CN107432956A

CN107432956A - 介孔硅酸钙镁‑京尼平交联小麦蛋白支架、载姜黄素支架及制备方法和应用

Info

Publication number: CN107432956A
Application number: CN201710656990.8A
Authority: CN
Inventors: 魏杰; 魏武; 高超; 梅师奇; 胡兴龙; 韩航; 蔡亮; 苏佳灿; 冯世鹏
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2017-12-05

Abstract

本发明公开了介孔硅酸钙镁‑京尼平交联小麦蛋白支架、载姜黄素支架及制备方法和应用。介孔硅酸钙镁‑京尼平交联小麦蛋白支架的制备方法包括：(1)将介孔硅酸钙镁、小麦蛋白和致孔剂混合得固体混合料；(2)将固体混合料压制成型，与浓度为6‑14mmol/L的京尼平溶液混合交联得前体；(3)将前体浸泡于溶剂中去除致孔剂，冷冻干燥即可。载姜黄素支架的制备方法包括：将上述支架浸没在姜黄素溶液中吸附姜黄素即得。本发明的介孔硅酸钙镁‑京尼平交联小麦蛋白支架具有优异的生物活性和降解性能，可促进细胞粘附、增殖和分化，并具有良好的力学性能和骨修复效果，负载姜黄素后可赋予支架一定的抗菌性能，并且对成骨无明显抑制作用。

Description

介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架、载姜黄素支架及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架、载姜黄素支架及制备方法和应用。

背景技术

骨骼中的主要成分是胶原和磷灰石，其中10-30％是坚硬多孔的外层结构(皮质骨)，30-90％是富有弹性的多孔内部结构(松质骨)，两者的力学性能差别很大，故设计一个具有天然骨结构的支架是一项非常艰难的任务。其中，支架材料对治疗骨缺损起着极其重要的作用。

以往修复骨缺损的材料通常有两类：第一类是生物惰性陶瓷(Al₂O₃， Si₃N₄陶瓷等)和医用级金属与合金，它们在机体内不发生或者只会发生微弱的化学反应；第二类是生物活性材料，该材料会诱导新生骨组织的产生和降低免疫排斥反应，但这类材料的不足之处是会长期留在生物体内，不发生降解。近年来，新一代体内可降解并具有多孔结构的骨组织工程支架逐渐成为研究热点，这种支架不仅仅追求在骨缺损部位诱导新骨的生长，而且希望支架材料在生物体内降解的同时逐渐被新生骨组织所取代，从而达到骨缺损部位完全被自身新生骨组织所代替的效果。

小麦蛋白(WG)是一种可再生、可生物降解的天然绿色高分子材料，其无细胞毒性，具有很好的血液相容性和生物相容性，且利于细胞的粘附，逐渐引起国内外学者的普遍关注。然而，WG由于其自身独特的氨基酸组成，含有较多的疏水性氨基酸和不带电荷的氨基酸，分子内疏水作用区域较大，溶解度较低，降解速率过快导致骨缺损部位没有生物力学支撑，且降解产物使体系偏酸性不利于保证细胞正常的代谢和机体的正常生理机能。

介孔硅酸钙镁(m-MCS)具有高比表面积和高孔容，可有效促进细胞粘附和组织生长，是一种具有良好生物活性的骨修复材料。但是，m-MCS力学强度低，抗弯曲和冲击性能差，且其降解速率过慢会阻碍新生骨组织的长入，并且其生物相容性不佳，从而影响了其实际应用。

目前已有文献报道将WG和m-MCS进行复合，以获得一种生物活性佳、降解速率适宜、生物相容性好的骨修复材料。如中国专利文献CN104721885A 公开了一种介孔硅酸钙镁/小麦蛋白复合材料，但该复合材料的力学强度仍较低，不能满足高负荷人工骨的要求；且其降解速率过快，在Tris-HCl中浸泡两周后失重率就可高达75％，导致骨缺损部位没有生物力学支撑。

因此，如何研发一种力学强度高、生物活性好、生物相容性佳、降解速率适宜、细胞相容性和体内成骨性能优良的支架材料仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于克服现有的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白复合材料力学强度仍较低、降解速率过快进而影响成骨性能的缺陷，提供了一种介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(m-GCWG)支架、载姜黄素支架及制备方法和应用。本发明的m-GCWG支架具有多孔结构，大孔和小孔之间的贯通性好，且表面粗糙，利于细胞粘附和增殖；并且m-GCWG支架的抗压强度高、降解速率适宜、降解过程中溶液的pH可通过m-MCS的含量进行调控，且具有良好的生物活性和生物相容性，可为细胞提供良好的生长环境，对骨缺损的修复效果也较好。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明的第一方面，提供了一种介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(m- GCWG)支架的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

(1)将介孔硅酸钙镁、小麦蛋白和致孔剂混合，得固体混合料；

(2)将所得固体混合料压制成型，然后与京尼平溶液混合进行交联反应，得前体；所述京尼平溶液的浓度为6-14mmol/L；

(3)将所述前体浸泡于溶剂中去除致孔剂，冷冻干燥即可。

步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁可为本领域常规使用的介孔硅酸钙镁，一般其组成比例符合CaMg(SiO₃)₂，宏观以粉末态存在。本发明中，对于所使用的介孔硅酸钙镁的粉末粒径无特殊限制，只要其能够与小麦蛋白和致孔剂混合均匀即可，较佳地，所述介孔硅酸钙镁的粉末粒径为800-1500nm，例如1000nm、1070nm等。

较佳地，步骤(1)中所用的介孔硅酸钙镁符合下述条件：所述介孔硅酸钙镁呈非晶态，比表面积为200-1000m²/g，孔容为0.3-1.0cm³/g，具有孔径为 6-7nm的规则六角形孔道。

在本发明一较佳实施例中，步骤(1)中所用的介孔硅酸钙镁符合下述条件：所述介孔硅酸钙镁呈非晶态，比表面积为395.3m²/g，孔容为0.53cm³/g，具有孔径为6.4nm的规则六角形孔道。

步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁可采用本领域常规用于制备介孔硅酸钙镁的方法制备而得，一般采用溶胶凝胶法。在本发明某一实施方式中，所述介孔硅酸钙镁采用包括如下步骤的方法制备：

S1、将模板剂与水和乙醇混合，搅拌，至溶液澄清；

S2、在30-50℃下，将盐酸(HCl)、正硅酸乙酯(TEOS)、六水硝酸镁 (Mg(NO₃)₂·6H₂O)、四水硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)和水加入上述溶液中，搅拌4-6h反应形成溶胶；

S3、将所得溶胶在90-98℃下陈化，使凝胶物质沉淀；

S4、洗涤所得沉淀物，然后在500-700℃下煅烧除去模板剂即可。

其中，步骤S1中，所述模板剂为本领域常规使用的模板剂，通常采用聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，例如Sigma Aldrich提供的平均重均分子量为5800的P123三嵌段共聚物。在本发明某一实施方式中，步骤S1按照如下操作进行：将5-7gP123嵌段共聚物与170-260mL水和29-43mL乙醇混合，搅拌，至溶液澄清。

其中，步骤S2中，向上述溶液中加入盐酸、正硅酸乙酯、六水硝酸镁、四水硝酸钙和水可采用分步加入，先滴加入盐酸和正硅酸乙酯，再加入六水硝酸镁、四水硝酸钙和水。在本发明某一实施方式中，步骤S2按照如下操作进行：在35-40℃下，依次将14-20mL浓度为1.5-2.5mol/L的盐酸和10- 15mL正硅酸乙酯滴加入上述溶液中，然后再加入6.5-9.5g六水硝酸镁、5.8- 8.8g四水硝酸钙和25-35mL水，搅拌4-6h反应形成溶胶。

其中，步骤S3中，所述陈化的时间不作特殊限定，以使凝胶物质能够充分沉淀为宜，所述陈化的时间一般为2-5天，例如3天。所述陈化的温度例如可为95℃。

其中，步骤S4中，所述洗涤一般采用去离子水和无水乙醇进行洗涤。所述煅烧的温度例如可为500℃。

步骤(1)中，所述小麦蛋白为本领域常规使用的小麦蛋白，包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白。所述小麦蛋白可市售获得，例如可选用TCI (上海)化成工业发展有限公司提供的小麦蛋白。

步骤(1)中，所述致孔剂可选用本领域常规使用的致孔剂，一般采用氯化钠(NaCl)。所述氯化钠的颗粒粒径不做特殊限定，较佳地为400-500nm。所述氯化钠的用量例如可为相对于介孔硅酸钙镁和小麦蛋白总质量的5-7倍，如6倍。

步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁和小麦蛋白的质量比较佳地为(10-50): (50-90)，更佳地为(20-40):(60-80)。

步骤(1)中，所述混合可采用搅拌混合，所述混合一般为混合至各组分均匀。

步骤(2)中，所述压制成型可采用本领域常规装置进行，一般采用粉末压片机。所述压制成型的工艺参数可采用本领域常规，所述压制成型的压力例如可为1-3MPa，如2MPa；所述压制成型的保压时间例如可为2-5min，如 3min。

步骤(2)中，所述京尼平溶液的浓度较佳地为10-14mmol/L，更佳地为 10mmol/L。当京尼平浓度小于10mmol/L时，支架的交联度和抗压强度随着京尼平浓度增加而增加；当京尼平的浓度大于10mmol/L，支架的交联度和抗压强度保持不变，所以选用10mmol/L的用量是最优化的选择。

步骤(2)中，所述京尼平溶液的用量没有特殊限制，一般以能够浸没压制成型后的固体混合料为宜。在本发明某一实施方式中，压制成型后的固体混合料的规格为Φ12×2mm，所述京尼平溶液的用量为0.8-1.2mL。

步骤(2)中，所述交联反应的温度较佳地为30-45℃，例如37℃；所述交联反应的时间较佳地为18-30h，例如24h。

步骤(3)中，所述溶剂为本领域常规使用的溶剂，所述溶剂的种类不作特殊限定，只要能够溶解致孔剂但不会使介孔硅酸钙镁和小麦蛋白溶解即可，所述溶剂一般采用水，例如去离子水。

步骤(3)中，所述浸泡的时间不作特殊限定，例如可为24-48h，如36h。浸泡期间，为使致孔剂更好地去除，一般可每隔一段时间更换一次溶剂，例如每8-16h如每12h更换一次溶剂。

步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度和时间可参照本领域常规的工艺参数。所述冷冻干燥的温度一般可在-60℃至-40℃范围内，例如-55℃；所述冷冻干燥的时间一般可为12-48h，例如24h。

本发明的第二方面，提供了由上述制备方法制得的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架。

本发明的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架呈现深蓝色，随着介孔硅酸钙镁含量增加，深蓝色逐渐变浅；具有大孔和小孔贯通的多孔结构及粗糙的表面；且吸水率高，抗压强度好，降解速率适宜，生物活性佳，利于细胞粘附、增殖和成骨细胞的分化，对骨缺损的修复效果较好。

本发明的第三方面，提供了一种载姜黄素(CUR)的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(m-GCWG)支架的制备方法，采用本领域常规方法在上述介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架上吸附上姜黄素即可得到载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架。

在本发明某一实施方式中，所述载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架采用如下制备方法制得：将上述介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架浸没在姜黄素溶液中，吸附姜黄素，即得。

其中，所述姜黄素溶液的浓度不作特殊限定，例如可为600-1000μg/mL，如800μg/mL。

其中，所述吸附的温度和时间可参照本领域常规的吸附温度和时间。所述吸附的温度一般为30-45℃，例如37℃；所述吸附的时间一般为12-36h，例如24h。所述吸附一般在恒温震荡箱中进行。

本发明的第四方面，还提供了一种由上述制备方法制得的载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架。

本发明载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架在具有上述介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架的优异性能外，还具有优良的抗菌效果。

本发明还提供了上述介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架或者上述载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架在制备骨缺损修复材料中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明采用京尼平对小麦蛋白(WG)进行化学交联，并利用介孔硅酸钙镁(m-MCS)对京尼平交联WG进行改性，通过颗粒浸出法制备得到了m-GCWG多孔支架，赋予了支架一定的力学性能，同时m-MCS的添加显著提高了支架的生物活性和降解性能，并可促进细胞的粘附、增殖和分化。

(2)本发明将m-GCWG植入动物体内，通过体内体外实验相结合，系统探究了m-GCWG支架的体内降解性和成骨性，结果显示m-GCWG支架对骨缺损的修复效果较好。

(3)本发明利用m-MCS的介孔孔道和支架多孔结构，将草本植物的天然药物-姜黄素负载于m-GCWG，赋予其一定抗菌性能，介孔结构提高了m- GCWG对姜黄素的负载和缓释性能，同时根据体外细胞和体内动物实验表明姜黄素无细胞毒性、对成骨无明显抑制作用。

附图说明

图1为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架的制备流程示意图。

图2为本发明实施例1-2中介孔硅酸钙镁(m-MCS)的广角X射线衍射图谱(a)、小角X射线衍射图谱(b)和傅里叶红外衍射图(c)。

图3为本发明实施例1-2中介孔硅酸钙镁(m-MCS)的SEM照片(a) 和TEM照片(b)。

图4为本发明实施例1-2中介孔硅酸钙镁(m-MCS)的EDS图谱。

图5为本发明实施例1-2中介孔硅酸钙镁(m-MCS)的氮气吸附-脱附等温线(a)、孔径分布图(b)和DLS测试结果图(c)。

图6为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m- GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架的IR图谱(a)和XRD图谱(b)。

图7为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m- GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架的SEM照片，其中a、b为GCWG的SEM照片；c、d为20m-GCWG的 SEM照片；e、f为40m-GCWG的SEM照片。

图8为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m- GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架的吸水率曲线图。

图9为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m- GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架浸泡在SBF溶液7天后表面的SEM照片，其中a、b为GCWG的SEM 照片；c、d为20m-GCWG的SEM照片；e、f为40m-GCWG的SEM照片。

图10为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m- GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架浸泡在SBF溶液7天后的表面XRD谱图(a)和表面EDS谱图(b)。

图11为本发明实施例2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(40m- GCWG)支架浸泡在SBF溶液14天内溶液ICP(Ca、Si、Mg、P)变化曲线图。

图12为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m- GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架浸泡在Tris-HCl中不同时间节点的失重率曲线图(a)和溶液pH变化曲线图(b)。

图13为本发明实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m- GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架浸泡在Tris-HCl中28天后的SEM照片，其中a、b为GCWG的SEM照片；c、d为20m-GCWG的SEM照片；e、f为40m-GCWG的SEM照片。

图14为MC3T3-E1细胞分别在实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架表面培养的不同时间节点的SEM照片，其中a、d、g分别为MC3T3-E1细胞在GCWG支架表面培养12h、1d和3d时的SEM照片； b、e、h分别为MC3T3-E1细胞在20m-GCWG支架表面培养12h、1d和3d 时的SEM照片；c、f、i分别为MC3T3-E1细胞在40m-GCWG支架表面培养12h、1d和3d时的SEM照片。

图15为MC3T3-E1细胞分别在实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架表面培养1、3和5天时的增殖率柱状图，其中*p＜0.05。

图16为MC3T3-E1细胞分别在实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架表面培养7、10和14天时的ALP活性柱状图，其中*p＜0.05。

图17为实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、 40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架植入兔股骨内1、2和3个月后的大体观察照片，其中a、b、c分别为GCWG支架植入兔股骨内1、2和3个月后的大体观察照片；d、e、f分别为20m-GCWG 支架植入兔股骨内1、2和3个月后的大体观察照片；g、h、i分别为40m- GCWG支架植入兔股骨内1、2和3个月后的大体观察照片。

图18为实施例2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(40m-GCWG) 支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架植入兔股骨内1、2和 3个月后的micro-CT三维成像图。

图19为实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、 40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架植入兔股骨内1个月、2个月和3个月后的通过HE染色方法分析的新骨生成量和材料残余率，其中*p＜0.05。

图20为实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、 40m-GCWG)支架和对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架植入兔股骨内1个月、2个月和3个月后的I型胶原阳性表达率柱状图，其中*p＜ 0.05。

图21为姜黄素标准曲线(a)和实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、40m-GCWG)支架及对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架对姜黄素(CUR)的载药效率(b)，其中*p＜0.05。

图22为实施例2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(40m-GCWG) 支架载姜黄素(CUR)前后的XRD图谱。

图23为实施例1-2的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(20m-GCWG、 40m-GCWG)支架及对比例1的京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架对姜黄素(CUR)的体外缓释曲线图。

图24为MC3T3-E1细胞分别在实施例5-6的载姜黄素的介孔硅酸钙镁- 京尼平交联小麦蛋白(CUR@20m-GCWG、CUR@40m-GCWG)支架和对比例2的载姜黄素的京尼平交联小麦蛋白(CUR@GCWG)支架表面培养1、 3和7天时的SEM照片，其中a、d、g分别为MC3T3-E1细胞在CUR@GCWG 支架表面培养1、3和7天时的SEM照片；b、e、h分别为MC3T3-E1细胞在CUR@20m-GCWG支架表面培养1、3和7天时的SEM照片；c、f、i分别为MC3T3-E1细胞在CUR@40m-GCWG支架表面培养1、3和7天时的 SEM照片。

图25为MC3T3-E1细胞分别在实施例5-6的载姜黄素的介孔硅酸钙镁- 京尼平交联小麦蛋白(CUR@20m-GCWG、CUR@40m-GCWG)支架和对比例2的载姜黄素的京尼平交联小麦蛋白(CUR@GCWG)支架表面培养1、 3和5天时的增殖率柱状图，其中*p＜0.05。

图26为MC3T3-E1细胞分别在实施例5-6的载姜黄素的介孔硅酸钙镁- 京尼平交联小麦蛋白(CUR@20m-GCWG、CUR@40m-GCWG)支架和对比例2的载姜黄素的京尼平交联小麦蛋白(CUR@GCWG)支架表面培养7、 10和14天时的ALP活性柱状图，其中*p＜0.05。

图27为实施例5-6的载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白 (CUR@20m-GCWG、CUR@40m-GCWG)支架和对比例2的载姜黄素的京尼平交联小麦蛋白(CUR@GCWG)支架在24h时的金色葡萄球菌菌落分布图，其中，a为CUR@GCWG，b为CUR@20m-GCWG，c为CUR@40m-GCWG。

图28为实施例5-6的载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白 (CUR@20m-GCWG、CUR@40m-GCWG)支架和对比例2的载姜黄素的京尼平交联小麦蛋白(CUR@GCWG)支架在24h时的抗菌率。

图29为实施例6的载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白 (CUR@40m-GCWG)支架植入兔股骨内1、2和3个月后的micro-CT三维成像图。

图30为实施例6的载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(CUR@40m-GCWG)支架植入兔股骨内1、2和3个月后的新生骨体积的柱状图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，所用小麦蛋白(WG)和京尼平由TCI(上海)化成工业发展有限公司提供；所用P123三嵌段共聚物由Sigma Aldrich提供，平均重均分子量为5800；所用正硅酸乙酯(TEOS)由上海凌峰化学试剂有限公司提供，纯度为AR；所用六水硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O由上海泰坦科技股份有限公司提供，纯度为AR；所用四水硝酸钙由国药集团化学试剂有限公司提供，纯度为AR。其它原料和试剂皆市售可得。

下述实施例中，所用粉末压片机为TCYPJ-24，由北京天创尚邦仪器设备有限公司提供。

实施例1

1、介孔硅酸钙镁(m-MCS)的制备

本实施例的m-MCS采用如下方法制备得到：

S1、称取6g模板剂P123三嵌段共聚物，加入217mL去离子水和36mL 乙醇，持续搅拌直到溶液变澄清；

S2、在水浴38℃条件下，先后将17mL HCl(2.0mol/L)和12.9mL TEOS 缓慢滴加到溶液中，然后向溶液中加入7.9g Mg(NO₃)₂·6H₂O、7.3g Ca(NO₃)₂·4H₂O和30mL去离子水，此过程中，继续保持水浴38℃，持续搅拌溶液5h反应形成溶胶；

S3、将所得溶胶在95℃下陈化3天，使凝胶物质沉淀；

S4、所得沉淀物先后分别用去离子水、无水乙醇洗涤，然后在600℃下煅烧除去模板剂P123三嵌段共聚物，即得。

2、介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(m-GCWG)支架的制备

本实施例的m-GCWG支架采用如下制备方法制备，制备流程示意图可参见附图1：

(1)将m-MCS和WG按照20:80的质量比混合，并加入相对于m-MCS 和WG总质量6倍质量的致孔剂NaCl颗粒(d≈400-500nm)，混合搅拌均匀，得固体混合料；

(2)将所得固体混合料置于不锈钢模具(Φ12×2mm)中，用粉末压片机在压力2MPa下压制成型，并保压3min，然后将每个成型的样品放入24 孔板中，在每个孔中加入浓度10mmol/L、体积1mL的京尼平溶液，使其在 37℃下交联24h，得前体；

(3)将所得前体用去离子水浸泡36h，在此期间，每12h更换一次去离子水，以除去致孔剂NaCl颗粒，之后在-55℃下冷冻干燥24h，即得；该实施例所得m-GCWG支架记为20m-GCWG支架。

实施例2

1、介孔硅酸钙镁(m-MCS)的制备

本实施例的m-MCS制备方法同实施例1。

2、介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(m-GCWG)支架的制备

(1)将m-MCS和WG按照40:60的质量比混合，并加入相对于m-MCS 和WG总质量6倍质量的致孔剂NaCl颗粒(d≈400-500nm)，混合搅拌均匀，得固体混合料；

(3)将所得前体用去离子水浸泡36h，在此期间，每12h更换一次去离子水，以除去致孔剂NaCl颗粒，之后在-55℃下冷冻干燥24h，即得；该实施例所得m-GCWG支架记为40m-GCWG支架。

实施例3

1、介孔硅酸钙镁(m-MCS)的制备

本实施例的m-MCS采用如下方法制备得到：

S1、称取5g模板剂P123三嵌段共聚物，加入170mL去离子水和29mL 乙醇，持续搅拌直到溶液变澄清；

S2、在水浴35℃条件下，先后将14mL HCl(1.5mol/L)和10mL TEOS 缓慢滴加到溶液中，然后向溶液中加入6.5g Mg(NO₃)₂·6H₂O、5.8g Ca(NO₃)₂·4H₂O和25mL去离子水，此过程中，继续保持水浴35℃，持续搅拌溶液4h反应形成溶胶；

S3、将所得溶胶在90℃下陈化3天，使凝胶物质沉淀；

S4、所得沉淀物先后分别用去离子水、无水乙醇洗涤，然后在500℃下煅烧除去模板剂P123三嵌段共聚物，即得。

2、介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(m-GCWG)支架的制备

(1)将m-MCS和WG按照10:90的质量比混合，并加入相对于m-MCS 和WG总质量5倍质量的致孔剂NaCl颗粒(d≈400-500nm)，混合搅拌均匀，得固体混合料；

(2)将所得固体混合料置于不锈钢模具(Φ12×2mm)中，用粉末压片机在压力1MPa下压制成型，并保压5min，然后将每个成型的样品放入24 孔板中，在每个孔中加入浓度6mmol/L、体积1mL的京尼平溶液，使其在 45℃下交联18h，得前体；

(3)将所得前体用去离子水浸泡24h，在此期间，每8h更换一次去离子水，以除去致孔剂NaCl颗粒，之后在-40℃下冷冻干燥48h，即得；该实施例所得m-GCWG支架记为10m-GCWG支架。

实施例4

1、介孔硅酸钙镁(m-MCS)的制备

本实施例的m-MCS采用如下方法制备得到：

S1、称取7g模板剂P123三嵌段共聚物，加入260mL去离子水和43mL 乙醇，持续搅拌直到溶液变澄清；

S2、在水浴40℃条件下，先后将20mL HCl(2.5mol/L)和15mL TEOS 缓慢滴加到溶液中，然后向溶液中加入9.5g Mg(NO₃)₂·6H₂O、8.8g Ca(NO₃)₂·4H₂O和35mL去离子水，此过程中，继续保持水浴40℃，持续搅拌溶液6h反应形成溶胶；

S3、将所得溶胶在90℃下陈化5天，使凝胶物质沉淀；

2、介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白(m-GCWG)支架的制备

(1)将m-MCS和WG按照50:50的质量比混合，并加入相对于m-MCS 和WG总质量5倍质量的致孔剂NaCl颗粒(d≈400-500nm)，混合搅拌均匀，得固体混合料；

(2)将所得固体混合料置于不锈钢模具(Φ12×2mm)中，用粉末压片机在压力3MPa下压制成型，并保压2min，然后将每个成型的样品放入24 孔板中，在每个孔中加入浓度14mmol/L、体积1mL的京尼平溶液，使其在 30℃下交联30h，得前体；

(3)将所得前体用去离子水浸泡48h，在此期间，每16h更换一次去离子水，以除去致孔剂NaCl颗粒，之后在-60℃下冷冻干燥12h，即得；该实施例所得m-GCWG支架记为50m-GCWG支架。

实施例5

载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架(CUR@m-GCWG) 的制备

本实施例的CUR@m-GCWG采用如下方法制备：配制800μg/mL CUR 溶液，将实施例1的20m-GCWG多孔支架置于25mL烧杯中，并向烧杯加入10mL CUR溶液(800μg/mL)，使支架浸没在溶液中，在37℃恒温震荡箱中进行CUR的吸附，24h后得到载CUR的m-GCWG多孔支架，记为 CUR@20m-GCWG支架。

实施例6

本实施例的CUR@m-GCWG采用如下方法制备：配制800μg/mL CUR 溶液，将实施例2的40m-GCWG多孔支架置于25mL烧杯中，并向烧杯加入10mL CUR溶液(800μg/mL)，使支架浸没在溶液中，在37℃恒温震荡箱中进行CUR的吸附，24h后得到载CUR的m-GCWG多孔支架，记为 CUR@40m-GCWG支架。

实施例7

本实施例的CUR@m-GCWG采用如下方法制备：配制600μg/mL CUR 溶液，将实施例3的10m-GCWG多孔支架置于25mL烧杯中，并向烧杯加入10mL CUR溶液(600μg/mL)，使支架浸没在溶液中，在30℃恒温震荡箱中进行CUR的吸附，36h后得到载CUR的m-GCWG多孔支架，记为 CUR@10m-GCWG支架。

实施例8

本实施例的CUR@m-GCWG采用如下方法制备：配制1000μg/mL CUR 溶液，将实施例4的50m-GCWG多孔支架置于25mL烧杯中，并向烧杯加入10mL CUR溶液(1000μg/mL)，使支架浸没在溶液中，在45℃恒温震荡箱中进行CUR的吸附，12h后得到载CUR的m-GCWG多孔支架，记为 CUR@50m-GCWG支架。

对比例1

京尼平交联小麦蛋白(GCWG)支架的制备

本对比例的GCWG支架采用如下制备方法制备：

(1)将WG和相对于WG 6倍质量的致孔剂NaCl颗粒(d≈400-500nm)，混合搅拌均匀，得固体混合料；

(3)将所得前体用去离子水浸泡36h，在此期间，每12h更换一次去离子水，以除去致孔剂NaCl颗粒，之后在-55℃下冷冻干燥24h，即得GCWG 支架。

对比例2

载姜黄素的京尼平交联小麦蛋白支架(CUR@GCWG)的制备

本对比例的CUR@GCWG采用如下方法制备：配制800μg/mL CUR溶液，将对比例1的GCWG支架置于25mL烧杯中，并向烧杯加入10mL CUR 溶液(800μg/mL)，使支架浸没在溶液中，在37℃恒温震荡箱中进行CUR的吸附，24h后得到载CUR的GCWG多孔支架，记为CUR@GCWG支架。

效果实施例1

对实施例1-2中的m-MCS结构、形貌、元素组成等进行表征。

①IR、XRD分析

采用傅立叶变换红外光谱仪(IR，Nicolet 5700型，美国Nicolet公司)，对m-MCS进行分子结构和化学组成分析，测试范围使用中红外光(约4000- 400cm^-1)。采用X射线衍射仪(XRD，Rigaku D/max 2550/PC 18KW，日本理学电机rigaku)，分别在广角(10-80°)和小角(0.5-10°)进行测试，对m- MCS的结构进行分析。测试结果如图2所示。

图2(a)是m-MCS的广角XRD图谱。m-MCS在2θ＝24°处出现一个宽峰，所以合成的m-MCS是非晶态硅酸盐材料。非晶态的硅酸盐材料具有较好的生物活性，这是由于非晶态的硅酸盐材料可以快速使材料表面形成富硅层，溶液中更快达到形成羟基磷灰石的过饱和度，从而有利于羟基磷灰石形成。

图2(b)是m-MCS的小角XRD图谱。m-MCS在(100)、(110)和 (200)处出现较强的衍射峰，说明合成出的m-MCS具有规则的六角形介孔孔道。图2(c)是m-MCS的IR图谱。802cm^-1、1080cm^-1处的特征峰是Si- O-Si不对称伸缩振动峰、Si-O-Si对称伸缩振动峰，1639cm^-1和3450cm^-1处特征峰是H₂O吸收峰。

②SEM、TEM分析

采用扫描电子显微镜(SEM，Hatachi S-4800，日本日立集团)，对m-MCS 进行表面形态观察。采用投射电子显微镜(TEM，JEM-1400，日本电子株式会社)，对m-MCS进行亚显微或超微结构分析。测试结果如图3所示。

图3(a)是m-MCS的SEM。m-MCS粉末呈不规则的蠕虫状结构且表面光滑，长度约2-3μm。图3(b)是m-MCS的TEM。由图可知，m-MCS 介孔孔道尺寸均一、有序，孔径约6nm。

③EDS分析

采用扫描电子显微镜能谱(SEM/EDS，Hatachi S-4800，日本日立集团)，对m-MCS进行材料微区成分元素种类与含量进行分析。测试结果如图4所示。

图4是m-MCS的EDS图谱。m-MCS主要是由Mg、Ca和Si元素组成，其组成比例约为1:1:2，随着m-MCS降解，m-MCS中三种主要离子缓慢释放出来时，不仅展现优异的生物活性，还促进成骨细胞的增殖和分化。

④BET、DLS分析

采用氮气吸附脱附仪(Tristar-3000，美国麦克公司)，测定m-MCS材料对氮气的吸附脱附曲线，采用BJH模型(Barrett-Joyer-Hanlenda)对介孔孔道进行分析(比表面积、孔容和孔径)。采用动态光散射粒度仪(DLS，NICOMP 380ZLS，PSS Nicomp)测定m-MCS的平均粒径。测试结果如图5所示。

图5(a)是m-MCS氮气吸附-脱附等温线。该曲线属于不可逆第IV型吸附-脱附等温线和H1型迟滞回线，所以m-MCS具有形状和尺寸均一的介孔结构和窄的孔径分布。图5(b)是m-MCS的孔径分布。通过BJH孔径分布计算方法得出，合成的m-MCS具有较高的比表面积(395.3m²g^-1)、高孔容(0.53cm³g^-1)，孔径约6.4nm。图5(c)是m-MCS的DLS测试结果图， m-MCS的粉末粒径尺寸约1070nm。

实施例3-4中的m-MCS的结构、形貌、元素组成、比表面积、孔容、粒径与实施例1-2中的m-MCS基本相当。

效果实施例2

对实施例1-2的m-GCWG(20m-GCWG和40m-GCWG)支架及对比例 1的GCWG支架进行结构形貌、力学性能、体外生物活性、体外降解性能等表征。

1、结构和形貌表征

①宏观观察

Touyama等研究表明京尼平与甲胺反应生成京尼平-甲胺单体，从而导致蓝色色素的形成，京尼平-甲胺单体是通过甲胺上的-NH₂与京尼平C3位的烯碳原子发生亲核反应，二氢吡喃环开环形成杂环胺，蓝色色素可能通过氧自由基聚合反应和脱氢反应而形成的。Fujikawa等研究发现京尼平与甘氨酸反应生成蓝色色素，这种蓝色色素是较简单的1:1复合物，京尼平和氨基酸反应生成环烯醚萜氮化物，经脱水形成芳香族单体，然后该芳香族单体可能基于自由基二聚反应形成分子间和分子内交联结构。

目测观察GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG多孔支架。交联24h后，颜色变成深蓝色，这是由于京尼平与WG中的-NH₂自发发生反应形成一种蓝色色素，由于m-MCS含量的增加，WG的含量减少，-NH₂的含量随之减少，-NH₂随之减少，所以深蓝色逐渐变浅。另外在三组多孔支架表面均有大量的孔洞，说明在制备过程中随着NaCl颗粒的浸出，支架由外至内完成了交联过程。

②IR、XRD分析

采用IR对上述多孔支架GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG进行分子结构和化学组成分析，测试范围使用中红外光(约4000-400cm^-1)。采用XRD，在广角(10-80°)进行测试，对样品GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG的结构进行分析。测试结果如图6所示。

图6(a)是GCWG(i)、20m-GCWG(ii)和40m-GCWG(iii)多孔支架的IR图谱。1656cm^-1处的峰是-CO-NH-的特征峰，这表明京尼平的- COOCH₃与WG中的-NH₂反应生成-CO-NH-。3100-3400cm^-1处的宽峰是-CO- NH-中N-H伸缩振动峰，1529cm^-1是-CO-NH-中N-H弯曲振动峰，1445cm^-1是-CO-NH-内C-N伸缩振动峰。这表明京尼平充分交联WG。在20m-GCWG 和40m-GCWG复合支架中，1080cm^-1和802cm^-1处出现Si-O-Si不对称伸缩振动峰和Si-O-Si对称伸缩振动峰，且随着m-MCS含量的增加，Si-O-Si的特征峰强度增加。

图6(b)是GCWG(i)、20m-GCWG(ii)和40m-GCWG(iii)多孔支架的XRD图谱。GCWG是非晶态结构，在2θ＝21°处出现宽峰。m-MCS是典型的非晶态硅酸盐材料，在2θ＝24°处出现宽峰。由于m-MCS质量分数的增加，20m-GCWG和40m-GCWG的峰均向高角度偏移(2θ＝24°、2θ＝25°)。结果表明，m-GCWG中m-MCS和京尼平交联的WG混合均匀，且没有结晶相产生。

③SEM分析

利用SEM对多孔支架(GCWG、20m-GCWG、40m-GCWG)进行表面形态与结构观察。测试结果如图7所示。

图7是GCWG(a、b)、20m-GCWG(c、d)和40m-GCWG(e、f)多孔支架的SEM照片。材料孔径过大或者过小均不利于细胞和骨组织的长入，比较适宜的孔径大小是100-500μm。GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG三组多孔支架的孔隙都具有良好的贯通性，且大孔径约500μm(图7a、c、e)。在大孔壁上，也有一些小孔，小孔径约100μm(图7b、d、f)。GCWG的孔结构是规则的球形(图7a、b)，而随着m-MCS含量的增加(20m-GCWG和 40m-GCWG)，其孔结构越来越不规则(图7c、d、e、f)。另外，GCWG支架表面比较光滑且均匀(图7a、b)，而20m-GCWG和40m-GCWG的表面比较粗糙(图7c、d、e、f)。材料表面的粗糙度会影响着细胞的行为(细胞趋化、迁移、粘附、增殖等)，与光滑的材料表面相比，粗糙的材料表面更有利于细胞的粘附，使细胞与材料紧密结合。

④孔隙率表征

采用阿基米德排水法测定多孔支架(GCWG、20m-GCWG、40m-GCWG) 的孔隙率(P)。采用无水乙醇(密度ρ)作为排除液，并用比重瓶作为此实验的容器。

计算公式为：

支架的体积＝(W₁+W_S-W₂)/ρ (1-1)

孔隙的体积＝(W₂-W₃-W_S)/ρ (1-2)

P＝(W₂-W₃-W_S)/(W₁-W₃)×100％ (1-3)

其中，W_S＝干燥支架的重量，W₁＝装一定量乙醇的比重瓶质量，W₂＝支架完全浸没在装有乙醇的比重瓶的质量，W₃＝将支架取出后装有乙醇的比重瓶的质量。

测试结果如下表1所示。

表1 GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG多孔支架的孔隙率

由上表可知，当制备支架的方法与参数固定不变以后，随着m-MCS与WG的质量比从0:100增加到20:80和40:60时，支架的孔隙率从53.4％ (GCWG)增加到70.1％(20m-GCWG)和77.2％(40m-GCWG)。m-MCS 特殊的介孔结构(较高的比表面积)，提高了m-GCWG多孔支架的孔隙率。

2、交联度测定

根据Mi方法用茚三酮方法对制备的支架进行交联度测定。分别称取京尼平交联前、交联后的样品7mg放入试管中，加入一定量的去离子水静置 1h，再加入茚三酮4mL，100℃水浴20min，待混合溶液冷却至20℃后，用 50％异丙醇稀释并混合均匀。吸取200μL混合溶液，使用酶标仪(Spectra max plus，美国科仪公司)，在570nm波长下，测吸光度值(O.D.)。所有操作均在暗室中进行。以不同浓度的甘氨酸作为制作标准曲线，计算交联度的公式如下：

交联度＝(M₀-M_t)/M₀×100％ (1-4)

其中，M₀是交联前自由α氨基酸的量，M_t是交联后自由α氨基酸的量。

测试结果如下表2所示。

表2京尼平交联后支架的孔隙率

由上表可知，GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG的交联度是65.43％、 61.77％和58.39％，随着m-MCS含量的增加会导致支架交联度降低。

3、吸水率测试

多孔支架的吸水率测定方法如下：将实验样品(GCWG、20m-GCWG和 40m-GCWG)浸泡在去离子水中，浸润的样品分别在1、5、10、15、30、60 和120min后取出，除净表面残余的液体后，测量样品的重量。

计算公式为：

吸水率＝(W_H-W_D)/W_D×100％ (1-5)

其中，W_H＝每个时间段支架的湿重，W_D＝支架的干重。

测试结果见图8。

图8是GCWG(i)、20m-GCWG(ii)和40m-GCWG(iii)多孔支架的吸水率。在浸泡去离子水中30min后，GCWG的吸水率只有385.44％，而 20m-GCWG和40m-GCWG的吸水率分别为447.02％和549.82％。在浸泡去离子水中240min后，三种支架的吸水率趋于稳定，吸水率分别为474.18％ (GCWG)、519.61％(20m-GCWG)和591.14％(40m-GCWG)。m-MCS具有高比表面积、高孔容，提高了m-GCWG的吸水率。

4、抗压强度测定

测定抗压强度样品的规格是Φ6×6mm，用电子万能试验机对样品 (GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG)的抗压强度进行测试，保证样品与仪器接触面平滑。测试结果如下表3所示。

表3京尼平交联前后支架的抗压强度

由上表可知，不使用京尼平对样品进行交联，支架无法成型，抗压强度为0MPa。在37℃经过京尼平交联24h后，GCWG、20m-GCWG和40m- GCWG的抗压强度分别是1.93MPa、1.86MPa和1.71MPa，可能是因为m- MCS导致支架交联度降低，所以抗压强度也随之降低。

5、体外生物活性测试

支架材料体外生物活性的评价是通过在37℃模拟体液(SBF)中浸泡7 天，观察其羟基磷灰石的生长情况来判定。SBF溶液中的化学成分主要有 NaCl、NaHCO₃、KCl、K₂HPO₄·3H₂O、MgCl₂·6H₂O、HCl(1mol/L)、CaCl₂、Na₂SO₄和NH₂CH₂OH，最后用HCl(0.5mol/L)调节溶液pH＝7.4。

将样品(GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG，规格Φ12×2mm)浸泡在 SBF溶液中，浸泡比例为20mL/g。放于37℃温度、100％湿度、60r/min恒温振荡箱中，浸泡7天。用去离子水清洗材料表面，并在50℃下烘干24h。采用SEM对支架(GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG)进行表面形态观察。采用XRD，于广角(10-80°)进行测试，对样品(GCWG，20m-GCWG，40m- GCWG)的成分、结构进行分析。采用EDS对40m-GCWG进行材料微区成分元素种类与含量进行分析。

分别在0、1、3、5、9和14天时，在40m-GCWG的SBF浸泡液中提取1mL液体，用去离子水稀释10倍。采用等离子体发射光谱仪(ICP，ICPE- 9000，日本岛津)，检测40m-GCWG各个时间段的SBF溶液中Ca、Mg、Si 和P离子的浓度。

测试结果见图9-11。

图9是GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG多孔支架浸泡在SBF溶液 7天后表面的SEM照片。浸泡SBF溶液7天后，GCWG支架表面有少量不规则颗粒(图9a、b)。20m-GCWG支架表面集聚了形状略规则的矿物晶体 (图9c、d)。与20m-GCWG相比，40m-GCWG支架表面被大量微球晶体所覆盖，且其表面的微球晶体层密度更大，微球直径约2±0.5μm(图9e、f)。后续实验可以证明生成的微球晶体是羟基磷灰石(HA)。材料表面HA生成最关键的两个因素是HA的成核位点和局部超饱和的Ca²⁺浓度。40m-GCWG 中的m-MCS可以为HA的形成提供成核位点，首先m-MCS中的Ca²⁺、Mg²⁺释放出来，使材料表面形成富Si层，从而Ca-P初始晶核形成，最终诱导HA的生成。40m-GCWG支架可以良好的诱导HA的产生，具有一定的生物活性，有助于在体内成骨中与周围骨组织产生化学键合，从而形成新生骨组织。

图10(a)是GCWG(i)、20m-GCWG(ii)和40m-GCWG(iii)多孔支架浸泡在SBF溶液7天后表面XRD谱图。对照标准卡片可知，HA的特征峰是2θ＝25.17°、42.86°、44.40°和55.42°，由XRD图谱可得GCWG没有HA的产生，20m-GCWG和40m-GCWG有HA的特征峰，说明在SBF浸泡 7天后有HA的生成。40m-GCWG有HA的特征峰强度较大，表明其表面形成的HA层密度大，这与图9情况相符。

图10(b)是40m-GCWG浸泡在SBF溶液7天后表面EDS谱图。大量文献研究表明，化学计量羟基磷灰石Ca/P≈1.67。40m-GCWG表面覆盖的微球晶体主要成分有Ca和P，且Ca/P≈1.60，与HA化学计量基本相符。综合 XRD和EDS结果，40m-GCWG多孔支架具有很好的体外生物活性，可以在 SBF溶液中诱导HA的生成。

图11是40m-GCWG浸泡在SBF溶液14天内溶液ICP(Ca、Si、Mg、 P)变化曲线图。由ICP曲线图可知，40m-GCWG浸泡SBF中后，HA逐渐形成，Ca和P离子浓度下降。而Si和Mg离子的浓度在整个浸泡过程中一直呈现上升的趋势，这主要由于40m-GCWG多孔支架的降解和m-MCS结构的破坏。因此，结果表明，40m-GCWG多孔支架具有较好的体外生物活性，生成的羟基磷灰石层可以有效的将骨组织与支架材料紧密相连。

6、体外降解性测试

支架材料体外降解性是在37℃中Tris-HCl浸泡84天，通过其失重率和 pH变化情况来判定。

将样品(GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG，规格Φ12×2mm)浸泡在 Tris-HCl中(浸泡比例：20mL/g)，每周更新一次Tris-HCl溶液。分别在第 1、3、7、14、21、28、35、42、56、70和84天将支架从溶液中取出干燥并称重。

计算失重率的公式如下：

失重率＝(W₀-W_t)/W₀×100％ (1-6)

其中，W₀＝支架初始质量，W_t＝每个时间段支架干重。

将样品(GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG，规格Φ12×2mm)浸泡在 Tris-HCl中(浸泡比例：20mL/g)，在整个浸泡周期中，分别在第1、3、7、 14、21、28、35、42、56、70和84天，用pH计(PhS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司)测定其溶液pH值。

采用SEM对浸泡28天的支架(GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG) 进行表面形态观察。

测试结果见图12和图13。

图12(a)是GCWG(i)、20m-GCWG(ii)和40m-GCWG(iii)浸泡在Tris-HCl中不同时间节点的失重率曲线图。前42天，三组多孔支架的失重率比较快；从第42天到第84天，三组多孔支架的失重率比较缓慢。40m- GCWG在整个降解实验中的失重率最显著，在第84天，其失重率达到69.45％。而GCWG和20m-GCWG的适中率分别为41.65％和60.42％。理想的骨修复材料的降解速度十分重要，支架的降解速度应适中，太快会造成缺损部位没有生物力学支撑，太慢会阻碍新生骨组织的长入。m-GCWG支架有较好的降解速率，且速率能通过m-MCS进行调控。

图12(b)是GCWG(i)、20m-GCWG(ii)和40m-GCWG(iii)浸泡在Tris-HCl中不同时间节点溶液pH变化曲线图。GCWG在整个降解实验中，溶液pH持续下降(从7.40到6.84)，最终溶液呈弱酸性状态。与之情况不同的是，28天后，20m-GCWG溶液的pH从7.40上升到7.47，而40m- GCWG溶液的pH从7.40上升到7.59。这是由于随着m-GCWG支架不断降解，支架表面大量m-MCS中的Ca²⁺、Mg²⁺、SiO₄ ^4-释放到溶液中，使溶液处于弱碱的环境。

84天后，20m-GCWG溶液的pH下降到7.10，40m-GCWG溶液的pH 下降到7.25。这是由于m-GCWG支架种WG的含量比m-MCS的含量多，随着材料进一步降解，WG的降解产物比m-MCS的降解产物多，所以pH稍有下降，但是最终pH均趋于稳定状态。人体体液pH正常情况下处于弱碱环境(约7.4)，只有在弱碱条件下，才能保证细胞正常的代谢和机体的正常生理功能。结果显示，在降解实验中，m-GCWG溶液有较好的pH范围，且溶液pH可以通过m-MCS的含量进行调控。

图13是GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG浸泡在Tris-HCl中28天后的SEM照片。GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG浸泡28天后，降解程度有所不同。GCWG由于降解后，大孔与小孔贯通性更好，且孔道不规则，但支架表面依然较光滑(图13a、b)。20m-GCWG由于降解后，支架略有坍塌，但孔贯通性依然较好，表面粗糙不平(图13c、d)。40m-GCWG由于降解后，支架出现瓦解，孔结构遭到破坏，支架整体沟壑纵横，且表面有微裂痕(图13e、f)。介孔材料的降解性比非介孔材料快，由于m-MCS有序的孔结构、高的比表面积、高孔容，使得m-GCWG有较好的降解性，且降解效果可以通过m-MCS的含量进行调控。此结果与图12(a)的失重率结果相符。

7、细胞实验

细胞实验按照如下操作进行：首先将从液氮中取出的小鼠成骨细胞 (MC3T3-E1)，然后将融化的细胞悬液转移到离心管中离心10分钟，取下面沉淀物，并加入10mL含10％胎牛血清的DMEM(gibco公司)培养液，反复离心弃上清液，最终将细胞放入含有上述培养液的培养皿中，37℃、100％湿度和5％CO₂条件下培养，每两天更换一次培养液，待MC3T3-E1生长成为细胞株，用0.25％的Trypsin和0.03％的EDTA混合溶液处理。

将样品(GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG，规格Φ12×2mm)灭菌处理放入24孔板中，将剥离后的细胞种在样品表面，接种密度为2×10⁴个/孔。

(1)细胞形态

细胞在材料表面粘附情况的好坏决定了材料是否具有生物相容性。本效果实施例中细胞在支架表面的粘附情况通过观察其细胞形态进行表征，具体为在培养的第12小时、1天、3天和7天时，用PBS清洗样品，再用2.5％的戊二醛溶液固定，用于SEM观察。

SEM观察：在培养第12小时、1天、3天时，用PBS清洗样品2-3次，将戊二醛固定液洗净，然后依次用1mL的10％、30％、50％、70％、85％和 90％乙醇溶液脱水处理，每次时间为15min，最后再用100％无水乙醇脱水两次。将样品在37℃下烘干。采用SEM对支架(GCWG、20m-GCWG和40m- GCWG)进行表面的细胞形态观察。

测试结果见图14。图14为MC3T3-E1细胞分别在三组支架表面培养不同时间节点的SEM照片。在培养第12小时，三种多孔支架上粘附的细胞近球形、互不接触，且40m-GCWG上粘附的细胞较多(图14a、b、c)。在培养第1天时，三种多孔支架上粘附的细胞伸出伪足呈现出梭形和多角形，但 GCWG上的细胞单独存在，而20m-GCWG和40m-GCWG上的细胞连在一起(图14d、e、f)。在培养第3天时，细胞已经铺展于三组支架表面，40m- GCWG上的细胞数目多，且已形成交织状网络(图14g、h、i)

由SEM分析，细胞在GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG上粘附和生长状况良好，说明这三种支架无细胞毒性。m-GCWG的粘附效果较好，这是由于m-GCWG粗糙的表面形貌有利于细胞的粘附，其溶液呈弱碱性适合细胞的生长，且m-MCS可以促进细胞的粘附、铺展和生长。

(2)细胞增殖

当细胞在支架表面附着、铺展后，需要尽快表达一定的增殖性，才能使支架附近产生富集大量细胞的微环境，从而使得细胞外基质的分泌和各类蛋白的合成，促进材料与周围组织紧密结合。

本效果实施例采用MTT法测定MC3T3-E1细胞的增殖性并进行统计分析。在细胞培养第1、3和5天时，每孔加入100μL 5％MTT液(Sigma Aldrich Chemistry)，37℃培养4h，然后加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，最后用酶标仪在570nm处，测吸光度值(O.D.)。至少选择5组平行样本进行测试， p<0.05表示具有统计学显著性差异，所有的定量数据采用平均值使用Origin pro8.2进行分析。

分析结果见图15。图15是MC3T3-E1分别在GCWG(i)、20m-GCWG (ii)、40m-GCWG(iii)支架表面培养1、3和5天时的增殖率柱状图，*p ＜0.05。随着培养时间的延长，GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG的细胞增殖率都呈增长趋势，说明这三种支架材料都具有细胞相容性。在培养第3 天和第5天时，40m-GCWG和20m-GCWG的细胞增殖率明显高于GCWG。其中40m-GCWG的细胞增殖率在培养第1、3和5天均高于其他两组。m- MCS产生的Mg、Ca和Si离子可以促进细胞的增殖，另外m-GCWG的弱碱性溶液适合细胞生长所需的微环境，所以在GCWG中添加一定量的m- MCS可以促进细胞的增殖和生长。

(3)细胞分化

与细胞在多孔支架上粘附并表达增殖性相比，细胞在支架表面的功能化更重要，ALP活性是成骨细胞分化与功能成熟的重要指标。因此本效果实施例用ALP活性来评估MC3T3-E1细胞的分化功能。具体为在细胞培养第7、 10和14天时，用含50mg/L 10％胎牛血清、抗坏血酸和10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的α-MEM培养，弃诱导液，用PBS清洗3次，加入250μL细胞裂解液，反复冻融，离心后取细胞裂解液上清液，用ALP检测试剂盒(Sigma AldrichChemistry)在405nm处，测定相应的吸光度值(O.D.)。至少选择5 组平行样本进行测试，p<0.05表示具有统计学显著性差异，所有的定量数据采用平均值使用Origin pro8.2进行分析。

分析结果见图16。图16是MC3T3-E1细胞分别在GCWG(i)、20m- GCWG(ii)和40m-GCWG(iii)多孔支架表面培养7、10天和14天时的 ALP活性柱状图，*p＜0.05。尽管在培养第7天时，三组支架的ALP活性差异较小，但随着培养时间的延长，40m-GCWG和20m-GCWG明显高于 GCWG。其中40m-GCWG的细胞活性在培养第7天、第10天和第14天均高于其他两组。这是由于m-MCS可以促进细胞的成骨分化能力，且m-GCWG 粗糙的表面有利于细胞的附着，活性ALP加速细胞外基质钙化和钙磷沉积。

通过上述比较细胞在GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG多孔支架粘附、增殖和分化情况可知，在GCWG中添加m-MCS可以促进细胞的粘附， m-MCS含量的增加，细胞的粘附效果变好，40m-GCWG的细胞增殖率、ALP 活性在各自的培养周期中优于GCWG和20m-GCWG，说明在GCWG中加入m-MCS可以促进细胞的增殖和生长、成骨细胞的分化及其功能成熟。

综上，本发明的m-GCWG多孔支架呈现深蓝色，并且随着m-MCS含量的增加，深蓝色逐渐变浅。本发明的m-GCWG多孔支架的孔隙都具有良好的贯通性，大孔径约500μm，小孔径约100μm，且添加了m-MCS的支架表面比较粗糙。随着m-MCS与WG的质量比从0:100增加到40:60时，孔隙率从53.4％(GCWG)增加到77.2％(40m-GCWG)，吸水率从474.18％ (GCWG)增加到591.14％(40m-GCWG)。利用茚三酮方法测定支架的的交联度，发现GCWG的交联度是65.43％，而40m-GCWG的交联度下降到 58.39％，m-MCS含量增加，支架的交联度下降，从而抗压强度下降。浸泡 SBF溶液7天后，m-GCWG的生物活性远优于GCWG，其中40m-GCWG可以良好的诱导HA的产生。在体外降解实验中，40m-GCWG的失重率最显著，84天后失重率为69.45％，而GCWG和20m-GCWG的适中率分别为 41.65％和60.42％。降解过程中溶液的pH可以通过m-MCS的含量进行调控， 40m-GCWG溶液的pH处于弱碱的环境，最终稳定在7.25。通过比较细胞在 GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG多孔支架粘附、增殖和分化情况可知，在GCWG中添加m-MCS可以促进细胞的粘附，m-MCS含量的增加，细胞的粘附效果变好，40m-GCWG的细胞增殖率、ALP活性在各自的培养周期中优于GCWG和20m-GCWG，说明在GCWG中加入m-MCS可以促进细胞的增殖和生长、成骨细胞的分化及其功能成熟。

实施例3-4的10m-GCWG、50m-GCWG的结构形貌、孔隙率、交联度、吸水率、抗压强度、体外生物活性、体外降解性、细胞实验效果与实施例1- 2的20m-GCWG、40m-GCWG基本相当。

效果实施例3

对实施例1-2的m-GCWG(20m-GCWG和40m-GCWG)支架及对比例 1的GCWG支架进行体内植入实验。

细胞最适宜的生长环境是在体内，整个动物机体是一个不可拆分的整体，当机体的某个部位收到外界的刺激发生损伤和缺损时，其自身会产生促进损伤部位周围细胞生长的环境。由于体外细胞培养的环境无法模拟细胞在体内生长的真正状态，所以体内动物实验就尤为重要。在体内存在自身免疫反应和体液微环境，在体内对植入材料的影响或者环境的促进因素尚不明确，所以只有将材料植入动物体内观察，才能真正判断该材料的成骨性和是否可以修复骨缺损。

本效果实施例构建兔右侧股骨缺损作为动物模型，将GCWG、20m- GCWG和40m-GCWG植入缺损部位，术后第1、2和3个月取出股骨缺损区域。采用同步辐射micro-CT二维和三维成像、组织切片染色(HE染色、 Masson染色)和免疫组化染色分析手段对取出的股骨缺损区域进行检测分析。评估材料周围细胞炎症反应；定性和定量分析材料残余率、新生骨组织生长情况以及成熟骨组织成骨量分析；定性和定量分析骨缺损部位I型胶原蛋白的分泌情况，从而对新骨生成量进行分析。

1、兔股骨模型植入实验

动物实验的样品是Φ6×6mm的GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG多孔支架。将支架密封，利用紫外辐射进行灭菌。

构建兔右侧股骨缺损作为动物模型。选取2-3个月龄新西兰大白兔18只 (体重约2.5kg/只)，每个实验组在每个时间点设置两组平行样，雌雄不限，相同环境条件下饲养。

实验过程如下。首先将大白兔右侧股骨处剃毛、消毒。再注入适量鹿眠宁麻醉实验兔，麻醉量可随着实验过程中情况酌情而定。手术中用0.5％碘伏进行手术台消毒，铺无菌手术单，手术均在无菌条件下进行。取实验兔股骨处，切开皮肤和皮肤下组织，使股骨充分显露没有软组织的保护状态。用电钻制造Φ6×6mm的孔洞缺损，然后用止血纱布清理伤口并去除多余碎骨。将支架放入骨缺损内，缝合伤口。最后用抗生素涂在伤口预防感染，并完成植入手术。

术后第1、2和3个月分别处死实验兔，取出股骨缺损区域，用2.5％戊二醛固定，放入4℃冰箱待用。

图17是GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG植入兔股骨内1、2和3个月后的大体观察照片。

支架植入1个月后，三组支架在外观上不可见，三组支架的缺损部位均未被骨组织完全覆盖，但都未发生红肿发炎现象。相比20m-GCWG，GCWG 的未修复区域较大。40m-GCWG修复效果良好，骨缺损部位表面几乎被新骨覆盖，但依然有未修复的痕迹。

支架植入2个月后，三组支架缺损部位均有愈合趋势，且均未发生红肿发炎现象。GCWG的修复效果较慢，其缺损部位依然较明显。20m-GCWG缺损部位依然可见。40m-GCWG缺损部位的新生骨与原骨组织已紧密结合，缺损部位基本消失。

支架植入3个月后，三组支架缺损部位进一步愈合，且均未发生红肿发炎现象。GCWG效果不佳，其缺损部位依然可以观察到未修复的孔洞。20m- GCWG和40m-GCWG缺损部位愈合平整，新生骨组织逐渐成熟、逐渐致密，新生骨和原骨组织结合牢固。

2、同步辐射micro-CT成像

利用上海光源BL13W1线站对实验骨头样品进行二维和三维成像。用动态X射线同轴位相衬度成像、显微断层成像等可对材料进行高分辨、无损的成像研究。被单色化的X射线与样品的各个部位发生菲涅耳衍射，带有样品信息的光线被探测器接收，从而得到相应的图像。

本实验将样品固定在操作台上，成像距离1.6m，旋转角度180°，再使用 VHR对每个样品采集1600张CT图像。最后用Image Pro Plus 6.3、VG studio MAX处理图像信息。测试结果见图18。

图18是GCWG和40m-GCWG支架植入兔股骨内1、2和3个月后的 micro-CT三维成像图。红色虚线框标识的部位是骨缺损区域。

支架植入1个月后，GCWG未修复骨缺损区域较大，皮质骨的缺损未修复面积依然较大，而松质骨的缺损也几乎未修复。40m-GCWG皮质骨的缺损未修复面积较小，而松质骨的缺损有少量骨组织生成。

支架植入2个月后，GCWG未修复骨缺损区域依然较大，皮质骨的缺损部位依然可见，而松质骨的缺损有少量骨组织生成。40m-GCWG皮质骨缺损基本愈合，松质骨也得到一定的修复，且新生骨组织沿支架三维网络结构进行生长。

支架植入3个月后，GCWG和40m-GCWG缺损部位进一步愈合。GCWG 皮质骨的缺损愈合完全，而松质骨的缺损部位变小。40m-GCWG骨缺损区域大部分被新骨组织替代，新生的骨小梁呈网状排列。但是为了定量评估新生骨量和材料残余率，还需要对样品进行组织学切片分析。

3、组织切片染色

取同步辐射后的骨头样品，放入配制好的4％多聚甲醛/PBS溶液中，在 4℃温度下固定24h。再置于10％的EDTA/PBS脱钙液体中，37℃温度下， 120r/min震荡脱钙一段时间，期间更换脱钙液。最后包埋、切片。

HE染色：先用二甲苯进行脱蜡，每次5-10min。再用100％、95％、85％、 70％和50％酒精梯度浸泡。然后将样品放入苏木素染液中染色10-30min，流水冲洗。再放入1％盐酸乙醇中褪色数十秒直到切片颜色变红变浅。依次放入50％、70％和80％乙醇中(4min/次)，再用伊红乙醇液对比染色约2min。最后用二甲苯处理，中性树胶封存。显微镜下观察切片，观察支架材料与骨结合程度、新生骨生长情况。至少选择5组平行样本进行测试，p<0.05表示具有统计学显著性差异，所有的定量数据采用平均值使用Origin pro8.2进行分析。具体结果参见图19。

图19是通过HE染色方法分析的GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG 支架植入兔股骨内不同时间段的新骨生成量和材料残余率，*p＜0.05。理想的骨再生材料的降解速度应该和成骨速度一致，或者比成骨速度稍慢。材料逐渐降解，但不影响缺损部位的组织正常的生理功能，骨组织逐渐形成和重建。通过量化分析可得，支架植入1个月后，GCWG缺损部位新骨生成量和材料残余率分别是11.13％和80.72％，而20m-GCWG和40m-GCWG的缺损部位新骨生成量和材料残余率分别是13.47％、17.66％和70.34％、61.83％。

支架植入2个月后，材料进一步降解，GCWG、20m-GCWG和40m- GCWG的材料残余率分别是62.43％、40.21％和34.21％，GCWG新骨生成量23.07％，而20m-GCWG和40m-GCWG的新生骨较多，分别是36.83％和 44.53％。支架植入3个月后，40m-GCWG材料几乎完全降解，其材料残余率是19.62％，而GCWG和20m-GCWG是41.33％和29.73％，GCWG，20m- GCWG和40m-GCWG的成骨量也大幅度提升，分别是39.31％、56.11％和 62.43％。结果显示，m-MCS的加入可以促进材料的降解性和生物活性，40m- GCWG支架具备良好的降解性和成骨性能，能有效促进骨缺损的愈合。

4、免疫组化染色

免疫组化，是用显色剂标记抗体，再利用免疫学原理(抗原抗体高度特异性的互相结合)，来选择性追踪识别组织细胞内的抗原(蛋白质或多肽)，对其定性和定量分析研究。I型胶原在骨的生理方面有着重要作用，是骨组织中主要有机成分，与此同时对钙盐的沉积也有着一定的调节作用。

免疫组化染色按照如下操作进行：将切片用二甲苯、梯度乙醇处理。再分别用流水和去离子水清洗，每次清洗约5-10min。放入3％H₂O₂中10min 去除过氧化酶，PBS清洗(5min/次)。再放入枸橼酸钠缓冲溶液，高温微波修复10min，PBS清洗(5min/次)。37℃温度下，用5％血清封闭30min，PBS 清洗(5min/次)。加一抗兔抗I型胶原抗体，4℃、过夜处理，PBS清洗(5min/ 次)。加二抗兔抗I型胶原抗体，37℃、30min，PBS清洗(5min/次)。显微镜下用DAB显色，用去离子水停止显色过程。最后梯度脱水、透明处理、封固。至少选择5组平行样本进行测试，p<0.05表示具有统计学显著性差异，所有的定量数据采用平均值使用Origin pro8.2进行分析。

分析结果见图20。图20是GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG支架植入兔股骨内不同时间段的I型胶原阳性定量分析，*p＜0.05。由图20量化数据可知，在整个体内植入周期中，40m-GCWG的I型胶原阳性表达率高于 GCWG和20m-GCWG。支架植入3个月后，40m-GCWG的I型胶原阳性表达率可以达到64.22％，而GCWG和20m-GCWG只有37.28％和53.27％。结果表明，40m-GCWG支架具备良好成骨性能，能有效促进骨缺损的愈合。

通过组织学切片分析和免疫组化分析，可知40m-GCWG多孔支架对骨缺损的修复效果比较好，这是由于，40m-GCWG的降解速率适中，与骨的生长速度更契合，降解的pH值处于弱碱性，是新生骨组织形成所需要的微环境。其降解产物Mg离子是人体矿物质新陈代谢的重要影响因素，影响骨组织的钙化过程，直接控制新生骨组织的晶化和形成过程。Ca离子和Si离子有利于支架表面形成类骨磷灰石，类骨磷灰石可以吸附血清中的蛋白，不仅促进成骨细胞在支架表面粘附、增殖和分化，还可以促进胶原纤维的分泌和矿化，进而促进骨基质的形成。

综上，将本发明制备的GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG植入兔缺损部位，术后1、2和3个月取出，通过micro-CT三维成像图可知，当支架植入3个月后GCWG皮质骨的缺损愈合完全，而松质骨的缺损部位变小。而在40m-GCWG中，材料几乎全部吸收，新生骨组织与成熟骨组织交替排列，紧密结合。HE染色结果显示，40m-GCWG支架具备良好的降解性和成骨性能，在整个植入周期中，新生骨组织逐渐形成，可以有效代替植入支架，支架植入3个月后，40m-GCWG材料几乎完全降解，其材料残余率是19.62％，而GCWG和20m-GCWG是41.33％和29.73％，GCWG、20m-GCWG和40m- GCWG的成骨量也大幅度提升，分别是39.31％、56.11％和62.43％。从免疫组化分析可知，随着m-MCS与小麦蛋白的质量比从0:100增加到40:60时，I型胶原阳性表达率逐渐提高，GCWG、20m-GCWG的I型胶原阳性表达率是37.28％、53.27％，而40m-GCWG的I型胶原阳性表达率可以达到64.22％。体内植入实验说明，40m-GCWG多孔支架对骨缺损的修复效果比较好。

实施例3-4的10m-GCWG、50m-GCWG的体内植入实验效果与实施例 1-2的20m-GCWG、40m-GCWG基本相当。

效果实施例4

对实施例1-2的20m-GCWG、40m-GCWG和对比例1的GCWG的载药效率及所得CUR@20m-GCWG、CUR@40m-GCWG和CUR@GCWG进行表征。

1、载药效率测定

①姜黄素标准曲线测定

将姜黄素(CUR)溶于乙醇-水溶液(2:8，v/v)，配制成10mg/mL的CUR 溶液。把该溶液稀释成不同梯度浓度(100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、 500μg/mL、600μg/mL、800μg/mL和1000μg/mL)，取不同浓度的溶液200μL，用酶标仪在427nm处，测定相应的吸光度值(O.D.)，用Origin Pro 8.1绘制 CUR标准曲线。

②姜黄素吸附实验

配制800μg/mL CUR溶液，将对比例1的GCWG、实施例1的20m- GCWG和实施例2的40m-GCWG多孔支架分别置于25mL烧杯中，并向烧杯加入10mL CUR溶液(800μg/mL)，使支架浸没在溶液中。整个CUR吸附实验在37℃恒温震荡箱中进行，24h后得到载CUR多孔支架(CUR@GCWG、CUR@20m-GCWG和CUR@40m-GCWG)，取上清液 200μL，用酶标仪，测吸光度值(O.D.)，根据CUR标准曲线计算剩余CUR 浓度，通过如下公式计算支架的载药率：

载药率＝(D₀-D₁)/Ms×100％ (4-1)

其中D₀是CUR的总质量，D₁是溶液中未被负载到支架上的CUR质量， Ms是载药前支架的质量。

至少选择5组平行样本进行测试，p<0.05表示具有统计学显著性差异，所有的定量数据采用平均值使用Origin pro8.2进行分析。测试结果见图21。

图21a是在427nm吸光度下测得的CUR标准曲线。经过直线回归分析之后，绘制曲线，方程是：y＝2.62969×10^-4x+2.43123，相关系数：r＝0.98713。借助这条CUR标准曲线，可以计算未知溶液中CUR的释放量，假设某个时间节点的缓释液为V，测得O.D.值为y，即可求得对应标准曲线上姜黄素的浓度x＝(y-2.43123)/(2.62969×10^-4)，由x可以求得释放的CUR的量z：z＝Vx (单位：μg)。

图21b是借助CUR标准曲线计算而得的对比例1的GCWG、实施例1 的20m-GCWG和实施例2的40m-GCWG对CUR的载药效率图。GCWG的载药效率是0.71％，而20m-GCWG和40m-GCWG对CUR的载药效率分别是1.22％和1.45％。由于介孔粉末m-MCS的加入，载药效率有所提升，这是由于药物不仅在支架的孔中吸附，也会在m-MCS的介孔孔道中吸附，所制备的m-MCS具有有序的介孔孔道和高孔容。

2、XRD分析

采用X射线衍射仪(XRD，Rigaku D/max 2550/PC 18KW，日本理学电机rigaku)对CUR和载CUR前后的40m-GCWG进行测试。具体测试结果见图22。

图22是实施例2的40m-GCWG载CUR前后的XRD图谱。40m-GCWG 是非晶态结构，在2θ＝25°处出现宽峰。姜黄素在14.52°、15.94°、17.22°、 21.08°、24.70°、28.18°等多处出现特异性的结晶衍射峰。40m-GCWG负载CUR后，CUR@40m-GCWG的峰形为前两种物质特征峰的叠加。结果表明，40m-GCWG上负载了一定量的CUR。

3、姜黄素缓释实验

将对比例2的CUR@GCWG、实施例5的CUR@20m-GCWG和实施例 6的CUR@40m-GCWG放入真空干燥箱中37℃干燥，将载药支架放入10 mL装有PBS(pH＝7.0)的离心管中探究支架对药物缓释的情况，整个药物缓释实验依然在37℃恒温震荡箱中进行。在第0.5、1、3、5、7、10、13、 16和21天取上清液200μL，用酶标仪测吸光度值(O.D.)，同时向离心管中补充200μL PBS(pH＝7.0)溶液。然后通过CUR标准曲线计算每个时间段姜黄素的累积释放量。

具体测试结果见图23。图23是GCWG、20m-GCWG、40m-GCWG对 CUR的体外缓释曲线图。GCWG在前5天对CUR表现出突释行为，其释放量约43.5％，而最终GCWG的释药量只有54.7％。20m-GCWG在前10天对 CUR表现出缓慢释放效果(65.1％)，最后20m-GCWG的释药量为69.4％。 40m-GCWG在整个药物释放过程中的缓释效果更好，21天后的缓释量为 81.4％。三组支架在开始的一段时间的释药速度较快，是因为这一阶段的释放的药物是在支架表面吸附的药物。而40m-GCWG在后期的释放较缓慢，是因为此时释放的药物是在支架孔隙中和介孔中吸附的药物。结果表明， 40m-GCWG可以作为较好的药物缓释载体。

4、CUR@m-GCWG支架的细胞实验

将样品(对比例2的CUR@GCWG，实施例5的CUR@20m-GCWG，实施例6的CUR@40m-GCWG，规格Φ12×2mm)灭菌处理放入24孔板中，并接种细胞。具体方法参照效果实施例2第7小节的细胞实验部分。具体测试结果见图24至26。

图24是MC3T3-E1细胞分别在CUR@GCWG，CUR@20m-GCWG， CUR@40m-GCWG多孔支架表面培养不同时间节点的SEM照片。在培养第 1天时，细胞伸出伪足，呈现出多边形，CUR@GCWG的细胞单独存在， CUR@20m-GCWG和CUR@40m-GCWG的细胞数目较多(图24a、b、c)。在培养第3天时，CUR@GCWG的细胞相互连接，界限模糊，CUR@20m- GCWG和CUR@40m-GCWG细胞贴支架铺展，并有向支架内部生长的趋势 (图24d、e、f)。在培养第7天时，CUR@GCWG和CUR@20m-GCWG细胞铺展面积进一步增加，CUR@40m-GCWG表面的细胞已铺展成多层(图 24g、h、i)。结果显示，在整个7天的培养周期中，细胞在三组样品上的粘附和铺展状况较好，说明支架材料和CUR对MC3T3-E1无细胞毒性。

图25是MC3T3-E1细胞分别在CUR@GCWG，CUR@20m-GCWG， CUR@40m-GCWG表面培养1、3和5天时的增殖率柱状图，*p＜0.05。在培养第1天时，三组支架的增殖基本相同，CUR@20m-GCWG和CUR@40m- GCWG略高于CUR@GCWG。在培养第3天和第5天时，CUR@20m-GCWG 和CUR@40m-GCWG的增殖率都大幅度提升，其中CUR@40m-GCWG的增殖率一直高于其他两组。结果显示，CUR@40m-GCWG可以促进细胞增殖和生长，CUR没有细胞毒性。

图26是MC3T3-E1细胞分别在CUR@GCWG，CUR@20m-GCWG， CUR@40m-GCWG支架表面培养7、10和14天时的ALP活性柱状图，*p＜0.05。在培养第7天时，三组支架的ALP活性无太大区别，CUR@20m-GCWG 和CUR@40m-GCWG的ALP活性略高于CUR@GCWG。在培养第10天和第14天时，CUR@20m-GCWG和CUR@40m-GCWG的ALP活性明显高于 CUR@GCWG。在整个培养周期中，CUR@40m-GCWG的ALP活性一直处于较高水平。结果显示，CUR@40m-GCWG可以有效促进细胞的分化，CUR 没有细胞毒性。

5、CUR@m-GCWG支架的抗菌实验

抗菌实验的样品选用对比例2的CUR@GCWG，实施例5的CUR@20m- GCWG和实施例6的CUR@40m-GCWG。样品干燥后，将多孔支架磨成粉末，菌种选用金色葡萄球菌(S.aureus)，考察样品24h后的抑菌率。

抗菌实验具体操作步骤如下：首先在无菌的环境下，在超净台上用接种环挑取接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基的S.aureus，将其溶于培养基中，放入细菌培养箱内，37℃培养。培养24h后，取200μL的菌液均匀的涂在培基中，37℃的细菌培养箱内培养，待S.aureus生长后，数菌落个数并计算浓度。吸取10μL菌液于培养基上，再称取0.5mg经灭菌消毒后的支架粉末一同放入培养基中，在湿度大于90％、37℃的条件下培养24h。最后将培养液稀释，对培养基上的细菌菌落进行拍照，并对菌落数目计数，其中不加支架粉末的为空白对照组，抗菌率的计算公式如下：

抗菌率＝(M-N)/M×100％ (4-2)

其中，M是加入支架材料的菌落数，N是空白组的菌落数。

具体测试结果见图27和28。图27和28分别是CUR@GCWG， CUR@20m-GCWG，CUR@40m-GCWG在24h时对金色葡萄球菌(S.aureus) 菌落分布图和抗菌率。从图27可以看到，CUR@GCWG和CUR@20m-GCWG 的菌落数量较多，而CUR@40m-GCWG几乎看不到菌落。从图28的量化数据可知，CUR@GCWG、CUR@20m-GCWG和CUR@40m-GCWG的抗菌率分别为85％、88％和96％。结果显示，CUR@40m-GCWG对S.aureus具有一定的抗菌作用。

6、CUR@m-GCWG支架的动物实验

动物实验的样品尺寸选用GUR@40m-GCWG(规格Φ6×6mm)多孔支架。具体动物实验过程参照效果实施例3第1小节的兔股骨模型植入实验部分。对实验骨头样品进行三维成像，具体方法参照效果实施例3第2小节的同步辐射micro-CT成像部分。

测试结果见图29至30。

图29是CUR@40m-GCWG植入兔股骨内1、2和3个月后的micro-CT 三维成像图。支架植入1个月后，缺损部位的依然大部分都未得到修复，但是骨缺损内部有少量骨组织生成。支架植入2个月后，缺损部位有一定的愈合趋势，新生骨组织沿支架三维网络结构向内部进行生长。支架植入3个月后，支架植入的缺损区域有较好的修复效果，新生骨组织和原骨组织很好的结合，新生的骨小梁呈网状排列。结果显示，CUR@40m-GCWG支架具备良好成骨性，且CUR对成骨性无明显抑制作用。

图30是CUR@40m-GCWG植入兔股骨内1、2和3个月后的成骨量分析。由图30可知，支架植入1、2和3个月，新生骨体积分别是65.81mm³、 108.76mm³和133.48mm³。结果显示，CUR@40m-GCWG支架具备良好成骨性，可以促进骨组织的原位生长，且CUR对成骨性无明显抑制作用。

综上，将GCWG、20m-GCWG和40m-GCWG多孔支架浸没在CUR溶液中制备出载CUR多孔支架(CUR@GCWG，CUR@20m-GCWG， CUR@40m-GCWG)，随着介孔粉末m-MCS的加入，复合支架的载药效率有所提升，GCWG支架的载药效率是14.34％，而20m-GCWG和40m-GCWG 对CUR的载药效率分别是22.32％和31.32％。CUR缓释实验可知，在21天的缓释过程中，40m-GCWG的缓释效果更好，最终缓释量为81.4％，而GCWG 和20m-GCWG的释药量只有54.7％和69.4％。通过细胞在CUR@GCWG， CUR@20m-GCWG和CUR@40m-GCWG表面培养7天后的SEM照片可知，MC3T3-E1细胞在三组支架上的粘附和铺展状况较好，说明支架和CUR无细胞毒性。而通过比较细胞增殖率和ALP分化的量化结果，CUR没有细胞毒性，且可在GCWG中添加m-MCS可以显著促进细胞增殖、生长和分化。 CUR对S.aureus有一定的抗菌性能，CUR@GCWG、CUR@20m-GCWG和 CUR@40m-GCWG的抗菌率分别为85％、88％和96％。支架植入1、2和3 个月，新生骨体积分别是65.81mm³、108.76mm³和133.48mm³，CUR@40m- GCWG支架具备良好成骨性，且CUR对成骨性无明显抑制作用。

实施例7-8的CUR@10m-GCWG、CUR@50m-GCWG的结构、释药速度、细胞实验和动物实验效果与实施例5-6的CUR@20m-GCWG、 CUR@40m-GCWG基本相当。

Claims

1.一种介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：

(3)将所述前体浸泡于溶剂中去除致孔剂，冷冻干燥即可。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁符合下述条件：所述介孔硅酸钙镁呈非晶态，比表面积为200-1000m²/g，孔容为0.3-1.0cm³/g，具有孔径为6-7nm的规则六角形孔道；

和/或，步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁的粒径为800-1500nm；

和/或，步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁采用溶胶凝胶法制得。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁采用包括如下步骤的方法制备：

S1、将模板剂与水和乙醇混合，搅拌，至溶液澄清；

S2、在30-50℃下，将盐酸(HCl)、正硅酸乙酯(TEOS)、六水硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)、四水硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)和水加入步骤S1所得溶液中，搅拌4-6h反应形成溶胶；

S3、将所得溶胶在90-98℃下陈化，使凝胶物质沉淀；

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述模板剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，较佳地为平均重均分子量为5800的P123三嵌段共聚物；

和/或，步骤S1中，所述模板剂、水与乙醇的用量比为(5-7g):(170-260mL):(29-43mL)；

和/或，步骤S2中，向步骤S1所得溶液中加入盐酸、正硅酸乙酯、六水硝酸镁、四水硝酸钙和水可采用分步加入，先滴加入盐酸和正硅酸乙酯，再加入六水硝酸镁、四水硝酸钙和水；

和/或，步骤S2按照如下操作进行：在35-40℃下，依次将14-20mL浓度为1.5-2.5mol/L的盐酸和10-15mL正硅酸乙酯滴加入上述溶液中，然后再加入6.5-9.5g六水硝酸镁、5.8-8.8g四水硝酸钙和25-35mL水，搅拌4-6h反应形成溶胶；

和/或，步骤S3中，所述陈化的时间为2-5天；

和/或，步骤S4中，所述洗涤采用去离子水和无水乙醇进行洗涤。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述致孔剂为氯化钠，所述氯化钠的粒径较佳地为400-500nm，所述氯化钠的用量较佳地为相对于介孔硅酸钙镁和小麦蛋白总质量的5-7倍；

和/或，步骤(1)中，所述介孔硅酸钙镁和小麦蛋白的质量比为(10-50):(50-90)，较佳地为(20-40):(60-80)；

和/或，步骤(2)中，所述压制成型的压力为1-3MPa；所述压制成型的保压时间为2-5min；

和/或，步骤(2)中，所述京尼平溶液的浓度为10-14mmol/L，较佳地为10mmol/L；

和/或，步骤(2)中，所述交联反应的温度为30-45℃；所述交联反应的时间为18-30h；

和/或，步骤(3)中，所述溶剂为水；

和/或，步骤(3)中，所述浸泡的时间为24-48h；

和/或，步骤(3)中，浸泡期间，每隔8-16h更换一次溶剂；

和/或，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度在-60℃至-40℃范围内；所述冷冻干燥的时间为12-48h。

6.一种如权利要求1-5任一项所述制备方法制得的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架。

7.一种载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：将如权利要求6所述的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架浸没在姜黄素溶液中，吸附姜黄素，即得。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述姜黄素溶液的浓度为600-1000μg/mL；

和/或，所述吸附的温度为30-45℃；

和/或，所述吸附的时间为12-36h；

和/或，所述吸附在恒温震荡箱中进行。

9.一种如权利要求7或8所述制备方法制得的载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架。

10.一种如权利要求6所述介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架或者如权利要求9所述载姜黄素的介孔硅酸钙镁-京尼平交联小麦蛋白支架在制备骨缺损修复材料中的应用。