTTGATCAAGCAGAATTGCGAATTGTTCGAGCAATTGGGAGAGTACAAGTTCCAAAACGCTTTGCTAGTCAGATACACCAAGAAGGTTCCACAAGTTTCCACTCCAACTTTGGTTGAAGTCTCCAGAAACTTGGGTAAAGTTGGCTCTAAGTGTTGCAAGCATCCAGAAGCTAAGAGAATGCCTTGTGCCGAAGATTATTTGAGCGTTGTTTTGAACCAGCTTTGCGTTTTGCACGAAAAGACTCCAGTTTCCGATAGAGTCACTAAGTGTTGTACCGAATCCTTGGTTAACAGAAGACCTTGTTTCAGCGCTTTGGAAGTTGACGAAACTTACGTCCCAAAGGAATTCAACGCAGAAACTTTCACCTTCCACGCAGATATTTGCACTTTGTCCGAGAAGGAAAGACAGATCAAGAAGCAAACCGCTTTGGTTGAATTGGTGAAGCATAAGCCAAAGGCTACTAAGGAACAATTGAAGGCAGTTATGGACGATTTCGCAGCTTTCGTTGAAAAGTGTTGCAAGGCAGACGATAAGGAAACTTGTTTCGCCGAAGAAGGCAAAAAATTGGTCGCAGCTTCTCAAGCAGCTTTAGGTTTACATCACCATCATCATCATTAA(SEQ ID NO.:2)

应理解，所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物，指本发明融合蛋白在经过1-3个氨基酸添加或替换、1-2个氨基酸缺失并仍具有肿瘤抑制活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。

此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。

基因工程细胞

本发明提供了一种基因工程细胞(宿主细胞)，所述基因工程细胞为真核细胞(优选为酵母细胞)，并且所述细胞的基因组中整合有SlitD2-HSA融合蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有SlitD2-HSA融合蛋白的表达盒。

在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞。

在另一优选例中，所述的SlitD2-HSA融合蛋白的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、SlitD2-HSA融合蛋白的ORF序列和终止密码子。

本发明中，术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

药物组合物及施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.001-99wt％；较佳的0.01-95wt％；更佳的，0.1-90wt％。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针对肿瘤患者，通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.5mg-5mg/kg动物体重(较佳的2mg-4mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明的主要优点在于：

(1)首次利用基因工程方法改造酵母细胞，使其表达slit2D2-HSA融合蛋白；

(2)使用酵母细胞表达的slit2D2-HSA融合蛋白具有良好的抗肿瘤转移活性；

(3)获得的密码子优化序列，能够在酵母细胞中高效表达，且表达出的融合蛋白具有显著的抗肿瘤活性；

(4)意外地发现了一株高表达slit2D2-HSA融合蛋白的酵母细胞株，与一般酵母细胞相比，表达能力提高了约5-10倍。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

在本发明的一个优选地实施方式中，所用的培养基和试剂如下：

1.低盐LB培养基

10g蛋白胨

5g酵母粉

5g NaCl

加H₂O定容至1L(再加15g琼脂粉配制成固体培养基)

121℃高压灭菌20min

2.YPD培养基

20g蛋白胨

10g酵母粉

20g葡萄糖

加H₂O定容至1L

121℃高压灭菌20min

3.YPDS培养基

20g蛋白胨

10g酵母粉

20g葡萄糖

1M山梨醇(Sortitol)

加H₂O定容至1L(再加15g琼脂粉配制成固体培养基)

121℃高压灭菌20min

4.YPDZ

YPDS固体培养基使用前加Zeocin至终浓度为100ug/ml

5.BMMY培养基(Buffered Methanol-complex Medium)

1％酵母粉

2％蛋白胨

100mM磷酸钾pH 6.0

1.34％YNB

(酵母氮源，含有硫酸氨不含氨基酸)

4×10^-5％生物素

0.5％甲醇

a),b)为BMMY培养基制备时用到的stock溶液.

a)500XB(0.02％Biotin)

溶解20mg biotin在100mL ddH2O中过滤除菌，保存在4度。可以保存1年

b)10XM(5％methanol)

5mL甲醇加入95mL ddH2O，过滤除菌，保存在4度，可存放2个月.

BMMY配制：

10g酵母粉，20g蛋白胨溶解于700mL H2O中，121℃高压灭菌20min。

冷却到室温，无菌操作加入100mL 1M磷酸钾缓冲液,pH 6.0，100mL 10X YNB，2mL500XB

6.SDS-PAGE电泳缓冲液(5×)

Tris 15.1g；甘氨酸94g；SDS 5g，加去离子水充分溶解后定容至1L。

7.SDS-PAGE上样缓冲液(5×)

1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25ml；SDS 0.5g；BPB 25mg；甘油2.5ml；2-ME 5％,加去离子水定容至5ml。

8.考马斯亮蓝染色液

考马斯亮蓝R-250,1g；甲醇450ml；冰醋酸100ml；去离子水450ml。

9.脱色液

甲醇450ml；冰醋酸100ml；去离子水450ml。

10.分离胶与浓缩胶的配制

实施例1

1.实验试剂及仪器

1.1实验试剂

Xho I,Not I及SacI限制性内切酶，购于宝生物工程(大连)有限公司； DL2000及DL5000DNA ladder，Taq DNA聚合酶，KOF DNA聚合酶，一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)来自Novoprotein；CutSmart Buffer购于吉泰生物科技有限公司；质粒中量抽提试剂盒(Plasmid Midi Preparation Kit)购于碧云天；其他常规化学试剂均为国产分析纯试剂，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。本研究所有引物合成和测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2实验仪器

梯度PCR扩增仪(ThermoFisher)，核酸蛋白定量仪(Thermo)，台式离心机(湖南赛特)

2.实验方法

2.1目的基因获得

基因合成Slit2D2-HSA-His基因序列(SEQ ID NO.2)，设计引物ZSLIT-F:5’-GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTTGCATTGTCCAGCAGCTTG-3’(SEQ ID NO.3)

ZSLIT-R:5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCGCTTAATGATGATGATGGTGATG-3’(SEQ ID NO.4)扩增Xho I和Not I之间的基因序列。

反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR鉴定结果如图1所示，电泳结果表明获得PCR片段与预期相符。

2.2无缝克隆

选取一步定向克隆试剂盒将目的基因片段与载体pPICZaA(购自Invitrogen)进行连接。将连接后的质粒命名为pPICZaA-Slit2D2-HSA,质粒图谱如图2所示。

具体方法如下:

A.选用酶点Xho I和Not I对pPICZaA载体进行双酶切线性化。

B.将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比进行无缝克隆(详见一步定向克隆试剂盒说明书)。

C.无缝克隆反应完成后，立即进行转化，剩余反应液保存在4℃待用。

2.2酵母重组质粒转化E.coli DH5a

1.冰上融化一管100μl的E.coli DH5a感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入10μl的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育45分钟。

2.42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。

3.加入500μl LB液体培养基，37℃孵育45-60分钟。

4.5000g离心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含 25ug/mlZeocin平板上，培养过夜。

2.3酵母重组质粒转化DH5a菌落PCR鉴定

PCR反应条件如下：

1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认阳性克隆后扩大培养，送至捷瑞公司测序。

PCR鉴定结果如图3所示，实验结果与预期相符。

2.4测序正确的酵母表达质粒抽提

选取碧云天的质粒中量抽提试剂盒(Plasmid Midi Preparation Kit)进行质粒中抽。方法如下：

1.取过夜菌至3个1.5毫升离心管中，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。

2.每管加入250微升溶液I(溶液I中已经添加了RNase A)，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

3.每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。

4.每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

5.最高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。

6.将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。再重复两次，使三管质粒结合于同一纯化柱上。

7.在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

8.最高速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

9.将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入120微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。

10.最高速离心1分钟，所得液体中加入600微升溶液VI，混匀后加到原质粒纯化柱内。

11.最高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。

12.在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

13.最高速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

14.将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入120微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。

15.最高速离心1分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒。

2.5测序正确的质粒线性化

使用Sac I对质粒进行线性化。.线性化体系如下：

37℃过夜。

2.6电转酵母X33

取200ul酵母感受态细胞X33，加入20ul线性化质粒，混合后转入电转杯(d＝0.2cm)中，冰上放置数分钟后，放入电转仪中电击(电压：1680V，电击时间：5ms)，电击后，立刻加入1ml 1M D-山梨醇，轻轻吹打数次，将电转后的酵母吸到1.5ml EP管中，冰上放置数分钟。将EP管放到30℃培养箱中孵育1h后涂YPDZ平板，30℃培养3天。

2.7酵母X33表达株高拷贝筛选

用高Zeocin抗生素浓度平板进行高拷贝筛选，收集低浓度Zeocin平板上的菌落，涂布至高浓度Zeocin平板上，Zeocin浓度分别为200，400，600，800ug/ml，30℃培养3天。挑最高zeocin浓度平板上的克隆，培养，抽提酵母基因组进行阳性酵母株鉴定。

2.8阳性酵母株鉴定

2.8.1酵母基因组抽提

待单克隆挑至培养集中培养24h左右后，取1ml菌液保种。另取1ml菌液至1.5ml EP管中，离心收集菌体，用200ul TE Buffer重悬，加入1％(V/V)β-巯基乙醇和1％(V/V)蛋白酶K，50℃水浴消化3h左右，期间不时摇晃。加入200ul氯仿和200ul苯酚，涡旋数秒。12000rpm，离心5min，小心吸取上层液体，加入2倍体积无水乙醇沉淀回收。

2.8.2酵母基因组PCR鉴定

选用α-factor，3’AOX通用引物进行鉴定。反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR阳性鉴定结果如图4所示，结果与预期相符。

2.9甲醇诱导表达

挑取5个阳性单克隆至20-30ml YPD培养基中30℃扩大培养，待OD长至2-6时，1500g，离心5min，弃去培养基，再用BMMY培养基重悬，并调节OD至10左右。继续培养72h，并且每过24h补加1％(V/V)甲醇进行诱导表达。以空载转化的宿主菌作为阴性对照。收集发酵液上清进行超滤浓缩,SDS-PAGE及Anti-His western blot分析。

SDS-PAGE检测结果如图5所示，Western blot检测结果如图6所示。

实验结果表明3号株表达量较高，选定3号株作为种子株，进行保种，同时进行上清蛋白纯化。经定量检测，3号菌株的表达量较其它阳性克隆提高了约5-10倍，而且杂蛋白相对较少，纯化得率较高。3号菌株的保藏号为CCTCCM2016246。

2.10 Ni柱纯化

用SFF(Ni)亲和层析柱(5ml)对酵母分泌上清进行纯化，具体操作步骤为：

1.平衡凝胶介质：用10个柱体积的Buffer A(20mM Tris,250mM NaCl,10mMImidazole,pH8.0)平衡柱子；

2.将酵母分泌上清液加入纯化柱中；

3.调整核酸蛋白检测仪，调整流速为2mg/ml；

4.排净柱子中的buffer，收集流穿液；

5.用5倍柱体积的平衡缓冲液清洗柱子；

6.调整流速为1mg/ml；采用不同咪唑浓度(50mM，500mM)的洗脱液(20mM Tris,250mM NaCl,500mM Imidazole,pH8.0)进行梯度洗脱。洗脱杂蛋白，收集流分；

7.蛋白纯化完毕后，用平衡缓冲液Buffer A将柱子平衡20min，流出液体，最后用20％乙醇清洗柱子。

蛋白纯化结果如图7所示；终产品检测结果如图8所示。

3.体外活性测试-Transwell肿瘤体外转移模型建立

将肿瘤细胞消化打散，取15,000个细胞加入transwell小室上层，总体积为100ul，不含血清，各组含有不同浓度的药物，每组三个平行。小室下层中加入600ul含有10％血清的培养基，并加入终浓度为10nM的SDF1，除了NC组下层不加SDF1，其余各组都加。24小时后将小室用4％多聚甲醛固定，然后将上层膜的细胞轻轻擦除，下层膜的细胞用DAPI染色。将染色后的下层膜的细胞置于荧光显微镜下拍照，每个小室随机选取5个视野，20X物镜。对每张照片中的细胞数进行统计。设置HSA阴性对照组、Slit2D2-HSA/HEK-293(该蛋白为HEK-293细胞表达)阳性对照组、slit2D2-his/HEK-293(该蛋白为HEK-293细胞表达)阳性对照组，同时对以下细胞系进行体外检测，乳腺癌：MCF-7/ADR(购自ATCC)、MDA-MB-231(购自ATCC)；肝癌:SMMC7721(购自ATCC)。检测酵母表达体系表达的slit2D2-HSA蛋白体外抗肿瘤迁移活性。

实验结果如图9、10、11所示，结果表明酵母表达的slit2D2-HSA蛋白具有明显抑制肿瘤迁移的活性，与哺乳动物细胞表达的蛋白在活性上无显著差别。显示，该slit2D2-HSA活性蛋白可用较低生产成本酵母系统表达生产和制备。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有肿瘤抑制活性；

缺失或添加而形成的，且保留肿瘤抑制活性的衍生多肽。

2.一种分离的经密码子优化的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白；并且所述多核苷酸选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸；

(c)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为酵母细胞。

6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为保藏号为CCTCC M2016246的酵母细胞株。

7.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

9.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗或预防肿瘤的药物。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述用途还包括用于制备治疗或预防肿瘤转移的药物。