CN107427535A - 经修饰的血凝块 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于制备经修饰的血凝块的方法，包括除去血凝块的细胞内容物。本发明进一步提供了经修饰的血凝块作为治疗剂的用途，以及用作细胞、生物分子和其它试剂的递送载体的用途。

Description

经修饰的血凝块

技术领域

本发明涉及组织愈合与止血领域。更具体地，本发明描述了经修饰的血凝块，及它们作为治疗剂和作为细胞和生物分子的递送载体的用途。

背景技术

下面列出了被认为与目前披露的主题相关的作为背景的文献：

1.Gale AJ.Current Understanding of Hemostasis.Toxicologicpathology.2011；39(1)：273-280；

2.Mosesson MW.Fibrinogen and fibrin structure and functions.J ThrombHaemost.2005 Aug；3(8)：1894-904；

3.Dickneite G，Metzner H，Pfeifer T，Kroez M，Witzke G.A comparison offibrin sealants in relation to their in vitro and in vivo properties.ThrombRes.2003；112(1-2)：73-82；

4.WO1993005822；

5.US7125569；

6.WO2015128858；

7.Blair P，Flaumenhaft R.Platelet α-granules：Basic biology andclinical correlates.Blood reviews.2009；23(4)：177-189；

8.Dohan Ehrenfest DM，Rasmusson L，Albrektsson T.Classification ofplatelet concentrates：from pure platelet-rich plasma(P-PRP)to leucocyte-andplatelet-rich fibrin (L-PRF).Trends Biotechnol.2009 Mar；27(3)：158-67；

9.WO2010100570；

10.Li PS et al A novel albumin-based tissue scaffold for autogenictissue engineering applications Sci.Rep.2014 Jul 18；4：5600。

这里对上述文献的认知并不意味着这些文献与目前所披露的主题的可专利性有任何关系。

止血是一种在阻止伤口部位出血的同时，维持血液循环中其他位置的正常血流的生理过程。血液流失通过止血栓的形成而被阻止(综述于Gale AJ中)。

止血过程包括血小板聚集、血小板血栓形成和通过蛋白水解的凝血级联产生的不溶性纤维蛋白沉积。该不溶性纤维蛋白形成被并入血小板血栓中和围绕血小板血栓的网状物。该网状物用来加固和稳定血凝块。

已生产了多种类型的血凝块替代产品，例如纤维蛋白密封剂，也称为“纤维蛋白胶”(参见例如Dickneite G et al)。

纤维蛋白密封剂由涉及纤维蛋白原、凝血酶和因子XIII的酶促反应形成。凝血酶通过酶促反应，以由凝血酶浓度确定的速率将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。因子XIII是凝血系统的酶，它使纤维蛋白凝块交联并稳定。纤维蛋白制剂可进一步包括抗蛋白水解剂(如WO1993005822中所述)。可除去纤溶酶原以阻止或延缓纤维蛋白溶解(参见例如US7125569)。

纤维蛋白原部分的制备过程可引起一些血浆蛋白从纤维蛋白原组合物中部分或完全去除。WO2015128858公开了用血浆补充浓缩的纤维蛋白原制剂，以使纤维蛋白原制剂更稳定。

另一种类型的血液制品是血小板浓缩物(综述于Dohan Ehrenfest DM et al中)。典型地，这类制剂是在未活化状态下注入修复部位的存活血小板的浓缩物。有时向浓缩物溶液中加入活化剂，如氯化钙或葡萄糖酸钙。或者，将该浓缩物溶液加入支架中，如胶原支架，这可引起浓缩物溶液中血小板的一些活化。

发明内容

本文描述的方法和组合物部分涉及令人惊讶的发现，即血凝块(其通常作为生物废物被丢弃)可以经修饰，例如通过去除包括在凝块中的存活细胞来修饰，并施用于患者以便增强治疗过程，例如组织再生和止血。从组合物中去除凝块的细胞成分，如血小板(凝血细胞)、白细球(WBC，白血胞)和红细胞(RBC，红血球)，从而获得具有组织再生特性的可重复使用的凝块。

因此，本发明的第一方面提供了一种用于制备经修饰的血凝块的方法，包括：

(a)获得血凝块；以及

(b)去除所述血凝块的细胞内容物；

从而获得经修饰的血凝块。

在一个实施方式中，在出血部位处体内形成所述血凝块。

在一个实施方式中，出血发生在手术操作，创伤性损伤或分娩期间。

在一个实施方式中，所述血凝块由获自供体的血液样品或血液制品离体形成。

在一个实施方式中，血液样品或血液制品的供体有着身体状况或患有疾病。

在一个实施方式中，身体状况或疾病选自由缺血性、退行性、炎性、癌性、遗传性、创伤性、发育性或获得性的身体状况或疾病所组成的组。

在一个实施方式中，所述血凝块由脐带血、胎盘血、外周血或混合血(pooledblood)的样品离体形成。

在一个实施方式中，将离体形成的所述血液样品在不存在抗凝剂的情况下进行孵育。

在一个实施方式中，在形成凝块之前，将离体形成的所述血液样品在存在至少一种抗凝剂的情况下进行孵育。

在一个实施方式中，所述至少一种抗凝剂选自由肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、它们的盐或它们组合所组成的组。

在一个实施方式中，在与抗凝剂孵育后，将能够逆转抗凝剂的作用的至少一种试剂加入到血液样品中。

在一个实施方式中，所述至少一种试剂是钙或钙盐。

在一个实施方式中，所述血液样品在凝血活化剂的存在下进一步进行孵育。

在一个实施方式中，所述凝血活化剂是纤维蛋白原裂解剂。

在一个实施方式中，所述纤维蛋白原裂解剂是凝血酶。

在一个实施方式中，上述除去细胞内容物的步骤通过将所述血凝块与至少一种试剂孵育来进行，其中至少一种试剂选自由增溶剂、洗涤剂、螯合剂、酶、抗体、高渗溶液、低渗溶液、脱水剂及它们的任意组合所组成的组。

在一个实施方式中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前用预修饰剂进行预修饰的步骤，其中，所述预修饰剂选自由生物分子、药物、抗原、微生物和细胞所组成的组。

在一个实施方式中，所述生物分子是胶原或透明质酸。

在一个实施方式中，所述药物是抗生素药物或抗炎性药物。

在一个实施方式中，所述抗原是微生物抗原或癌细胞抗原。

在一个实施方式中，所述细胞是癌细胞或血细胞。

在一个实施方式中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后的加工步骤(c)，其中，所述加工步骤选自由脱水、冻干、低温保存、部分或完全消化、纯化、溶解、分级、裂解及它们的任意组合所组成的组。

在另一个实施方式中，所述方法在步骤(b)之后进一步包括：将细胞或细胞聚集体接种到经修饰的血凝块上的步骤(c)，以及可选地包括从经修饰的血凝块中去除细胞或细胞聚集体的进一步步骤(d)，从而改变经修饰的血凝块的至少一种生物性质和/或机械性质。

另一方面，本发明提供了在不溶的生物相容性支架内包埋至少一种试剂的方法，所述方法包括：

(a)获得血凝块；以及

(b)去除所述血凝块的细胞内容物；

从而获得经修饰的血凝块，其中，所述经修饰的血凝块的特征在于：不溶性、生物相容性且包括包埋在其中的至少一种试剂。

在一个实施方式中，所述至少一种试剂选自由可溶性血浆分子、活化的血小板衍生分子和活化的WBC衍生分子所组成的组。

在一个实施方式中，所述至少一种试剂是白蛋白。

另一方面，本发明提供一种根据本文公开的方法制备的经修饰的血凝块。

在另一方面，本发明提供了一种经修饰的血凝块，其中，所述经修饰的血凝块是经离体修饰的，且特征在于以下一项或多项：

(a)是用抗纤维蛋白溶解因子稳定的，

(b)不含或基本上不含细胞内容物，

(c)并入了具有抗微生物活性的生物分子，

(d)并入了活化的血小板和活化的WBC衍生生物分子，

(e)并入了血小板和WBC活化因子，以及

(f)并入了可溶性血清生物分子，如白蛋白。

在一个方面，本发明的经修饰的血凝块用细胞或细胞聚集体离体接种。

在一个实施方式中，所述细胞或细胞聚集体选自由分化的细胞、前体细胞、多能细胞或干细胞所组成的组。

在另一个实施方式中，所述细胞或细胞聚集体是原代细胞、来自已建立的细胞系的细胞、遗传修饰的细胞或产生激素的细胞。

在一个实施方式中，可选地在使用经修饰的血凝块之前，将所述接种的细胞或细胞聚集体从经修饰的血凝块中去除。

在一个实施方式中，所述经修饰的血凝块是疾病特异性经修饰的血凝块或病期特异性经修饰的血凝块。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的经修饰的血凝块和药学上可接受的载体或赋形剂。

另一方面，本发明提供一种治疗疾病或身体状况的方法，所述方法包括将本发明的经修饰的血凝块或本发明的药物组合物给药予有需要的受试者的步骤，其中，所述疾病或身体状况选自由缺血性、退行性、炎性、癌性、遗传性、创伤性、发育性或获得性的身体状况或疾病所组成的组。

在一个实施方式中，所述受试者是哺乳动物。

在一个实施方式中，所述受试者是人。

另一方面，本发明提供了本发明的经修饰的血凝块，用于止血、伤口愈合、软组织重建和/或修复、移植物附着、软组织填充、组织再生，以及用于在手术部位处或在受污染的医疗环境中控制感染。

在另一个实施方式中，本发明提供本发明的经修饰的血凝块，用作组织再生的支架。

在另一个实施方式中，本发明提供本发明的经修饰的血凝块，用于将细胞递送至有需要的受试者体内。

在另一个实施方式中，本发明提供本发明的经修饰的血凝块，用于为细胞生长、分化和/或将细胞递送至有需要的受试者体内提供支持性的微环境。

在另一个实施方式中，本发明提供本发明的经修饰的血凝块，用于将药物递送至有需要的受试者体内。

另一方面，本发明提供了本发明的经修饰的血凝块在制备用于止血、伤口愈合、软组织重建和/或修复、移植物附着、软组织填充、组织再生，以及用于在手术部位处或在受污染的医疗环境中控制感染的药物组合物中的用途。

另一方面，本发明提供一种改变细胞、多细胞聚集体或组织的方法，该方法包括将所述细胞、多细胞聚集体或组织暴露于本发明的经修饰的血凝块的步骤。

另一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括：

(a)容器，所述容器容纳本发明的经修饰的血凝块或本发明的药物组合物；和

(b)使用所述试剂盒的说明书。

在一个实施方式中，所述试剂盒进一步包括容纳至少一种凝血活化剂的容器。

附图说明

为了更好地理解本文所公开的主题并且举例说明如何可以在实践中实施，现在将参照附图，仅以非限制性实例的方式来描述实施方式，在附图中：

图1是使用不同化合物：十二烷基硫酸钠(图1A)和RBC裂解缓冲液(图1B)处理的自发形成的血凝块的宏观视图。

图2是自发形成的血凝块的宏观视图，显示出其与水结合的能力。

图3A～3G是显示出MBC的各种3D形状的宏观视图。

图4是在×200(图4A)和×400(图4B)放大倍率下，未经修饰的血凝块的经苏木精～伊红(H&E)染色的组织切片的显微照片。

图5A和5B是×400放大倍率下，MBC的经H&E染色的组织切片的显微照片。

图6A、6B和6C是×200放大倍率下，MBC的倒置显微镜图像。

图7A和7B分别是在×40和×200放大倍率下，用胎盘衍生细胞完全覆盖的培养物中MBC的倒置显微镜图像。图7C和7D是在×200放大倍率下，用胎盘细胞接种的MBC的经H&E染色的组织切片。

具体实施方式

为了促进对本发明的原理的理解，现在将参考优选实施方式并使用特定语言对优选实施方式进行描述。然而，应当理解这并不意图限制本发明的范围。而是如本发明所属领域的技术人员所预期的，对本发明的这种变化和进一步的修改以及如本文所阐述的本发明的原理的这种进一步应用旨于成为本发明的一部分。

例如，作为一个实施方式的一部分阐述或描述的特征可以用于其他实施方式以产生更进一步的实施方式。此外，某些特征可与执行相同或相似功能的类似设备的特征或未提及的特征互换。因此，本发明总体上包括这些修改和变化。

本文公开了经修饰的血凝块(MBC)组合物，制造方法以及使用方法。

制备本发明中公开的经修饰的血凝块的方法基于正常的凝血过程，而不仅仅模仿该过程的最后阶段(如在纤维蛋白密封剂的情况中)。因此，不希望受理论束缚，这种高度规范的过程产生多功能支架，该多功能支架具有与体内凝块中存在的结构和生物活性高度相似的结构和生物活性。

在一些方面，如下文将进一步阐述的，MBC是没有细胞的，因此能够无需作重大修改地用于同种异体治疗。

此外，它能够在适用于非细胞组合物的条件下储存，如能够冻干储存和在室温下储存，来获得长的保质期。

MBC并入其他可溶性的各种血清生物分子，如血清白蛋白，使MBC获取这种白蛋白的生物活性。

此外，MBC富含具有充分抗微生物活性的生物分子，如WBC活化因子、WCB衍生的抗微生物的生物分子、免疫球蛋白和补体亚基。因此，组合物可以用于受污染的医疗环境中，并用于控制手术部位的感染。

本发明的MBC的制备相对简单，从而减少了与制造相关的时间和成本。类似地，MBC易于使用并且方便由实践者(最终使用者)制备，即MBC作为最终产品不含多种成分，因此实践者不需要进行组合步骤。

MBC的物理性质，如它的3D形状、粘弹性、孔隙率、强度、稳定性和抗纤维蛋白溶解性可受到严格控制。

MBC的特征使其成为用于递送各种治疗剂(如细胞或药物)的安全且有效的自体工具或同种异体工具。

因此，本发明的第一方面提供了一种用于制备经修饰的血凝块(MBC)的方法，该方法包括：

(a)获得血凝块；以及

(b)去除所述血凝块的细胞内容物；

从而获得经修饰的血凝块。

血凝块在止血过程中自然地形成。止血是一种在阻止伤口部位出血的同时，维持血液循环中其他位置的正常血流的生理过程。血液流失通过止血栓的形成而被阻止(综述于Gale AJ中)。止血有两个主要的构成要素。初步止血是指血小板聚集和血小板血栓形成。血小板在多方面过程中被激活，作为结果它们粘附于受伤部位并彼此粘附来堵塞受伤处。受伤部位处的血小板聚集由血小板受体(如糖蛋白受体)、血小板衍生的激动剂(如ADP、TXA2和血清素)、血小板衍生的粘附蛋白(如vWF、玻连蛋白、P-选择素和CD40)和血浆衍生的粘附蛋白(如vWF、纤维蛋白原和纤连蛋白)介导。继发止血是指由蛋白水解的凝血级联产生的不溶性纤维蛋白沉积。该不溶性纤维蛋白形成被并入血小板血栓中和围绕血小板血栓的网状物。该网状物用来加固和稳定血凝块。这两个过程同时发生，并受到严格的调控且机械地交织在一起。

根据本发明，可以使用任何类型的血凝块来制备经修饰的血凝块。例如，血凝块可以是自发形成的凝块，即在自发凝血过程中形成的凝块，或是由凝血因子或凝血活化剂(也称为血小板活化剂)，例如但不限于凝血酶，诱导形成的凝块。

根据本发明，可以在体内或离体形成血凝块。

为了离体形成血凝块，获取血液或血液成分。如本文所使用的，术语“血液或血液成分”在本文中也称为“血液”或“血液制品”或“血液样品”，是指为血液或衍生自血液的任何制品或物质。例如，血液制品包括但不限于全血(未经分级的血液)，或血液级分如血小板混合物、血浆、富含血小板的血浆(如血小板富集血浆)、血清、血清白蛋白制剂、血液成分和含源自血液的蛋白质的治疗性蛋白质组合物，及其人造制剂如重组血浆。

“血浆(Plasma)”和“血浆(blood plasma)”可以互换使用，并且是指血液的血浆级分，该血液的血浆级分尤其含盐、酶、免疫球蛋白(抗体)、凝血因子和蛋白质(包括白蛋白、因子VIII和纤维蛋白原)。“血浆源”可以是来自分级的血浆、混合血浆、低温血浆、回收的血浆，以及通过血浆除去法收集的人体血液的流体部分。在一个实施方式中，血浆是去凝血酶和/或去因子的血浆。

术语“血小板混合物”是指一种类型的血液制品，其中，细胞成分主要是或仅仅是血小板。血小板浓缩物是一种类型的血小板混合物，其中，血小板与小于正常的部分的血浆相关联。

术语“血小板富集血浆”(PRP)通常涉及由浓缩在有限体积的血浆中的血小板组成的离体制剂。在一个实施方式中，血浆是不含凝血酶和/或去因子的血浆。“去因子的血浆”在本文中涉及失去一种或多种凝血因子，如因子II、因子X或因子V，的血浆。

“去因子II的血浆”或“缺乏因子II的血浆”或“缺乏凝血酶原的血浆”由去凝血因子II或去凝血酶原的混合的正常人血浆制成。凝血酶原的剩余活性可以是，如小于或等于10％，或小于或等于1％。

术语“不含凝血酶的血浆”涉及凝血酶活性例如等于或小于2IU/ml或根据凝血时间测定或显色测定无法检测到的血浆。

可以通过本领域已知的任何方式离体制备血凝块，如抗凝血血液的再钙化、非抗凝血血液的自发凝血，或由外源性凝血因子诱导或引发的凝血。

血液或血液组分可以从患者的外周血系统或从胎盘或从脐带获得。

血凝块的来源可以是自体的、同种异体的或异种的。

术语“自体的”是指衍生自同一个体或涉及一个个体作为供体和受体。

术语“同种异体的”是指衍生自同一物种的不同个体。

术语“异种的”意指衍生自不同的物种。

凝血可以在实践者选定的对这个方法来说是最佳的时间点开始。可以将抗凝血剂(也称为抗凝剂)加入到血液样品或血液制品中从而延缓凝块形成，直到加入凝血活化剂以形成凝块。

适用于本发明的抗凝剂的代表性示例包括肝素，柠檬酸盐，草酸盐，乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐(如二钾盐)，柠檬酸盐、茶碱、腺苷和双嘧达莫(称为CTAD)的组合，聚茴香磺酸钠，和酸性枸橼酸葡萄糖及它们的混合物。广泛地说，抗凝剂以有效抑制血液凝固的量存在。相对于血液或血液制品样品的体积，该量通常在约1mM至约200mM的浓度范围内，而在一些其它实施方式中为约10mM至约50mM。

在本发明的另一个实施方式中，当血液或血液制品与凝血活化剂接触时，凝血开始。在另一个实施方式中，所述凝血活化剂是纤维蛋白原裂解剂。在本发明的另一个实施方式中，通过将血液暴露于诸如玻璃珠的物体来开始凝血。

如本文所使用的，术语“血小板活化剂(platelet activating agent)”或“血小板活化物(platelet activator)”是指如下的试剂，该试剂刺激血小板释放存储在其颗粒中的因子，如参与凝血级联的因子，并分泌参与伤口愈合和炎症的细胞因子。血小板活化剂包括但不限于胶原、凝血酶、ADP、带负电的表面(如玻璃)、血清素、乙酰胆碱及它们的组合。

纤维蛋白原分子由连接在一起的两组α、β和γ链构成。纤维蛋白原通过凝血酶转化为不溶性纤维蛋白。通过凝血酶介导，分别从α和β链释放称为Fp(A)和Fp(B)的纤维蛋白肽，开始纤维蛋白的组装。这暴露了聚合位点，导致纤维蛋白分子对准和形成双链原纤维，其中双链原纤维经进一步缔合以产生多链纤维。

纤维蛋白原/纤维蛋白具有由多种分子和细胞相互作用介导的多种生物学功能，包括结合生长因子，结合白细胞，通过结合纤连蛋白与细胞外基质相互作用，介导血小板和内皮细胞的附着和扩散，成纤维细胞增殖，和促进毛细血管形成和血管生成。

本文所使用的“纤维蛋白原裂解剂”是指能够从纤维蛋白原切割纤维蛋白肽A或纤维蛋白肽B或上述两者的酶。通常使用的纤维蛋白原裂解剂是获自诸如人或牛的任何合适来源的凝血酶；来自蛇毒液的酶，如巴曲酶、凝血酶(calobin)、纤维酶；和来自巴西矛头蝮(Bothrops jararacussu)毒液的酶。

“凝血酶”或“凝血酶多肽”是由另一种丝氨酸蛋白酶(因子Xa)切割凝血酶原(因子II)，一种酶原前体，而产生的哺乳动物丝氨酸蛋白酶。凝血酶是血液凝血级联的一部分，并将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链，并催化其他与凝血有关的反应。在人类中，凝血酶原由F2基因编码，所得多肽在凝血级联中被蛋白水解切割以形成凝血酶。

可以取回自发形成的凝块并用于制备本发明的MBC。这种通常被认为是生物废弃物并被丢弃的自发形成的血凝块可以例如在手术操作、创伤或分娩期间被取回。

在另一个实施方式中，血液可以从血液回收系统或细胞救助机(如haemoneticsCell Saver)获得。

在一个实施方式中，从单个供体获得血液。在另一个实施方式中，从多个供体获得多个血液样品并混合。

在一个实施方式中，血液一旦获得，可以立即用于形成MBC。在另一个实施方式中，血液被储存或储备入库以备将来使用。

血液或血液制品的来源(如供体)可以是动物如哺乳动物，或人类。供体可以是活供体或已死亡的供体(即尸体供体)。

在一个实施方式中，血液供体是健康个体。在另一个实施方式中，血液或血液制品的供体可能有着身体状况或患有疾病。

血凝块的主要细胞成分是血小板。血小板存储和分泌在愈合过程中发挥关键作用的各种生长因子和细胞因子，包括例如：血小板衍生的生长因子、血小板活化因子、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。这些分泌的因子还包括可以将其他愈合因子引向受伤部位的趋化因子(综述于BlairP和Flaumenhaft R中)。

根据本发明的这一方面，上述方法包括去除血凝块的细胞内容物的步骤。如本文所使用的，术语“去除(......)细胞内容物”是指用于实现基本上不含存活细胞组分的血凝块的各种方式。“基本上不含”及其语法等同语是指展示出全部或近似全部程度或限度的感兴趣特征或性质的定性条件。具体地说，在本发明的上下文中，“基本上不含”是指在使用下面将要阐述的方法去除细胞时，在血液凝块中没有细胞残留或残留的细胞数量可忽略不计。

术语“经修饰的血凝块(MBC)”和“MBC组合物”在本文中可互换使用。如本文所使用的，术语“经修饰的血凝块”是指经过处理以去除血小板和其它细胞内容物的血凝块。经修饰的血凝块是脱细胞的三维支架，其并入在修饰前填充血凝块的源自血浆的各种生物分子、活化的血小板和活化的WBC。

如本文所使用，术语“活化的”是指细胞或血小板已经获得了活化的细胞或血小板的一种或多种功能或表型特征。

血凝块修饰，即去除细胞内容物的步骤可以通过本领域已知的任何机械、物理、化学或生物学的手段，物质或化合物进行。通常，该方法采用各种机械、物理、化学或生物学手段来分裂、降解、中和和/或破坏血小板和细胞内容物和/或促进血小板和细胞内容物的去除。该方法是本领域所披露的。本发明不限于这些技术，且还包括这些技术的变型，以及其他目前可用或将来研发出的技术。

在某些实施方式中，血凝块与修饰剂或物质一起孵育。

在一个实施方式中，修饰剂增强了细胞裂解和细胞组分的破坏，即破坏和/或降解了诸如细胞膜、蛋白质、核酸等细胞成分。

修饰可以使用单一修饰剂或两种或更多种修饰剂来实现。

在某些实施方式中，修饰剂是增溶剂、洗涤剂、螯合剂、乳化剂、酶、抗体、高渗溶液、低渗溶液、脱水剂及它们的任意组合。

合适的洗涤剂的非限制性实例包括离子洗涤剂如SDS(十二烷基硫酸钠)，和非离子洗涤剂如Triton X(叔辛基苯基聚氧乙烯)，或它们的组合。

在一个实施方式中，修饰剂溶液包括在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的Triton X、CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)-二甲基-铵基]-1-丙烷磺酸盐)或SDS中的一种或多种。其它合适的洗涤剂包括聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯(80)脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温20和吐温80)、脱氧胆酸钠和辛基葡糖苷。

在某些实施方式中，修饰剂是高渗溶液(如3M NaCl)或低渗溶液(如水或RBC裂解缓冲液)。水性低渗溶液或低离子强度溶液通过渗透作用促进细胞裂解。这样的溶液可以包括去离子水或水性低渗缓冲液(例如，pH为约5.5至8，优选约7至7.5)。在某些实施方式中，用交替的高渗溶液和低渗溶液修饰血凝块。

由于细胞裂解时释放的蛋白酶，血凝块的修饰可能导致细胞外基质的残留损伤。因此，在本发明的某些实施方式中，溶液中包括各种添加剂，例如，金属离子螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)和/或蛋白酶抑制剂。合适的蛋白酶抑制剂例如包括苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、亮抑酶肽和N-乙基马来酰亚胺(NEM)中的一种或多种。

修饰溶液可以进一步包括降解细胞组分的各种酶。这样的酶包括核酸酶(例如，DNA酶诸如DNA酶I，RNA酶诸如RNA酶A)、磷脂酶(例如，磷脂酶A或C)和蛋白酶(例如，中性蛋白酶II、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶)。

蛋白酶的活性是时间、温度和浓度的函数，并且可以适当地调整这些变量以实现可接受的修饰，而不会引起不可接受的细胞外基质和并入的生物分子的破坏。核酸酶通常以0.1μg/ml至50μg/ml的浓度使用。优选地，DNA酶I以约10μg/ml的浓度使用，而RNA酶A以约1.0μg/ml的浓度使用。核酸酶优选在约20℃至38℃，优选37℃的温度下于生理缓冲溶液中使用。

修饰溶液通常包括缓冲液。合适的缓冲液包括有机缓冲液，如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES)等。还可以使用包括磷酸钠、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐或谷氨酸盐的缓冲剂。通常，使用约5.5至8.0、约6.0至7.8或约7.0至7.5的pH。

上面提供的修饰技术的实例并不是限制性的，本发明基本上涵盖了任何的细胞去除技术的应用。

血凝块与修饰化合物或修饰物质的孵育周期可以是变化的，且取决于所使用的化合物的类型、反应的温度(例如，室温(如约20℃)、37℃或4℃))及血凝块的大小。在某些实施方式中，与修饰化合物或修饰物质的孵育进行约10秒至约1分钟，约1分钟至约30分钟，例如1分钟或5分钟或10分钟或15分钟或20分钟或30分钟，或40分钟或50分钟，或1小时至24小时，或一天，或两天，或三天，或四天，或五天，或六天，或七天，或八天或九天或十天或更多天。

由于在去除细胞内容物时所释放的蛋白酶，血液凝块修饰可能会损伤剩余的细胞外基质。因此，在本发明的某些实施方式中，使用各种添加剂，例如，金属离子螯合剂如EDTA和/或蛋白酶抑制剂。

可以进一步处理本发明的MBC组合物。例如，可以进行分级、裂解、纯化、经历完全或部分酶消化、溶解、脱水、冻干，低温保存或它们的任意组合。

血凝块修饰过程的条件通过控制系统可以是受到监测的，自动的和受控的，从而获得最佳结果。控制系统可以手动或自动地操作和控制。控制系统监测诸如压力、流速、温度、pH水平、氧气水平、电解质水平、持续时间等参数。

修饰对血凝块的结构、内容物、机械和生物学性质的影响可以通过本领域已知的任何方法进行评估。这些方法的示例包括光学和电子显微镜检查、组织学、分子生物学测定、质谱法、流变学试验和拉伸试验等。

MBC组合物可以在制备后立即施用于受试者，或存储或储备入库以备将来使用。

经修饰的血凝块(MBC)和包括MBC的组合物并入衍生自数量均衡的活化的血小板和活化的WBC(即通常在血凝块中发现的数量，其中，血小板和WBC与血浆的正常部分相关联)的因子。这些因子被有效地包埋在组合物内并且可以有效地递送至受试者。

已知活化的血小板释放含有参与凝血、愈合和再生过程的各种因子的颗粒。本发明的方法利用这些因子的协调释放，并且能使它们有效地包埋在MBC中并有效地传递至受试者体内。

WBC参与许多愈合过程，并参与宿主对外来抗原和微生物的防御反应。WBC的常见类型包括淋巴细胞(如T细胞、B细胞和天然杀伤细胞)、粒细胞(如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和单核细胞(其分化成巨噬细胞)。WBC参与愈合过程和防御机制主要与它们生产生物分子如免疫球蛋白、细胞因子和生长因子有关。

如在WO2010100570中所公开的，WBC可以例如通过在允许它们活化的温度下孵育一段时间来活化。

用于本发明组合物的血液或血液制品可以含有WBC或可与WBC混合。包括在血液制品中的WBC或加入到血液制品中的WBC可能是被活化的。因此，由WBC或活化的WBC产生的生物分子可以有效地被包埋在组合物中，并且可以有效地被递送给患者。

因此，本发明另一方面提供了一种经修饰的血凝块，其中，所述经修饰的血凝块是离体修饰的，其特征在于以下一项或多项：

(a)是用抗纤维蛋白溶解因子稳定的，

(b)不含或基本上不含细胞内容物，

(c)并入了具有抗微生物活性的生物分子，

(d)并入了活化的血小板和活化的WBC衍生生物分子，

(e)并入了血小板和WBC活化因子，以及

(f)并入了可溶性血清生物分子，如白蛋白。

如本文所使用的，术语“抗微生物活性”堤指修饰靶微生物的功能或代谢过程的能力，例如，至少部分影响复制、营养生长、毒素产生、存活、静态下的存活力或其他属性。在一个实施方式中，该术语涉及微生物生长的抑制。在一个具体实施方式中，抗微生物活性涉及杀死至少一种细菌物种的能力。在另一个实施方式中，该术语可以表现为对微生物生长的杀微生物或抑微生物(microbistatic)抑制。

本文中术语“微生物(microorganism)”或“微生物(microbe)”广泛地涉及细菌、真菌、病毒和原生生物。特别地，该术语适用于具有脂双层膜的细胞或结构组分的微生物。在具体实施方式中，膜是细胞质膜。通常包括本领域已知的致病的细菌、真菌、病毒和原生动物。

可以例如使用细菌杀伤测定法测量MBC的抗微生物活性。简言之，将临床相关细菌置于含有4ml大豆肉汤的无菌管中，并在37℃下生长过夜。在实验的第2天，将细菌样品系列稀释并用MBC组合物处理。将经处理的培养物在37℃下孵育过夜。在第3天，将细菌培养物置于琼脂平板上并在37℃下孵育24小时。于次日计数形成的菌落数，并由此测定MBC的抗微生物效果。

具有抗微生物活性的生物分子的实例包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶，其介导细菌破碎和裂解；嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，其是展现出革兰氏阴性和革兰氏阳性抗菌活性的细胞毒素和蠕虫毒素(helminthotoxin)；中性粒细胞防御素1，其具有抗细菌、杀真菌和抗病毒的活性；杀菌通透性增加蛋白，其是对革兰氏阴性细菌有有效的杀伤活性的内源性抗生素蛋白；以及天青杀素(Azurocidin)，其是嗜中性粒细胞颗粒来源的抗菌剂并且是单核细胞和成纤维细胞特异性趋化性糖蛋白。

如本文所使用的，术语“生物分子”是指参与生物活性或有效调节生物活性如消除、减少或增强各种生物反应的活生物体一部分的任何分子或其类似物。因此，生物分子包括例如氨基酸或氨基酸的聚合体，如肽和蛋白质(包括抗体和酶)；脂质，如脂肪酸、糖脂、甾醇、甘油脂和磷脂；核苷和核苷酸；核酸或核酸的聚合体，如RNA或DNA分子；碳水化合物，如单糖、二糖和多糖；维生素；激素；神经递质；代谢物；抗体；酶；以及合成产生的上述生物分子的类似物。

稳定MBC的生物分子的实例包括因子XIII，其是交联纤维蛋白从而稳定纤维蛋白凝块的凝血因子；以及α-2-抗纤溶酶，其是使胃蛋白酶失活并有助于抵抗纤维蛋白溶解的蛋白酶抑制剂。

如本文所使用的，当涉及经修饰的血凝块的细胞内容物时，术语“基本上不含”意味着在使用上述手段去除细胞后，血凝块中没有细胞或细胞数量可忽略不计。

在一个实施方式中，MBC包括来自表1所列蛋白质的至少一种蛋白质。在其它实施方式中，MBC包括表1所列蛋白质的至少85％，或90％，或95％，或98％，或99％或全部。在一个实施方式中，MBC由表1所列蛋白质的至少85％，或90％，或95％，或98％，或99％或全部组成。

在一个实施方式中，MBC包括来自表2所列通路的至少一种通路。在其它实施方式中，MBC包括表2所列通路的至少85％，或90％，或95％，或98％，或99％或全部。在一个实施方式中，MBC由表2所列通路的至少85％，或90％，或95％，或98％，或99％或全部组成。在优选的实施方式中，MBC包括以下蛋白质中的至少一种：PRG2蛋白聚糖2；含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1；转化生长因子-β诱导蛋白ig-h3(TGFBI)；α-2-抗纤溶酶；血小板反应蛋白1(TSP-1)；血小板相关因子，如α粒子内容物中存在的化合物：vWF、CLCX7(血小板碱性蛋白、趋化因子)；纤连蛋白；纤维蛋白原；血小板反应蛋白；转化生长因子β-1(TGF-β1)；CD36；与囊泡运输和成熟相关的蛋白质，如网格蛋白、AFR3、NSFL1辅因子p47、AP-1复合亚单位β-1、AP-2复合亚单位α-1、Ras相关蛋白Rab-5B或踝蛋白(Talin)。

蛋白质PRG2蛋白聚糖2是嗜酸性粒细胞颗粒的晶核的主要成分。胎盘和妊娠血清中也存在高水平的该蛋白质形式，在其中该蛋白质以与几种其他若干蛋白质的复合体形式存在，其他若干蛋白质包括妊娠相关血浆蛋白A(PAPPA)、血管紧张素原(AGT)和C3dg。该蛋白质可作为细胞毒素和蠕虫毒素(helminthotoxin)参与抗寄生虫的防御机制，并参与免疫超敏反应。该编码的蛋白质含有显示出对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的有效抗微生物活性的肽。它直接涉及过敏性疾病中的上皮细胞损伤、剥落和支气管痉挛。对于该基因已经发现了编码不同亚型的经选择性拼接的转录物变体。

含蛋白质EGF的腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1结合EGFR，EGF的受体，诱导EGFR自身磷酸化并活化下游信号转导通路。它可在细胞粘附和细胞迁移中起作用。

转化生长因子-β诱导的蛋白ig-h3(TGFBI)：该蛋白由TGF-β诱导，与I、II和IV型胶原结合。该粘附蛋白可在细胞-胶原相互作用中起重要作用。

α-2-抗纤溶酶：该蛋白质是使胃蛋白酶失活并有助于抵抗纤维蛋白溶解的蛋白酶抑制剂。

血小板反应蛋白1是介导细胞与细胞间及细胞与基质间相互作用的粘附性糖蛋白。该蛋白质能够结合纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、V型胶原和整合素，并已被用作血小板活化的标志。

CD36是血小板表面糖蛋白。它是结合胶原和血小板反应蛋白的细胞粘附分子。潜在的TGF-β复合体通过其配体，血小板反应蛋白-1(TSP-1)与CD36结合。

踝蛋白是体内血小板整合素活化的主要调节因子。

MBC可以基本上不含纤溶酶和/或纤溶酶原。去除用于形成MBC的血液中纤溶酶和纤溶酶原可以通过本领域中描述的任何方法来进行。

可以控制MBC组合物的3D(三维)形状。在形成不溶性纤维蛋白之前，血液或血液制品通常是液体或柔性的。通过使用框架或模具，血液或血液制品可以成形为任何想要的3D形式或外观。一旦组装完成，血凝块获得修饰的形状。然后，对血凝块进行修饰以形成具有任何想要的3D形状的本发明的组合物。具有各种3D形状的血凝块的非限制性实例如图3所示。

可以修饰MBC组合物的机械性质。例如，在血凝块修饰之前，血凝块可以受到诸如张力的机械刺激，并获得修饰的机械性质。然后，对血凝块进行处理以形成本发明的组合物。

在一个实施方式中，MBC组合物是柔性的，即MBC可以在正常使用期间承受施加的应力而不破裂。由于MBC组合物的柔性，它符合于其被施加至的大多数连续轮廓。

根据本发明，可以对血液或血液制品进行预先修饰，即在凝血前可暴露于一种或多种预修饰剂。

预修饰包括例如并入额外的生物分子或消除现有的生物分子。在一个实施方式中，预修饰可能意味着血小板或WBC的活化。

预修饰剂可以包括生物分子、药物、微颗粒、纳米颗粒、成像剂、抗原、微生物和细胞。

“微颗粒”和“纳米颗粒”分别是指微观尺寸或纳米尺寸的聚合物微粒，任选地含有溶解、分散、包埋、包封或附着于其中的药物或试剂。

术语“颗粒”是指小的物体、材料的碎片或块，包括但不限于聚合物颗粒；可生物降解的颗粒；不可生物降解的颗粒；单乳液颗粒；双乳液颗粒；团聚体；脂质体；微粒；纳米颗粒；宏观颗粒；小球；晶体；聚集体；复合体；粉碎、磨碎或以其他方式破坏的基质；交联蛋白质或多糖颗粒。颗粒可由单一物质或多种物质构成。

生物分子的非限制性实例包括胶原和透明质酸。

药物的非限制性实例包括抗生素药物和抗炎药。

如本文所使用的，术语“抗原”堤指可被抗体分子特异性结合的任何物质。因此，术语抗原包括生物分子及大分子，其中，生物分子包括但不限于简单的中间代谢物、糖、脂质和激素，大分子例如是复合碳氢化合物、磷脂、核酸和蛋白质。

抗原的非限制性实例包括微生物抗原和癌细胞抗原。

细胞的非限制性实例包括癌细胞或血细胞。

预修饰细胞可以是活化的或非活化的细胞，贴壁或非贴壁细胞。

本发明的MBC可以用作本领域已知的用于组织工程应用的支架的新型形式。组合物可以通过本领域已知的任何手段用作制造支架的原料。在一个实施方式中，MBC组合物是用于细胞移植和细胞递送的支架。在另一个实施方式中，MBC组合物是用于药物递送的支架。

MBC组合物可以与药物、生物制品(如生物分子、细胞和组织)和医疗装置相组合。

该组合物可以用作血浆分子的贮液器，其中，血浆分子可以根据需要从组合物中收获或分离。

如上所述，可以从有身体状况或患有疾病的患者来制备MBC。

身体状况或疾病选自以下项中的一种或多种：缺血性、退行性、炎性、癌性、遗传性、创伤性、发育性或获得性的身体状况或疾病。

根据本发明，从患者获得血液的时机依据身体状况或疾病的特定阶段或程度来安排。

血液可一次获得或多次获得。

因此，根据本发明，可以获得疾病特异性或病期特异性的血液样品。此外，从这些血液样品获得的MBC分别呈现出疾病特异性或病期特异性，并且可以用于治疗这种特定疾病或特定病期。

在一个实施方式中，使MBC适合疾病或身体状况的急性期。在另一个实施方式中，使MBC适合疾病或身体状况的非急性期，如亚急性或慢性期。

在一个实施方式中，疾病特异性或病期特异性的血液一旦获得，可以立即用于形成MBC。在另一个实施方式中，疾病特异性或病期特异性血液被储存或储备入库以备将来使用。

细胞、多细胞聚集体或组织可以通过暴露于本发明的疾病特异性或病期特异性MBC而受到影响或改变。因此，本发明的另一方面涉及通过暴露于MBC来改变细胞、多细胞聚集体或组织的方法。

在一个非限制性实例中，细胞是干细胞。

由于干细胞的自我更新和分化能力，以及恢复组织稳态和使病变组织或损伤组织再生的能力，干细胞治疗已经成为各医学领域中有前景的治疗方式。

然而，由于以下若干原因，它们的临床使用是有限的：如宿主靶部位处的低移入率和低存活率，宿主免疫系统的免疫排斥，以及可能由离体扩增期间的次优培养条件引起的功能降低或治疗活性不显著。

为了增加其治疗效果，细胞可以在使用前进行预处理。体外暴露于细胞在受损组织中经历的应激，如氧化应激、缺氧培养条件和热激处理，可以增强干细胞在体内的存活。此外，细胞可暴露于可影响其分化状态和提高其存活率的分子，如生长因子。

此外，据推测，干细胞在移植后会遇到活化它们以产生特定治疗效果的特定刺激环境。

根据本发明，可以通过暴露于MBC来改变诸如干细胞的细胞，从而增加它们的治疗效果，并更精确地调节其治疗患者的身体状况或疾病的能力。如本文所使用的，术语“改变”(或“变化”)包括以下项中的一个或多个：生物学性质的改变，功能的改变，物理性质的改变，机械性质的改变，化学性质的改变，刺激作用，抑制作用，结构的改变，内容物的变化，增强的生物相容性，增强的植入，增强的存活，增强的归巢，增强的治疗效果，不良反应或副作用的改变，分化，细胞表型的改变，免疫学性质的改变，或免疫相容性的改变。

为了有利于通过MBC来使细胞发生变化，细胞必须通过本领域已知的任意方式与MBC接触。在优选的实施方式中，通过将细胞接种在MBC上使所述细胞与MBC接触。在另一个实施方式中，细胞与补充了有效量MBC的培养基一起孵育。

在一个实施方式中，细胞与MBC接触足以实现所需改变的一段时间。

在另一个实施方式中，细胞与MBC短期接触，例如12至48小时。在另一个实施方式中，孵育时间较长，例如2至28天。

在另一个实施方式中，受MBC影响的组合物是源自干细胞的提取物。这样的组合物例如公开于WO/2009/098698中。

在另一个实施方式中，通过将用于生产诸如WO/2009/098698中所公开的支架和提取组合物的细胞或组织与本发明的MBC相接触，可以改变这些支架和提取组合物。

在一个实施方式中，本发明的MBC组合物可以在给药受试者之前重新接种细胞和/或血小板。

接种的细胞可以与MBC相互作用并进一步改变MBC的生物学性质和机械性质，例如，在MBC上形成ECM，并且分泌各种可溶性因子，从而为MBC补充额外的试剂。换句话说，接种的细胞与MBC的相互作用引起MBC的重构。

如本文所使用的，术语“重构”是指用接种的细胞修饰MBC。这种修饰发生在结构和功能水平，并且是接种的细胞与MBC之间相互作用的结果。重构包括例如结构的全局再成形和新合成基质成分的整合。重构可以改善MBC的物理和生物学特征，以及通过接种组织特异性细胞或通过接种患者自体的细胞，来改善MBC的匹配度以治疗特定靶组织或特定患者。

重构也可以通过连续接种若干类型的细胞，或者通过同时接种若干类型的细胞的混合群体，然后通过任何合适的技术消除细胞来实现。

在将MBC给药到受体之前，可以进一步除去接种的细胞。重构可以由细胞接种和消除的一个或多个循环组成，其中一种或多种细胞类型被同时或依次接种到MBC上。

根据本发明，相对于组合物所给药的宿主，接种的细胞可以是自体的、同种异体的或异种的。

细胞可以获自任何类型的动物。在一个实施方式中，细胞分离自哺乳动物，如猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、猪、山羊和绵羊。

在优选的实施方式中，细胞是人类细胞。

细胞可以是任何细胞类型，包括例如分化的细胞、前体细胞或干细胞。细胞可以是凝血细胞。细胞可以是多能细胞。

细胞可以是原代细胞、来自已建立的细胞系的细胞或经遗传修饰的细胞。

在优选的实施方式中，将约5000个细胞至5亿个细胞悬浮在培养基中并施加到每平方厘米的MBC表面上。优选地，将5万至5000万个细胞，更优选地，将5万到500万个细胞悬浮在培养基中并施加到每平方厘米的MBC表面上。将MBC在标准培养条件(例如37℃，5％CO₂)下孵育一段时间，直到细胞附着。可以理解，接种到MBC上的细胞密度是可以变化的。取决于细胞，也可以使用其他接种技术。例如，细胞可以通过真空过滤施加至MBC。根据本文的教导，细胞类型的选择和将细胞接种到MBC上对于本领域普通技术人员来说是常规的。

在一个实施方式中，MBC接种有一种细胞群体。在另一个实施方式中，MBC在其两侧上接种有两种不同的细胞群体。这可以通过首先在MBC的一侧接种，然后在另一侧上接种来进行。例如，MBC可以一侧向上放置并接种。然后，MBC可以被重新放置以使第二侧向上。第二侧随后可以用第二细胞群体来接种。或者，MBC的两侧可以同时接种。例如，两个细胞腔室可以位于MBC的两侧(即夹心)。两个腔室可以填充不同的细胞群体以同时接种MBC的两侧。夹在中间的MBC可以经常旋转或翻转，以使两种细胞群体能有平等的附着机会。

在另一个实施方式中，两个独立的MBC用不同的细胞群体来接种。接种后，两个MBC可以附着在一起以形成两侧上具有两种不同细胞群体的单一单元。可以使用诸如纤维蛋白胶、液体共聚物、缝合等的标准程序来进行MBC的彼此附着。

为了有利于在本发明MBC上的细胞生长，MBC可以涂覆有一种或多种细胞粘附增强剂。这些细胞粘附增强剂包括但不限于胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白。

此外，细胞可以在促进细胞增殖和生长的试剂存在下培养到MBC上。这样的试剂包括一些生长因子，这些生长因子能够根据所存在的细胞类型进行选择(非限制性实例包括：角质形成细胞生长因子(KGF)；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；转化生长因子(TGF)α、β等等；胰岛素；生长激素；集落刺激因子；红细胞生成素；表皮生长因子(EGF)；和肝红细胞生成因子(肝细胞生成素))。血清，如胎牛血清(FBS)等，也可以提供一部分这些生长因子。此外，诸如抗坏血酸的试剂可用于增加细胞外基质的产生。

在一个实施方式中，在进一步使用之前，细胞基本上从本发明的接种的MBC中消除，以提供富含由接种的细胞群体提供的细胞外基质组分和分泌的因子并且经它们调节的无细胞MBC。无细胞的MBC可具有降低的免疫原性水平，并且可为宿主细胞再增殖或二次细胞接种提供适当的基质。

细胞去除或消除可以通过本领域已知的任何合适技术来实现，例如上述用于去除血凝块的细胞内容物的技术。可以从接种的MBC中消除细胞，例如通过空气干燥或冻干来杀死细胞。还可以使用热休克、辐射、声学处理、pH改变、机械破坏、添加毒素、洗涤剂(SDS或Triton x100)、酶(RNA酶、DNA酶、蛋白酶、脂肪酶)或溶剂(乙醇、丙酮或氯仿)。此外，具有非生理离子强度的低渗溶液或高渗溶液的处理也能促进细胞消除过程。参见例如WO9603093和WO9632905。

基本上任何细胞都可以用于本文所述的方法和组合物中。

细胞包括心脏祖细胞，心肌细胞；心脏成纤维细胞；内皮细胞；骨骼肌细胞；平滑肌细胞；内皮祖细胞；骨骼肌祖细胞；神经祖细胞；神经细胞；真皮成纤维细胞；外胚层细胞；骨细胞；软骨细胞；肌腱细胞；韧带细胞；肝细胞；胰岛细胞；肠细胞；源自由骨髓或脂肪所组成的组中选择的组织的祖细胞；干细胞；诱导性多能干细胞(iPS细胞)；激素产生细胞和遗传转化细胞。

如本文所使用的，“岛细胞”是指源自哺乳动物胰腺的内分泌细胞。岛细胞包括分泌胰高血糖素的α细胞，分泌胰岛素和胰淀素的β细胞，分泌生长抑素的δ细胞，分泌胰腺多肽的PP细胞，或分泌胃饥饿素的ε细胞。该术语包括这些细胞的同源和异源群体。在优选的实施方式中，岛细胞群体含有至少β细胞。

如本文所使用的，术语“干细胞”堤指能够自我更新的细胞，即能够增殖以产生更多的干细胞，并且可能产生谱系指定的细胞，能够分化为谱系特异性的细胞类型。干细胞可以是全能干细胞、多能(pluripotent)干细胞、多潜能(multipotent)干细胞、寡能干细胞或单能干细胞。如本文所使用的，术语“多能细胞”是指能够分化成所有三个胚层细胞的细胞。多能细胞的实例包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞(iPS)。干细胞可以是表达多谱系分化潜能的一种或多种标志物的细胞，或表达多能干细胞的一种或多种标志物的细胞。

当细胞保持在体外条件下时，可以使用本领域技术人员已知的常规的组织培养条件和方法。各种细胞的分离和培养方法在本领域技术人员的知识范围之内。

考虑将异源和同源细胞群体与本文所述的方法和组合物一起使用。此外，考虑将细胞的聚集体、附着于颗粒或包封在颗粒内的细胞、可注射递送载体(如水凝胶)内的细胞和附着于可移植基底(包括支架)的细胞，与本文所述的方法和组合物一起使用。

用于向受试者给药细胞的各种手段是本领域技术人员已知的。这样的方法可以包括全身注射，例如静脉内(i.v.)注射或将细胞植入受试者的靶部位。其他方法可以包括气管内递送、鞘内递送、骨内递送、肺部递送、口腔递送和口服递送。细胞可以插入递送装置中，其中递送装置有利于通过注射或植入来引入受试者体内。这样的递送装置可以包括用于将细胞和流体注射到受体体内的管道，如导管。在一个优选的实施方式中，管道额外具有针(如注射器)，通过针可以在期望的位置将细胞引入至受试者体内。在一些实施方式中，低温保存的细胞在给药予受试者之前被解冻。

术语“水凝胶”堤指通常共价(如聚合水凝胶)或非共价(例如，自组装水凝胶)连接在一起的3-D分子网络，其中，水是主要成分(通常大于80％)。

在一些实施方式中，细胞包含在器官、组织或细胞聚集体(如胰岛、卵泡)或它们的组织工程化类似物中。

MBC还可以作为细胞递送的支架，为细胞提供微环境。

如本文所使用的，“支架”是指提供适合于细胞粘附和增殖的表面的结构。支架可进一步提供机械稳定性和支撑性。支架可以是特定的形状或形式，以便影响或界定由增殖细胞群体所呈现的三维形状或形式。

将激素分泌细胞或蛋白质分泌细胞移植到有需要的受试者体内是治疗许多疾病、失调和身体状况的有前景的策略。

本领域需要一种生物相容性材料，该生物相容性材料在提供细胞活力、生长和功能性所必需的一些重要的细胞-ECM信号的同时，可以与用于递送到受试者体内的细胞组合。本质上，需要一种可以为细胞提供微环境的生物相容性材料。术语“微环境”堤指包括与细胞接触并可能受细胞影响的分子，如细胞活力、生长和功能性所必需的细胞-ECM信号，的环境。它还指细胞周围的化学参数和物理参数，例如pH、离子强度、3D结构和孔隙率。

在优选的实施方式中，将细胞或细胞聚集体与本发明的MBC组合或混合以产生MBC-细胞组合物。

MBC-细胞组合物可通过本领域已知的任何方法来形成。优选的方法是包封。

用于包封细胞的方法和组合物是本领域已知的。参见例如WO2014153126。

如本发明所使用的，术语“包封”是指将细胞包埋在生物相容性材料的范围内。

MBC可用作微胶囊。如本文所使用的，术语“微胶囊”堤指具有约150μm至约1000μm平均直径的MBC或MBC碎片。MBC微胶囊可具有适于细胞包封的任何形状。MBC微胶囊可含有分散在其中的一种或多种细胞，从而“包封”细胞。

在优选的实施方式中，MBC胶囊或MBC微胶囊由含有悬浮细胞的MBC溶液使用包封机(如Inotech包封机)来制造。

在优选的实施方式中，含有细胞的MBC用例如HEPES溶液、克氏(Krebs)液和/或RPMI-1640培养基清洗。

细胞可以从供体、来自供体细胞的细胞培养物或已建立的细胞培养系中直接获得。在优选的实施方式中，细胞从供体中直接获得，经清洗后直接植入(接种)至MBC上。使用组织培养领域的技术人员已知的技术培养细胞。在优选的实施方式中，细胞是自体的，例如，源自细胞要被移植在其中的个体，但可能是同种异体的或异种的。

可以使用扫描电子显微镜、组织学和使用放射性同位素的定量评估，来评估细胞的附着和存活力。所植入细胞的功能性和活力可以使用上述技术和功能性测定的组合来确定。

出于创建新组织或组织等同物的目的，本发明的MBC可以在它们的三维支架内，用于递送单一细胞类型、多细胞聚集体(如胰岛和卵泡或它们的组织工程化类似物)、多细胞类型，其中包括经遗传改变的细胞，用于有效转移大量细胞并促进移植移入。还可以用于通过排除宿主免疫系统，为细胞移植物提供免疫保护，同时使新的组织或组织等效物生长。

如本文所述可以植入的细胞的实例包括干细胞，血小板，软骨细胞和形成软骨的其它细胞，成骨和形成骨骼的其它细胞，肌肉细胞，成纤维细胞，角质细胞，卵母细胞，生殖细胞，卵巢细胞，和器官的细胞。如本文所使用的，“器官的细胞”包括肝细胞，岛细胞，肠源性细胞，源自肾的细胞，和其他主要用于合成和分泌的细胞，或者用于代谢原料或生物分子的细胞。优选的细胞类型是产生胰岛素的细胞。

MBC可以与体液因子组合，促进细胞移植和植入。例如，MBC可以与血管生成因子，抗生素，抗炎因子，生长因子，诱导分化的化合物，以及细胞培养领域的技术人员已知的其它因子组合。

例如，体液因子可以在移植前以缓释形式与细胞-MBC组合物混合。或者，MBC可以在与细胞组合前被修饰以结合体液因子或信号识别序列。

本文所描述的技术可以用于递送许多不同的细胞类型，以实现不同的组织结构。在优选的实施方式中，细胞与MBC混合并被直接注射到想要移植细胞的部位。然而，MBC也可被塑造并移植到身体的一个或多个不同区域中以适合特定应用。本申请与如下的情况特别相关，其中需要特定结构设计，或其中细胞要被植入的区域缺少特定结构或支撑来促进细胞生长和增殖。

基于个体需要来确定细胞待植入的一个部位、多个部位，同样确定细胞的必要数量。对于具有器官功能的细胞，例如，肝细胞或岛细胞而言，混合物可以被注射至肠系膜，皮下组织，腹膜后腔，腹膜前空间和肌内空间中。

MBC-细胞组合物可以移植到有需要的患者体内以治疗疾病或失调。在一些实施方式中，细胞获自同一物种的在遗传上不相同的成员。在可替代的实施方式中，细胞获自与患者不同的物种。在优选的实施方式中，激素分泌细胞或蛋白质分泌细胞与MBC组合并移植到患者体内以治疗疾病或失调。在优选的实施方式中，疾病或失调涉及患者体内的功能失常的激素分泌细胞或蛋白质分泌细胞，或由患者体内的功能失常的激素分泌细胞或蛋白质分泌细胞引起。

MBC-细胞组合物可以与任何其它组分一起被包括在溶液中，或者MBC-细胞组合物可以保存在单独的溶液中。这可以根据细胞来源及对存活细胞的最佳环境的选择来确定。如果培养细胞，则可提供悬浮在细胞生长培养基中的细胞，或者细胞可以悬浮在进一步包括一种或多种其它成分的其它合适的溶液中。

在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法可以用于将试剂递送至受试者。

本发明能够递送与MBC相关联的药物或其它诊断剂或成像剂。在一些实施方式中，MBC用作药物包封颗粒的递送载体。

药物可以是治疗剂、诊断剂和/或成像剂。

适合由本发明的MBC递送的试剂可以是任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属或它们的组合。如从上下文中明确的，在一些实施方式中，试剂可以是或包括细胞或生物体，或它们的级分、提取物或成分。在一些实施方式中，试剂是或包括天然产物，因为其在自然中发现和/或由自然中获得。在一些实施方式中，试剂是或包括一种或多种人造实体，因为它们是通过人手的操作被设计、工程化和/或产生的，和/或在自然界中未被发现。在一些实施方式中，试剂可以分离或纯的形式使用；在一些实施方式中，试剂可以粗制的形式使用。在一些实施方式中，潜在的试剂作为集合或文库提供，例如该集合或文库可以经筛选以在其中鉴定或表征出活性试剂。可根据本发明使用的试剂的一些具体实施方式包括小分子、抗体、抗体片段、适体、siRNA、shRNA、DNA/RNA杂交体、反义寡核苷酸、核酶、肽、肽模拟物、肽核酸、小分子等。在一些实施方式中，试剂是或包括聚合物。在一些实施方式中，试剂包含至少一种聚合物部分。

如本文所使用的，“成像剂”堤指有利于检测其连接的试剂的任何元素、分子、官能团、化合物、它们的片段或部分。

适合于由本发明的MBC递送的治疗剂可以是当被给药予受试者时，具有治疗效果和/或引起所需生物学和/或药理学作用的任何试剂。

本发明的一个实施方式涉及进一步包括白蛋白的MBC。

人血清白蛋白(HSA)是最丰富的血清蛋白，在许多生物和生理活动中起作用。由于它具有相对较高的分子量且其三级结构稳定，因此被保留在血浆中。HSA包含585个氨基酸残基(大部分是离子的)，使得该蛋白质高度可溶。

HSA还起到内源生物分子和外源生物分子，如肽、蛋白质、激素或药物的载体的作用。HAS改善与其连接的生物分子的一种或多种性质。该一种或多种性质可以选自由改善的药代动力学、增加的保质期、增加的溶解度、增加的靶亲和力和增加的生物活性所组成的组。

HAS聚合物用于组织工程和组织修复的应用(参见例如Li PS等人)。通常以干燥和冻干粉末的形式提供市售的来自动物的白蛋白。将这些粉末溶于合适的反应缓冲液中以制备白蛋白溶液。为了能够将HSA用于组织工程和组织修复的应用，液体白蛋白溶液必须通过本领域已知的各种制造方法首先转化成白蛋白聚合物，然后转化成固态支架。

在化学交联反应中，可溶性白蛋白可聚合并变得不溶。这种交联反应改变了白蛋白的分子结构，降低了其参与生物和生理活动的能力。此外，交联剂常常是有毒的。因此，利用HSA进行再生医学是一个繁琐的多阶段并有潜在毒性的过程。

相比之下，根据本发明的一个实施方式，将血清白蛋白并入MBC中，因此，MBC使HSA的有益性质与其各种其它性质组合在一起。

本发明的一个实施方式涉及进一步包括生长因子的组合物。生长因子可以与任何其它组分一起被包括在溶液中，或者可以单独的溶液来供应。该生长因子可能有助于为递送到伤口部位或已经存在于伤口部位的效应细胞创建最佳可能的条件。生长因子与纤维蛋白封闭剂的共同应用节省了伤口处理过程中的步骤。

在本发明的一个实施方式中，生长因子选自由上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α(TGFα)、转化生长因子β(TGFβ)和白介素-1所组成的组。

上文所公开的经修饰的血凝块(MBC)组合物可用于促进或增强治疗过程，包括但不限于止血和愈合、伤口愈合、移植物或医疗装置固定、吻合部位的密封、软组织重建/修复、软组织填充、真皮填充、皮肤固定、硬脑膜修复、烧伤治疗、出血控制、组织再生，及药物和细胞疗法。例如，MBC可以粘附于伤口和组织表面，并用于控制出血、促进愈合(如伤口愈合)并重建组织和器官。

如本文所使用的，术语“促进”或“增强”治疗过程是指对治疗过程的支持、放大、强化，其中治疗过程引起具体疾病、失调和/或病症的部分或完全缓减、改善、减轻、抑制、严重性的降低，和/或一种或多种症状、特征和/或病因的发生率方面的降低。

如本文所使用的，术语“组织”堤指人或动物中的任何类型的组织，包括但不限于血管组织、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、神经组织、泌尿生殖组织、胃肠组织、包括骨和软骨的骨骼组织、脂肪组织、包括肌腱和韧带的结缔组织、羊膜组织、绒毛组织、硬脑膜、心包、肌肉组织、腺组织、面部组织、眼组织、它们的组织工程化类似物。

如本文所使用的，术语“组织再生”堤指组织的结构或功能的全部或部分恢复，该组织表现出例如由疾病或受伤而引起的结构或功能的丢失或损害。组织再生的非限制性实例为恢复缺血的、低氧的或缺氧的组织的血液流动；恢复断骨的机械功能；恢复创伤性损伤后的脑或脊髓区域的神经功能；或恢复I型糖尿病胰腺组织的葡萄糖反应性胰岛素的产生。其他实例对于本领域技术人员来说是显而易见的，且所公开的内容不限于此。

如本文所使用的，术语“器官”堤指在生物体内执行特定功能或功能组的固体血管化器官。术语器官包括但不限于心脏、肺、肾、肝、胰腺、皮肤、子宫、骨、软骨、小肠或大肠、膀胱、脑、乳房、血管、食管、输卵管、胆囊、卵巢、胰腺、前列腺、胎盘、脊髓、包括上肢和下肢的肢体、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道、子宫。

如本文所使用的，术语“促进伤口愈合”堤指与未用MBC或包括MBC的药物组合物处理的对照伤口相比，施用MBC或包括MBC的药物组合物将90％伤口闭合所需的时间减少了至少1天。优选地，促进愈合的治疗使愈合所需的时间减少2天或更多天、3天或更多天、4天或更多天、5天或更多天、6天或更多天，甚至7天(一周)或更多天。

如本文所用，“表面”堤希望施用经修饰的血凝块的位置或部位。表面取决于经修饰的血凝块的使用。经修饰的血凝块可用于例如在血管手术中封闭手术伤口，包括提供止血、组织移植物固定、器官移植物固定、伤口愈合和吻合，如动脉、胃肠道和气管吻合。

表面可以是身体外表面，如可通过肉眼看到的皮肤，或者可以是作为受试者的内部解剖的一部分身体内部的表面。外表面包括但不限于面部、咽喉、头皮、胸部、背部、耳朵、颈部、手、肘部、髋部、膝部和其他皮肤部位的皮肤。身体内部的实例包括但不限于暴露于外部环境和内部器官的体腔或解剖学上的开口，如鼻孔；嘴唇；耳朵；包括子宫、阴道和卵巢的生殖器区；肺；肛门；脾；肝；血管和心肌。表面可以是受试者的出血部位或非出血部位。

如本文所使用的，“受试者”堤指给药MBC的患者。该术语包括动物，如哺乳动物，包括人类。在一个实施方式中，受试者是手术患者或受伤患者。

适用于本发明的MBC处理的伤口通常是活组织的烧伤、穿刺、切割或撕裂的形式。皮肤的伤口可以穿透表皮、真皮或在全层伤口的情况下穿透皮下组织。因此，适于用本发明的MBC组合物处理的代表性伤口类型包括烧伤(例如，由暴露于火或对皮肤高度腐蚀性的药剂而导致)、溃疡(例如，压力性溃疡、静脉溃疡和糖尿病溃疡)、肌腱炎；与冠状动脉手术相关的手术伤口；腹部和任何其他类型手术后的手术后伤口。其它伤口是由于在战斗或其它暴力活动中导致的创伤引起的伤口，包括由枪击、刀子或能够导致皮肤切口或撕裂的任何其它物体导致的伤口。本发明的MBC同样适合处理：口腔(如牙齿)的伤口，以及作为药物的副作用或作为各种病变(如与卡波西肉瘤相关的疮)出现的伤口，以及内部伤口(例如，肌肉组织破裂，如肛裂)，以及胃肠道的伤口或损伤，如胃或肠内的溃疡)。

本发明的MBC组合物还可用于处理由血管功能不足加重的任何伤口或损伤。出于本发明的目的，血管功能不足是指不充分的血液循环，导致受累区域的灌注不足。这种不足可以由创伤(例如，与骨折相邻的脉管系统的损伤)或各种病变(例如，糖尿病和动脉粥样硬化)而导致。在任一情况下，无论是创伤诱发的还是疾病诱发的，血管功能不足都降低了有效的伤口愈合的可能性。MBC组合物可用于改善这些患者中的伤口愈合结果。

在一个实施方式中，MBC组合物对于治疗糖尿病足溃疡，或由卧床患者身体表面上的长时间压力和受阻血流导致的皮肤和深部组织的慢性压力性溃疡是有用的。至少48％的IV期压力性溃疡在治疗一年后仍然未愈合。

在其它方面，本发明涉及一种抑制伤口感染发作的方法，包括向伤口给药本发明的MBC组合物。在一个实施方式中，所述伤口由创伤导致。在另一个实施方式中，所述伤口由手术导致。

在涉及治疗伤口的方法的那些方面，也可通过向伤口给药包括本发明的MBC组合物的制品来治疗伤口。

在一个实施方式中，MBC组合物的施用利用一次或多次将MBC组合物直接注入伤口或伤口周围的组织来实现。MBC组合物可直接施用于开放性伤口中。

MBC组合物可注射到各部位的伤口中。在一个实施方式中，对于伤口的整个长度，注射约每一厘米至约每三厘米发生一次。在其它实施方式中，所述MBC组合物给药至伤口内的单一部位处。伤口，尤其是压力性伤口的生物学空间通常受到限制。当注射到伤口中时，存在压力导致注射器与针头分离的风险。使用锁定注射器消除了这种风险。如果使用18G或更大的针头来抽吸，则更换22G～35G尺寸的针来注射到伤口中。

当无法注射到伤口组织中时，MBC组合物可以直接施加到伤口的腔体处。该方法中的施用可以用注射器或导管直接施用来进行。

MBC组合物可以借助于敷料施用于伤口部位或在伤口部位的周围。干燥敷料包括纱布和绷带；非粘合的网、膜和箔；泡沫；和组织粘合剂。保湿屏障敷料包括糊剂，霜剂和软膏；不渗透或半渗透的膜或箔；水胶体；水凝胶；和组合产品。生物活性敷料包括抗微生物敷料；交互式敷料；单组分生物敷料；和组合产品(例如，软膏、凝胶、纤维蛋白封闭剂，生长因子和血管生成因子(如PDGF、VEGF或胶原))。在一些实施方式中，用浸泡在MBC组合物中的无菌纱布填充伤口。敷料，如无菌纱布垫可以用其它组合物(如乳酸林格氏(Hartmann′s)溶液、含藻酸盐的敷料或聚氨酯敷料)饱和，用于覆盖伤口，然后施用干燥敷料。如果受试者伤口高度感染，则可以施用银敷料。注射后敷料的选择基于临床医师的决定。商业可用性，过去临床成功的历史和患者耐受性都是选择伤口敷料时要考虑的因素。敷料可周期性地(如通常在约24小时后)除去，以便用无菌水和肥皂冲洗伤口。

一旦临床医生确定是否需要额外施用，组合物可以在例如4周后一次或多于一次地施用于伤口。可能考虑的因素包括伤口尺寸(宽度、长度和深度)的增加，化脓，发热或表明顽固性伤口感染的任何其他迹象或症状，以致于重新治疗是必要的。除了重新治疗，可在临床医生认为合适的任何时候指示进行手术清创术的推荐。

组合物可以与任何其它常规的伤口治疗，例如，加温(治疗性加热)、电刺激、磁力、激光光疗和超声结合使用。也可以与生物治疗一起使用，例如，皮肤替代品，培养的角质形成细胞(Epicel，Genzyme biosurgery)，人真皮替物(Dermagraft，Smith and NephewInc.)，源于尸体经加工真皮(Alloderm，Life Cell Corporation)，双层皮肤等同物(Apligraf，Organogenesis Inc.)，TransCyte(Smith and Nephew Inc.)，生长因子(如PDGF)和纤维蛋白封闭剂。在一些实施方式中，MBC组合物与VAC结合使用，其中，VAC是由KCI制造的市售伤口疗法。VAC通过向伤口施加负压来促进伤口愈合。在这些实施方式中，组合物优选在VAC治疗之前施用于伤口。组合物可以在患者接受高压氧治疗之前施用于伤口。组合物也可以与每厘米伤口长度的低能量冲击波治疗(例如，约0.1mJ/ram2；5Hz的脉冲)结合使用。(参见例如，Dumfarth，et al，Ann.Thorac.Surg.55：1909-13(2008)。治疗后，可评估伤口的长度、宽度和高度测量值。通常，当这些参数的所有测量值都可忽略时，伤口被认为是愈合的。

本发明的MBC组合物可以在将随着待治疗的伤口或组织的类型和组合物的确切配方而变化的频率范围内给药，合适剂量的选择在医师的能力范围内。

在缝合或以其他方式封闭进入内部伤口表面的外部入口之前，MBC组合物可以例如在内伤口表面治疗时给药一次。对于其它伤口，例如用非手术方法可进入的外表面或内表面上的那些伤口，可能施用更为频繁，例如，最初施用，随后在数小时内(如4小时、8小时、12小时等)再施用；或更可能地，随后每天再施用一次或两次，例如直到伤口愈合。实际上，普通技术人员可以使用保持愈合率的任何范围的再次施用。

治疗效果可由普通技术人员判断。显然，如果涉及慢性伤口，则引起伤口闭合或愈合的任何愈合均涉及有效治疗。或者，如果伤口是非慢性伤口，如急性手术伤口，则基于从业者对相似伤口的频繁经验，使伤口闭合所需时间(即愈合率)的变化，对从业者来说是显而易见的。

本发明的又一方面提供了一种药物组合物，包括本发明的经修饰的血凝块和药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体的混合物。

如本文所使用的，术语“药物组合物”或“药物制剂”堤指旨在给药人或其它哺乳动物的任何组合物，且包括作为至少一种活性剂的本发明的经修饰的血凝块；还可以包括一种或多种其它添加剂，例如药学上可接受的赋形剂、载体、渗透促进剂、稳定剂、缓冲剂或其它物质。

术语“药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体”堤指与制剂中的成分相容，并与合理效益/风险比率相称适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它并发症的试剂、化合物、材料、组合物、稀释剂。适合与本文公开的经修饰的血凝块一起使用的药学上可接受的载体可以是但不限于液体、半固体和固体材料。

取决于例如预定的给药途径、递送形式和期望的剂量，本领域技术人员将确定最佳的药物组合物。

在一个实施方式中，药物组合物可以是由以下项所组成的组的形式：香膏、溶液、悬浮液、乳液、软膏、泡沫、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂、粉末、油膏、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、血清、滴剂、脂质体、纳米颗粒和喷雾剂。在其它实施方式中，组合物可以是霜剂、洗剂或溶液。在其它实施方式中，组合物可以是浸渍的或制成绷带的一部分。在其他实施方式中，绷带可以是手术敷料、石膏绷带、粘合绷带或纱布。

一旦配制了药物组合物，其可以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或以脱水粉末或冻干粉末的形式储存在无菌容器中。该制剂可冷冻储存。该制剂可以即用形式或在给药前复原的形式(如冻干的)储存。

为了协助接受者的摄取、分布和吸收，可以使用制药领域熟知的方法将本发明的组合物与其它分子，分子结构或化合物如脂质体，受体靶向分子，口服剂型、直肠剂型、外用剂型或其它剂型的混合物，混合、包封、缀合或以其他方式相关联。

在一个实施方式中，药物组合物可进一步包括选自由以下项所组成的组中的组分：单核细胞、干细胞、基因治疗产品、维生素、棕榈酸视黄醇、醋酸托可维(tocoferilacetate)、磷酸钠抗坏血酸、D-泛醇、肽、重组生长因子、微粉化人类同一性的激素、氨基酸、植物提取物、抗氧化剂、硫辛酸、DMAE、胶原、GAG、透明质酸、蛋白聚糖、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、微量元素、矿物质、蛋白酶、神经酰胺、多糖(polisaccarides)、藻类和海洋提取物。

本发明的组合物可进一步包括可生物降解的或不可生物降解的增强成分，也称为增强剂。增强剂可以在组合物制备的液体或柔性形式阶段(即在装配组合物的不溶性网之前)加入，或者在组合物配制之后施用到组合物上。

本发明的组合物可以以各种各样的方式给药予有需要的个体。优选的给药方式包括外用、口服、直肠、通过吸入或喷雾、静脉内、血管内、肌内、皮下、脑内、腹膜内、软组织注射、手术放置、内镜放置、局部给药和经皮插入，如直接注射、套管插入或导管插入。任何给药都可以是本发明的组合物的单一施用或多次施用。可给药至接受者的单一部位或多于一个的部位。多次给药可基本上同时发生或在时间上分开发生。

如本文所使用的，术语“给药(administering)”、“给药的(administered)”或“给药(administration)”包括将药物组合物或治疗剂递送至受试者系统中，或者受试者体内或受试者上的具体区域的任何方法。

本发明还提供了治疗受试者的损伤、创伤或失血的方法，包括将治疗有效量的本发明的MBC组合物施用于损伤、创伤或失血的部位。

“治疗有效量”堤指MBC或包括MBC的组合物的量促进所期望的治疗效果，如封闭、愈合和/或减少受试者的失血量，或治疗、预防、缓解或减少受试者身体状况的至少一种症状。

如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指物质的任何给药，这使特定疾病、失调和/或病症部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟发作，降低严重性，和/或降低一种或多种症状、特征和/或病因的发生率。该治疗可能是针对不表现出相关疾病、失调和/或病症迹象的受试者，和/或是对仅表现出疾病、失调和/或病症的早期迹象的受试者。或者或另外，该治疗可以是针对表现出相关疾病、失调和/或病症的一个或多个确定迹象的受试者。在一些实施方式中，该治疗可以是针对已被诊断患有相关疾病、失调和/或病症的受试者。在一些实施方式中，该治疗可以是针对已知具有与发展相关疾病、失调和/或病症的风险增加在统计学上相关的一个或多个易感因子的受试者。

MBC组合物可悬浮在培养基中，或包括在组织中或者天然或合成组织修复基质，例如但不限于生物可再吸收的胶原支架或基质中，或并入绷带中或伤口闭合装置中。

在另一个实施方式中，本发明提供了治疗缺血组织，如心肌组织、骨骼肌组织、骨组织、软骨组织、神经组织、肝组织、肾组织和皮肤组织的方法。

在一个实施方式中，将一种或多种试剂加入到本发明的经修饰的血凝块或药物组合物中。此类试剂的非限制性实例包括钙、抑肽酶、纤维蛋白原、胶原、凝血酶、透明质酸、因子XII、纤维连接蛋白、纤溶酶原、抗纤维蛋白溶解剂(如氨甲环酸(transexamic acid))、稳定剂(如精氨酸盐酸盐)、血小板活化物、WBC活化因子、维生素K依赖性凝血酶原。

在可替代的实施方式中，组合物基本上不含添加的蛋白酶抑制剂。

另一方面，提供了容纳有本发明组合物的容器。容器可以是例如安瓿、小瓶或注射器。容器可以由例如玻璃、金属或塑料制成。

在另一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括如上所述的容纳有本发明组合物的容器，上述容器例如是安瓿、小瓶、试管或注射器；任选地该试剂盒包括凝血酶组分和/或使用说明书。

源自血液组分的生物材料通常从感染性颗粒中纯化出来，以便将血源性病原体引起的潜在风险最小化。纯化过程可以通过纳滤、溶剂/洗涤剂(S/D)处理、热处理、γ或UVC(＜280nm)辐照或通过本领域已知的任何其它方法进行。

术语“感染性颗粒”堤指可以在生物体内感染或繁殖的微观颗粒，例如但不限于微生物或朊病毒。感染性颗粒可以是病毒颗粒。感染性颗粒的灭活过程可以通过在手术前和/或手术期间向溶液中加入灭活分子来进行。添加的分子及其产物可以通过重力、柱层析相分离或本领域已知的任何其它方法除去。感染性颗粒的除去可以通过过滤或通过选择性吸收方法如亲和力、离子交换或疏水层析进行。

多步病毒灭活过程可以例如通过组合以下项的两种或更多种来进行：溶剂/洗涤剂处理、巴氏杀菌、选择性色谱法和纳滤。

术语“病毒灭活“指病毒保持在溶液中但呈现无活性的情形(如通过溶解其脂质层)，和/或指将病毒从溶液中物理去除的情形(如通过尺寸排阻技术)。

MBC制剂如通过巴氏灭菌和/或过滤，优选地是无菌的且不含病原体。

如本文所使用的，除非上下文另有明确规定，不定冠词“一/一个/一种(a)”和“一/一个/一种(an)”是指“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。

如本文所使用的，术语“包括”、“(包)含”、“具有”及其语法变型将被视为指定所述特征、步骤或成分，但不排除添加一种或多种额外的特征、步骤、成分或它们的组。

当数值前面加上术语“约”时，术语“约”表示+/-10％。

实施例

虽然以下实施例说明了本发明的某些实施方式，但是它们不被解释为限制本发明的范围，而是有助于对本发明的完整描述。

MBC的制备

I.自发形成的血凝块按如下方式制备：将人脐带全血收集到无抗凝剂的玻璃管中，并在室温下凝结1小时。

II.再钙化的血凝块按如下方式制备：将人脐带全血样品收集到含3.2％柠檬酸钠的聚丙烯采血管(BD Vacutainer)中。将样品用10mM CaCl₂(终浓度)再钙化，并在室温下凝结1小时。

III.凝血酶诱导的血凝块按如下方式制备：将人脐带全血样品收集到含3.2％柠檬酸钠的聚丙烯采血管(BD Vacutainer)中。将样品用10mM CaCl₂(Sigma)(终浓度)再钙化，并与2NIH(国立卫生研究院)单位/ml牛凝血酶(Sigma)混合以诱导纤维蛋白形成。然后使样品在室温下凝结1小时。

通过上述任意方法形成的血凝块进一步修饰如下：

血凝块用PBS洗涤以除去进入的血液，然后在恒定搅拌、4℃下，暴露于修饰化合物，例如含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的0.1％十二烷基硫酸钠或RBC裂解缓冲液(1∶1000)，持续长达6天，直到血凝块变得发白和半透明(图1)。然后在恒定搅拌、4℃下，将样品用去离子水(DI)水洗涤，随后用PBS洗涤，并保持在4℃用于进一步分析。

自发形成的血凝块能够结合水。水在任何生物反应中起主要作用，是决定生物材料物理性质的积极参与者。因此，润湿性(吸水能力)是植入后影响生物材料的生物响应的最重要的参数之一。为了定性地显示结合水含量或保水能力，将由自发形成的血凝块产生的MBC浸入到DI水中10分钟。然后，使用滤纸轻轻除去进入的水并用镊子夹持着MBC，证明其保水能力(图2)。

血凝块可以形成在不同形状的容器中，从而产生适于治疗需要的各种三维形状。例如，凝块可以在注射器或皮氏培养皿或管中形成，从而呈现期望的形状。如上所述产生凝血酶诱导的MBC。简言之，将柠檬酸化的人脐带全血转移到三个容器中：15ml聚丙烯离心管、60mm皮氏培养皿和1ml注射器(图3A)。接下来，将每个容器中的血液用CaCl₂再钙化，与牛凝血酶混合，并在室温下凝结1小时。图3B～3C示出了修饰前产生的血凝块，其呈现出相应的容器形状。接下来，将产生的血凝块用PBS洗涤，并在恒定搅拌、4℃下暴露于含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的0.1％十二烷基硫酸钠溶液(1∶1000)。在2天、3天和5天后，产生的血凝块的渐进修饰分别如图3D、3E和3F所示。5天后，产生的MBC变得发白、半透明(图3F和3G)。

对组织切片进行苏木精和伊红(H&E)组织学染色，来分析经修饰的血凝块的微观结构。将新鲜的、未经修饰的血凝块或MBC在4％福尔马林中固定至少24小时，然后包埋在石蜡中，连续切片，安装在载玻片上并用苏木精和伊红(H&E)进行染色以用于光学显微镜观察。未修饰的正常血凝块的组织学表观如图4所示，示出了典型的RBC聚集体和偶然包埋在纤维蛋白网中的WBC。修饰的凝块的结构如图5所示，示出不存在细胞物质，展现出高度多孔的，保存良好的纤维蛋白基质结构。使用倒置显微镜进一步观察经修饰的血凝块的形态特征(图6)。将图6所示的血凝块与修饰剂一起孵育10分钟。

接下来，将经修饰的血凝块用源自胎盘的细胞接种。简言之，胎盘组织是在剖腹产后经健康女性知情同意后无菌获得的。分离胎盘细胞并接种在组织培养板上，并在补充有10％FBS和1％抗生素的DMEM存在下培养。接下来，使用胰蛋白酶将细胞从培养板上分离，接种在MBC上并继续培养10天。如图7A和7B中的倒置显微镜图像所示，接种的胎盘细胞易于填充MBC并将MBC完全覆盖。如图7C和7D所示的用胎盘细胞接种的MBC经H&E染色的组织切片证实了在MBC的表面上以及朝向MBC中心的较深层都具有高水平的细胞粘附、增殖。

质谱(MS)分析

如上所述产生的经修饰的血凝块用胰蛋白酶消化，并在Q-Exactive质谱仪(Thermo)上通过LC-MS/MS进行分析。使用QualBrowser(ThermoFisher Scientific)浏览MS文件。使用Byonic(Protein Metrics Inc)鉴定从MS/MS光谱获得的峰列表。

针对UniProtKB[PMID 14681372]的智人补体的连接靶/诱饵[PMID 20013364]版本(49888个序列)进行蛋白质鉴定。诱饵序列通过倒转Byonic中的靶序列产生。鉴定设置如下：胰蛋白酶具有最多2个未酶切位点；MS1为10.0ppm(百万分率)，MS2容差为20.0ppm；固定修饰：C的羧甲基化(+57.021464Da)。可变修饰：N和Q的脱氨基化(+0.984016Da)，M和P的氧化(+15.994915Da)，S、T和Y的磷酸化(+79.966331Da)，蛋白质N-末端的乙酰化(+42.010565Da)，以及S、T和N的Hex(+162.0528)和HexNAc(+203.0794)。最多允许3处修饰。

在使用诱饵命中分布估计的0.8％错误发现率(FDR)下，验证了肽谱匹配(PSM)、肽和蛋白质。手工检查结果，并用每个蛋白质最少2个肽和＞200个置信度过滤，得到324个高置信度的独特蛋白质。

结果：

在源自人脐带血的MBC中共鉴定出了324种蛋白(见表1：蛋白质列表)。

表1：蛋白质列表：

＞sp|P02671|FIBA_人纤维蛋白原α链 OS＝智人 GN＝FGA PE＝1 SV＝2

＞sp|P02675|FIBB_人纤维蛋白原β链 OS＝智人 GN＝FGB PE＝1 SV＝2

＞sp|P02679|FIBG_人纤维蛋白原γ链 OS＝智人 GN＝FGG PE＝1 SV＝3

＞sp|P02751|FINC_人纤维蛋白原 OS＝智人 GN＝FN1 PE＝1 SV＝4

＞sp|HBA_人|(常见污染物蛋白)

＞sp|P01857|IGHG1_人Igγ-1链C区域 OS＝智人 GN＝IGHG1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P69892|HBG2_人血红蛋白亚基γ-2 OS＝智人 GN＝HBG2 PE＝1SV＝2

＞sp|P11678|PERE_人嗜酸性粒细胞过氧化酶 OS＝智人 GN＝EPX PE＝1 SV＝2

＞tr|A0A087WWV8|A0A087WWV8_人蛋白质IGKV1-8 OS＝智人 GN＝IGKV1-8 PE＝4SV＝1

＞sp|P0C0L4|CO4A_人补体C4-A OS＝智人 GN＝C4A PE＝1 SV＝2

＞sp|P06702|S10A9_人蛋白质S100-A9 OS＝智人 GN＝S100A9 PE＝1 SV＝1

＞sp|P21980|TGM2_人蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶2 OS＝智人 GN＝TGM2PE＝1 SV＝2

＞sp|Q5SSJ5|HP1B3_人异染色质蛋白1-结合蛋白3 OS＝智人 GN＝HP1BP3 PE＝1SV＝1

＞sp|P05109|S10A8_人蛋白质S100-A8 OS＝智人 GN＝S100A8 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q6P995|F171B_人蛋白质FAM171B OS＝智人 GN＝FAM171B PE＝2 SV＝3

＞sp|P01023|A2MG_人α-2-巨球蛋白 OS＝智人 GN＝A2M PE＝1 SV＝3

＞sp|P35527|K1C9_人角蛋白(HUMAN Keratin)，I型细胞骨架9 OS＝智人 GN＝KRT9 PE＝1 SV＝3

＞sp|P27105|STOM_人红细胞带7内在膜蛋白 OS＝智人 GN＝STOM PE＝1 SV＝3

＞sp|P06396|GELS_人凝溶胶蛋白 OS＝智人 GN＝GSN PE＝1 SV＝1

＞sp|P08697|A2AP_人α-2-抗纤溶酶 OS＝智人 GN＝SERPINF2 PE＝1 SV＝3

＞sp|P02730|B3AT_人带3阴离子转运蛋白 OS＝智人 GN＝SLC4A1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P05164|PERM_人髓过氧化物酶 OS＝智人 GN＝MPO PE＝1 SV＝1

＞sp|P60709|ACTB_人肌动蛋白，细胞质1 OS＝智人 GN＝ACTB PE＝1 SV＝1

＞sp|Q13201|MMRN1_人多聚蛋白-1 OS＝智人 GN＝MMRN1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P01024|CO3_人补体 C3 OS＝智人 GN＝C3 PE＝1 SV＝2

＞sp|P00747|PLMN_人纤溶酶原 OS＝智人 GN＝PLG PE＝1 SV＝2

＞sp|P01860|IGHG3_人Igγ-3链C区域 OS＝智人 GN＝IGHG3 PE＝1 SV＝2

＞sp|P0CG05|LAC2_人Igλ-2链C区域 OS＝智人 GN＝IGLC2 PE＝1 SV＝1

＞sp|P30626|SORCN_人抗药蛋白OS＝智人 GN＝SRI PE＝1 SV＝1

＞sp|TRYP_PIG|(常见污染物蛋白)

＞sp|P02768|ALBU_人血清白蛋白 OS＝智人 GN＝ALB PE＝1 SV＝2

＞sp|P04275|VWF_人血管假性血友病因子OS＝智人 GN＝VWF PE＝1 SV＝4

＞sp|Q12986|NFX1_人转录抑制子NF-X1 OS＝智人 GN＝NFX1 PE＝1 SV＝2

＞sp|HBB人|(常见污染物蛋白)

＞sp|P11413|G6PD_人葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶 OS＝智人 GN＝G6PD PE＝1 SV＝4

＞sp|P35269|T2FA_人通用转录因子IIF亚基1 OS＝智人 GN＝GTF2F1 PE＝1 SV＝2

＞sp|O60814|H2B1K_人组蛋白H2B型 1-K OS＝智人 GN＝HIST1H2BK PE＝1 SV＝3

＞sp|P00488|F13A_人凝血因子XIIIA链 OS＝智人 GN＝F13A1 PE＝1 SV＝4

＞sp|P61978|HNRPK_人不均一核糖核蛋白K OS＝智人 GN＝HNRNPK PE＝1 SV＝1

＞sp|Q8WUM4|PDC6I_人程序性细胞死亡6-相互作用蛋白 OS＝智人 GN＝PDCD6IPPE＝1 SV＝1

＞sp|P60842|IF4A1_人真核起始因子4A-I OS＝智人 GN＝EIF4A1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P11166|GTR1_人溶质载体家族2，促进葡萄糖转运蛋白成员1 OS＝智人 GN＝SLC2A1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P30613|KPYR_人丙酮酸激酶PKLR OS＝智人 GN＝PKLR PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9Y490|TLN1_人踝蛋白-1 OS＝智人 GN＝TLN1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P20073|ANXA7_人 膜联蛋白A7 OS＝智人 GN＝ANXA7 PE＝1 SV＝3

＞sp|P01623|KV305_人Igκ链V-III区域 WOL OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q9Y6C2|EMIL1_人界面蛋白-1 OS＝智人 GN＝EMILIN1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9UNZ2|NSF1C_人NSFL1辅因子p47 OS＝智人 GN＝NSFL1C PE＝1 SV＝2

＞sp|P68104|EF1A1_人延长因子1-α1 OS＝智人 GN＝EEF1A1 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q13404|UB2V1_人泛素缀合酶E2变体1 OS＝智人 GN＝UBE2V1 PE＝1 SV＝2

＞tr|A0A0B4J2B5|A0A0B4J2B5_人蛋白质IGHV3OR16-9(片段) OS＝智人 GN＝IGHV3OR16-9 PE＝1 SV＝1

＞sp|P04083|ANXA1_人膜联蛋白A1 OS＝智人 GN＝ANXA1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P08311|CATG_人组织蛋白酶G OS＝智人 GN＝CTSG PE＝1 SV＝2

＞sp|P59665|DEF1_人中性粒细胞防御素1 OS＝智人 GN＝DEFA1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P13727PRG2_人骨髓蛋白聚糖 OS＝智人 GN＝PRG2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P35579|MYH9_人肌球蛋白-9 OS＝智人 GN＝MYH9 PE＝1 SV＝4

＞sp|P01009|A1AT_人α-1-抗胰蛋白酶 OS＝智人 GN＝SERPINA1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P12724|ECP_人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白 OS＝智人 GN＝RNASE3 PE＝1 SV＝2

＞sp|P06727|APOA4_人载脂蛋白A-IV OS＝智人 GN＝APOA4 PE＝1 SV＝3

＞sp|P50570|DYN2_人发动蛋白-2 OS＝智人 GN＝DNM2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P30043|BLVRB_人黄素还原酶(NADPH) OS＝智人 GN＝BLVRB PE＝1 SV＝3

＞sp|Q14624|ITIH4_人间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4 OS＝智人 GN＝ITIH4 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q15365|PCBP1_人聚(rC)-结合蛋白1 OS＝智人 GN＝PCBP1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P04264|K2C1_人角蛋白(HUMAN Keratin)，II型细胞骨架1 OS＝智人 GN＝KRT1 PE＝1 SV＝6

＞sp|Q9Y3I1|FBX7_人F-框特有蛋白7(HUMAN F-box only protein 7)OS＝智人GN＝FBXO7 PE＝1 SV＝1

＞sp|P37840|SYUA_人α-突触核蛋白 OS＝智人 GN＝SNCA PE＝1 SV＝1

＞sp|Q7Z4W1|DCXR_人L-木酮糖还原酶 OS＝智人 GN＝DCXR PE＝1 SV＝2

＞sp|Q14847|LASP1_人LIM和SH3结构域蛋白1 OS＝智人 GN＝LASP1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P31949|S10AB_人蛋白质S100-A11 OS＝智人 GN＝S100A11 PE＝1 SV＝2

＞sp|P02649|APOE_人载脂蛋白E OS＝智人 GN＝APOE PE＝1 SV＝1

＞sp|P62805|H4_人组蛋白H4 OS＝智人 GN＝HIST1H4A PE＝1 SV＝2

＞sp|Q16695|H31T_人组蛋白H3.1t OS＝智人 GN＝HIST3H3 PE＝1 SV＝3

＞sp|P14543|NID1_人巢蛋白-1 OS＝智人 GN＝NID1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P02788|TRFL_人乳运铁蛋白 OS＝智人 GN＝LTF PE＝1 SV＝6

＞sp|P10909|CLUS_人丛生蛋白 OS＝智人 GN＝CLU PE＝1 SV＝1

＞sp|P11940|PABP1_人聚腺苷酸-结合蛋白1 OS＝智人 GN＝PABPC1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P49368|TCPG_人T-复合蛋白1亚基γ OS＝智人 GN＝CCT3 PE＝1 SV＝4

＞sp|P08758|ANXA5_人膜联蛋白A5 OS＝智人 GN＝ANXA5 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q15691|MARE1_人微管相关蛋白RP/EB家族成员1 OS＝智人 GN＝MAPRE1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P68363|TBA1B_人微管蛋白α-1B链 OS＝智人 GN＝TUBA1B PE＝1 SV＝1

＞sp|P0C0S8|H2A1_人组蛋白H2A 1型OS＝智人 GN＝HIST1H2AG PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9UKV8|AGO2_人蛋白质阿尔戈-2(Protein argonaute-2)OS＝智人 GN＝AGO2 PE＝1 SV＝3

＞sp|P12429|ANXA3_人膜联蛋白A3 OS＝智人 GN＝ANXA3 PE＝1 SV＝3

＞sp|P07996|TSP1_人血小板反应蛋白-1 OS＝智人 GN＝THBS1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q562R1|ACTBL_人β-肌动蛋白-样蛋白2 OS＝智人 GN＝ACTBL2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P07437|TBB5_人微管蛋白β链 OS＝智人 GN＝TUBB PE＝1 SV＝2

＞sp|O00233|PSMD9_人26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基9 OS＝智人 GN＝PSMD9 PE＝1 SV＝3

＞sp|P05160|F13B_人凝血因子XIII B链OS＝智人 GN＝F13B PE＝1 SV＝3

＞sp|P62826|RAN_人GTP-结合核蛋白Ran OS＝智人 GN＝RAN PE＝1 SV＝3

＞tr|A0A087WZW8|A0A087WZW8_人蛋白质IGKV3-11 OS＝智人 GN＝IGKV3-11 PE＝4 SV＝1

＞sp|P02452|CO1A1_人胶原α-1(I)链 OS＝智人 GN＝COL1A1 PE＝1 SV＝5

＞sp|Q9GZP4|PITH1_人含PITH域蛋白1 OS＝智人 GN＝PITHD1 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q14766|LTBP1_人潜伏-转化生长因子β-结合蛋白1 OS＝智人 GN＝LTBP1PE＝1 SV＝4

＞sp|Q9UJU6|DBNL_人脑发育调节蛋白-样蛋白 OS＝智人 GN＝DBNL PE＝1 SV＝1

＞sp|P02747|C1QC_人补体C1q亚成分亚基C OS＝智人 GN＝C1QC PE＝1 SV＝3

＞sp|P26447|S10A4_人蛋白质S100-A4 OS＝智人 GN＝S100A4 PE＝1 SV＝1

＞sp|P08133|ANXA6_人膜联蛋白A6 OS＝智人 GN＝ANXA6 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q14254|FLOT2_人浮舰蛋白-2 OS＝智人 GN＝FLOT2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P03952|KLKB1_人血浆激肽释放酶 OS＝智人 GN＝KLKB1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P06753|TPM3_人原肌球蛋白α-3链 OS＝智人 GN＝TPM3 PE＝1 SV＝2

＞sp|P35580|MYH10_人肌凝蛋白-10 OS＝智人 GN＝MYH10 PE＝1 SV＝3

＞sp|P17987|TCPA_人T-复合蛋白1亚基α OS＝智人 GN＝TCP1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P04040|CATA_人过氧化氢酶OS＝智人 GN＝CAT PE＝1 SV＝3

＞sp|P32119|PRDX2_人过氧化物酶-2 OS＝智人 GN＝PRDX2 PE＝1 SV＝5

＞sp|P02746|C1QB_人补体C1q亚成分亚基B OS＝智人 GN＝C1QB PE＝1 SV＝3

＞tr|J3QRK5|J3QRK5_人蛋白质UBBP4 OS＝智人 GN＝UBBP4 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q15582|BGH3_人转化生长因子-β-诱导蛋白ig-h3 OS＝智人 GN＝TGFBI PE＝1 SV＝1

＞sp|P13645|K1C10_人角蛋白(HUMAN Keratin)，I型细胞骨架10 OS＝智人 GN＝KRT10 PE＝1 SV＝6

＞sp|P21333|FLNA_人细丝蛋白-A OS＝智人 GN＝FLNA PE＝1 SV＝4

＞sp|P37802|TAGL2_人转凝蛋白-2 OS＝智人 GN＝TAGLN2 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q5TDH0|DDI2_人蛋白质DDI1同源物2 OS＝智人 GN＝DDI2 PE＝1 SV＝1

＞sp|P04004|VTNC_人玻连蛋白OS＝智人 GN＝VTN PE＝1 SV＝1

＞sp|Q5XPI4|RN123_人E3泛素-蛋白连接酶RNF123 OS＝智人 GN＝RNF123 PE＝1SV＝1

＞sp|P02652|APOA2_人载脂蛋白A-II OS＝智人 GN＝APOA2 PE＝1 SV＝1

＞sp|P02549|SPTA1_人血影蛋白α链，红细胞1 OS＝智人 GN＝SPTA1 PE＝1 SV＝5

＞sp|P01871|IGHM_人Ig mu链C区域 OS＝智人 GN＝IGHM PE＝1 SV＝3

＞sp|Q9Y2V2|CHSP1_人钙调节热稳定蛋白1 OS＝智人 GN＝CARHSP1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q96CW1|AP2M1_人AP-2复合亚基mu OS＝智人 GN＝AP2M1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P50991|TCPD_人T-复合蛋白1亚基δ OS＝智人 GN＝CCT4 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q6B0K9|HBM_人血红蛋白亚基mu OS＝智人 GN＝HBM PE＝2 SV＝1

＞sp|P26599|PTBP1_人聚嘧啶通道-结合蛋白1 OS＝智人 GN＝PTBP1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P04406|G3P_人甘油醛-3-磷酸脱氢酶OS＝智人 GN＝GAPDH PE＝1 SV＝3

＞sp|P00568|KAD1_人腺苷酸激酶同工酶1 OS＝智人 GN＝AK1 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q9Y2Y8|PRG3_人蛋白多糖3 OS＝智人 GN＝PRG3 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q5T4S7|UBR4_人E3泛素-蛋白连接酶UBR4 OS＝智人 GN＝UBR4 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q00610|CLH1_人网格蛋白重链1 OS＝智人 GN＝CLTC PE＝1 SV＝5

＞sp|P30041|PRDX6_人过氧化物酶-6 OS＝智人 GN＝PRDX6 PE＝1 SV＝3

＞sp|P16671|CD36_人血小板糖蛋白4 OS＝智人 GN＝CD36 PE＝1 SV＝2

＞sp|P50995|ANX11_人膜联蛋白A11 OS＝智人 GN＝ANXA11 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q04637|IF4G1_人真核翻译起始因子4γ1 OS＝智人 GN＝EIF4G1 PE＝1 SV＝4

＞sp|O75131|CPNE3_人科皮纳-3(Copine-3) OS＝智人 GN＝CPNE3 PE＝1 SV＝1

＞sp|P16157|ANK1_人锚蛋白-1 OS＝智人 GN＝ANK1 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q01518|CAP1_人腺苷酸环化酶相关蛋白1 OS＝智人 GN＝CAP1 PE＝1 SV＝5

＞sp|P16401|H15_人组蛋白H1.5 OS＝智人 GN＝HIST1H1B PE＝1 SV＝3

＞sp|P01593|KV101_人Ig κ链V-I区域AG OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q99832|TCPH_人T-复合蛋白1亚基eta OS＝智人 GN＝CCT7 PE＝1 SV＝2

＞sp|P19823|ITIH2_人间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H2 OS＝智人 GN＝ITIH2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P53004|BIEA_人胆绿素还原酶A OS＝智人 GN＝BLVRA PE＝1 SV＝2

＞sp|P01617|KV204_人Igκ链V-II区域TEW OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|P00390|GSHR_人谷胱甘肽还原酶，线粒体 OS＝智人 GN＝GSR PE＝1 SV＝2

＞sp|P54727|RD23B_人UV切除修复蛋白RAD23同源物B OS＝智人 GN＝RAD23B PE＝1 SV＝1

＞sp|Q93008|USP9X_人可能的泛素羧基末端水解酶FAF-X OS＝智人 GN＝USP9XPE＝1 SV＝3

＞sp|Q02086|SP2_人转录因子Sp2 OS＝智人 GN＝SP2 PE＝1 SV＝3

＞sp|P31943|HNRH1_人不均一核糖核蛋白H OS＝智人 GN＝HNRNPH1 PE＝1 SV＝4

＞sp|P23588|IF4B_人真核翻译起始因子4B OS＝智人 GN＝EIF4B PE＝1 SV＝2

＞sp|P04196|HRG_人富含组氨酸的糖蛋白 OS＝智人 GN＝HRG PE＝1 SV＝1

＞sp|P98160|PGBM_人基膜-特异性硫酸乙酰肝素蛋白多糖

core protein OS＝智人 GN＝HSPG2 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q9NTK5|OLA1_人Obg-样ATP酶1 OS＝智人 GN＝OLA1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9BUF5|TBB6_人微管蛋白β-6链 OS＝智人 GN＝TUBB6 PE＝1 SV＝1

＞tr|A0A0B4J1T9|A0A0B4J1T9_人蛋白质IGKV3-15(片段) OS＝智人

GN＝IGKV3-15 PE＝4 SV＝1

＞sp|P25685|DNJB1_人DnaJ同源物亚家族B成员1 OS＝智人 GN＝DNAJB1 PE＝1SV＝4

＞sp|O43665|RGS10_人G-蛋白信号调节子10 OS＝智人 GN＝RGS10 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q06124|PTN11_人酪氨酸-蛋白磷酸酶非受体型11 OS＝智人 GN＝PTPN11PE＝1 SV＝2

＞sp|P00734|THRB_人凝血酶原 OS＝智人 GN＝F2 PE＝1 SV＝2

＞sp|O14964|HGS_人肝细胞生长因子-调节酪氨酸激酶底物 OS＝智人 GN＝HGSPE＝1 SV＝1

＞sp|Q16610|ECM1_人细胞外基质蛋白1 OS＝智人 GN＝ECM1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q08722|CD47_人白细胞表面抗原CD47 OS＝智人 GN＝CD47 PE＝1 SV＝1

＞sp|P15153|RAC2_人Ras相-关C3肉毒毒素底物2 OS＝智人 GN＝RAC2 PE＝1 SV＝1

＞sp|P10412|H14_人组蛋白H1.4 OS＝智人 GN＝HIST1H1E PE＝1 SV＝2

＞sp|P12111|CO6A3_人胶原α-3(VI)链 OS＝智人 GN＝COL6A3 PE＝1 SV＝5

＞tr|H3BM21|H3BM21_人整合素β(片段) OS＝智人 PE＝3 SV＝1

＞sp|B9A064|IGLL5_人免疫球蛋白λ-样多肽5 OS＝智人 GN＝IGLL5 PE＝2 SV＝2

＞sp|P08246|ELNE_人中性粒细胞弹性蛋白酶 OS＝智人 GN＝ELANE PE＝1 SV＝1

＞sp|P01859|IGHG2_人Igγ-2链C区域 OS＝智人 GN＝IGHG2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P61626|LYSC_人溶菌酶C OS＝智人 GN＝LYZ PE＝1 SV＝1

＞sp|Q9UQ80|PA2G4_人增殖-相关蛋白2G4 OS＝智人 GN＝PA2G4P E＝1 SV＝3

＞sp|P22626|ROA2_人不均一核糖核蛋白A2/B1 OS＝智人 GN＝HNRNPA2B1 PE＝1SV＝2

＞sp|P01621|KV303_人Igκ链V-III区域NG9(片段) OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|P11171|41_人蛋白质4.1 OS＝智人 GN＝EPB41 PE＝1 SV＝4

＞sp|P63241|IF5A1_人真核翻译起始因子 5A-1 OS＝智人 GN＝EIF5A PE＝1 SV＝2

＞sp|Q14247|SRC8_人Src底物皮质激素 OS＝智人 GN＝CTTN PE＝1 SV＝2

＞sp|P07355|ANXA2_人膜联蛋白A2 OS＝智人 GN＝ANXA2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P01598|KV106_人Igκ链V-I区域EU OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|O75955|FLOT1_人浮舰蛋白-1 OS＝智人 GN＝FLOT1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P35908|K22E_人角蛋白(HUMAN Keratin)，II型细胞骨架2表皮 OS＝智人GN＝KRT2 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q06830|PRDX1_人过氧化物酶-1 OS＝智人 GN＝PRDX1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P01625|KV402_人Igκ链V-IV区域Len OS＝智人 PE＝1 SV＝2

＞sp|P01042|KNG1_人激肽原-1 OS＝智人 GN＝KNG1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q86UX7|URP2_人Fermitin家族同源物3(HUMAN Fermitin family homolog3) OS＝智人 GN＝FERMT3 PE＝1 SV＝1

＞tr|A6NE09|A6NE09_人40S核糖体蛋白SA OS＝智人 GN＝RPSAP58 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q9BSL1|UBAC1_人含泛素相关域蛋白1 OS＝智人 GN＝UBAC1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P09651|ROA1_人不均一核糖核蛋白A1 OS＝智人 GN＝HNRNPA1 PE＝1 SV＝5

＞sp|Q9H169|STMN4_人抑微管装配蛋白-4 OS＝智人 GN＝STMN4 PE＝2 SV＝1

＞sp|P20160|CAP7_人天青杀素 OS＝智人 GN＝AZU1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P16452|EPB42_人红细胞膜蛋白带4.2 OS＝智人 GN＝EPB42 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q9UIA9|XPO7_人输出蛋白-7 OS＝智人 GN＝XPO7 PE＝1 SV＝3

＞sp|O95747|OXSR1_人丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶OSR1 OS＝智人 GN＝OXSR1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P52294|IMA5_人输入蛋白亚基α-5 OS＝智人 GN＝KPNA1 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q14974|IMB1_人输入蛋白亚基β-1 OS＝智人 GN＝KPNB1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P02008|HBAZ_人血红蛋白亚基ζOS＝智人 GN＝HBZ PE＝1 SV＝2

＞sp|P23528|COF1_人丝切蛋白-1 OS＝智人 GN＝CFL1 PE＝1 SV＝3

＞tr|A0A075B6R2|A0A075B6R2_人蛋白质IGHV4-4(片段) OS＝智人 GN＝IGHV4-4PE＝4 SV＝2

＞sp|P06310|KV206_人Igκ链V-II区域RPMI 6410 OS＝智人 PE＝4 SV＝1

＞sp|P16403|H12_人组蛋白H1.2 OS＝智人 GN＝HIST1H1C PE＝1 SV＝2

＞sp|P05107|ITB2_人整合素β-2 OS＝智人 GN＝ITGB2 PE＝1 SV＝2

＞sp|P02647|APOA1_人载脂蛋白A-I OS＝智人 GN＝APOA1 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q16401|PSMD5_人26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基5 OS＝智人 GN＝PSMD5 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q16204|CCDC6_人含卷曲螺旋域的蛋白6 OS＝智人 GN＝CCDC6 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q86VP6|CAND1_人滞蛋白-相关NEDD8-解离蛋白1 OS＝智人 GN＝CAND1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P34932|HSP74_人休克70kDa蛋白4 OS＝智人 GN＝HSPA4 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q5VVQ6|OTU1_人泛素硫酯酶OTU1 OS＝智人 GN＝YOD1 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q7LBR1|CHM1B_人带电荷的多泡体蛋白1b OS＝智人 GN＝CHMP1B PE＝1 SV＝1

＞sp|Q9BY43|CHM4A_人带电荷的多泡体蛋白4a OS＝智人 GN＝CHMP4A PE＝1 SV＝3

＞sp|Q9BSK4|FEM1A_人蛋白质fem-1同源物A OS＝智人 GN＝FEM1A PE＝1 SV＝1

＞sp|P08107|HSP71_人热休克70kDa蛋白1A/1B OS＝智人 GN＝HSPA1A PE＝1 SV＝5

＞sp|P01603|KV111_人Igκ链V-I区域Ka OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|P11142|HSP7C_人热休克同源物71kDa蛋白 OS＝智人 GN＝HSPA8 PE＝1 SV＝1

＞sp|P02745|C1QA_人补体C1q亚成分亚基A OS＝智人 GN＝C1QA PE＝1 SV＝2

＞tr|F5H423|F5H423_人未表征蛋白 OS＝智人 PE＝3 SV＝1

＞sp|P50552|VASP_人血管扩张剂-刺激的磷蛋白 OS＝智人 GN＝VASP PE＝1 SV＝3

＞sp|Q00013|EM55_人55kDa红细胞膜蛋白 OS＝智人 GN＝MPP1 PE＝1 SV＝2

＞tr|A0A0B4J1U2|A0A0B4J1U2_人蛋白质IGLV7-43(片段) OS＝智人 GN＝IGLV7-43 PE＝4 SV＝1

＞sp|O00410|IPO5_人输入蛋白-5 OS＝智人 GN＝IPO5 PE＝1 SV＝4

＞tr|A0A0B4J1Z7|A0A0B4J1Z7_人蛋白质IGKV1-39(片段) OS＝智人 GN＝IGKV1-39 PE＝1 SV＝1

＞sp|P08603|CFAH_人补体因子H OS＝智人 GN＝CFH PE＝1 SV＝4

＞sp|Q10567|AP1B1_人AP-1复合亚基β-1 OS＝智人 GN＝AP1B1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q04323|UBXN1_人含UBX域蛋白1 OS＝智人 GN＝UBXN1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9NRW1|RAB6B_人Ras-相关蛋白Rab-6B OS＝智人 GN＝RAB6B PE＝l SV＝1

＞sp|Pl1169|GTR3_人溶质载体家族2，促进葡萄糖转运蛋白成员3 OS＝智人 GN＝SLC2A3 PE＝1 SV＝1

＞sp|P15311|EZRI_人埃兹蛋白 OS＝智人 GN＝EZR PE＝1 SV＝4

＞sp|P13796PLSL_人丝束蛋白-2 OS＝智人 GN＝LCP1 PE＝1 SV＝6

＞sp|P46734MP2K3_人双重特异性丝裂原-活化蛋白激酶3OS＝智人_GN＝MAP2K3_PE＝1 SV＝2

＞tr|A0A075B6I0|A0A075B6I0_人蛋白质IGLV8-61(片段) OS＝智人 GN＝IGLV8-61 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q9H4A3|WNK1_人丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶WNK1 OS＝智人 GN＝WNK1 PE＝1SV＝2

＞sp|P08670|VIME_人波形蛋白 OS＝智人 GN＝VIM PE＝1 SV＝4

＞sp|P05546|HEP2_人肝素辅因子2 OS＝智人 GN＝SERPIND1 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q9Y277|VDAC3_人电压-依赖性阴离子选择通道蛋白3 OS＝智人 GN＝VDAC3PE＝1 SV＝1

＞sp|P01765|HV304_人Ig重链V-III区域TIL OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|O14578|CTRO_人香橼Rho-相互作用激酶 OS＝智人 GN＝CIT PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9UBV8|PEF1_人Peflin OS＝智人 GN＝PEF1 PE＝1 SV＝1

＞sp|O95782|AP2A1_人AP-2复合亚基α-1 OS＝智人 GN＝AP2A1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P02775|CXCL7_人血小板碱性蛋白 OS＝智人 GN＝PPBP PE＝1 SV＝3

＞sp|P16050|LOX15_人花生四烯酸15-脂氧合酶OS＝智人 GN＝ALOX15 PE＝1 SV＝3

＞sp|P01616|KV203_人Igκ链V-II区域MIL OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|P04075|ALDOA_人果糖-二磷酸醛缩酶A OS＝智人 GN＝ALDOA PE＝1 SV＝2

＞sp|Q15819|UB2V2_人泛素-缀合酶E2变体2 OS＝智人 GN＝UBE2V2 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q9Y570|PPME1_人蛋白磷酸酶甲酯酶1 OS＝智人 GN＝PPME1 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q8WW22|DNJA4_人DnaJ同源物亚家族A成员4 OS＝智人 GN＝DNAJA4 PE＝1SV＝1

＞sp|P01137|TGFB1_人转化生长因子β-1 OS＝智人 GN＝TGFB1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P84095|RHOG_人Rho-相关GTP-结合蛋白RhoG OS＝智人 GN＝RHOG PE＝1SV＝1

＞sp|P80511|S10AC_人蛋白质S100-A12 OS＝智人 GN＝S100A12 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9H0U4|RAB1B_人Ras-相关蛋白Rab-1B OS＝智人 GN＝RAB1B PE＝1 SV＝1

＞sp|Q93084|AT2A3_人浆细胞/内质网钙ATP酶3 OS＝智人 GN＝ATP2A3 PE＝1SV＝2

＞sp|P09496|CLCA_人网格蛋白轻链A OS＝智人 GN＝CLTA PE＝1 SV＝1

＞sp|P20292|AL5AP_人花生四烯酸5-脂氧合酶活化蛋白 OS＝智 人GN＝ALOX5APPE＝1 SV＝2

＞sp|Q96EP5|DAZP1_人DAZ-相关蛋白1 OS＝智人 GN＝DAZAP1 PE＝1 SV＝1

＞tr|A0A0C4DH35|A0A0C4DH35_人蛋白质IGHV3-35(片段) OS＝智人 GN＝IGHV3-35 PE＝4 SV＝1

＞sp|Q96NA2|RILP_人Rab-相互作用溶酶体蛋白 OS＝智人 GN＝RILP PE＝1 SV＝1

＞sp|P04839|CY24B_人细胞色素b-245重链 OS＝智人 GN＝CYBB PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9Y265|RUVB1_人RuvB-样1 OS＝智人 GN＝RUVBL1 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q02161|RHD_人血型Rh(D)多肽 OS＝智人 GN＝RHD PE＝1 SV＝3

＞sp|P48507|GSH0_人谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基 OS＝智人 GN＝GCLM PE＝1 SV＝1

＞tr|A0A0B4J2B7|A0A0B4J2B7_人蛋白质IGHV3-30(片段) OS＝智人 GN＝IGHV3-30 PE＝1 SV＝1

＞sp|P45880|VDAC2_人电压-依赖性阴离子选择通道蛋白2 OS＝智人 GN＝VDAC2PE＝1 SV＝2

＞sp|Q86XH1|IQCA1_人含IQ和AAA域蛋白1 OS＝智人 GN＝IQCA1 PE＝2 SV＝1

＞sp|P08962|CD63_人CD63抗原 OS＝智人 GN＝CD63 PE＝1 SV＝2

＞tr|A0A0B4J1U7|A0A0B4J1U7_人蛋白质IGHV6-1(片段) OS＝智人 GN＝IGHV6-1PE＝4 SV＝1

＞sp|P46109|CRKL_人Crk-样蛋白 OS＝智人 GN＝CRKL PE＝1 SV＝1

＞sp|Q12805|FBLN3_人含EGF腓骨蛋白-样细胞外基质蛋白1 OS＝智人 GN＝EFEMP1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P04921|GLPC_人血型糖蛋白-C OS＝智人 GN＝GYPC PE＝1 SV＝1

＞sp|P01019|ANGT_人血管紧张肽原OS＝智人 GN＝AGT PE＝1 SV＝1

＞sp|P05155|IC1_人血浆蛋白酶C1抑制剂 OS＝智人 GN＝SERPING1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P09525|ANXA4_人膜联蛋白A4 OS＝智人 GN＝ANXA4 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q06033|ITIH3_人间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H3 OS＝智人 GN＝ITIH3 PE＝1 SV＝2

＞tr|A0A075B6J7|A0A075B6J7_人蛋白质IGLV3-21(片段) OS＝智人 GN＝IGLV3-21 PE＝1 SV＝1

＞sp|P53396|ACLY_人ATP-柠檬酸合酶 OS＝智人 GN＝ACLY PE＝1 SV＝3

＞sp|P51692|STA5B_人信号转导和转录激活因子5B OS＝智人 GN＝STAT5B PE＝1 SV＝2

＞sp|P62330|ARF6_人ADP-核糖基化因子6 OS＝智人 GN＝ARF6 PE＝1 SV＝2

＞sp|P25686|DNJB2_人DnaJ同源物亚家族B成员2 OS＝智人 GN＝DNAJB2 PE＝1SV＝3

＞tr|K7N7A8|K7N7A8_人未表征蛋白(片段) OS＝智人 PE＝3 SV＝2

＞sp|Q13418|ILK_人整合素激酶 OS＝智人 GN＝ILK PE＝1 SV＝2

＞sp|Q9NP79|VTA1_人空泡蛋白质分选-相关蛋白VTA1同源物OS＝智人 GN＝VTA1PE＝1 SV＝1

＞sp|Q16181|SEPT7_人胞裂蛋白-7 OS＝智人 GN＝SEPT7 PE＝1 SV＝2

＞sp|P04208|LV106_人Igλ链V-I区域WAH OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|014980|XPO1_人输出蛋白-1 OS＝智人 GN＝XPO1 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q13057|COASY_人双功能辅酶A合成酶 OS＝智人 GN＝COASY PE＝1 SV＝4

＞sp|Q13526|PIN1_人肽基脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1 OS＝智人 GN＝PIN1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P54725|RD23A_人UV切除修复蛋白RAD23同源物A OS＝智人 GN＝RAD23A PE＝1 SV＝1

＞sp|O60784TOM1_人Myb蛋白靶标1 OS＝智人 GN＝TOM1 PE＝1 SV＝2

＞sp|O43598|DNPH1_人2′-脱氧核苷5′-磷酸N-水解酶1 OS＝智人 GN＝DNPH1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P40227|TCPZ_人T-符合蛋白1亚基ζ OS＝智人 GN＝CCT6A PE＝1 SV＝3

＞sp|P21796|VDAC1_人电压-依赖性阴离子选择通道蛋白1 OS＝智人 GN＝VDAC1PE＝1 SV＝2

＞sp|P07737|PROF1_人抑制蛋白-1 OS＝智人 GN＝PFN1 PE＝1 SV＝2

＞sp|P01761|HV106_人Ig重链V-I区域SIE OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q16543CDC37_人Hsp90辅助-伴侣Cdc37 OS＝智人 GN＝CDC37 PE＝1 SV＝1

＞sp|P78371|TCPB_人T-复合蛋白1亚基β OS＝智人 GN＝CCT2 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q15942|ZYX_人斑联蛋白 OS＝智人 GN＝ZYX PE＝1 SV＝1

＞sp|P78318|IGBP1_人免疫球蛋白结合蛋白1 OS＝智人 GN＝IGBP1 PE＝1 SV＝1

＞sp|P61020|RAB5B_人Ras-相关蛋白Rab-5B OS＝智人 GN＝RAB5B PE＝1 SV＝1

＞sp|P28676|GRAN_人颗粒钙蛋白 OS＝智人 GN＝GCA PE＝1 SV＝2

＞sp|P19827|ITIH1_人间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H1 OS＝智人 GN＝ITIH1 PE＝1 SV＝3

＞sp|P01608|KV116_人Igκ链V-I区域Roy OS＝智人 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q96P70|IPO9_人输入蛋白-9 OS＝智人 GN＝IPO9 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q00577|PURA_人转录激活子蛋白Pur-α OS＝智人 GN＝PURA PE＝1 SV＝2

＞sp|P0C0L5|CO4B_人补体C4-B OS＝智人 GN＝C4B PE＝1 SV＝2

＞sp|Q15435|PP1R7_人蛋白磷酸酶1调节亚基7 OS＝智人 GN＝PPP1R7 PE＝1 SV＝1

＞sp|P08631|HCK_人酪氨酸蛋白激酶HCK OS＝智人 GN＝HCK PE＝1 SV＝5

＞sp|P31942|HNRH3_人不均一核糖核蛋白H3 OS＝智人 GN＝HNRNPH3 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q5JTV8TOIP1_人耐扭蛋白-1A-相互作用蛋白1 OS＝智人 GN＝TOR1AIP1 PE＝1 SV＝2

＞sp|Q92599|SEPT8_人胞裂蛋白-8 OS＝智人 GN＝SEPT8 PE＝1 SV＝4

＞sp|P18206|VINC_人黏着斑蛋白 OS＝智人 GN＝VCL PE＝1 SV＝4

＞sp|P54578|UBP14_人泛素羧基-末端水解酶14 OS＝智人 GN＝USP14 PE＝1 SV＝3

＞sp|Q96CV9|OPTN_人视神经病变诱导反应蛋白(HUMAN Optineurin) OS＝智人GN＝OPTN PE＝1 SV＝2

＞sp|Q16555|DPYL2_人二氢嘧啶酶相关蛋白2 OS＝智人 GN＝DPYSL2 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q92841|DDX17_人可能的ATP-依赖性RNA解旋酶DDX17 OS＝智人 GN＝DDX17PE＝1 SV＝2

＞sp|P52565|GDIR1_人Rho GDP-解离抑制剂1 OS＝智人 GN＝ARHGDIA PE＝1 SV＝3

＞sp|P62736|ACTA_人肌动蛋白，主动脉平滑肌 OS＝智人 GN＝ACTA2 PE＝1 SV＝1

＞sp|P68366|TBA4A_人微管蛋白α-4A链 OS＝智人 GN＝TUBA4A PE＝1 SV＝1

＞sp|O00148|DX39A_人ATP依赖性RNA解旋酶DDX39A OS＝智人 GN＝DDX39A PE＝1 SV＝2

＞sp|P17213|BPI_人杀菌通透性增加蛋白 OS＝智人 GN＝BPI PE＝1 SV＝4

＞sp|O15198|SMAD9_人母亲DPP同源物9(HUMAN Mothers againstdecapentaplegic homolog 9)OS＝智人 GN＝SMAD9 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q99969|RARR2_人视黄酸受体反应蛋白2 OS＝智人 GN＝RARRES2 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q8IXQ3|CI040_人未表征蛋白C9orf40 OS＝智人 GN＝C9orf40 PE＝1 SV＝1

＞sp|P04003|C4BPA_人C4b-结合蛋白α链 OS＝智人 GN＝C4BPA PE＝1 SV＝2

＞sp|P29622|KAIN_人组织激肽释放酶结合蛋 OS＝智人 GN＝SERPINA4 PE＝1SV＝3

＞sp|Q08380|LG3BP_人半乳凝素-3-结合蛋白 OS＝智人 GN＝LGALS3BP PE＝1SV＝1

＞sp|P09917|LOX5_人花生四烯酸5-脂氧合酶 OS＝智人 GN＝ALOX5 PE＝1 SV＝2

＞sp|P17066|HSP76_人热休克70kDa蛋白6 OS＝智人 GN＝HSPA6 PE＝1 SV＝2

＞sp|O00299|CLIC1_人氯化物细胞内通道蛋白1 OS＝智人 GN＝CLIC1 PE＝1 SV＝4

＞sp|Q15366|PCBP2_人聚(rC)结合蛋白2 OS＝智人 GN＝PCBP2 PE＝1 SV＝1

＞sp|P00403|COX2_人细胞色素c氧化酶亚基2 OS＝智人 GN＝MT-CO2 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q9Y6C9|MTCH2_人线粒体载体同源物2 OS＝智人 GN＝MTCH2 PE＝1 SV＝1

＞sp|Q86YZ3|HORN_人角蛋白(HUMAN Hornerin) OS＝智人 GN＝HRNR PE＝1 SV＝2

＞sp|Q06187|BTK_人酪氨酸蛋白激酶BTK OS＝智人 GN＝BTK PE＝1 SV＝3

在鉴定出的蛋白质中，证实了纤维蛋白原α和β链分别不包括Fp(A)和Fp(B)肽，这表明鉴定出的纤维蛋白原蛋白经历凝血酶介导的切割并转化为不溶性纤维蛋白。

利用Uniprot登录列表使用反应组[PMID 24243840，24213504]进行通路富集分析。使用1％FDR过滤数据。

表2示出了通路富集，共鉴定了65个通路。这些鉴定出的通路大多数与止血、凝块形成、血小板活化和脱颗粒、先天免疫系统、补体活化和白细胞活化、ECM组织化和细胞-ECM相互作用有关。

表2：通路列表

Claims (46)

1.一种用于制备经修饰的血凝块的方法，包括：

(a)获得血凝块；以及

(b)除去所述血凝块的细胞内容物；

从而获得经修饰的血凝块。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在出血部位处体内形成所述血凝块。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，出血发生在手术操作，创伤性损伤或分娩期间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述血凝块由获自供体的血液样品或血液制品离体形成。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述血液样品或血液制品的供体有身体状况或患有疾病。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述身体状况或疾病选自由缺血性、退行性、炎性、癌性、遗传性、创伤性、发育性或获得性的身体状况或疾病所组成的组。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述血凝块由脐带血、胎盘血、外周血或混合血的样品离体形成。

8.根据权利要求4至7任一项所述的方法，其中，将所述血液样品在不存在抗凝剂的情况下进行孵育。

9.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中，在形成凝块之前，将所述血液样品在存在至少一种抗凝剂的情况下进行孵育。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述至少一种抗凝剂选自由肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、它们的盐或它们的组合所组成的组。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，在与所述抗凝剂孵育后，将能逆转所述抗凝剂的作用的至少一种试剂加入到所述血液样品中。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述至少一种试剂是钙或钙盐。

13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，其中，所述血液样品在凝血活化剂的存在下进一步进行孵育。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述凝血活化剂是纤维蛋白原裂解剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述纤维蛋白原裂解剂是凝血酶。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，除去细胞内容物是通过将所述血凝块与选自由增溶剂、洗涤剂、螯合剂、酶、抗体、高渗溶液、低渗溶液、脱水剂及它们的任意组合所组成的组中的至少一种试剂孵育来进行。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前用预修饰剂进行预修饰的步骤，其中，所述预修饰剂选自由生物分子、药物、抗原、微生物和细胞所组成的组。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述生物分子是胶原或透明质酸。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述药物是抗生素药物或抗炎性药物。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述抗原是微生物抗原或癌细胞抗原。

21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞是癌细胞或血细胞。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后的加工步骤(c)，其中，所述加工步骤选自由脱水、冻干、低温保存、部分或完全消化、纯化、溶解、分级、裂解及它们的任意组合所组成的组。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，所述方法在步骤(b)之后进一步包括：将细胞或细胞聚集体接种到所述经修饰的血凝块上的步骤(c)，以及可选地包括从所述经修饰的血凝块中去除所述细胞或细胞聚集体的进一步步骤(d)，从而改变所述经修饰的血凝块的至少一种生物性质和/或机械性质。

24.一种在不溶的生物相容性支架内包埋至少一种试剂的方法，所述方法包括：

(a)获得血凝块；以及

(b)除去所述血凝块的细胞内容物；

从而获得经修饰的血凝块，其中，所述经修饰的血凝块的特征在于：不溶性、生物相容性且包括至少一种试剂，所述试剂包埋在所述经修饰的血凝块中。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述至少一种试剂选自由可溶性血浆分子、活化的血小板衍生分子和活化的WBC衍生分子所组成的组。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述至少一种试剂是白蛋白。

27.一种根据权利要求1至23中任一项所述的方法制备的经修饰的血凝块。

28.一种经修饰的血凝块，其中，所述经修饰的血凝块是经离体修饰的，且特征在于以下一项或多项：

(a)是用抗纤维蛋白溶解因子稳定的，

(b)不含或基本上不含细胞内容物，

(c)并入了具有抗微生物活性的生物分子，

(d)并入了活化的血小板和活化的WBC衍生生物分子，

(e)并入了血小板和WBC活化因子，以及

(f)并入了可溶性血清生物分子，如白蛋白。

29.根据权利要求27或28所述的经修饰的血凝块，其中，所述经修饰的血凝块用细胞或细胞聚集体离体接种。

30.根据权利要求29所述的经修饰的血凝块，其中，所述细胞或细胞聚集体选自由分化的细胞、前体细胞、多能细胞或干细胞所组成的组。

31.根据权利要求29所述的经修饰的血凝块，其中，所述细胞或细胞聚集体是原代细胞、来自已建立的细胞系的细胞、遗传修饰的细胞或产生激素的细胞。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的经修饰的血凝块，其中，接种的所述细胞或细胞聚集体从所述经修饰的血凝块中去除。

33.根据权利要求27至32中任一项所述的经修饰的血凝块，其中，所述经修饰的血凝块是疾病特异性经修饰的血凝块或病期特异性经修饰的血凝块。

34.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块，和药学上可接受的载体或赋形剂。

35.一种治疗疾病或身体状况的方法，所述方法包括将权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块或权利要求34所述的药物组合物给药予有需要的受试者的步骤，其中，所述疾病或身体状况选自由缺血性、退行性、炎性、癌性、遗传性、创伤性、发育性或获得性的身体状况或疾病所组成的组。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。

37.根据权利要求35所述的方法，其中，所述受试者是人。

38.权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块，用于止血、伤口愈合、软组织重建和/或修复、移植物附着、软组织填充、组织再生，以及用于在手术部位处或在受污染的医疗环境中控制感染。

39.权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块，用作组织再生的支架。

40.权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块，用于将细胞递送至有需要的受试者体内。

41.权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块，用于为细胞生长、分化和/或将细胞递送至有需要的受试者体内提供支持性的微环境。

42.权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块，用于将药物递送至有需要的受试者体内。

43.权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块在制备用于止血、伤口愈合、软组织重建和/或修复、移植物附着、软组织填充、组织再生，以及用于在手术部位处或在受污染的医疗环境中控制感染的药物组合物中的用途。

44.一种改变细胞、多细胞聚集体或组织的方法，包括将所述细胞、多细胞聚集体或组织暴露于权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块的步骤。

45.一种试剂盒，包括：

(a)容器，所述容器容纳权利要求27至33中任一项所述的经修饰的血凝块或权利要求34所述的药物组合物；和

(b)使用所述试剂盒的说明书。

46.根据权利要求45所述的试剂盒，进一步包括容纳至少一种凝血活化剂的容器。