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CN107417801B - 一种可注射水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种可注射水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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CN107417801B CN201710467784.2A CN201710467784A CN107417801B CN 107417801 B CN107417801 B CN 107417801B CN 201710467784 A CN201710467784 A CN 201710467784A CN 107417801 B CN107417801 B CN 107417801B
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Abstract

本发明公开一种可注射水凝胶及其制备方法与应用，所述制备方法包括步骤：将10～20g壳聚糖悬浮于50～100ml异丙醇中，加入20～40ml 5～15mol/L NaOH水溶液室温下搅拌20～40min，再滴加20～30g一氯乙酸，加热至55～65℃搅拌2～4h后，过滤洗涤干燥，得到羧甲基壳聚糖；按黄原胶和高碘酸钠的摩尔比1:1～3将高碘酸钠水溶液滴加到黄原胶水溶液中，暗室中搅拌反应2～4h，再加入乙二醇搅拌1～2h，透析纯化反应溶液，得到醛化黄原胶；将醛化黄原胶与羧甲基壳聚糖反应生成可注射水凝胶。本发明通过利用天然多糖进行官能团修饰后合成的可注射水凝胶，安全无毒，成本低廉，抗酶解能力显著。

Description

一种可注射水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及可注射水凝胶领域，尤其涉及一种可注射水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
在临床工作中，通常使用商品化的猪源性纤维蛋白胶进行肠瘘的封堵治疗，使得一部分肠瘘患者可以通过保守治疗而恢复肠道的连续性，避免了肠瘘手术治疗。但是这种纤维蛋白胶由于其来源于生物而价格高昂，此外，这种生物材料的抗酶解能力差，使得其应用过程中很快被肠液完全消化，使得部分患者治疗效果不满意。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可注射水凝胶及其制备方法与应用，旨在解决现有的纤维蛋白胶价格高昂，且抗酶解能力差的问题。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种可注射水凝胶的制备方法，包括：
步骤A、将10～20g壳聚糖悬浮于50～100ml异丙醇中，加入20～40ml 5～15mol/LNaOH水溶液，在室温下搅拌20～40min，再滴加20～30g一氯乙酸，加热至55～65℃搅拌2～4h后，过滤、洗涤、干燥，得到羧甲基壳聚糖；
步骤B、按照黄原胶和高碘酸钠的摩尔比为1:1～3，将高碘酸钠水溶液滴加到黄原胶水溶液中，在暗室中搅拌反应2～4h，再加入乙二醇继续搅拌1～2h，然后透析纯化反应溶液，得到醛化黄原胶；
步骤C、将所述醛化黄原胶与所述羧甲基壳聚糖进行交联反应生成可注射水凝胶。
所述的可注射水凝胶的制备方法，其中，所述步骤A中，过滤、洗涤、干燥的步骤具体包括：过滤后，将过滤的残余物用体积比为70～90％的甲醇/水混合溶液洗涤3～5次，然后用乙醇洗涤2～4次，最后通过真空干燥得到所述羧甲基壳聚糖。
所述的可注射水凝胶的制备方法，其中，所述步骤B中，所述黄原胶水溶液的质量体积比为0.5～2.0％，所述高碘酸钠水溶液的质量体积比为5～20％。
所述的可注射水凝胶的制备方法，其中，所述步骤B中，透析纯化反应溶液时，使用透析袋用蒸馏水透析纯化反应溶液，透析2～4天，每天至少更新5次水。
本发明提供一种可注射水凝胶，采用以上任一项所述的制备方法制成。
本发明又提供一种可注射水凝胶，包括醛化黄原胶和羧甲基壳聚糖，其中，所述醛化黄原胶的结构式为：
Figure BDA0001326325660000021
n为大于1的整数。
本发明还提供一种可注射水凝胶，其中，所述可注射水凝胶的结构式为：
Figure BDA0001326325660000031
其中，m、n均为大于1的整数。
本发明还提供一种可注射水凝胶的应用，将以上任一项所述的可注射水凝胶应用于制备肠瘘封堵的材料。
有益效果：本发明提供了一种可注射水凝胶及其制备方法与应用，本发明通过利用天然多糖进行官能团修饰后合成的可注射水凝胶，安全无毒，成本低廉，抗酶解能力显著。
附图说明
图1为本发明合成醛化黄原胶的反应方程式，图中a为黄原胶，b为醛化黄原胶，n为大于1的整数。
图2为本发明合成羧甲基壳聚糖的反应方程式，图中c为壳聚糖，d为羧甲基壳聚糖，m为大于1的整数。
图3为本发明合成所述可注射水凝胶的反应方程式，图中e为所述可注射水凝胶，m、n均为大于1的整数。
图4为本发明所述羧甲基壳聚糖、所述醛化黄原胶、所述可注射水凝胶的红外光谱结果图。
图5为本发明所述可注射水凝胶的体外毒性测试结果图。
图6为本发明所述可注射水凝胶的抗酶解试验结果图，图中P<0.001表示具有明显的统计学差异。
具体实施方式
本发明提供一种可注射水凝胶及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明较佳实施例的可注射水凝胶的制备方法，包括步骤：
S100、将10～20g壳聚糖(CS)悬浮于50～100ml异丙醇中，加入20～40ml 5～15mol/L的NaOH水溶液，在室温下搅拌20～40min，再滴加20～30g一氯乙酸，加热至55～65℃搅拌2～4h后，过滤、洗涤、干燥，得到羧甲基壳聚糖(NOCC)；
S200、按照黄原胶和高碘酸钠(NaIO4)的摩尔比为1:1～3，将高碘酸钠水溶液滴加到黄原胶水溶液中，在暗室中搅拌反应2～4h，再加入乙二醇继续搅拌1～2h，然后透析纯化反应溶液，得到醛化黄原胶；
S300、将所述醛化黄原胶与所述羧甲基壳聚糖进行交联反应生成可注射水凝胶，即醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶。
进一步的，本实施例中，所述步骤S100中，合成羧甲基壳聚糖的反应方程式如图2所示，所述过滤、洗涤、干燥的步骤具体包括：过滤后，将过滤的残余物用体积比为70～90％(v/v)的甲醇/水混合溶液洗涤3～5次，然后用乙醇洗涤2～4次，最后通过真空干燥得到所述羧甲基壳聚糖。
优选的，所述步骤S100具体实施时，可以将10g壳聚糖悬浮于75ml异丙醇中，然后在室温下搅拌；将25ml 10mol/L NaOH水溶液等分成5份，并以5min间隔依次加入到搅拌的浆液中；之后，将所得浆液搅拌30min，然后滴加20g一氯乙酸，加热至60℃，并在该温度下搅拌3h；随后，将反应混合物过滤，过滤的残余物用80％(v/v)甲醇/水混合物彻底洗涤3次，用乙醇洗涤2次，通过真空干燥得到最终产物NOCC，制得的NOCC的取代度为85％，显示出良好的亲水性。
进一步的，本实施例中，将黄原胶与高碘酸钠反应生成醛化黄原胶的反应方程式如图1所示，所述步骤S200中，按照黄原胶和高碘酸钠的摩尔比为1:1～3，将高碘酸钠水溶液滴加到黄原胶水溶液中，在暗室中搅拌反应2～4h，目的是为了切割底物基团的碳-碳键，并在分子链的黄原胶单元中产生反应性醛基，得到醛化黄原胶(Xan-CHO)。
进一步的，本实施例中，所述步骤S200中，所述黄原胶水溶液的质量体积比(w/v)为0.5～2.0％，例如，可以为0.5％、0.6％、1.0％、2.0％；所述高碘酸钠水溶液的质量体积比(w/v)为5～20％，例如，可以为5％、8％、15％、20％。
进一步的，本实施例中，所述步骤S200中，加入乙二醇继续搅拌1～2h的目的是为了中和未反应的高碘酸钠，其中，乙二醇可以加入1～3ml，例如可以加入1ml、2ml、3ml。
进一步的，本实施例中，所述步骤S200中，透析纯化反应溶液时，使用透析袋用蒸馏水透析纯化反应溶液，透析2～4天，每天至少更新5次水，得到Xan-CHO产品。例如，可以透析2天，每天更新8次水，或者可以透析3天，每天更新5次水。所述透析袋优选使用MWCO12000-14000。优选的，将Xan-CHO产品在冷冻干燥机中冷冻干燥，然后在4℃的密封塑料袋中储存。
优选的，所述步骤S200具体实施时，制备0.6％黄原胶水溶液和8％NaIO4水溶液，将80ml黄原胶水溶液倒入烧杯中并滴加2ml NaIO4水溶液(黄原胶与NaIO4摩尔比为1:1.5)；之后将混合液在暗室中继续搅拌3h；再加入1ml乙二醇以中和未反应的NaIO4，将反应物再搅拌1h，并使用透析袋用蒸馏水纯化溶液3天，在透析过程中每天更新5次水；最后将Xan-CHO产品在冷冻干燥机中冷冻干燥并在4℃的密封塑料袋中储存。
进一步的，本实施例中，所述步骤S300具体实施时，将所述醛化黄原胶与羧甲基壳聚糖按预定比例(重量百分比)溶于水中在孔板中成胶生成所述可注射水凝胶，Xan-CHO与NOCC反应生成醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶的反应方程式如图3所示，其中，Xan-CHO与NOCC的预定比例为1％：(0.1～0.5％)，例如可以为1％：0.1％、1％：0.33％、1％：0.5％。
本发明实施例还提供了一种可注射水凝胶，其采用以上任一项所述的制备方法制成。本发明制备的可注射水凝胶即醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，包括醛化黄原胶和羧甲基壳聚糖，其中，所述醛化黄原胶和所述醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶的结构式分别为：
Figure BDA0001326325660000061
Figure BDA0001326325660000062
其中，m、n均为大于1的整数。
本发明实施例还提供一种可注射水凝胶的应用，将以上所述的可注射水凝胶应用于制备肠瘘封堵的材料。
本发明通过利用天然多糖进行官能团修饰后合成的可注射水凝胶，安全无毒，成本低廉，抗酶解能力显著，比纤维蛋白胶性质显著优越。
下面以具体实施例对本发明做详细说明：
实施例1
1、醛化黄原胶的合成：制备0.6％(w/v)黄原胶水溶液和8％(w/v)NaIO4水溶液，然后将80ml黄原胶水溶液倒入烧杯中并滴加2ml NaIO4水溶液(黄原胶与NaIO4的摩尔比为1:1.5)；之后，将混合液在暗室中继续搅拌3h；然后加入1ml乙二醇以中和未反应的NaIO4，将反应物再搅拌1h，并使用透析袋用蒸馏水纯化溶液3天，在透析过程中每天更新5次水；最后，将Xan-CHO产品在冷冻干燥机中冷冻干燥，然后在4℃的密封塑料袋中储存。
通过羟胺盐酸盐滴定法测定Xan-CHO的氧化度(氧化黄原酸重复单元的比例)。将5ml黄原胶CHO水溶液(0.2％w/v)溶于15ml盐酸羟胺溶液(2.3％w/v)中，通过pH计记录pH1，然后将混合溶液搅拌24h，测量pH2。相关的反应和计算公式如下：
Xan-(CHO)n+nH2N·HCl＝Xan-(CH＝N-OH)n+nH2O+nHCl (1)
C1(H+)＝10-pH1 (2)
C2(H+)＝10-pH2 (3)
ΔC＝C2(H+)-C1(H+) (4)
氧化度(％)＝993×ΔC×20×10-3/(2×W) (5)
在式(5)中，993是Xan-CHO重复单元的分子量，单位为g/mol。20表示反应溶液的总体积(15ml+5ml)。W指Xan-CHO的重量，单位为g。经计算，制备的Xan-CHO的氧化度为44.1％。
2、羧甲基壳聚糖的合成：将10g壳聚糖悬浮于75ml异丙醇中，然后在室温下搅拌，将25ml 10mol/L NaOH水溶液等分成5份，并以5min间隔依次加入到搅拌浆液中；之后，将所得浆液搅拌30min，滴加20g一氯乙酸，然后加热至60℃搅拌3h；随后，将反应混合物过滤后，再将过滤残余物用80％(v/v)甲醇/水混合物彻底洗涤3次，用乙醇循环2次，最后通过真空干燥得到羧甲基壳聚糖。
3、醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶的合成：将所述醛化黄原胶与羧甲基壳聚糖按重量百分比1％：0.33％溶于水中在孔板中成胶生成醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，即所述可注射水凝胶。
红外光谱检测：应用FTIR红外光谱检测壳聚糖、羧甲基壳聚糖、黄原胶、醛化黄原胶以及最终的交联产物醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶的红外光谱特点。在室温下使用Nicolet-6700光谱仪。将每种聚合物的粉末研磨后放置在干燥KBr盘，并以4cm-1的分辨率进行32次扫描记录光谱。红外光谱结果如图4所示，通过图4所示的FTIR证实了羧甲基壳聚糖和醛化黄原胶的成功制备。壳聚糖和羧甲基壳聚糖均显示了1340cm-1附近的多糖结构的特征吸收带(C-C-H和O-C-H振荡)和1100cm-1(C-O振荡)。与壳聚糖相比，由于COO-基团的不对称和对称伸缩振动，羧甲基壳聚糖在1610cm-1和1432cm-1处具有特征吸收带。在黄原胶和醛化黄原胶中，也观察到多糖结构的典型吸收带。此外，在1740cm-1处是C＝O组伸缩振动，其在醛化黄原胶中比在黄原胶中更明显。上述结果表明，对黄原胶的醛化和对壳聚糖的羧甲基化成功。
体外毒性检测：通过浸提液法评估水凝胶的安全性。首先，在24孔板中充分制备了Xan-CHO/NOCC水凝胶(1％：0.33％)，随后用10％FBS(胎牛血清)的DMEM(培养基)在37℃下提取24h，然后进行原液的连续稀释，得到浸出液的不同浓度(100％，50％，25％，12.5％)；将成纤维细胞与浸提液(200μL)共培养48h，接着，每孔加入10μLCCK-8，37℃孵育4h，待溶液均质后，测定450nm处的吸光度。体外毒性检测结果如图5所示，通过图5可以发现，无论浸提液与新鲜培养基以何种比例混合，都不会影响细胞的增殖，因此，本发明制备的醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶是安全无毒的。
抗消化酶酶解试验：在6孔板中制备了三块X-CHO/NOCC水凝胶(1％：0.33％)和纤维蛋白凝胶，然后在37℃下浸入新鲜的十二指肠液中。十二指肠液每六h更换一次。6h，12h，24h，48h和72h后，取出水凝胶块，并用薄纸立即擦去表面水分。然后测量水凝胶的重量，之后将它们放回6孔板中。抗消化酶酶解试验结果如图6所示，图6结果显示本发明制备的醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶的抗酶解能力相比商品化的纤维蛋白胶具体显著的优势。
实施例2
1、醛化黄原胶的合成：制备0.5％(w/v)黄原胶水溶液和5％(w/v)NaIO4水溶液，然后将黄原胶水溶液倒入烧杯中并滴加NaIO4水溶液(黄原胶与NaIO4的摩尔比为1:1)；之后，将混合液在暗室中继续搅拌2h；然后加入1ml乙二醇以中和未反应的NaIO4，将反应物再搅拌1h，并使用透析袋用蒸馏水纯化溶液2天，在透析过程中每天更新8次水；最后，将Xan-CHO产品在冷冻干燥机中冷冻干燥，然后在4℃的密封塑料袋中储存。
2、羧甲基壳聚糖的合成：将10g壳聚糖悬浮于50ml异丙醇中，然后在室温下搅拌，将20ml 5mol/L NaOH水溶液等分成5份，并以5min间隔依次加入到搅拌浆液中；之后，将所得浆液搅拌20min，滴加20g一氯乙酸，然后加热至55℃搅拌2h。随后，将反应混合物过滤后，再将过滤残余物用70％(v/v)甲醇/水混合物彻底洗涤5次，用乙醇循环4次，最后通过真空干燥得到羧甲基壳聚糖。
3、醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶的合成：将所述醛化黄原胶与羧甲基壳聚糖按重量百分比1％：0.33％溶于水中在孔板中成胶生成醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶。
将本实施例制备的醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，进行与实施例1同样的红外光谱检测、体外毒性检测、以及抗消化酶酶解试验，结果发现本实施制备的醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，同样具有无毒性和显著的抗酶解能力。
实施例3
1、醛化黄原胶的合成：制备2％(w/v)黄原胶水溶液和20％(w/v)NaIO4水溶液，然后将黄原胶水溶液倒入烧杯中并滴加NaIO4水溶液(黄原胶与NaIO4的摩尔比为1:3)；之后，将混合液在暗室中继续搅拌4h；然后加入3ml乙二醇以中和未反应的NaIO4，将反应物再搅拌2h，并使用透析袋用蒸馏水纯化溶液4天，在透析过程中每天更新5次水；最后，将Xan-CHO产品在冷冻干燥机中冷冻干燥，然后在4℃的密封塑料袋中储存。
2、羧甲基壳聚糖的合成：将20g壳聚糖悬浮于100ml异丙醇中，然后在室温下搅拌，将40ml 15mol/L NaOH水溶液等分成5份，并以5min间隔依次加入到搅拌浆液中；之后，将所得浆液搅拌40min，滴加30g一氯乙酸，然后加热至65℃搅拌4h。随后，将反应混合物过滤后，再将过滤残余物用90％(v/v)甲醇/水混合物彻底洗涤3次，用乙醇循环2次，最后通过真空干燥得到羧甲基壳聚糖。
3、醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶的合成：将所述醛化黄原胶与羧甲基壳聚糖按重量百分比1％：0.33％溶于水中在孔板中成胶生成醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶。
将本实施例制备的醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，进行与实施例1同样的红外光谱检测、体外毒性检测、以及抗消化酶酶解试验，结果发现本实施制备的醛化黄原胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，同样具有无毒性和显著的抗酶解能力。
综上所述，本发明提供了一种可注射水凝胶及其制备方法与应用，本发明通过利用天然多糖进行官能团修饰后合成的可注射水凝胶，安全无毒，成本低廉，抗酶解能力显著。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤A、将10~20g壳聚糖悬浮于50~100ml异丙醇中，加入20~40ml 5~15mol/L NaOH水溶液，在室温下搅拌20~40min，再滴加20~30g一氯乙酸，加热至55~65℃搅拌2~4h后，过滤、洗涤、干燥，得到羧甲基壳聚糖；
步骤B、按照黄原胶和高碘酸钠的摩尔比为1:1~3，将高碘酸钠水溶液滴加到黄原胶水溶液中，在暗室中搅拌反应2~4h，再加入乙二醇继续搅拌1~2h，然后透析纯化反应溶液，得到醛化黄原胶；
步骤C、将所述醛化黄原胶与所述羧甲基壳聚糖进行交联反应生成可注射水凝胶；
所述步骤A中，过滤、洗涤、干燥的步骤具体包括：过滤后，将过滤的残余物用体积比为70~90％的甲醇/水混合溶液洗涤3~5次，然后用乙醇洗涤2~4次，最后通过真空干燥得到所述羧甲基壳聚糖；
所述步骤B中，所述黄原胶水溶液的质量体积比为0.5~2.0％，所述高碘酸钠水溶液的质量体积比为5~20％；透析纯化反应溶液时，使用透析袋用蒸馏水透析纯化反应溶液，透析2~4天，每天至少更新5次水。
2.一种可注射水凝胶，其特征在于，采用如权利要求1所述的制备方法制成。
3.根据权利要求2所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述醛化黄原胶的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，n为大于1的整数。
4.根据权利要求2所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述可注射水凝胶的结构式为：
Figure 233898DEST_PATH_IMAGE002
，其中，m、n均为大于1的整数。
5.一种可注射水凝胶的应用，其特征在于，将如权利要求2~4任一项所述的可注射水凝胶应用于制备肠瘘封堵的材料。
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