CN107406835A - 表达嵌合rsv/bpiv3f蛋白的重组人/牛副流感病毒3(b/hpiv3)及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了包括编码异源基因的病毒基因组的重组副粘病毒。在数个实施方案中，该重组副粘病毒是重组副流感病毒，诸如包括编码与来自PIV3的F蛋白的跨膜域和胞质尾连接的异源呼吸道合胞病毒F外域的病毒基因组的重组PIV3。还提供了包括重组副粘病毒的基因组的核酸分子。该重组病毒可以在疫苗配制剂，诸如针对副流感病毒和呼吸道合胞病毒的疫苗中有利地使用。
Description
相关申请
本申请要求2015年1月20日提交的美国临时申请No.62/105,667的优先权，通过援引将其完整收录。
领域
本公开文本涉及包括如下病毒基因组的重组副粘病毒，该病毒基因组包括编码异源病毒的抗原的异源基因。例如，该重组副粘病毒可以是包括如下基因组的重组副流感病毒(PIV)，该基因组包括编码呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白的异源基因。
背景
副粘病毒是一个负义单链RNA病毒科，引起每年全世界许多动物和人死亡。副粘病毒包括副粘病毒亚科和肺病毒亚科。呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科，肺病毒属中的一种有包膜的不分段负链RNA病毒。它是儿童在他们生命第一年中细支气管炎和肺炎的最常见原因。RSV还引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，可发生于任何年龄，尤其是在年老的或那些具有受损的心，肺，或免疫系统的中。当前使用被动免疫接种来预防由RSV感染引起的重病，尤其是在具有早产，支气管肺发育异常，或先天性心脏病的婴儿中。尽管某些群体中RSV感染的重担，有效RSV疫苗的开发仍然是难以捉摸的。
像RSV一样，副流感病毒(PIV)是副粘病毒科中的另一种有包膜的不分段负链RNA病毒。然而，PIV在副粘病毒亚科中。PIV包括呼吸道病毒属(包括PIV1，PIV3，仙台病毒)和德国麻疹病毒属(包括PIV2，PIV4，PIV5)的成员。另外，禽腮腺病毒属(包括新城疫病毒NDV)的成员在历史上称作PIV，而且在操作上可以相同考虑。人副流感病毒(HPIV，血清型1，2，和3)在全世界婴儿和儿童中引起严重呼吸道感染方面仅次于RSV，其中HPIV3是HPIV中就疾病冲击而言最重要的。HPIV基因组是大约15.5kb，包括3’-N-P-M-F-HN-L的基因次序。每种基因编码分开的mRNA，编码主要蛋白：N，核蛋白；P，磷蛋白；M，基质蛋白；F，融合糖蛋白；HN，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白；L，大型聚合酶蛋白。P基因含有一个或多个另外的编码辅助蛋白的可读框(ORF)。与RSV类似，有效HPIV疫苗的开发仍然是难以捉摸的。
概述
提供了包括编码异源基因的病毒基因组的重组副粘病毒。在数个实施方案中，该重组副粘病毒可以是包含如下病毒基因组的重组副流感病毒，该病毒基因组包含编码包含与副粘病毒的F蛋白的胞质尾(CT)，或跨膜域(TM)和CT连接的重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因。该副粘病毒可以是例如重组人/牛副流感病毒3(B/HPIV3)，重组人副流感病毒1(HPIV1)，重组人副流感病毒2(HPIV2)，重组人副流感病毒3(HPIV3)，或重组牛副流感病毒3(BPIV3)。
令人惊讶地，当将该重组副粘病毒施用于受试者时，用异源RSV F蛋白的TM和CT交换副粘病毒F蛋白的相应TM和CT提供重组副粘病毒的包膜中RSV F外域并入的多倍升高，且剧烈提高针对外域的免疫应答的引发。进一步地，病毒中和性血清抗体的诱导在数量和质量方面均剧烈升高。因而，在数个实施方案中，所公开的重组副粘病毒可以包括在用于引发针对副粘病毒和异源RSV F蛋白的二价免疫应答的免疫原性组合物中。
该由异源基因编码的RSV F外域可以来自人RSV F蛋白。在数个实施方案中，该RSVF外域可以包括一处或多处氨基酸替代(诸如“DS-Cav1”替代，S155C，S290C，S190F，和V207L)以将该外域稳定化于RSV F融合前构象。在另外的实施方案中，该RSV F外域可以包括一处或多处氨基酸替代以提高外域表达或病毒包膜中的并入(诸如“HEK”替代，K66E和Q101P)。
在一个非限制性实施方案中，该重组副粘病毒可以是重组B/HPIV3且该RSV F外域是与来自BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。在一些此类实施方案中，与来自BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：21所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21至少90％同一的氨基酸序列。
在数个实施方案中，该重组副粘病毒是包含如下病毒基因组的重组PIV，该病毒基因组从上游到下游包含：PIV基因组启动子，接着是N，P，M，F，HN，和L基因。在一些此类实施方案中，该病毒基因组中包括的异源基因可以位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，或编码N和P蛋白的基因之间。
在另外的实施方案中，该重组副粘病毒的病毒基因组中包括的异源基因可以是为了人细胞中的表达而密码子优化的。在更多实施方案中，该重组副粘病毒可以是减毒病毒。在其它实施方案中，所添加的基因及其编码的蛋白可以提供疫苗候选所需要的减毒。
还提供了包括该重组副粘病毒的免疫原性组合物。该组合物可以进一步包括佐剂。还公开了在受试者中产生免疫应答的方法，其通过对该受试者施用有效量的所公开的重组副粘病毒进行。进一步提供的是包括本文中公开的任何重组副粘病毒的病毒基因组的分离的核酸分子。
本公开文本的前述和其它特征和优点会由于下述数个实施方案的详细描述变得更加明白，这提及附图进行。
附图简述
图1。表达多种型式的含有非HEK或HEK氨基酸指派的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的构建。使用GeneArt(GA)算法为了人表达而密码子优化FORF。构建物称作non-HEK/GA-opt和HEK/GA-opt。HEK(66E，101P)和non-HEK(66K，101Q)氨基酸指派以星号标示。其它注释：S，信号序列；p27，通过切割-活化释放的27k蛋白片段；FP，融合肽；TM，跨膜；CT，胞质尾。将RSV FORF放置在BPIV3基因起点和基因终点转录信号控制下并插入B/HPIV3载体的N和P基因之间的第2基因组位置。rB/HPIV3载体包括来自BPIV3的N，P，M，和L基因，和来自HPIV3的F和NH基因。相同载体基因组位置和载体转录信号用于图1-35中描述的所有表达RSV F蛋白的其它rB/HPIV3载体。
图2A和2B。RSV F蛋白中HEK指派的存在导致与非HEK F蛋白相比蛋白质表达升高和蛋白质三聚体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率降低。于32℃以10TCID50的MOI用表达HEK或非HEK RSV F的载体(来自GA优化的ORF，显示于图1)感染Vero细胞。在感染后48小时制备细胞裂解物。在煮沸并还原后(A)或在没有煮沸和还原的情况下(B)通过电泳分析等量的细胞裂解物。用商品化RSV F特异性小鼠单克隆抗体检测变性且还原的RSV F单体(A)。用通过重复免疫接种蔗糖纯化的RSV颗粒在家兔中生成的多克隆抗体检测天然RSV F三聚体(B)。
图3A和3B。感染有表达非HEK或HEK RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的Vero细胞单层中合胞体的形成。于32℃以10TCID50的MOI用表达具有(A)非HEK或(B)HEK指派的GA密码子优化的RSV F的rB/HPIV3(见图1)感染细胞。在感染后48小时获取感染细胞的图像。以短划线轮廓标示代表性合胞体。
图4。表达(为了人表达)通过不同算法密码子优化且含有HEK指派的RSV F ORF的rB/HPIV3载体的构建。使用GA算法(HEK/GA-opt，显示于图1)，DNA2.0算法(HEK/D2-opt)，或GenScript(GS)算法(HEK/GS-opt)为了人密码子选择而优化编码具有HEK指派的RSV F蛋白的ORF。将这些密码子优化的ORF与非HEK，非优化型式的RSV F ORF(non-HEK/non-opt)比较。在与图1中完全相同的位置且与图1中相同的载体信号一起，将这些RSV F ORF插入rB/HPIV3载体。
图5A和5B。RSV F蛋白来自rB/HPIV3载体的体外表达由于HEK指派和密码子优化而升高。通过Western印迹分析评估RSV F在(A)Vero和(B)LLC-MK2细胞中的表达。于32℃以10TCID50的MOI用标示的rB/HPIV3载体感染细胞，并在感染后48小时收获细胞裂解物。将裂解物提交还原和变性条件下的凝胶电泳并通过Western印迹进行分析。蛋白质通过与荧光抗体的反应来显现并通过红外线成像来检测。用总共三个孔每种病毒实施实验。一种对RSVF特异性的单克隆抗体检测未切割的F0前体和已切割的F1亚基。对RSV F1条带强度定量并针对以“1”标示的non-HEK/non-opt样品的条带强度标准化。还测定HPIV3 HN蛋白的表达作为载体蛋白表达的内部对照及确保MOI和复制的等价性；使用β-肌动蛋白作为加载对照。
图6。F ORF的HEK和密码子优化对载体感染的Vero细胞单层中合胞体形成的影响。模拟感染(模拟)细胞或用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或用表达不含HEK且非优化的(non-HEK/non-opt)或含HEK且GA优化的(HEK/GA-opt)或含HEK且DNA2.0优化的(HEK/D2-opt)或含HEK且GS优化的(HEK/GS-opt)RSV F ORF的rB/HPIV3载体感染细胞。于32℃以10TCID50的MOI实施感染并在感染后48小时获取图像。在一些小图中用短划线轮廓标示代表性合胞体。
图7A和7B。自非优化的或密码子优化的ORF表达HEK或非HEK RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的多周期体外复制。于32℃以0.01TCID50的MOI用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或表达不含HEK且非优化的(non-HEK/non-opt)或不含HEK且GA优化的(non-HEK/GA-opt)或含HEK且GA优化的(HEK/GA-opt)或含HEK且GS优化的(HEK/GS-opt)RSV F ORF的载体一式三份感染(A)LLC-MK2和(B)Vero细胞。以24小时间隔收集培养基上清液的小样达6天，于32℃通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法测定病毒滴度，并作为TCID50/ml报告。显示了来自三项独立实验的均值滴度±SEM。
图8A和8B。自非优化的或密码子优化的ORF表达HEK或非HEK RSV F蛋白的rB/HPIV3载体在仓鼠中的复制。在0.1ml接种体中用105TCID50标示的rB/HPIV3载体或106PFUwt RSV(A2株)鼻内(IN)感染金黄色叙利亚仓鼠。在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死(n＝6每种病毒每天)，取出(A)鼻甲和(B)肺，匀浆，并于32℃通过LLC-MK2(rB/HPIV3载体)或Vero(RSV)细胞上的有限稀释测定病毒滴度：空心和实心圆形分别标示在第3和5天处死的动物的滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且分别以虚和实水平线标示在第3和5天每个组的均值滴度。检测限度(LOD)为1.5log10TCID50/g组织，以短划线标示。通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法滴定rB/HPIV3载体并作为TCID50/g报告；通过Vero细胞上的噬斑测定法滴定RSV并作为PFU/g报告。
图9。来自感染有自非优化的或密码子优化的ORF表达HEK或非HEK RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的仓鼠的血清RSV中和性抗体滴度。在0.1ml接种体中给仓鼠(n＝6只动物每种病毒)IN接种105TCID50标示的rB/HPIV3载体或106PFU wt RSV。在免疫接种后28天收集血清样品，并通过使用于32℃在豚鼠补体存在下在Vero细胞上实施的60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定RSV中和性抗体滴度。每一个符号代表一只个别动物。每个柱的高度代表每个组的均值滴度。均值滴度的值显示于柱的上方。通过水平线显示均值的标准误差。中和测定法的检测限度为5.3倒数log2PRNT60，以点线标示。
图10A和10B。免疫接种仓鼠针对RSV攻击的保护。在免疫接种后第31天在0.1ml接种体中用106PFU wt RSV IN攻击如图9中所示用标示的rB/HPIV3载体或用wt RSV免疫接种的仓鼠(n＝6只动物每种病毒)。在攻击后第3天，对仓鼠处以安乐死并收集(A)鼻甲和(B)肺。通过Vero细胞中的噬斑测定法测定组织匀浆物中的RSV滴度。每一个符号代表一只个别动物，而以水平线显示各组的均值病毒滴度。测定法的检测限度为log10 2.7PFU/g组织，以短划线标示。
图11。表达分泌型(Ecto)，融合后，和稳定化融合前形式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的构建。这些已修饰蛋白质均含有HEK指派且自(为了人表达)GA优化的ORF表达。注释：S，信号序列；p27，通过切割-活化释放的27k蛋白片段；FP，融合肽；TM，跨膜；CT，胞质尾。HEK/GA-opt构建物表达全长RSV F。外域或“ecto”形式由RSV F蛋白的氨基酸1-513组成；它缺少CT和TM锚且会是分泌可得的。“融合后”形式通过自融合肽的N末端进一步删除头10个氨基酸(FP；137-146aa)而衍生自外域(1-513aa)(McLellan et al,2011,J Virol 85:7788-96)。“DS”和“DS-Cav1”是两种型式的全长RSV F蛋白，通过S155C/S290C突变(DS)或通过DS和S190F/V207L(Cav1)突变而稳定化于融合前形式(McLellan et al,2013,Science342:931)。在图1和4中描述的相同位置中且与图1和4中描述的相同载体信号一起将编码这些各种各样形式的RSV F的ORF插入rB/HPIV3载体。
图12A和12B。表达分泌型，融合后，和稳定化融合前形式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的多周期体外复制。以0.01TCID50的MOI用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或用标示的构建物感染(A)LLC-MK2和(B)Vero细胞：HEK/GA-opt；Ecto；融合后；和DS(描述见图11)。如下测定于32℃6天时间段期间的病毒复制，即以24小时间隔收集培养基上清液样品并通过LLC-MK2细胞上的有限稀释实施病毒滴定。突变蛋白的图见图11。星号*指示所有这些RSV F构建物是含HEK且GA优化的。
图13A和13B。分泌型(Ecto)，融合后，和稳定化融合前形式的RSV F蛋白来自rB/HPIV3载体的体外表达。以10TCID50的MOI用标示的rB/HPIV3载体或以10PFU的MOI用wt RSV感染Vero细胞。将感染细胞于(A)32℃或(B)37℃温育48小时。收获用表达融合后，Ecto，或HEK/GA-opt的rB/HPIV3载体，或用wt RSV感染的细胞的(A)培养基上清液和裂解物，和用具有non-HEK/non-opt，HEK/GA-opt，DS，或DS-Cav1形式的RSV F的rB/HPIV3载体感染的细胞的(B)裂解物，并通过Western印迹分析RSV F表达。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是GA优化的。
图14A和14B。表达分泌型(Ecto)，融合后，和稳定化融合前形式的RSVF蛋白的rB/HPIV3载体在仓鼠中的复制。在0.1ml接种体中用105TCID50标示的rB/HPIV3载体或106PFUwt RSV IN感染仓鼠。在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死(n＝6每种病毒每天)，取出(A)鼻甲和(B)肺，匀浆，并于32℃通过LLC-MK2细胞(rB/HPIV3载体s)或Vero(RSV)细胞上的有限稀释测定病毒滴度：空心和实心圆形分别标示在第3和5天处死的动物的滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且分别以虚或实水平线标示在第3和5天每个组的均值滴度。第5天滴度的均值显示于顶部。通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法滴定rB/HPIV3载体并作为TCID50/g报告；通过Vero细胞上的噬斑测定法滴定RSV并作为PFU/g报告。检测限度(LOD)为1.5log10TCID50/g组织，以点线标示。通过Tukey-Kramer检验确定峰滴度之间差异的统计学显著性并以星号标示；*，P≤0.05；**，P≤0.01；或***，P≤0.001。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA优化的。
图15A和15B。来自表达分泌型(Ecto)，融合后，和稳定化融合前形式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体感染的仓鼠的血清RSV中和性抗体滴度。在0.1ml接种体中给仓鼠(n＝6只动物每种病毒)IN接种105TCID50标示的rB/HPIV3载体或106PFU wt RSV。在免疫接种后28天收集血清样品，并通过于32℃在(A)有和(B)没有添加豚鼠补体的情况下在Vero细胞上实施的60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定RSV中和性抗体滴度。每个柱的高度代表均值滴度。均值滴度的值显示于柱的上方。通过水平线显示均值的标准误差。以点线标示中和测定法的检测限度。ND表示中和滴度在检测限度以下。通过Tukey-Kramer检验确定各组间差异的统计学显著性并以星号标示；*，P≤0.05；**，P≤0.01；或***，P≤0.001；或ns，P＞0.05。
图16A和16B。免疫接种仓鼠针对RSV攻击的保护。在免疫接种后第31天在0.1ml接种体中用106PFU wt RSV IN攻击如图15中所示免疫接种的仓鼠(n＝6只动物每种病毒)。在攻击后第3天，对仓鼠处以安乐死并收集(A)鼻甲和(B)肺。于32℃通过Vero细胞中的噬斑测定法测定组织匀浆物中的RSV滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且以水平线显示各组的均值病毒滴度。测定法的检测限度为log102.7PFU/g组织，以点线标示。
图17A和17B。表达试图提高掺入载体颗粒而改造的型式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的构建。(A)F蛋白的结构。(B)RSV F蛋白(氨基酸指派为黑体)和BPIV3 F蛋白(粗体)的外域的胞质尾(CT)，跨膜(TM)域，和毗邻区的序列，标示了氨基酸序列位置。这些已修饰蛋白均含有HEK指派且自GA优化的ORF表达。HEK/GA-opt构建物表达全长RSV F蛋白。“B3CT”中RSV F蛋白的CT(氨基酸序列位置551-574)用BPIV3 F蛋白的CT(位置515-540，粗体)替换。“B3TMCT”中RSV F蛋白的TM和CT二者(位置530-574)用BPIV3 F蛋白的TM和CT(位置494-540，粗体)替换。“DS/B3CT”，“DS/B3TMCT”，“DS-Cav1/B3CT”，和“DS-Cav1/B3TMCT”是含有设计成稳定化融合前构象的DS或DS-Cav1突变的型式的B3CT和B3TMCT。在图1，4，和11中描述的相同位置中且与图1，4，和11中描述的相同载体信号一起将编码这些各种各样形式的RSVF蛋白的ORF插入rB/HPIV3载体。
图18A和18B。B3CT和B3TMCT型式的RSV F蛋白掺入rB/HPIV3载体颗粒。于32℃以0.01TCID50的MOI用标示rB/HPIV3载体感染LLC-MK2细胞。感染后6-7天收获培养基上清液，通过低速离心澄清，并提交10％-30％蔗糖梯度上的离心以获得部分纯化的载体颗粒。以0.01PFU的MOI用wt RSV感染另外的Vero细胞并以相同方式加工。通过标准商业性试剂盒测定蔗糖纯化的制备物的蛋白质浓度。(A)RSV F蛋白包装入rB/HPIV3颗粒的效率的Western印迹评估。为了比较颗粒中RSV F的相对量，裂解0.5μg蔗糖纯化的颗粒，变性，还原并提交Western印迹分析。对载体颗粒的HPIV3 HN和BPIV3 N蛋白定量用于比较。(B)通过将其条带强度针对BPIV3 N蛋白标准化来计算每一种形式的RSV F包装入其各自载体颗粒的效率。道的次序与A部分相同。相对于设为“1”的天然F蛋白显示各种形式的RSV F的包装效率。B3CT和B3TMCT形式的RSV F包装入载体颗粒的效率判断为与RSV F包装入RSV颗粒的效率相似，因为已修饰RSV F蛋白每0.5μg载体颗粒的量(3，4，6，7道)与天然RSV F蛋白每0.5μg RSV颗粒的量(5道)相似。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。
图19A-19F。B3CT和B3TMCT型式的RSV F蛋白掺入rB/HPIV3颗粒通过透射电子显微术(TEM)的显现。用RSV F特异性鼠单克隆抗体和用6nm金颗粒标记的小鼠IgG特异性二抗标记蔗糖纯化的病毒。用TEM显现病毒粒体和金颗粒。显示了(A)RSV，(B)空rB/HPIV3载体(空B/H3)，(C)表达HEK/GA-opt的载体，(D)表达B3CT的载体，(E)表达B3TMCT的载体，和(F)表达DS/B3TMCT的载体的代表性图像。箭指向HEK/GA-opt病毒粒体中的零星金颗粒(C)。实质性更大量的与载体颗粒相关的金颗粒在D，E，和F中是明显的。
图20A和20B。表达B3CT和B3TMCT型式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的多周期体外复制。于32℃以0.01TCID50的MOI用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或表达HEK/GA-opt，或B3CT(上部小图)，或B3TMCT(上部小图)，或DS/B3CT(下部小图)或DS/B3TMCT(下部小图)的载体感染(A)LLC-MK2和(B)Vero细胞。以24小时间隔收集培养基上清液的小样，于32℃通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法测定病毒滴度，并作为TCID50/ml报告。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化。测定法中的感染复数为0.01。
图21A和21B。有或无稳定化融合前形式的RSV F蛋白的DS或DS-Cav1突变的B3CT和B3TMCT型式的RSV F蛋白的体外表达。(A)B3CT和B3TMCT；和(B)DS和DS-Cav1与B3CT和B3TMCT的组合的表达。以10TCID50的MOI用标示的rB/HPIV3载体，或以10PFU的MOI用RSV感染Vero细胞。将感染细胞于(A)32℃或(B)37℃温育48小时。通过Western印迹对细胞裂解物分析RSV F表达。使用HPIV3 HN蛋白作为对照来显示载体复制的等价性；使用GAPDH作为加载对照。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。
图22。表达有或无稳定化融合前形式的RSV F蛋白的DS突变的B3CT或B3TMCT型式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体感染的Vero细胞单层中合胞体的形成。以10TCID50的MOI用表达标示型式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体感染Vero细胞并于32℃温育。在感染后48小时获取图像。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。
图23A和23B。表达有或无稳定化融合前形式的RSV F蛋白的DS突变的B3CT或B3TMCT型式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体在仓鼠中的复制。在0.1ml接种体中用105TCID50rB/HPIV3载体或106PFU wt RSV IN感染仓鼠。在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死(6只每种病毒每天)，取出(A)鼻甲和(B)肺，匀浆，并于32℃通过LLC-MK2(rB/HPIV3载体)或Vero(RSV)细胞上的有限稀释测定病毒滴度：空心和实心圆形分别标示在第3和5天处死的动物的滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且分别以虚或实水平线标示在第3和5天每个组的均值滴度。第5天滴度的均值显示于顶部。通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法滴定rB/HPIV3载体并作为TCID50/g报告；通过Vero细胞上的噬斑测定法滴定RSV并作为PFU/g报告。检测限度(LOD)为1.5log10TCID50/g组织，以点线标示。通过Tukey-Kramer检验确定峰滴度之间差异的统计学显著性并以星号标示(*，P≤0.05；**，P≤0.01；或***，P≤0.001)。沿着x轴以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。没有检查含有DS-Cav1修饰的构建物，因为它们在这项实验时不可得。
图24A和24B。来自表达有或无稳定化融合前形式的RSV F蛋白的DS突变的B3CT或B3TMCT型式的RSV F蛋白的rB/HPIV3载体感染的仓鼠的血清RSV中和性抗体滴度。在0.1ml接种体中给仓鼠(n＝6只动物每种病毒)IN接种105TCID50标示rB/HPIV3载体或106PFU wtRSV。在免疫接种后28天收集血清样品，并在有(A)或无(B)添加豚鼠补体的情况下通过60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定抗体滴度。每个柱的高度代表均值滴度，连同SEM显示。均值滴度的值显示于柱的上方。中和测定法的检测限度以点线标示。通过Tukey-Kramer检验确定均值滴度的差异的统计学显著性并以星号标示(*，P≤0.05；**，P≤0.01；ns，P≥0.05)。ND，中和滴度在检测限度以下。沿着x轴以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。
图25A和25B。免疫接种仓鼠针对RSV攻击的保护。在免疫接种后第31天在0.1ml接种体中用106PFU wt RSV IN攻击如图24中所示免疫接种的仓鼠(n＝6只动物每种病毒)。在攻击后第3天，对仓鼠处以安乐死并收集(A)鼻甲和(B)肺。于32℃通过Vero细胞中的噬斑测定法测定组织匀浆物中的RSV滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且以水平线显示各组的均值病毒滴度。测定法的检测限度为log102.7PFU/g组织，以点线标示。
图26。在仓鼠中复制期间RSV F通过rB/HPIV3载体表达的稳定性。通过直接自组织匀浆物回收的载体的双重染色噬斑测定法测定在免疫接种后第3和5天鼻甲和肺中回收的表达RSV F的载体的百分比。表述个别动物的结果。标示了所测试的标本中表达RSV F蛋白的rB/HPIV3的百分比。100％表达RSVF蛋白的标本着黄色；90-99％表达RSV F的标本着绿色；80-89％表达RSV F的标本着橙色；少于79％表达RSV F的标本着红色。由于低滴度而不生成噬斑的标本标注“NA”。如果样品生成的噬斑的总数少于10，那么噬斑的数目在括号中记录为“p＝X”(X等于噬斑的数目)。
图27。B/HPIV3载体的温度敏感性表型。对标示的载体评估于标示的温度在LLC-MK2细胞上形成噬斑的能力。噬斑形成降低≥100倍指示温度敏感性。以粗体，下划线标示每一种病毒的最低的此类限制性温度，称作关闭温度。
图28。在非人灵长动物(恒河猴)中对rB/HPIV3构建物评估减毒和免疫原性。恒河猴通过组合的IN和气管内路径感染106TCID50每个部位下述构建物：non-HEK/non-opt；HEK/GA-opt/DS；和HEK/GA-opt/DS/B3TMCT，分别以5，5和4只动物的组。
图29A和29B。rB/HPIV3载体在恒河猴中的复制。如图28中所述用标示的rB/HPIV3载体感染恒河猴。通过在标示的日子收集(A)鼻咽拭样和(B)气管灌洗液并通过有限稀释测定法测定病毒滴度来评估呼吸道中的载体复制。检测限度为1.2log10TCID50/mL，以点线显示。
图30。由rB/HPIV3载体诱导的血清HPIV3中和性抗体滴度。在免疫接种后0，14，21，28，35和56天收集猴血清并在添加的豚鼠补体存在下通过60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定HPIV3中和性抗体滴度。中和测定法的检测限度以点线标示。标示了RSV攻击的日子。
图31和32。由rB/HPIV3载体诱导的血清RSV中和性抗体滴度。在免疫接种后0，14，21，28，35和56天收集猴血清。(图31)在添加的豚鼠补体存在下通过60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定所有时间点时的RSV中和性抗体滴度。(图32)在添加的补体缺失下通过60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定免疫接种后第28天时的RSV中和性抗体滴度。中和测定法的检测限度以点线标示。通过Tukey-Kramer检验确定均值滴度的差异的统计学显著性并以星号标示(**，P≤0.01；***，P≤0.001)。标示RSV攻击的日子。
图33。在恒河猴中复制期间RSV F通过rB/HPIV3载体表达的稳定性。通过双重染色噬斑测定法测定来自免疫接种后第4，5和6天的鼻咽拭样中回收的表达RSV F的载体的百分比。标示了所测试的标本中表达RSV F的rB/HPIV3的百分比。100％病毒表达RSV F的标本着黄色；99-90％病毒表达RSV F的标本着绿色；由于低滴度而不生成噬斑的标本标注“NA”。
图34。表达含有C端“折叠子”序列的分泌型型式的HEK/GS-opt/DS-Cav1 RSV F蛋白的rB/HPIV3载体的构建。将含有HEK指派且自具有DS-Cav1突变的(为了人表达)GS密码子优化的ORF表达的RSV F蛋白改造成含有F蛋白的N端513个氨基酸(即缺少TM和CT域)，融合至标示的4个氨基酸的接头和标示是来自T4噬菌体的27个氨基酸的折叠子序列(SEQ IDNO：132，参见Efimov et al.1994,J MolBiol 242:470-486；Miroshnikov et al1998Protein Eng.11:329-332)。在图1，4，11，和17中描述的相同位置且与图1，4，11，和17中描述的相同载体信号一起将ORF插入rB/HPIV3载体。
图35。例示性的表达RSV F的rB/HPIV3载体的汇总，注释指示已经在实施例1的仓鼠中的两项不同研究及恒河猴中的两项不同研究中评估的构建物。
图36。在第一(F1)，第二(F2)，或第三(F3)基因组位置处含有RSV F基因插入物的HPIV1 CD170和LY942A突变体的反基因组cDNA的构建。用于RSV F表达的rHPIV1主链含有两处减毒突变任一：即P/C基因中的CD170突变(以*标示)或L基因中的LY942A突变(以·标示)。对于HPIV1-F1构建物，在HPIV1 N基因前面的第一基因组位置处插入RSV F基因，在位于N基因的非翻译区上游的MluI位点。在HPIV1-F2的情况中，在HPIV1 N和P基因之间插入RSV F基因，在位于P基因的非翻译区上游的AscI位点。对于HPIV1-F3，在HPIV1 P和M基因之间克隆RSVF基因，在位于P基因的非翻译区下游的NotI位点。对于所有构建物，RSV F ORF是为了人表达而密码子优化的且含有HEK氨基酸指派。在RSV F插入物后面(F1，F2)或前面(F3)添加一个拷贝的N基因终点(GE)，基因间(IG)CTT三联体，和P基因起点(GS)序列，使得它在一组HPIV1转录信号控制下。SEQ ID NO：138-140的序列显示在HPIV1-F1下在RSV F插入物侧翼；SEQ ID NO：141-143的序列显示在HPIV1-F2下在RSV F插入物侧翼；而SEQ ID NO：144-145的序列显示在HPIV1-F3下在RSV F插入物侧翼。
图37A-37D。HPIV1/RSV-F病毒在Vero(图37A和37C)和LLC-MK2(图37B和37D)细胞中的多步复制。以0.01TCID50的MOI用表达RSV F(F1，F2，或F3)的HPIV1 CΔ170(A和B)或LY942A(C和D)病毒，平行地用wt HPIV1，HPIV1 LY942A，和HPIV1 CΔ170感染6孔板中一式三份孔的细胞单层。于32℃温育培养物。以24小时间隔收集细胞培养物培养基的小样并于32℃通过LLC-MK2细胞上的连续稀释和血细胞吸附测定法测定病毒滴度(log10TCID50/ml)。显示了均值滴度及均值的标准误差(SEM)。使用单向ANOVA及Tukey氏多重比较检验确定感染后第2天每一种病毒的滴度较之wt HPIVZ之间的差异的统计学显著性并如下以星号标示：*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；****，p<0.0001。
图38A-38C。通过Western印迹分析RSV F和HPIV1载体蛋白表达。以5的MOI用标示的病毒感染Vero细胞。在感染后48小时，用SDS样品缓冲液裂解细胞。将所有样品变性，还原，并提交SDS-PAGE和Western印迹。将蛋白质转移到PVDF膜上并用RSV F特异性小鼠单克隆抗体或HPIV1N-，P-，HN-，或F特异性多克隆抗体(通过分开给家兔免疫接种代表相应蛋白的合成肽而生成)任一探查。(A)使用对应的缀合有红外线染料的抗小鼠(IRDye 680LT)和抗家兔(IRDye 800CW)抗体显现结合的抗体。使用Odyssey红外线成像系统通过扫描印迹获取图像。所显示的图像来自代表三次独立实验的一次实验。(B和C)对三项独立实验对rHPIV1 CΔ170(B)和rHPIV1 LY942A(C)构建物的蛋白质条带的强度定量，而且相对于设为1.0的F3病毒显示表达。图以来自三项独立实验的均值±SEM显示数据，通过单向ANOVA及Dunnett多重比较检验分析，使用95％置信区间。将HPIV1蛋白通过F1，F2和F3病毒的表达在统计学上与它们对应的空载体主链比较。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图39A-39I。表达RSV F的rHPIV1载体感染的LLC-MK2细胞单层上细胞病变效应和合胞体的形成。以0.01TCID50的MOI感染MK2细胞，温育5天，并用光学显微镜使用相衬以40X放大倍数获取图像。显示了(A)rHPIV1 CΔ170-F1；(B)rHPIV1 CΔ170-F2；(C)rHPIV1 CΔ170-F3；(D)rHPIV1 CΔ170；(E)rHPIV1 LY942A-F1；(F)rHPIV1 LY942A-F2；(G)rHPIV1 LY942A-F3；(H)rHPIV1 LY942A；和(I)wt HPIV1的显微照片。
图40A和40B。表达RSV F的HPIV1载体在仓鼠的鼻甲(图40A)和肺(图40B)中的复制。给仓鼠鼻内接种105TCID50wt HPIV1，rHPIV1 CD170或rHPIV1 LY942A空载体，自三个基因组位置(F1，F2，或F3)表达RSV F的rHPIV1 CD170或rHPIV1 LY942A，rHPIV1-CR84GCD170HN553ALY942A(一种先前描述的HPIV1疫苗候选(Bartlett et al 2007Virol J 4:6))，或rB/HPIV3-F2，自第2位置表达RSV F的嵌合牛/人PIV3(也称作HEK/GA-opt，见图1)。在LLC-MK2细胞中通过血细胞吸附测定法测定病毒滴度并作为Log10TCID50/g组织报告。显示了在第3天(Δ)和第5天(·)个别动物(6只每组)的滴度，每一个符号代表一只个别动物。显示了在第3天(粗体)和第5天(斜体)每个组的均值。检测限度(LOD)为1.5log10TCID50/ml，以穿过每幅图底部的点线标示。使用Tukey氏多重比较检验以95％置信区间通过单向ANOVA确定在感染后第3天和第5天每一种病毒较之wt HPIV1(红色星号)或较之rB/HPIV3-F2(顶部的柱)之间的差异的统计学显著性。*，p≤0.05；***，p≤0.001；****，p≤0.0001；或ns，不显著。
图41A和41B。免疫接种仓鼠的鼻甲(图41A)和肺(图41B)中针对wt RSV攻击病毒复制的保护。在免疫接种后30天用106PFU wt RSV A2鼻内攻击每个组中的仓鼠(n＝6)。在攻击后第3天自处以安乐死的动物收集鼻甲和肺，对通过Vero细胞上的RSV特异性噬斑测定法每一份样品测定病毒滴度，并作为Log10PFU/g组织报告。以粗体数值和水平柱显示每个组的均值。使用Tukey氏多重比较检验以95％置信区间通过单向ANOVA确定病毒间的差异的统计学显著性并标示*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.0001；或ns，不显著。
图42显示表，说明在HPIV1主链中在P/C或L ORF中引入的减毒突变。wt序列中的核苷酸变化(删除或替代)标有下划线。
图43显示表，说明重组病毒在LLC-MK2细胞单层上的温度敏感性。对于温度敏感性，标有下划线的粗体值标示病毒关闭温度，指示以病毒滴度于给定温度较之32℃的均值log10降低比wt rHPIV1于相同的两个温度的降低大2.0log10或更多的最低限制性温度定义的温度敏感性表型。对于单层，将每一种标示的病毒的连续稀释液在LLC-MK2细胞上于多个温度温育7天。通过豚鼠红细胞的血细胞吸附测定病毒滴度并作为Log10TCID50/ml报告，检测限度为1.2。
图44显示表，说明在体内复制后表达RSV F的病毒群体的百分比。通过免疫荧光双重染色噬斑测定法测定在体内复制后表达RSV F的病毒群体的百分比(稳定性)。用连续稀释的在感染后第3和5天收集的感染仓鼠(n＝6只每种病毒)的鼻甲或肺的组织匀浆物感染Vero细胞(总共144份样品)，并在甲基纤维素覆盖下温育6天。用小鼠单克隆抗RSV F和山羊多克隆抗HPIV1特异性抗体对病毒噬斑染色，接着用对应的红外线染料缀合的二抗检测。显示了表达RSV F和HPIV1抗原二者的噬斑的百分比。由于它们在这些组织中缺少复制，未能测试肺样品中HPIV1 CD170-F1，-F2，和F3及URT和肺中HPIV1 LY942A-F1，-F2，和F3的稳定性。括号中的数值标示每种病毒总共6只仓鼠中该RSV F表达状态的仓鼠的数目。ND，没有检测到噬斑。
图45显示表，列出结果，指示给仓鼠免疫接种表达RSV F的rHPIV1诱导针对RSV的血清中和性抗体。在0.1ml接种体中给多组6周龄仓鼠(n＝6)鼻内免疫接种105TCID50每一种标示的病毒。在免疫接种前及在免疫接种后28天收集血清样品。使用表达绿色荧光蛋白(GFP)或增强型GFP(eGFP)的病毒(rRSV-eGFPM或HPIV1-GFP)通过使用60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定针对RSV和HPIV1的抗体滴度，而且中和性抗体滴度以均值倒数log2±SE呈现。基于测定法中使用的初始血清稀释度，PRNT60测定法对RSV和HPIV1分别具有3.3和1.0倒数log2PRNT60的滴度检测限度。通过单向ANOVA及Tukey氏多重比较检验确定RSV抗体滴度在各组间的差异的统计学显著性(p<0.05)，并通过不配对t检验确定HPIV1抗体滴度在各组间的差异的统计学显著性。将均值中和性抗体滴度以组归类(在括号中标示A，B，C，和D)。具有不同字母的处理组的均值抗体滴度在统计学上彼此不同；标示两个字母表示的滴度与任一字母标示的滴度在统计学上没有差异。
图46和47。表达具有DS-Cav1突变的GA优化的(GA-opt)融合前形式的RSV F的rB/HPIV3载体的多周期体外复制。于32℃以0.01TCID50的MOI用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或表达含HEK，GA-opt，且含有DS-Cav1融合前稳定化突变的(HEK/GA-opt/DS-Cav1)或含HEK，GA-opt，且含有DS-Cav1突变和BPIV3特异性TM和CT域作为潜在包装信号(HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT)的RSV F ORF的载体一式三份感染(图46)Vero和(图47)LLC-MK2细胞。以24小时间隔收集培养基上清液的小样达6天，于32℃通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法测定病毒滴度，并作为TCID50/ml报告。显示了来自三项独立实验的均值滴度±SEM。
图48A和48B。表达具有不同修饰的GS优化的(GS-opt)RSV F的rB/HPIV3载体的多周期体外复制。于32℃以0.01TCID50的MOI用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或表达含HEK且GS-opt RSV F(HEK/GS-opt)，或含HEK，GS-opt且携带DS-Cav1融合前稳定化突变(HEK/GS-opt/DS-Cav1)，或含HEK，GS-opt，且携带DS-Cav1突变和BPIV3特异性TM和CT域(HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT)，或截短型RSV F氨基酸1至513融合至4个氨基酸的接头和来自T4噬菌体的27个氨基酸的寡聚化序列，含HEK，GS-opt且携带DS-Cav1突变(HEK/GS-opt/DS-Cav1/(1-513)折叠子)的RSV F ORF的载体一式三份感染(A)Vero和(B)LLC-MK2细胞。以24小时间隔收集培养基上清液的小样达6天，于32℃通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法测定病毒滴度，并作为TCID50/ml报告。显示了来自三项独立实验的均值滴度±SEM。
图49A-49D。表达GS-opt和GA-opt RSV F的rB/HPIV3载体的多周期体外复制的比较。图49A和49B：于32℃以0.01TCID50的MOI用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或表达含HEK，GS-opt，且携带该DS-Cav1突变(HEK/GS-opt/DS-Cav1)，或含HEK，GA-opt，且携带DS-Cav1突变(HEK/GA-opt/DS-Cav1)的RSV F ORF的载体一式三份感染(A)Vero和(B)LLC-MK2细胞。图49C和49D：于32℃以0.01TCID50的MOI用空rB/HPIV3载体(空B/H3)或表达含HEK，GS-opt，且携带DS-Cav1和B3TMCT修饰(HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT)，或含HEK，GA-opt，且含有DS-Cav1和B3TMCT修饰(HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT)的RSV F ORF的载体感染(C)Vero和(D)LLC-MK2细胞。以24小时间隔收集培养基上清液的小样达6天，于32℃通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法测定病毒滴度，并作为TCID50/ml报告。显示了来自三项独立实验的均值滴度±SEM。
图50A-50C。多种已修饰形式的RSV F在细胞培养物中通过rB/HPIV3载体的表达。以3PFU/细胞的MOI用空rB/HPIV3载体(1道)，或rB/HPIV3载体表达标示的已修饰形式的RSVF(2-5和8道)，或wt RSV(wt RSV，6道)感染(A)Vero和(B，C)LLC-MK2细胞，或不感染(模拟，7道)。感染Vero(A)和LLC-MK2(B)细胞于32℃温育，而LLC-MK2(C)细胞于37℃温育。在感染后48小时收集Vero细胞的细胞裂解物和培养基上清液并提交RSV F表达的Western印迹分析，作为已切割F1和/或未切割F0形式检测。使用BPIV3 N作为载体蛋白表达的内部对照；使用GAPDH作为加载对照。
图51A和51B。rB/HPIV3载体在仓鼠的上和下呼吸道中的复制。在0.1ml接种体中用105TCID50标示的rB/HPIV3载体或106PFU wt RSV IN感染仓鼠。在感染后第4和5天对仓鼠处以安乐死(n＝6只每种病毒每天)，取出(A)鼻甲和(B)肺，匀浆，于32℃通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定病毒滴度，并作为TCID50/g(rB/HPIV3载体)报告，或者于32℃通过Vero细胞上的噬斑测定法测定病毒滴度，并作为PFU/g(wt RSV)报告。检测限度(LOD)为1.5log10TCID50/g组织，以点线标示。空心和实心圆形分别标示在第4和5天处死的个别动物的滴度。分别以虚和实水平线标示在第4和5天每个组的均值滴度。第4和5天均值滴度的值显示于顶部。使用Tukey-Kramer检验第5天的均值病毒滴度指派至不同组：具有不同子母的均值滴度在统计学上不同(p<0.05)，而标示两个字母的滴度与任一字母标示的滴度没有显著差异。
图52和53。来自标示的表达有或无DS或DS-Cav1或B3TMCT修饰的GA-opt或GS-optRSV F蛋白的rB/HPIV3载体感染的仓鼠的血清RSV中和性抗体滴度。在0.1ml接种体中给仓鼠(n＝6只动物每种病毒)IN接种105TCID50标示的rB/HPIV3载体或106PFU wt RSV。在免疫接种后28天收集血清样品，和在有(图52)或无(图53)添加豚鼠补体的情况下通过60％噬斑减少中和测试(PRNT60)测定抗体滴度。每个柱的高度代表均值滴度，连同SEM显示。均值滴度的值显示于柱的上方。使用成对Student t检验来评估各数值之间的差异的统计学显著性：在均值滴度上的三条水平线每一条中，将以垂直柱标示的值彼此成对比较并记录为显著不同(*，p<0.05)或并非显著不同(ns)。中和测定法的检测限度以点线标示。ND，中和滴度在检测限度以下。
图54A和54B。免疫接种标示的rB/HPIV3载体的仓鼠针对RSV攻击的保护。在免疫接种后30天在0.1ml接种体中用106PFU wt RSVIN攻击如图53中所示免疫接种的仓鼠(n＝6只动物每个免疫接种组)。在攻击后第3天，对仓鼠处以安乐死并收集(A)鼻甲和(B)肺。于37℃通过Vero细胞中的噬斑测定法测定组织匀浆物中的RSV滴度。每一个符号代表一只个别动物，各组的病毒滴度的均值显示在符号的上方，以短水平线标示。使用成对Student t检验来评估各数值之间的差异的统计学显著性：在均值滴度上的每一条水平线中，将以垂直柱标示的值彼此成对比较并记录为显著不同(*，p<0.05)或并非显著不同(ns)。测定法的检测限度为log101.7PFU/g组织，以点线标示。
图55。在非人灵长动物(恒河猴)中对rB/HPIV3构建物评估减毒和免疫原性。恒河猴通过组合的IN和气管内路径感染106TCID50每个部位下述构建物：HEK/GA-opt/DS/B3TMCT；HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT；和HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT，分别以4，6和6只动物的组。
图56A和56B。rB/HPIV3载体在恒河猴中的复制。用图55中标示的rB/HPIV3载体感染恒河猴。通过在标示的日子收集(A)鼻咽拭样和(B)气管灌洗液并通过有限稀释测定法测定病毒滴度来评估呼吸道中的载体复制。检测限度为1.2log10TCID50/mL，以点线显示。
图57A和57B。由rB/HPIV3载体诱导的血清RSV中和性抗体滴度。自图55和56中显示的实验，在免疫接种后0，14，21，和28天收集血清。图57A：在添加的豚鼠补体存在下通过60％噬斑减少中和检验(PRNT60)测定标示的时间点时的RSV中和性抗体滴度。通过成对Student t检验确定每个时间点时均值滴度的差异的统计学显著性(ns，P＞0.05)。图57A：在添加的补体缺失下通过PRNT60测定免疫接种后第28天时的RSV中和性抗体滴度。中和测定法的检测限度以点线标示。通过成对Student t检验确定每个时间点时均值滴度的差异的统计学显著性(ns，P＞0.05)。
图58A和58B。自N前位置表达HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT的rB/HPIV3载体的构建，及HPIV3 HN蛋白的氨基酸序列的修饰以实现载体的表型稳定性升高。图58A：HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT插入物插入rB/HPIV3的第一基因位置。图58A：赋予表型稳定性升高的HPIV3 HN基因修正。通过反求遗传学生成的原始重组HPIV3(Durbin et al Virology 235:323-332,1997)中的HN基因具有HN基因中的两处工程化核苷酸替代，在反基因组位置7913和7915，导致氨基酸替代P370T，和一处偶然突变，在反基因组位置7593，导致氨基酸替代T263I。在这里，将这些突变变回“野生型”指派，即在生物学衍生HPIV3株JS中找到的(Genbank Z11575.1；Stokes et al Virus Res 25:91-103,1992)。
图59A和59B。RSV F和载体蛋白通过表达第一基因位置(N前)或第二基因位置(N-P)中各种型式的RSV F蛋白的载体的细胞内表达。rB/HPIV3-wt HN-HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT/pre-N，图58A中示意的构建物的分析。用空rB/HPIV3载体(空B/H3，1道)，或wtHN/HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT/pre-N构建物(集合CL20a，CL24a，3和4道)，或相同型式的RSVF插入第二(N-P)位置的载体(HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT/N-P，5道)，或non-HEK/non-opt型式的RSV F插入N前位置的载体(6道)，或wt RSV(2道)，或模拟(7道)感染Vero(图59A)和LLC-MK2(图59B)细胞。以10TCID50/细胞的MOI感染载体，并以3PFU/细胞的MOI感染wt RSV。感染单层于32℃温育。在感染后48小时收集细胞裂解物并提交Western印迹分析。检测已切割F1和/或未切割F0形式的RSV F。使用BPIV3 N和P蛋白来评估对载体蛋白表达的影响。使用GAPDH作为加载对照。
图60。HPIV1载体：RSV F蛋白(A2株，氨基酸指派)和HPIV1F蛋白(粗体)的外域的胞质尾(CT)，跨膜(TM)域，和毗邻区的序列，标示了氨基酸序列位置。RSV-F-TMCT是一种嵌合蛋白，由RSV F蛋白的外域附着至HPIV1 F蛋白的TM和CT域组成。
图61和62。表达设计成稳定化于融合前构象(DS-Cav1)及提高掺入HPIV1载体颗粒的型式的RSV F蛋白的HPIV1-CΔ170载体的构建。这些已修饰RSV F插入物均含有HEK指派(HEK)且是为了人表达通过GS密码子优化的(GS-opt)。通过DS和Cav1突变(DS-Cav1)本身(图61和62中的上部构建物)或伴有它的TMCT域用来自HPIV1F的TMCT域替换的进一步修饰(TMCT，图61和62中的下部构建物)，RSV F插入物改造成稳定化于融合前构象。所得HEK/GS-opt/DS-Cav1和HEK/GS-opt/DS-Cav1/TMCT型式的RSV F通过侧翼序列及在(图61)第一基因位置(MluI位点)或(图62)第二基因位置(AscI位点)插入HPIV1-CΔ170载体(HPIV1载体和CΔ170突变的解释见实施例2)来修饰。在每一种情况中，RSV F在HPIV1转录信号控制下，作为分开的mRNA表达。核苷酸编号方式相对于最终构建物的完整反基因组RNA序列。SEQ ID NO：146和147的序列显示在F1/HEK/GS-opt/DS-Cav1，F1/HEK/GS-opt/DS-Cav1/TMCT，F2/HEK/GS-opt/DS-Cav1，和F2/HEK/GS-opt/DS-Cav1/TMCT的示意图下在RSV F插入物侧翼。
图63。表达无或有来自HPIV1F蛋白的TMCT，稳定化于融合前构象(DS-Cav1)的RSVF的rHPIV1-CΔ170载体在Vero细胞中的多周期生长的动力学。以0.01的MOI用构建物一式三份感染Vero细胞并于32C温育7天。在7天里以24小时间隔收集总共3mL培养物上清液中的0.5mL。收集样品后，对每一份培养物添加0.5mL新鲜培养基以恢复原始体积。通过血细胞吸附测定法在LLC-MK2细胞上实施所收集的样品的病毒滴定并以均值±SEM将数值绘图。
图64。无或有来自HPIV1F蛋白的TMCT的稳定化于融合前构象(DS-Cav1)的RSV F蛋白掺入HPIV1-CΔ170病毒粒体颗粒。使标示的病毒构建物(为了简要，省略名称HEK/GS-opt)在LLC-MK2细胞中生长并通过蔗糖梯度离心来纯化病毒粒体。通过BCA测定法测定纯化的病毒的蛋白质浓度。将1μg来自每一种纯化的病毒的总蛋白质在RIPA裂解缓冲液中裂解，还原，变性，并提交SDS-PAGE和Western印迹分析。分别用小鼠单克隆和家兔多克隆HPIV1肽特异性(N，F，和HN)抗体检测RSV F(顶部小图)和HPIV1蛋白(第二，第三，和第四小图)。使用红外线标记的二抗来检测结合的一抗。2和4道中的嵌合RSV-F-DS-Cav1/TMCT蛋白(第四小图)是可见的，因为对HPIV1F蛋白特异性的抗肽血清是使用含有CT域C端18个氨基酸的合成肽生成的，且因而与携带HPIV1F蛋白TMCT域的RSV F蛋白反应。
图65。无和有来自HPIV1F蛋白的TMCT的稳定化于融合前构象(DS-Cav1)的RSV F蛋白在感染Vero细胞中的表达。以5的MOI给6孔板中的Vero细胞单层接种标示的病毒(为了简要，省略名称HEK/GS-opt)，包括wt HPIV1和rHPIV1-CΔ170空载体对照并于32℃温育48小时。通过在200μL LDS样品缓冲液中裂解单层来制备细胞裂解物。将蛋白质样品还原并变性，并取45μL每一份样品进行电泳，接着将蛋白质转移至PVDF膜。使用与图64中描述相同的一抗和二抗检测RSV F和HPIV1蛋白。
图66。RSV F蛋白(氨基酸指派)和HPIV3 F蛋白(粗体)的外域的胞质尾(CT)，跨膜(TM)域，和毗邻区的序列，标示了氨基酸序列位置。RSV-F-H3TMCT是一种嵌合蛋白，由RSV F蛋白的外域附着至HPIV3 F蛋白的TM和CT域组成。
图67A和67B。表达设计成稳定化于融合前构象(DS-Cav1)及提高掺入rHPIV3载体颗粒的型式的RSV F蛋白的rHPIV3载体的构建。载体是野生型rHPIV3 JS株，其经修饰含有HN蛋白中的263T和370P氨基酸指派(见图58B)，发现它们赋予载体以表型稳定性。另外，通过创建位置103-109处的BlpI位点(A，顶部构建物)，用于在基因位置1中插入RSV F(或可能任何其它插入物)，或创建位置1675-1682处的AscI位点(B，顶部构建物)，用于在基因位置2中插入RSV F来修饰rHPIV3载体。已修饰的RSV F插入物均含有HEK指派(HEK)且是为了人表达而通过GS密码子优化的(GS-opt)。另外，通过DS和Cav1突变(DS Cav1)本身(A和B，第二构建物)或伴有它的TMCT域用来自rHPIV3 F的TMCT域替换的进一步修饰(H3TMCT，A和B，第三构建物)，RSV F插入物改造成稳定化于融合前构象。所得HEK/GS-opt/DS-Cav1和HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT型式的RSV F通过侧翼序列及插入wt rHPIV3 JS的(A)第一基因位置(BlpI位点)或(B)第二基因位置(AscI位点)来修饰。在每一种情况下，RSV F在HPIV3转录信号控制下，作为分开的mRNA表达。核苷酸编号方式相对于最终构建物的完整反基因组RNA序列。SEQ ID NO：148的序列显示于rHPIV3 wt-JS的示意图下。SEQ ID NO：149和150的序列显示在F1/HEK/GS-opt/DS-Cav1，F1/HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT，F2/HEK/GS-opt/DS-Cav1，和F2/HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT的示意图下在RSV F插入物侧翼。
序列表
如37C.F.R.1.822中限定的，所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示的。只显示了每种核酸序列的一条链，但是理解的是通过对所显示的链的任何提交而包括互补链。序列表是作为ASCII文本文件以2016年1月19创建的名为“序列.txt”的文件(～344kb)的形式的提交，通过援引将其收入本文。在所附序列表中：
详述
一项在先研究(Zimmer et al J Virol 2005 79:10467-77)评估了仙台病毒中来自异源基因的RSV F蛋白的表达，仙台病毒是HPIV1的鼠亲戚，而且还与HPIV3紧密相关。该研究显示很少的RSV F蛋白掺入仙台病毒载体颗粒。调查人员将RSV F蛋白的CT或CT加TM用来自仙台F蛋白的对应序列替换，前提是这会改善外来RSV F蛋白与载体颗粒的相互作用的效率。这些修饰确实提高工程化RSV F掺入仙台颗粒，但仅在仙台F蛋白基因也删除的情况中。删除载体F蛋白的要求与生成感染性，减毒病毒供疫苗接种用不相容，而且还会去除认为是生成二价疫苗所需要的载体保护性抗原之一。
如本文中公开的，当由rB/HPIV3，HPIV3，或HPIV1表达时，包括RSV FTM和CT的RSVF蛋白仅以痕量掺入载体颗粒。然而，用异源RSV F蛋白的TM和CT交换副粘病毒F蛋白的对应TM和CT提供了RSV F外域掺入重组副粘病毒包膜的多倍升高，使得RSV F包装入载体与RSV自身相比同样有效(例如B/HPIV3)或更加有效(例如HPIV1)每μg纯化的病毒粒体。这在TM和CT一起交换时或在CT单独交换时是有效的。然而，对单独的CT特异性的嵌合RSV F的融合原性(fusogenicity)升高的出乎意料的效果提供优选TMCT的指导。
RSV F有效包装入载体颗粒剧烈提高当对受试者施用重组副粘病毒时针对外域(携带所有中和表位)的免疫应答的引发。出乎意料地，病毒中和性血清抗体应答在质量上剧烈升高，这是通过比较在补体缺失下(测量强中和性抗体)或在其存在下(提升弱或非中和性抗体的中和)的RSV体外中和活性而评估的。抗体质量中的这种不曾预料到的升高对于RSV是特别重要的，它因诱导不完全免疫保护而被注意到。携带载体糖蛋白的TMCT域的外来糖蛋白的表达和有效包装具有破坏载体复制和形态发生的明显潜力：然而，提供了具有最小限度这种效应的构建物。
为了进一步提高免疫原性，评估了将RSV F蛋白稳定化于融合前构象。融合前稳定化自身还导致强中和性抗体的滴度升高，提示中和表位的稳定化。在仓鼠模型中，融合前稳定化对免疫原性和保护升高的作用看来对TMCT赋予的有效包装的作用是叠加的。然而，当在非人灵长动物中评估时，包装的作用看来比融合前稳定化的作用要更大。
面对实现针对RSV的保护的挑战，想要最大限度的免疫原性。广泛实验揭示了提供升高的RSV F表达和降低的由高融合原性RSV F蛋白介导的合胞体形成的细胞病变效应的载体和插入物构建(例如利用各种插入位点，利用密码子优化，和利用早期传代RSV F蛋白序列)的其它方面。
值得注意的是，通过本公开文本的方法确认了一种基于表达在临床试验中具有令人失望的RSV免疫原性的未修饰RSV F蛋白(Bernstein,et al.2012.PediatricInfectious Disease Journal 31:109-114)的rB/HPIV3的原型疫苗病毒诱导具有较差质量，仅在添加补体存在下拥有体外中和活性的RSV中和性血清抗体。相反，所公开的构建物在非洲绿猴中诱导高滴度的能够在体外在补体缺失下有效中和RSV的血清抗体。
I.术语的汇总
除非另有注释，依照常规用法使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes X,published by Jones&Bartlett Publishers,2009；和Meyers et al.(eds.),The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine,published by Wiley-VCH in 16volumes,2008；和其它类似参考文献中找到。
如本文中使用的，单数形式“一个”，“一种”，和“该”指单数以及复数二者，除非上下文另有清楚指示。例如，术语“一种抗原”包括单数的或复数的抗原，而且可以考虑为等同于短语“至少一种抗原”。如本文中使用的，术语“包含”意味着“包括”。进一步要理解的是，为核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子质量值是近似的，而且是为了描述目的而提供的，除非另有指示。虽然可以使用与本文中描述的那些相似或等同的许多方法和材料，但是本文中描述了特别合适的方法和材料。在抵触的情况中，以本说明书(包括术语的解释)为准。另外，材料，方法，和例子仅仅是例示性的，并非意图是限制性的。为了便于查看各个实施方案，提供了下面的术语的解释：
佐剂：用于增强抗原性的媒介。佐剂包括吸附抗原的矿物(明矾，氢氧化铝，或磷酸盐)的悬浮液；或油包水乳状液，例如抗原溶液在矿物油(弗氏不完全佐剂)中乳化，有时包括杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原降解和/或引起巨噬细胞流入)。也可以使用免疫刺激性寡核苷酸(诸如那些包括CpG基序的)作为佐剂。佐剂包括生物学分子(“生物学佐剂”)，诸如共刺激性分子。例示性佐剂包括IL-2，RANTES，GM-CSF，TNF-α，IFN-γ，G-CSF，LFA-3，CD72，B7-1，B7-2，OX-40L，4-1BBL，免疫刺激性复合物(ISCOM)基质，和toll样受体(TLR)激动剂，诸如TLR-9激动剂，PolyI:C，或PolyICLC。本领域普通技术人员熟悉佐剂(参见例如Singh(ed.)Vaccine Adjuvants and DeliverySystems.Wiley-Interscience,2007)。佐剂可以与所公开的重组体组合使用。
施用：通过所选择的路径将组合物导入受试者。施用可以是局部的或系统的。例如，如果所选择的路径是鼻内，那么通过将组合物导入受试者的鼻通道来施用组合物(诸如包括所公开的重组副粘病毒的组合物)。例示性施用路径包括但不限于口服，注射(诸如皮下，肌肉内，皮内，腹膜内，和静脉内)，舌下，直肠，经皮(例如表面)，鼻内，阴道，和吸入路径。
氨基酸替代：多肽中的一个氨基酸用不同氨基酸或无氨基酸(即删除)替换。在一些例子中，多肽中的氨基酸用来自同源多肽的氨基酸替代，例如，重组A群RSV F多肽中的氨基酸可以用来自B群RSV F多肽的对应氨基酸替代。提及RSV F蛋白中的“66E”氨基酸指在位置66处包含谷氨酸残基的RSV F蛋白。该氨基酸可以是由于来自参照序列的替代而存在的。提及RSV F蛋白中的“K66E”替代指在位置66处包含谷氨酸残基来替代参照(例如天然)序列中的赖氨酸残基的RSV F蛋白。
减毒：“减毒的”或具有“减毒表型”的副粘病毒指在相似感染条件下具有与参照野生型副粘病毒相比降低的毒力的副粘病毒。减毒通常与在相似感染条件下与参照野生型副粘病毒的复制相比降低的病毒复制有关，因而“减毒”和“受限复制”常常同义使用。在一些宿主(典型的是非天然宿主，包括实验动物)中，疾病在所讨论参照副粘病毒感染期间不明显，而且可以使用病毒复制限制作为减毒的代替标志物。在一些实施方案中，减毒的重组副粘病毒(例如RSV，PIV3)展现哺乳动物的上或下呼吸道中的病毒滴度分别与在相同感染条件下相同物种的哺乳动物的上或下呼吸道中的非减毒，野生型病毒滴度相比降低至少约10倍或更多，诸如至少约100倍或更多。哺乳动物的例子包括但不限于人，小鼠，家兔，大鼠，仓鼠，诸如例如金黄仓鼠(Mesocricetus auratus)，和非人灵长动物，诸如例如南非小猴(Ceroptihecus aethiops)。减毒副粘病毒可以展示不同表型，包括但不限于改变的生长，稳定敏感性生长，宿主范围受限生长，或噬斑大小改变。
胞质尾(CT)：跨膜蛋白中包括该蛋白的终端(N或C端任一)并自细胞膜或病毒包膜的胞质表面延伸入细胞或包膜病毒的胞质的连续区。在I型跨膜蛋白的情况中，CT包括该蛋白的C端。在II型跨膜蛋白的情况中，CT包括该蛋白的N端。
简并变体：在本公开文本的上下文中，“简并变体”指编码包括如下序列的多肽的多核苷酸，该序列因遗传代码而是简并的。有20种天然氨基酸，大多数由超过一种密码子来规定。因此，包括编码一种肽的所有简并核苷酸序列，只要由核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列没有变化。
基因：包含RNA转录(无论是mRNA或或者是其它)所必需的控制和编码序列的核酸序列，典型的是DNA序列。例如，基因可以包含启动子，一个或多个增强子或沉默子，编码RNA和/或多肽的核酸序列，下游调节序列和可能的牵涉调节mRNA表达的其它核酸序列。
异源：源自不同遗传来源。重组病毒基因组中包括的异源基因是并非源自该病毒基因组的基因。在一个具体的，非限制性的例子中，编码RSV F蛋白的外域的异源基因包括在重组PIV载体的基因组中。用于导入病毒载体中的异源基因的方法是本领域公知的，而且在本文中也有描述。
宿主细胞：在其中载体能繁殖且其核酸能表达的细胞。细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括主题宿主细胞的任何后代。理解的是，既然可能有复制期间发生的突变，那么所有后代可以不是与亲本细胞同一的。然而，在使用术语“宿主细胞”时包括此类后代。
免疫应答：免疫系统的细胞(诸如B细胞，T细胞，或单核细胞)对刺激的响应。在一个实施方案中，应答是对特定抗原特异性的(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，诸如CD4+应答或CD8+应答。在另一个实施方案中，应答是B细胞应答，而且导致特异性抗体生成。
免疫原：能在动物中刺激抗体或T细胞应答生成的化合物，组合物，或物质，包括注射或吸收入动物的组合物。免疫原与特异性体液或细胞免疫(包括那些由异源抗原(诸如所公开的重组副粘病毒)诱导的)的产物反应。对受试者施用免疫原能导致针对感兴趣病原体的保护性免疫。
免疫原性组合物：包含诱导可测量的针对抗原的T细胞应答或诱导可测量的针对抗原的B细胞应答(诸如抗体生成)的免疫原的组合物，该抗原包括在免疫原上或或由包括在免疫原中的核酸分子编码。在一个例子中，免疫原性组合物是包括当施用于受试者时诱导可测量的针对RSV和/或PIV的CTL应答，或诱导可测量的针对RSV和/或PIV的B细胞应答(诸如抗体生成)的所公开的重组副粘病毒的组合物。免疫原性组合物可以包括分离的本文中公开的重组副粘病毒。对于体内使用，免疫原性组合物会典型地在药学可接受载剂中包括重组副粘病毒，而且还可以包括其它药剂，诸如佐剂。
分离的：“分离的”生物学成分已经自其它生物学成分(诸如该成分在其中天然发生的其它生物学成分，诸如其它染色体和染色体外DNA，RNA，和蛋白)实质性分开或纯化。已经“分离的”蛋白质，肽，核酸，和病毒包括那些通过标准纯化方法纯化的。分离的不要求绝对纯，而且可以包括至少50％分离的，诸如至少75％，80％，90％，95％，98％，99％，或甚至99.9％分离的蛋白质，肽，核酸，或病毒分子。
连接的：术语“连接的”和“连接”指使两个分子成为一个连续分子；例如，通过重组手段将两个多肽连接成一个连续多肽。提及编码包含与异源F蛋白的TM和CT“连接”的RSV F外域的I型膜蛋白的基因指通过重组手段实现的基因中编码RSV F外域的核酸序列和编码异源F蛋白的TM和CT的核酸序列之间的遗传连接，使得该基因的表达导致以N至C端方向包括RSV F外域，TM，和CT的蛋白质生成。在一些实施方案中，RSV F外域的C端残基可以直接连接(通过肽键)至TM的N端残基。在一些实施方案中，RSV F外域的C端残基可以经肽接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头)间接连接至TM的N端残基。
接头：可用于将两个分子连接成一个连续分子的双功能分子。肽接头的非限制性例子包括甘氨酸-丝氨酸接头。
天然蛋白，序列，或二硫键：尚未修饰(例如通过选择性突变)的多肽，序列或二硫键。例如，将抗原的抗原性聚焦于靶表位，或在蛋白质中引入天然蛋白质中不存在的二硫键的选择性突变。天然蛋白质或天然序列还称作野生型蛋白质或野生型序列。非天然二硫键是天然蛋白质中不存在的二硫键，例如由于通过遗传工程引入蛋白质的一个或多个半胱氨酸残基而在蛋白质中形成的二硫键。
核酸分子：聚合物形式的核苷酸，其可以包括RNA，cDNA，基因组DNA，和上述的合成形式和混合聚合物的有义和反义链二者。核苷酸指核糖核苷酸，脱氧核苷酸或修饰形式的任一类型的核苷酸。如本文中使用的，术语“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。核酸分子通常长度是至少10个碱基，除非另有规定。该术语包括单和双链形式的DNA。多核苷酸可以包括通过天然发生的和/或非天然发生的核苷酸连接连接到一起的天然发生的和经过修饰的核苷酸任一或二者。
可操作连接：当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列是可操作连接的。一般地，可操作连接的核酸序列是连续的，而且在必须连接两个蛋白编码区的情况中，在同一读框中。
副粘病毒：一个有包膜的，不分段负义单链RNA病毒科。副粘病毒的例子包括但不限于人副流感病毒(HPIV)，包括1，2，3，4A，和4B型(分别是HPIV1，HPIV2，HPIV3，HPIV4A，和HPIV4B)，小鼠副流感病毒1型(仙台病毒，MPIV1)，牛副流感病毒3型(BPIV3)，副流感病毒5(PIV5，以前称作猿病毒5，SV5)，猿病毒41(SV41)，和腮腺炎病毒。HPIV1，HPIV3，MPIV1，和BPIV3归类在呼吸道病毒(Respirovirus)属中。HPIV2，HPIV4，SV5，SV41，和腮腺炎病毒归类在德国麻疹病毒(Rubulavirus)属中。MPIV1，PIV5，和BPIV3分别是HPIV1，HPIV2，和HPIV3的动物亲戚(Chancock et al.,Parainfluenza Viruses,Knipe et al.(Eds.),pp.1341-1379,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,2001)。HPIV1，HPIV2，和HPIV3代表独特的血清型，而且不引发显著的交叉免疫。HPIV是呼吸道感染(诸如哮吼，肺炎，或支气管炎)的病因学因子。
副流感病毒(PIV)：描述性地分组在一起的来自副粘病毒科的多种有包膜的不分段负义单链RNA病毒。这包括呼吸道病毒属的所有成员(例如，HPIV1，HPIV3)和德国麻疹病毒属的多个成员(例如HPIV2，HPIV4，PIV5)。禽腮腺病毒(avulavirus)属的成员(例如NDV)在历史上称作PIV，而且可以考虑为这个群的一部分。HPIV血清型1，2，和3在全世界婴儿和儿童中引起严重呼吸道感染方面仅次于RSV，其中HPIV3是HPIV中就疾病冲击而言最重要的。PIV由两个结构模块构成：(1)含有病毒基因组的内部核蛋白核心或核壳，和(2)外部，粗糙球形脂蛋白包膜。PIV病毒基因组长度是大约15,000个核苷酸且编码至少八种多肽。这些蛋白包括核壳结构蛋白(NP，NC，或N，取决于属)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合糖蛋白(F)，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)，大型聚合酶蛋白(L)，和C和D蛋白。P基因含有一个或多个另外的编码辅助蛋白的可读框(ORF)。基因次序是3’-N-P-M-F-HN-L-5’，而且每种基因编码分开的蛋白编码mRNA。例示性PIV株序列是本领域普通技术人员知道的，诸如HPIV1，HPIV2，HPIV3，和BPIV3病毒的序列。
药学可接受载剂：有用的药学可接受载剂是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,19thEdition,1995记载了适用于所公开的免疫原的制药学投递的组合物和配制剂。
一般而言，载剂的性质会取决于所采用的特定施用模式。例如，胃肠外配制剂通常包含可注射流体，包括药学和生理学可接受流体，诸如水，生理盐水，平衡盐溶液，水性右旋糖，甘油，等等作为媒介。对于固体组合物(例如粉，丸，片，或胶囊形式)，常规无毒固体载剂可以包括例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，或硬脂酸镁。在生物学中性载剂之外，要施用的药物组合物可以含有微量的无毒辅助物质，诸如润湿或乳化剂，防腐剂，和pH缓冲剂，等等，例如乙酸钠或单月硅酸山梨聚糖酯。在特定实施方案中，适合于对受试者施用，载剂可以是无菌的，和/或悬浮或以其它方式含有在单位剂量形式中，单位剂量形式含有一个或多个计量剂量的适合于诱导期望的免疫应答的组合物。它还可以伴有它用于治疗目的的药疗法。单位剂量形式可以例如在装有无菌内容的密封管形瓶或用于注射入受试者的注射器中，或冻干用于后续溶解和施用或在固体或受控释放剂量中。
多肽：任何氨基酸链，不管长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。“多肽”应用于氨基酸聚合物，包括天然发生氨基酸聚合物，以及非天然发生氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸，例如对应的天然发生氨基酸的人工化学模拟物。“残基”指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入多肽的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基端(N端)和羧基端(C端)。“多肽”与肽或蛋白质可互换使用，而且在本文中用于指氨基酸残基聚合物。
初始-加强疫苗接种：包括对受试者施用第一免疫原性组合物(初始疫苗)，接着是施用第二免疫原性组合物(加强疫苗)以诱导免疫应答的免疫疗法。在初始疫苗后对受试者施用加强疫苗；技术人员会了解初始疫苗和加强疫苗的施用之间的合适时间间隔，而且本文中公开了此类时帧的例子。初始-加强方案中可以包括另外的施用，例如第二加强。
重组：重组核酸分子是具有不是天然发生的序列(例如包括一处或多处核酸替代，删除或插入)和/或具有通过人工组合两个在其它情况中分开的序列区段而生成的序列的核酸分子。这种人工组合可以通过化学合成或更加常见地通过人工操作分离的核酸区段(例如通过遗传工程技术)来实现。
重组病毒是包括如下基因组的病毒，该基因组包括重组核酸分子。
重组蛋白是具有不是天然发生的序列或具有通过人工组合两个在其它情况中分开的序列区段而生成的序列的蛋白质。在数个实施方案中，重组蛋白是由已经导入宿主细胞，诸如细菌或真核细胞，或重组病毒的基因组的异源(例如重组)核酸编码的。
呼吸道合胞病毒(RSV)：副粘病毒科的一种有包膜的不分段负义单链RNA病毒。RSV基因组长度是～15,000个核苷酸且包括编码11种蛋白质的10种基因，包括糖蛋白SH，G和F。F蛋白介导融合，容许病毒进入细胞胞质且还促进合胞体形成。已经记载了人RSV株的两个抗原性亚群，A和B亚群，主要基于G糖蛋白的抗原性的差异。还知道其它物种的RSV株，包括牛RSV。例示性RSV株序列是本领域普通技术人员知道的。进一步地，有人RSV感染的数个模型可得，包括感染有hRSV的模式生物体，以及感染有物种特异性RSV的模式生物体，诸如在牛中使用bRSV感染(参见例如Bern et al.,Am J,Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.,301:L148-L156,2011；和Nam and Kun(Eds.).Respiratory Syncytial Virus:Prevention,Diagnosis and Treatment.Nova Biomedical Nova Science Publisher,2011；和Cane(Ed.)Respiratory Syncytial Virus.Elsevier Science,2007)。
RSV融合(F)蛋白：推动病毒和细胞膜融合的RSV包膜糖蛋白。在自然界中，RSV F蛋白首先作为长度为大约574个氨基酸的单一多肽前体合成，称作F0。F0包括N端信号肽，其指导定位至内质网，在那里信号肽(F0的大约头22个残基)受到蛋白水解切割。剩余的F0残基寡聚化以形成三聚体，其再次在两个保守弗林蛋白酶共有切割序列(大致F0位置109/110和136/137；例如RARR109(SEQ ID NO：1，残基106-109)和RKRR136(SEQ ID NO：1，残基133-136))处受到细胞蛋白酶的蛋白水解加工，切除pep27多肽并生成两个二硫化物连接的片段，F1和F2。这些片段中的较小者(F2)源自F0前体的N端部分且包括F0的大致残基26-109。这些片段中的较大者(F1)包括F0前体的C端部分(大致残基137-574)，包括胞外/腔区(～残基137-529)，TM(～残基530-550)，和C端的CT(～残基551-574)。
三个F2-F1原聚体在成熟F蛋白中寡聚化，其采取亚稳的“融合前”构象，一旦与靶细胞膜接触就被触发而经历构象变化(成为“融合后”构象)。这种构象变化暴露一段疏水性序列，称作融合肽，它位于F1多肽的N端，而且与宿主细胞膜联合并促进病毒的或受感染细胞的膜与靶细胞膜的融合。
RSV F蛋白的胞外部分是RSV F外域，其包括F2蛋白和F1外域。RSV F外域三聚体包括三个RSV F外域的蛋白复合物。
在触发导致RSV F转变成融合后构象的融合原性事件及之后在分泌系统中加工成成熟RSV F蛋白之前，RSV F蛋白采取“融合前”构象。处于融合前构象的一种例示性RSV F蛋白的三维结构显示及披露于例如WO2014160463，通过援引将其收入本文。处于融合前状态时，RSV F蛋白在它的膜远端顶点处包括称作“抗原性位点”的包括RSV F残基62-69和196-209的抗原性位点，而且还包括D25和AM22单克隆抗体的表位。因而，稳定化于融合前构象的重组RSV F蛋白能受到结合RSV F蛋白的融合前构象但不结合融合后构象的抗体(诸如特异性结合抗原性位点内的表位的抗体，例如D25或AM22抗体)的特异性结合。另外的RSVF融合前特异性抗体包括5C4和MPE8抗体。
序列同一性：氨基酸序列之间的相似性是在序列之间的相似性方面表述的，另外称作序列同一性。序列同一性常常在百分比同一性(或相似性或同源性)方面测量；该百分比越高，两种序列约相似。当使用标准方法比对时，多肽的同系物，直向同系物，或变体会拥有相对较高程度的序列同一性。
为了比较而比对序列的方法是本领域公知的。多种程序和比对算法记载于：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet et al.,Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988；Huang et al.Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；和Pearson et al.,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994。Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990呈现了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
一旦比对，通过对两种序列中存在同一核苷酸或氨基酸残基的位置的数目计数来确定匹配的数目。通过将匹配的数目除以所鉴定的序列所列序列的长度或特指长度(诸如来自所鉴定的序列所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)任一，接着将所得值乘以100来确定百分比序列同一性。例如，当与具有1554个氨基酸的测试序列比对时，具有1166个匹配的肽序列与测试序列是75.0％同一的(1166÷1554*100＝75.0)。百分比序列同一性值四舍五入成最近的十分之一。例如，75.11，75.12，75.13，和75.14向下四舍五入成75.1，而75.15，75.16，75.17，75.18，和75.19向上四舍五入成75.2。长度值总是会是整数。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403,1990)自数个来源(包括(美国)国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD))和在因特网上可得，与序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx联合使用。如何使用这种程序来确定序列同一性的说明在因特网上的NCBI网站上可得。
多肽(诸如RSV F外域)的同系物和变体典型地通过拥有与感兴趣氨基酸序列在全长比对上计数的至少约75％，例如至少约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性来表征。当通过这种方法评估时，与参照序列具有甚至更大相似性的蛋白质会显示渐增的百分比同一性，诸如至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％序列同一性。当为了序列同一性比较少于整个序列时，同系物和变体典型地会在10-20个氨基酸的短窗口上拥有至少80％序列同一性，而且可以拥有至少85％或至少90％或95％的序列同一性，取决于它们与参照序列的相似性。用于在如此短窗口上确定序列同一性的方法在因特网上的NCBI站点处得到。本领域技术人员会领会，这些序列同一性范围只是为了指导而提供的；完全有可能能得到落在所提供的范围之外的强显著同系物。
对于核酸序列的序列比较，典型地，一种序列充当参照序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，在必要时指派子序列坐标，并指派序列算法程序参数。使用缺省程序参数。为了比较而比对序列的方法是本领域公知的。用于比较的最佳序列比对可以进行例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法，Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法，Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的相似性搜索方法，这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)，或手工比对和肉眼检查(参见例如Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold SpringHarbor,New York,2012和Ausubel et al.(In Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,through supplement 104,2013))。有用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用Feng&Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360,1987的渐进式比对方法的一种简化。所使用的方法与Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-153,1989记载的方法相似。使用PILEUP，使用下述参数将参照序列与其它测试序列比较以确定百分比序列同一性关系：缺省缺口权重(3.00)，缺省缺口长度权重(0.10)，和加权末端缺口。PILEUP可以自GCG序列分析软件包获得，例如7.0版(Devereaux et al.,Nuc.Acids Res.12:387-395,1984)。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一个例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们记载于Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990和Altschulet al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1977。用于实施BLAST分析的软件是公众经由(美国)国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)可得的。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用词长度(W)11，比对(B)50，预期(E)10，M＝5，N＝-4，和比较两条链作为缺省。BLASTP程序(用于氨基酸序列)使用词长度(W)3，预期(E)10，和BLOSUM62评分矩阵作为缺省(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)。寡核苷酸是长度为多至约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。
如本文中使用的，提及“至少90％同一性”指与规定参照序列的“至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或甚至100％同一性”。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，一个包括人和非人哺乳动物的范畴。在一个例子中，受试者是人。在一个特定例子中，受试者是新生婴儿。在一个另外的例子中，受试者选择需要抑制RSV感染的。例如，受试者是未感染且处于RSV感染风险的或是需要治疗的已感染的任一。
跨膜域(TM)：跨越脂双层，诸如细胞或病毒或病毒样颗粒的脂双层的氨基酸序列。跨膜域可以用于将抗原锚定至膜。在一些例子中，跨膜域是RSVF跨膜域。
疫苗：为了预防，改善，或治疗感染性或其它类型疾病而施用的能够刺激免疫应答的免疫原性材料的制备物。免疫原性材料可以包括减毒的或杀死的微生物(诸如细菌或病毒)，或自它们衍生的抗原性蛋白，肽或DNA。减毒疫苗是已经修饰以生成毒力降低形式，但是无论如何保留引发抗体和细胞介导的针对有毒力形式的免疫的能力的有毒力的生物体。灭活(杀死)疫苗是先前有毒力，已经用化学制品，热，或其它处理灭活，但是引发针对该生物体的抗体的生物体。疫苗可以引发防范性(预防性或保护性)和治疗性应答二者。施用方法随疫苗而变化，但是可以包括接种，摄入，吸入或其它形式的施用。疫苗可以与佐剂一起施用以加强免疫应答。
载体：携带与感兴趣抗原的编码序列可操作连接且能表达该编码序列的启动子的含有DNA或RNA分子的实体。非限制性例子包括裸的或包装的(脂质和/或蛋白质)DNA，裸的或包装的RNA，可以是复制不胜任的病毒或细菌或其它微生物的亚成分，或可以是复制胜任的病毒或细菌或其它微生物。载体有时称作构建物。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可以包括允许它在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可以包括一种或多种本领域知道的选择标志基因和其它遗传元件。病毒载体是具有至少一些自一种或多种病毒衍生的核酸序列的重组核酸载体。
II.重组病毒载体
提供了包括来自多种病毒病原体的抗原且可以用于诱导针对那些病毒病原体的免疫应答的重组副粘病毒。重组副粘病毒包括编码异源基因的基因组。重组副粘病毒包含包含如下异源基因的基因组，该异源基因编码异源病毒病原体的跨膜蛋白(例如病毒糖蛋白)的外域。外域可以与来自副粘病毒的包膜蛋白的CT，或TM和CT连接以容许在副粘病毒包膜上表达来自异源病毒的跨膜蛋白的外域。例如，重组副粘病毒可以是包含包含如下异源基因的基因组的重组PIV，该异源基因编码与来自PIV的F蛋白的TM和CT连接的RSV F蛋白的外域。本文中提供了重组副粘病毒及其修饰的另外的描述。
副粘病毒基因组包括编码N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因。基因组还包括基因组启动子和反启动子，次序为启动子–N，P，M，F，HN，L–反启动子。重组副粘病毒的基因组中包括的异源基因可以位于副粘病毒基因组的基因之间，或启动子和N基因之间，或L基因和反启动子之间的任何位置。异源基因的侧翼可以是适宜的基因起点和基因终点序列以推动来自病毒基因组的表达。在一个优选实施方案中，异源基因可以位于启动子和N基因之间，或N基因和P基因之间。
在一个实施方案中，重组副粘病毒的基因组中包括的异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的CT，或TM和CT连接的I型跨膜蛋白(例如I型病毒糖蛋白)的外域。在其它实施方案中，重组副粘病毒的基因组中包括的异源基因编码与副粘病毒的HN蛋白的CT，或TM和CT连接的II型跨膜蛋白(例如II型病毒糖蛋白)的外域。
重组副粘病毒可以是例如重组HPIV1，HPIV2，HPIV3，BPIV3，PIV5，仙台病毒，或NDV，或其嵌合物。下文提供了此类重组副粘病毒的另外的描述。
生成包括包括异源基因的基因组的重组副粘病毒的一般方法是本领域普通技术人员知道的，就像用于此类方法的病毒序列和试剂。生成包括异源基因的重组PIV载体(诸如重组HPIV1，HPIV2，HPIV3，或H/BPIV3载体)的方法，将载体减毒(例如通过重组或化学手段)的方法，以及用于此类方法的病毒序列和试剂的非限制性例子提供于美国专利公开文本2012/0045471；2010/0119547；2009/0263883；2009/0017517；8084037；6,410,023；8,367,074；7,951,383；7,820,182；7704509；7632508；7622123；7250171；7208161；7201907；7192593；Newman et al.2002.Virus genes 24:77-92；和Tang et al.,2003.J Virol,77(20):10819-10828；通过援引将其每一篇完整收入本文。生成包括异源基因的重组NDV载体的方法，以及用于此类方法的病毒序列和试剂的非限制性例子提供于美国专利公开文本2012/0064112；和Basavarajappa et al.2014Vaccine,32:3555-3563；和McGinnes etal.,J.Virol.,85:366-377,2011，通过援引将其每一篇完整收入本文。生成包括异源基因的重组仙台载体的方法，以及用于此类方法的病毒序列和试剂的非限制性例子提供于美国专利公开文本20140186397，和Jones et al.,Vaccine,30:959-968,2012，通过援引将其每一篇完整收入本文。
A.HPIV1载体
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码HPIV1N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV1。HPIV1基因组及其中的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传元件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和反基因组启动子。一种例示性HPIV1华盛顿/1964株基因组序列作为GenBank登录号AF457102.1提供，通过援引将其完整收入本文。这种例示性HPIV1华盛顿/1964株基因组序列编码下列N，P，C，M，F，HN，和L蛋白：
HPIV1N，SEQ ID NO：24(GenBank蛋白ID#AAL89400.1，通过援引收入本文)
HPIV1P，SEQ ID NO：25(GenBank蛋白ID#AAL89402.1，通过援引收入本文)
HPIV1 C，SEQ ID NO：26(P的ORF，GenBank蛋白ID#AAL89403.1，通过援引收入本文)
HPIV1M，SEQ ID NO：27(GenBank蛋白ID#AAL89406.1，通过援引收入本文)
HPIV1F，SEQ ID NO：28(GenBank蛋白ID#AAL89407.1，通过援引收入本文)
HPIV1HN，SEQ ID NO：29(GenBank蛋白ID#AAL89408.1，通过援引收入本文)
HPIV1 L，SEQ ID NO：30(GenBank蛋白ID#AAL89409.1，通过援引收入本文)
下文提供了这些HPIV1基因的对应基因起点和基因终点序列：
| 基因 | 基因起点 | SEQ ID | 基因终点 | SEQ ID | 基因间 |
| N | agggttaaag | 54 | aagtaagaaaaa | 55 | ctt |
| P | agggtgaatg | 56 | Aattaagaaaaa | 57 | ctt |
| M | agggtcaaag | 58 | Aaataagaaaaa | 59 | ctt |
| F | agggacaaag | 60 | Aagtaagaaaaa | 55 | ctt |
| HN | agggttaaag | 61 | Gaataagaaaaa | 62 | ctt |
| L | agggttaatg | 63 | Tagtaagaaaaa | 64 | ctt |
进一步地，GenBank登录号AF457102.1中所列HPIV2 V94株的病毒前导/基因组启动子和尾随/反基因组启动子分别作为核苷酸1-96和15544-15600列出。
重组副粘病毒可以是包括编码上文所列HPIV1 N，P，C，M，F，HN，和L蛋白，或编码个别地与上文所列HPIV1 N，P，C，M，F，HN，和L蛋白具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV1N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV1。
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV1，该异源基因编码与下文所列HPIV1F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)，或编码与同下文所列HPIV1 F蛋白TM和CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV1 F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV1，该异源基因编码与下文所列HPIV1F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)，或编码与同下文所列HPIV1 F蛋白CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV1F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)。HPIV1F蛋白TM和CT序列是知道的(参见例如GenBank登录号AF457102.1，通过援引收入本文)。例示性HPIV1F蛋白TM和CT序列如下所列：
HPIV1F TM：QIIMIIIVCILIIIICGILYYLY，SEQ ID NO：31残基1-23
HPIV1F CT：RVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN，SEQ ID NO：31残基24-59
HPIV1F TM+CT：QIIMIIIVCILIIIICGILYYLYRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN，SEQ ID NO：31
B.HPIV2载体
在一些实施方案中，重组副粘病毒载体可以是包括编码HPIV2N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV2。编码这些HPIV2蛋白的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传元件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和anti基因组启动子。一种例示性HPIV2V94株基因组序列作为GenBank登录号AF533010.1提供，通过援引将其完整收入本文。这个例示性HPIV2V94株基因组序列编码下列N，P，V，M，F，HN，和L蛋白：
HPIV2N，SEQ ID NO：32(由GenBank No.AF533010.1编码，通过援引收入本文)
HPIV2P，SEQ ID NO：33(由GenBank No.AF533010.1编码，通过援引收入本文)
HPIV2V，SEQ ID NO：34(P的ORF，由GenBank No.AF533010.1编码，通过援引收入本文)
HPIV2M，SEQ ID NO：35(由GenBank No.AF533010.1编码，通过援引收入本文)
HPIV2F，SEQ ID NO：36(由GenBank No.AF533010.1编码，通过援引收入本文)
HPIV2HN，SEQ ID NO：37(由GenBank No.AF533010.1编码，通过援引收入本文)
HPIV2L，SEQ ID NO：38(由GenBank No.AF533010.1编码，通过援引收入本文)
下文提供了这些HPIV2基因的对应基因起点和基因终点序列：
进一步地，GenBank登录号AF533010.1中所列HPIV2V94株的病毒前导/基因组启动子和trailer/anti基因组启动子分别作为核苷酸1-175和15565-15654列出。
重组副粘病毒可以是包括编码上文所列HPIV2N，P，V，M，F，HN，和L蛋白，或编码个别地与上文所列HPIV2N，P，V，M，F，HN，和L蛋白具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV2N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV2。
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV2，该异源基因编码与下文所列HPIV2F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)，或编码与同下文所列HPIV2F蛋白TM和CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV2F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV2，该异源基因编码与下文所列HPIV2F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)，或编码与同下文所列HPIV2F蛋白CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV2F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSVF外域)。HPIV2F蛋白TM和CT序列是知道的(参见例如GenBank登录号AF533010.1，通过援引收入本文)。来自HPIV3JS株的例示性HPIV2F蛋白TM和CT序列如下所列：
HPIV2F TM域：TLYSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYII，SEQ ID NO：39残基1-28
HPIV2F CT：KLVSQIHQFRALAATTMFHRENPAVFSKNNHGNIYGIS，SEQID NO：39残基29-66
HPIV2F TM+CT：TLYSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRALAATTMFHRENPAVFSKNNHGNIYGIS，SEQ ID NO：39
C.HPIV3载体
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码HPIV3 N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV3。编码这些HPIV3蛋白的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传元件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和anti基因组启动子。作为GenBank登录号Z11575提供一种例示性HPIV3 JS株基因组序列，通过援引将其完整收入本文。对于这种例示性HPIV3 JS株基因组序列，编码N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的核酸序列如下所列。
HPIV3 N，SEQ ID NO：40(由GenBank No.Z11575核苷酸111-1658编码，通过援引收入本文)
HPIV3 P，SEQ ID NO：41(由GenBank No.Z11575核苷酸1784-3595编码，通过援引收入本文)
HPIV3 C，SEQ ID NO：114(由GenBank No.Z11575核苷酸1794-2393编码，通过援引收入本文)
HPIV3 M，SEQ ID NO：42(由GenBank No.Z11575核苷酸3753-4814编码，通过援引收入本文)，
HPIV3 F，SEQ ID NO：43(由GenBank No.Z11575核苷酸5072-6691编码，通过援引收入本文)，
HPIV3 HN，SEQ ID NO：44(由GenBank No.Z11575核苷酸6806-8524编码，通过援引收入本文)
HPIV3 L，SEQ ID NO：45(由GenBank No.Z11575核苷酸8646-15347编码，通过援引收入本文)
在一些实施方案中，HPIV3载体中的HN基因编码包含下列氨基酸序列的HPIV3 HN蛋白
MEYWKHTNHGKDAGNELETSMATHGNKLTNKIIYILWTIILVLLSIVFIIVLINSIKSEKAHESLLQDINNEFMEITEKIQMASDNTNDLIQSGVNTRLLTIQSHVQNYIPISLTQQMSDLRKFISEITIRNDNQEVLPQRITHDVGIKPLNPDDFWRCTSGLPSLMKTPKIRLMPGPGLLAMPTTVDGCVRTPSLVINDLIYAYTSNLITRGCQDIGKSYQVLQIGIITVNSDLVPDLNPRISHTFNINDNRKSCSLALLNIDVYQLCSTPKVDERSDYASSGIEDIVLDIVNYDGSISTTRFKNNNISFDQPYAALYPSVGPGIYYKGKIIFLGYGGLEHPINENVICNTTGCPGKTQRDCNQASHSTWFSDRRMVNSIIVVDKGLNSIPKLKVWTISMRQNYWGSEGRLLLLGNKIYIYTRSTSWHSKLQLGIIDITDYSDIRIKWTWHNVLSRPGNNECPWGHSCPDGCITGVYTDAYPLNPTGSIVSSVILDSQKSRVNPVITYSTATERVNELAILNRTLSAGYTTTSCITHYNKGYCFHIVEINHKSLNTFQPMLFKTEIPKSCS(SEQ ID NO：101)
如下提供一种例示性的编码SEQ ID NO：101的DNA序列：
atggaatactggaagcataccaatcacggaaaggatgctggtaatgagctggagacgtctatggctactcatggcaacaagctcactaataagataatatacatattatggacaataatcctggtgttattatcaatagtcttcatcatagtgctaattaattccatcaaaagtgaaaaggcccacgaatcattgctgcaagacataaataatgagtttatggaaattacagaaaagatccaaatggcatcggataataccaatgatctaatacagtcaggagtgaatacaaggcttcttacaattcagagtcatgtccagaattacataccaatatcattgacacaacagatgtcagatcttaggaaattcattagtgaaattacaattagaaatgataatcaagaagtgctgccacaaagaataacacatgatgtaggtataaaacctttaaatccagatgatttttggagatgcacgtctggtcttccatctttaatgaaaactccaaaaataaggttaatgccagggccgggattattagctatgccaacgactgttgatggctgtgttagaactccgtctttagttataaatgatctgatttatgcttatacctcaaatctaattactcgaggttgtcaggatataggaaaatcatatcaagtcttacagatagggataataactgtaaactcagacttggtacctgacttaaatcctaggatctctcatacctttaacataaatgacaataggaagtcatgttctctagcactcctaaatatagatgtatatcaactgtgttcaactcccaaagttgatgaaagatcagattatgcatcatcaggcatagaagatattgtacttgatattgtcaattatgatggttcaatctcaacaacaagatttaagaataataacataagctttgatcaaccatatgctgcactatacccatctgttggaccagggatatactacaaaggcaaaataatatttctcgggtatggaggtcttgaacatccaataaatgagaatgtaatctgcaacacaactgggtgccccgggaaaacacagagagactgtaatcaagcatctcatagtacttggttttcagataggaggatggtcaactccatcattgttgttgacaaaggcttaaactcaattccaaaattgaaagtatggacgatatctatgcgacaaaattactgggggtcagaaggaaggttacttctactaggtaacaagatctatatatatacaagatctacaagttggcatagcaagttacaattaggaataattgatattactgattacagtgatataaggataaaatggacatggcataatgtgctatcaagaccaggaaacaatgaatgtccatggggacattcatgtccagatggatgtataacaggagtatatactgatgcatatccactcaatcccacagggagcattgtgtcatctgtcatattagactcacaaaaatcgagagtgaacccagtcataacttactcaacagcaaccgaaagagtaaacgagctggccatcctaaacagaacactctcagctggatatacaacaacaagctgcattacacactataacaaaggatattgttttcatatagtagaaataaatcataaaagcttaaacacatttcaacccatgttgttcaaaacagagattccaaaaagctgcagttaa(SEQ ID NO：102)
下文提供了这些HPIV3基因的对应基因起点和基因终点序列：
| 基因 | 基因起点 | SEQ ID | 基因终点 | SEQ ID |
| N | aggattaaagac | 77 | aaataagaaaaa | 78 |
| P | Aggattaaag | 79 | aaataagaaaaa | 80 |
| M | Aggattaaag | 81 | aaataaaggataatcaaaaa | 82 |
| F | Aggacaaaag | 83 | aattataaaaaa | 84 |
| HN | Aggagtaaag | 85 | aaatataaaaaa | 86 |
| L | Aggagcaaag | 87 | aaagtaagaaaaa | 88 |
进一步地，GenBank登录号Z11575所列HPIV3 JS株的病毒基因组和anti基因组启动子分别作为核苷酸1-96(基因组启动子)和核苷酸15367-15462(anti基因组启动子)提供。
重组副粘病毒可以是包括编码上文所列HPIV3 N，P，C，M，F，HN，和L蛋白，或编码个别地与上文所列HPIV3 N，P，C，M，F，HN，和L蛋白具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV3 N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV3。
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV3，该异源基因编码与下文所列HPIV3 F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)，或编码与同下文所列HPIV3 F蛋白TM和CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV3 F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV3，该异源基因编码与下文所列HPIV3 F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)，或编码与同下文所列HPIV3 F蛋白CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV3 F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)。HPIV3 F蛋白TM和CT序列是知道的(参见例如由GenBank No.Z11575核苷酸5072-6691编码的蛋白)。来自HPIV3 JS株的例示性HPIV3 F蛋白TM和CT序列如下所列：
HPIV3 F TM域：IIIILIMIIILFIINITIITIAI，SEQ ID NO：46残基1-23
HPIV3 F CT：KYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK，SEQ ID NO：46残基24-46HPIV3 F TM+CT：IIIILIMIIILFIINITIITIAIKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK，SEQ ID NO：46
D.牛PIV3和嵌合人/牛PIV3载体
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码来自BPIV3和HPIV3的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的组合的病毒基因组的牛PIV3(BPIV3)或嵌合副粘病毒。例如，嵌合病毒基因组可以编码HPIV3 F和HN蛋白和BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白。编码这些HPIV3和BPIV3蛋白的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传元件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和anti基因组启动子。一种例示性BPIV3堪萨斯基因组序列作为GenBank登录号AF178654提供，通过援引将其完整收入本文。这种例示性BPIV3堪萨斯株基因组序列编码下文所列N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白：
BPIV3 N，SEQ ID NO：47(GenBank登录号：AAF28254，由GenBank No.AF178654核苷酸111-1658编码，通过援引将其每一篇收入本文)
BPIV3 P，SEQ ID NO：48(GenBank登录号：AAF28255，由GenBank No.AF178654核苷酸1784-3574编码，通过援引将其每一篇收入本文)
BPIV3 C，SEQ ID NO：115(由GenBank No.AF178654核苷酸1794-2399编码，通过援引收入本文)
BPIV3 V，SEQ ID NO：116(由GenBank No.AF178654核苷酸1784-3018编码，位于核苷酸2500-2507的基因编辑位点处的核苷酸2505-2506之间插入核苷酸g)
BPIV3 M，SEQ ID NO：49(GenBank登录号：AAF28256，由GenBank No.AF178654核苷酸3735-4790编码，通过援引将其每一篇收入本文)
BPIV3 F，SEQ ID NO：50(GenBank登录号：AAF28257，由GenBank No.AF178654核苷酸5066-6688编码，通过援引将其每一篇收入本文)
BPIV3 HN，SEQ ID NO：51(GenBank登录号：AAF28258，由GenBank No.AF178654核苷酸6800-8518编码，通过援引将其每一篇收入本文)
BPIV3 L，SEQ ID NO：52(GenBank登录号：AAF28259，由GenBank No.AF178654核苷酸8640-15341编码，通过援引将其每一篇收入本文)
在一些实施方案中，嵌合B/HPIV3载体中包括的HPIV3 HN基因编码包含SEQ IDNO：101或SEQ ID NO：44所列氨基酸序列或其变体的HPIV3 HN蛋白。一种例示性的编码SEQID NO：101的DNA序列提供于SEQ ID NO：102。
在一些实施方案中，嵌合B/HPIV3载体可以包括HPIV3 F基因替换BPIV3 F基因，例如编码SEQ ID NO：43所列HPIV3 F氨基酸序列或其变体的基因。
下文提供了这些BPIV3基因的对应基因起点和基因终点序列：
| 基因 | 基因起点 | SEQ ID | 基因终点 | SEQ ID |
| N | Aggattaaagaa | 89 | caagtaagaaaaa | 90 |
| P | Aggattaatgga | 91 | tgattaagaaaaa | 92 |
| M | Aggatgaaagga | 93 | gaaaaatcaaaaa | 94 |
| F | Aggatcaaaggg | 95 | aaaagtacaaaaaa | 96 |
| HN | Aggaacaaagtt | 97 | gaaataataaaaaa | 98 |
| L | Aggagaaaagtg | 99 | aaagtaagaaaaa | 100 |
进一步地，GenBank登录号AF178654所列BPIV3堪萨斯株的病毒基因组和anti基因组启动子分别作为核苷酸1-96(基因组启动子)和核苷酸15361-15456(anti基因组启动子)提供。
包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组副粘病毒可以编码上文所列HPIV3和BPIV3 N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的混合物，或者可以编码个别地与上文所列BPIV3或HPIV3 N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的BPIV3和HPIV3 N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的混合物。
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以包括编码上文所列HPIV3 F和HN蛋白和BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白，或编码个别地与上文所列对应HPIV3 F和HN蛋白或BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的HPIV3 F和HN蛋白和BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白的病毒基因组。
在一些实施方案中，包括编码来自BPIV3的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的，或与同下文所列BPIV3 F蛋白的TM和CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因。在一些实施方案中，包括编码来自BPIV3的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3 F蛋白的CT连接的，或与同下文所列BPIV3 F蛋白的CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因。
在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白(诸如HPIV3 F和HN蛋白和BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白)的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的，或与同下文所列BPIV3 F蛋白的TM和CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因。在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3 F蛋白的CT连接的，或与同下文所列BPIV3 F蛋白的CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因。来自BPIV3堪萨斯株的例示性BPIV3 F蛋白TM和CT序列如下所列：
BPIV3 F TM域：ITIIIVMIIILVIINITIIVV，SEQ ID NO：53残基1-21
BPIV3 F CT：IIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ，SEQ ID NO：53残基22-57
BPIV3 F TM+CT：ITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ，SEQ IDNO：53
在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白(诸如HPIV3 F和HN蛋白和BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白)的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与上文所列HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的，或与同上文所列HPIV3 F蛋白的TM和CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因。在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列HPIV3 F蛋白的CT连接的，或与同下文所列HPIV3 F蛋白的CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因。
E.仙台病毒
在一个实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码仙台病毒N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组，包括编码与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的，或与同仙台病毒F蛋白的CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因的重组仙台病毒。在一个实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码仙台病毒N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组的重组仙台病毒，包括编码与仙台病毒F蛋白的CT连接的，或与同仙台病毒F蛋白的CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因。仙台病毒F蛋白TM和CT序列是知道的(参见例如GenBank登录号BAN84670，通过援引收入本文)。例示性仙台病毒F蛋白TM和CT序列如下所列：
仙台F TM域：VITIIVVMVVILVVIIVIIIV(SEQ ID NO：103残基1-21)
仙台F CT：LYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(SEQ ID NO：103残基22-65)
仙台F TM+CT：VITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR，SEQ ID NO：103
F.NDV
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码NDV N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组，包括编码与下文所列NDV F蛋白的TM和CT连接的，或与同下文所列NDV F蛋白的TM和CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因的重组NDV病毒。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码NDV N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组，包括编码与下文所列NDV F蛋白的CT连接的，或与同下文所列NDV F蛋白的CT具有至少90％(诸如至少95％)序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域(诸如RSV F外域)的异源基因的重组NDV病毒。NDV病毒F蛋白TM和CT序列是知道的(参见例如GenBank登录号AAC28374，通过援引收入本文)。例示性NDV病毒F蛋白TM和CT序列如下所列：
NDV F TM域：IVLTIISLVFGILSLILACYL(SEQ ID NO：104残基1-21)
NDV F CT：MYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(SEQ ID NO：104残基22-49)
NDV F TM+CT：IVLTIISLVFGILSLILACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM，SEQ IDNO：104
G.异源基因
重组副粘病毒载体包括包括如下一种或多种异源基因的重组基因组，该一种或多种异源基因编码异源病毒病原体的一种或多种异源包膜蛋白(或其抗原性片段)的外域，其中该外域是与来自重组副粘病毒的包膜蛋白的TM和CT连接的。例如，可以由所公开的重组副粘病毒表达来自麻疹病毒，A亚群或B亚群呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒，人乳头状瘤病毒，1型或2型人免疫缺陷病毒，单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，狂犬病病毒，埃巴二氏病毒，纤丝病毒，布尼亚病毒，黄病毒，甲病毒，人偏肺病毒，埃博拉病毒(诸如扎伊尔埃博拉病毒)，流感病毒，或高度致病性冠状病毒(SARS，MERS)的一种或多种异源包膜蛋白(或其抗原性片段)。有用的包膜蛋白的例子包括但不限于麻疹病毒HA和F蛋白，A亚群或B亚群呼吸道合胞病毒F，G，和SH蛋白，腮腺炎病毒HN和F蛋白，人乳头状瘤病毒L1蛋白，1型或2型人免疫缺陷病毒gp160蛋白，单纯疱疹病毒和巨细胞病毒gB，gC，gD，gE，gG，gH，gI，gJ，gK，gL，和gM蛋白，狂犬病病毒G蛋白，埃巴二氏病毒gp350蛋白，纤丝病毒G蛋白，布尼亚病毒G蛋白，黄病毒前E，和NS1蛋白，人偏肺病毒(HMPV)G和F蛋白，埃博拉病毒GP蛋白，甲病毒E蛋白，和SARS和MERS S蛋白，和其抗原性域，片段和表位。将一个或多个异源基因或转录单元插入副粘病毒病毒基因组或反基因组的例示性方法记载于WO04/027037和US2013/0052718，通过援引将其每一篇收入本文。
在数个实施方案中，重组副粘病毒基因组中包括的异源基因编码RSV F蛋白，诸如牛RSV F蛋白或人RSV F蛋白的外域。人RSV可以归类入两个群：A和B。主要基于附着(G)和融合(F)蛋白的序列变异性，A和B群包括A1，A2，B1，和B2亚群。RSV F外域可以衍生自任何RSV群(诸如A群或B群)或RSV亚群，诸如A1，A2，B1，或B2亚群。
下文列出了来自A2亚群的例示性人RSV F蛋白序列和对应GenBank参照(通过援引将其完整收入本文)：
RSV F A2HEK蛋白序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：1)
RSV F B1HEK蛋白序列，登录号AAB82436：
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK(SEQ ID NO：2，GenBank登录号AAB82436，通过援引完整收入本文)
RSV F B1HEK核酸序列：
auggagcugcugauccacagguuaagugcaaucuuccuaacucuugcuauuaaugcauuguaccucaccucaagucagaacauaacugaggaguuuuaccaaucgacauguagugcaguuagcagagguuauuuuagugcuuuaagaacagguugguauaccagugucauaacaauagaauuaaguaauauaaaagaaaccaaaugcaauggaacugacacuaaaguaaaacuuauaaaacaagaauuagauaaguauaagaaugcagugacagaauuacagcuacuuaugcaaaacacaccagcugccaacaaccgggccagaagagaagcaccacaguauaugaacuauacaaucaauaccacuaaaaaccuaaauguaucaauaagcaagaagaggaaacgaagauuucugggcuucuuguuagguguaggaucugcaauagcaagugguauagcuguauccaaaguucuacaccuugaaggagaagugaacaagaucaaaaaugcuuuguuaucuacaaacaaagcuguagucagucuaucaaauggggucaguguuuuaaccagcaaaguguuagaucucaagaauuacauaaauaaccaauuauuacccauaguaaaucaacagagcugucgcaucuccaacauugaaacaguuauagaauuccagcagaagaacagcagauuguuggaaaucaacagagaauucagugucaaugcagguguaacaacaccuuuaagcacuuacauguuaacaaacagugaguuacuaucauugaucaaugauaugccuauaacaaaugaucagaaaaaauuaaugucaagcaauguucagauaguaaggcaacaaaguuauucuaucaugucuauaauaaaggaagaaguccuugcauauguuguacagcuaccuaucuaugguguaauagauacaccuugcuggaaauuacacacaucaccucuaugcaccaccaacaucaaagaaggaucaaauauuuguuuaacaaggacugauagaggaugguauugugauaaugcaggaucaguauccuucuuuccacaggcugacacuuguaaaguacaguccaaucgaguauuuugugacacuaugaacaguuugacauuaccaagugaagucagccuuuguaacacugacauauucaauuccaaguaugacugcaaaauuaugacaucaaaaacagacauaagcagcucaguaauuacuucucuuggagcuauagugucaugcuaugguaaaacuaaaugcacugcauccaacaaaaaucgugggauuauaaagacauuuucuaaugguugugacuaugugucaaacaaaggaguagauacugugucagugggcaacacuuuauacuauguaaacaagcuggaaggcaagaaccuuuauguaaaaggggaaccuauaauaaauuacuaugacccucuaguguuuccuucugaugaguuugaugcaucaauaucucaagucaaugaaaaaaucaaucaaaguuuagcuuuuauucguagaucugaugaauuacuacauaauguaaauacuggcaaaucuacuacaaauauuaugauaacuacaauuauuauaguaaucauuguaguauuguuaucauuaauagcuauugguuugcuguuguauugcaaagccaaaaacacaccaguuacacuaagcaaagaccaacuaaguggaaucaauaauauugcauucagcaaauag(SEQ ID NO：3，GenBank登录号：AF013254.1，核苷酸5666-7390，通过援引完整收入本文)
如通过上文序列例示的，hRSV F蛋白展现值得注意的序列保守性，在hRSV亚群间有超过85％的序列同一性。鉴于RSV F序列的保守性和宽度知识，本领域普通技术人员能容易地鉴定不同RSV F株和亚群之间的对应RSV F氨基酸位置。本文中公开的氨基酸替代的编号方式是提及来自SEQ ID NO：1所列A2株的例示性hRSV F蛋白序列做出的，除非上下文另有指示。
为了例示目的，来自A2株的RSV F蛋白(SEQ ID NO：1)的信号肽，F2多肽，pep27，F1，F1外域，跨膜域，和细胞溶胶域如下所列：
信号肽(SEQ ID NO：1，残基1-22)：MELLILKANAITTILTAVTFCF
F2多肽(SEQ ID NO：1，残基23-109)：ASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARR
Pep27(SEQ ID NO：1，残基110-136)：ELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR
F1(SEQ ID NO：1，残基137-574)：FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
F1成熟蛋白外域(SEQ ID NO：1，残基137-529)：FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITT
F1跨膜域(SEQ ID NO：1，残基530-550)：IIIVIIVILLSLIAVGLLLYC
F1CT(SEQ ID NO：1，残基551-574)：KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
在一些实施方案中，重组副粘病毒基因组中包括的异源基因编码人RSFF蛋白的外域，其中该RSV F外域包含与SEQ ID NO：1(WT RSV F A)，2(WT RSV F B)，12(A2HEK)，14(A2HEK+DS)，或19(A2HEK+DS-Cav1)之一的RSV外域至少85％(诸如至少90％，或至少95％)同一的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：12，14，或19的RSV外域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组副粘病毒可以包括包括已经为了在人细胞中表达而密码子优化的编码重组hRSV F蛋白的异源基因的基因组。例如，编码重组hRSV F蛋白的基因可以使用GA，DNA2.0(D2)，或GenScript(GS)优化算法(见实施例1)为了人表达而密码子优化。已经为了在人细胞中表达而密码子优化的编码RSV F蛋白的核酸序列的非限制性例子提供如下：
GeneArt优化的RSV F A2HEK DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcacaacaatcctgaccgccgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgccccggttcatgaactacaccctcaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgcctctggcgtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccacaaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaatgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacacaaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccggcagcgtgtcattctttccacaggccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccggcaagagcaccacaaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgagtctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggccagatccacccctgtgaccctgtccaaggatcagctgtccggcatcaacaatatcgccttctccaactga(SEQ ID NO：4)
GenScript优化的RSV F A2HEK DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctctaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctctaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtctatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaaggcaagaagcaccccagtcactctgtcaaaagaccagctgtcagggattaacaacattgccttcagtaactga(SEQ ID NO：5)
下文提供了密码子优化(为了人表达)序列的另外的例子。
由异源基因编码的RSV F蛋白可以包括一处或多处改善RSV F蛋白表达，病毒粒体包膜上RSV F蛋白的可用性，或RSV F蛋白的稳定性(例如处于融合前构象的)的氨基酸替代。在一些实施方案中，RSV F蛋白可以包括位置66处的谷氨酸替代，位置101处的脯氨酸替代，或二者。例如，RSV F蛋白可以包括K66E替代和Q101P替代的“HEK”替代。下文列出了包括HEK氨基酸替代的来自A2亚群的RSV F蛋白的例示性DNA和蛋白质序列。
具有HEK替代的RSV F A2蛋白(RSV F_A2_HEK)：SEQ ID NO：1
GeneArt优化的RSV F_A2_HEK DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcacaacaatcctgaccgccgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgccccggttcatgaactacaccctcaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgcctctggcgtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccacaaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaatgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacacaaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccggcagcgtgtcattctttccacaggccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccggcaagagcaccacaaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgagtctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggccagatccacccctgtgaccctgtccaaggatcagctgtccggcatcaacaatatcgccttctccaactga(SEQ ID NO：6)
GenScript优化的RSV F_A2_HEK DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctctaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctctaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtctatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaaggcaagaagcaccccagtcactctgtcaaaagaccagctgtcagggattaacaacattgccttcagtaactga(SEQ ID NO：7)
在另外的实施方案中，RSV F蛋白可以包括一处或多处将RSV F蛋白的外域稳定化于融合前构象的氨基酸替代。例如，RSV F蛋白可以包括位置155和290处形成非天然二硫键的一对半胱氨酸替代的“DS”替代以将RSV F蛋白稳定化于它的融合前构象。在一些实施方案中，RSV F蛋白可以包括位置190和/或207处的一处或多处空腔填充氨基酸替代以将该蛋白稳定化于融合前构象。例如，RSV F蛋白可以包括190F替代和/或207L替代。在一些实施方案中，RSV F蛋白可以包括S190F和F207L的“Cav1”替代。在一些实施方案中，RSV F蛋白可以包括S155C，S290C，S190F，和V207L的DS-Cav1替代以将蛋白稳定化于融合前构象。包括DS-Cav1氨基酸替代的来自A2亚群的RSV F蛋白(具有嵌合TM和/或CT域)的例示性DNA和蛋白质序列如SEQ ID NO：10-11和21-23所列。
可以用于将RSV F外域稳定化于融合前构象的另外的氨基酸替代和蛋白质修饰披露于例如WO2014160463，通过援引将其完整收录。HEK替代可以与任何用于将RSV F蛋白稳定化于融合前构象的氨基酸替代组合。
在数个实施方案中，重组副粘病毒基因组中包括的异源基因编码与重组副粘病毒的F蛋白的TM和CT连接的重组RSV F外域。
在一个实施方案中，重组副粘病毒是包括重组HPIV1基因组的重组HPIV1，该重组HPIV1基因组包括编码重组hRSV F外域的异源基因。RSV F外域可以是与来自HPIV1F蛋白的TM和CT连接的，例如如SEQ ID NO 31(TM)残基1-23，SEQ ID NO：31(CT)残基24-59，或SEQID NO：31(TM+CT)所列。下文提供了例示性序列：
包括HEK和DS-Cav1替代，和HPIV1F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F A2_HEK_DS-Cav1_H1CT)：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN(SEQ ID NO：133)
GenScript优化的RSV F A2_HEK_DS-Cav1_H1CT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtcgagtgcggagactgctggtcatgattaacagcacccacaattcccccgtcaacgcctacacactggagtctaggatgcgcaatccttatatggggaacaatagcaactgatag(SEQ IDNO：134)
包括HEK和DS-Cav1替代，和HPIV1F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV FA2_HEK_DS-Cav1_H1TMCT)：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTQIIMIIIVCILIIIICGILYYLYRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN(SEQ ID NO：135)
GenScript优化的RSV F A2_HEK_DS-Cav1_H1TMCT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacacagatcattatgatcattatcgtgtgcattctgattatcattatctgtggcatcctgtactatctgtaccgagtgcggagactgctggtcatgattaacagcacccacaattcccccgtcaacgcctacacactggagtctaggatgcgcaatccttatatggggaacaatagcaactgatag(SEQ ID NO：136)
在一个实施方案中，重组副粘病毒是包括重组HPIV2基因组的重组HPIV2，该重组HPIV2基因组包括编码重组hRSV F外域的异源基因。RSV F外域可以是与来自HPIV2F蛋白的TM和CT连接的，例如如SEQ ID NO：39残基1-28(TM)，SEQ ID NO：39残基29-66(CT)，或SEQID NO：39(TM+CT)所列。
在一个实施方案中，重组副粘病毒可以是包括如下基因组的重组HPIV3，该基因组包括编码重组hRSV F外域的异源基因。重组RSV F外域可以是与来自HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的，例如如SEQ ID NO 46残基1-23(TM)，SEQ ID NO：46残基24-46(CT)，或SEQ ID NO：46(TM+CT)所列。下文提供了例示性序列：
包括HEK和DS-Cav1替代，和HPIV3 F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_HEK_DS-Cav1_H3CT)蛋白质序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK(SEQ ID NO：8)
GenScript优化的RSV F_HEK_DS-Cav1_H3CT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaagtactaccgtatccagaagaggaacagagttgaccagaacgataagccatacgtgctcactaacaagtga(SEQ ID NO：9)
包括HEK和DS-Cav1替代，和HPIV3 F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)蛋白质序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIILIMIIILFIINITIITIAIKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK(SEQ ID NO：10)
GenScript优化的RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcatcttgatcatgatcatcatcctgttcatcatcaacatcacaatcatcaccatcgctatcaagtactaccgtatccagaagaggaacagagttgaccagaacgataagccatacgtgctcactaacaagtga(SEQ ID NO：11)
在一个实施方案中，重组副粘病毒是包括编码HPIV3 F和HN蛋白和BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白的重组病毒基因组的嵌合PIV，其中该病毒基因组进一步包括编码与来自BPIV3 F蛋白的TM和/或CT(例如如SEQ ID NO 53残基1-21(TM)，SEQ ID NO：53残基22-57(CT)或SEQ ID NO：53(TM+CT)所列)连接的重组hRSV F外域的异源基因。下文列出了可以在所公开的重组副粘病毒中使用的包括HEK，DS，和/或Cav1替代，以及来自BPIV3 F蛋白的异源TM和/或CT域的A2亚群的重组RSV F蛋白的例示性DNA和蛋白质序列。
包括HEK替代，和BPIV3 F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_B3TMCT)蛋白质序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(SEQ ID NO：12)
GeneArt优化的RSV F_A2_HEK_B3TMCT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcattatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(SEQ ID NO：13)
包括HEK和DS替代，hRSV F TM域和BPIV3 F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSVF_A2_HEK_DS_B3CT)蛋白质序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(SEQ ID NO：14)
GeneArt优化的RSV F_A2_HEK_DS_B3CT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(SEQ ID NO：15)
包括HEK和DS-Cav1替代，hRSV F TM域和BPIV3 F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3CT)蛋白质序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(SEQ ID NO：16)
GeneArt优化的RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3CT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(SEQ ID NO：17)
GenScript优化的RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3CT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtatcattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacattctgaccaacagacag(SEQ ID NO：18)
包括HEK和DS替代，和BPIV3 F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_DS_B3TMCT)蛋白质序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(SEQ ID NO：19)
GeneArt优化的RSV F_A2_HEK_DS_B3TMCT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(SEQ ID NO：20)
Genescript优化的RSV F_A2_HEK_DS_B3TMCT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctccaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaccatcattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtga(SEQ ID NO：137)
包括HEK和DS-Cav1替代，和BPIV3 F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)蛋白质序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(SEQ ID NO：21)
GeneArt优化的RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3TMCT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(SEQ ID NO：22)
GenScript优化的RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3TMCT DNA序列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaccatcattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtga(SEQ ID NO：23)
在一个实施方案中，重组副粘病毒包括包括编码重组hRSV F外域的异源基因的重组仙台病毒基因组。在此类实施方案中，与RSV F外域连接的TM和CT可以来自仙台病毒F蛋白，例如如SEQ ID NO：103残基1-21(TM)，SEQ ID NO：103残基22-65(CT)，或SEQ ID NO：103(TM+CT)所列。例如，在一些实施方案中，与仙台病毒TM和/或CT连接的重组hRSV F外域可以包括SEQ ID NO：105-108之一所列氨基酸序列：
包括HEK替代，和仙台病毒F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_SeVCT)蛋白质序列。
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(SEQ ID NO：105)
包括HEK替代，和仙台病毒F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_SeVTMCT)蛋白质序列。
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(SEQ ID NO：106)
包括HEK和DS-Cav1替代，和仙台病毒F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_SeVCT)蛋白质序列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR
(SEQ ID NO：107)
包括HEK和DS-Cav1替代，和仙台病毒F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSVF_A2_HEK_SeVTMCT)蛋白质序列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR
(SEQ ID NO：108)
在一个实施方案中，重组副粘病毒包括包括编码重组hRSV F外域的异源基因的重组NDV基因组。在此类实施方案中，与RSV F外域连接的TM和CT可以来自NDV病毒F蛋白，胞质尾，例如如SEQ ID NO：104残基1-21(TM)，SEQ ID NO：104残基22-49(CT)，或SEQ ID NO：104(TM+CT)所列。例如，在一些实施方案中，与NDV TM和/或CT连接的重组hRSV F外域可以包括SEQ ID NO：109-113之一所列氨基酸序列：
包括HEK替代，和NDV F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_NDVCT)蛋白质序列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(SEQ ID NO：109)
包括HEK替代，和NDV F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_NDVTMCT)蛋白质序列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIVLTIISLVFGILSLILACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(SEQ ID NO：110)
包括HEK和DS-Cav1替代，和NDV F CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_NDVCT)蛋白质序列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(SEQ ID NO：112)
包括HEK和DS-Cav1替代，和NDV F TM和CT域的来自A2株的hRSV F蛋白(RSV F_A2_HEK_NDVTMCT)蛋白质序列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR
(SEQ ID NO：113)
H.重组副粘病毒的另外的描述
特定实施方案
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒(PIV)，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDV F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDV F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV5F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV5F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒(PIV)，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDV F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDV F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV5F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV5F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒(PIV)，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV1F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV1F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDV F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDV F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5 F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5F蛋白的TM和CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒(PIV)，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV1F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV1 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组B/HPIV3，该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3 N，P，和M基因，HPIV3 F和HN基因，和BPIV3 L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDV F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDV N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDV F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5 F蛋白的CT连接的。
在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5，该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSV F外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5F蛋白的CT连接的。
在本文中公开的包括包括编码RSV F外域的异源基因的病毒基因组的重组副粘病毒(诸如上文讨论的任何重组副粘病毒)的任何实施方案中，编码重组RSV F外域的异源基因可以编码包含RSV F位置1-529的多肽序列。
另外的描述
所公开的重组副粘病毒是自我复制性的，即它们能够在感染适宜的宿主细胞后复制。在数个实施方案中，重组副粘病毒具有减毒表型，例如当施用于人受试者时。
重组副粘病毒的减毒可以使用本领域知道的多种方法来实现，例如通过引入一处或多处引起重组副粘病毒的生物学功能改变，导致减毒表型的突变。插入异源基因也能导致减毒表型。优选地，包含编码异源基因的基因组的副粘病毒在细胞或哺乳动物中与野生型副粘病毒相比减毒约100至5000倍或更多。
可以在公知的体外和体内模型中测试所公开的重组副粘病毒以确认适当的减毒，对表型反转的抗性，和免疫原性。在体外测定法，可以对经修饰的副粘病毒测试一种或多种期望表型，诸如例如温度敏感性复制。还可以在PIV和/或重组病毒中包括的异源基因的病毒病原体(例如RSV)感染的动物模型中测试所公开的重组副粘病毒。多种动物模型是知道的。
重组减毒副粘病毒优选在细胞或哺乳动物中与野生型副粘病毒相比减毒约100至5000倍。在一些实施方案中，优选的是，体外病毒复制水平足以提供供在广泛规模上使用的病毒疫苗生产。在一些实施方案中，优选的是，减毒副粘病毒体外病毒复制水平是至少106，更优选至少107，和最优选至少108每ml。减毒突变优选是稳定的。具有至少两处，三处，四处或甚至更多处减毒突变的重组副粘病毒很可能是更加稳定的。
正在进行的临床前研究已经鉴定出对于HPIV1，HPIV2，和HPIV3是减毒性的，而且可以通过反求遗传学来引入以生成减毒株作为潜在疫苗和载体主链的一些突变或修饰。在HPIV主链中包括外来基因对它自身也是减毒性的。这可能是由于多种效应，包括基因组长度延长和基因数目增多以及外来蛋白的影响。无论原因如何，当试图实现适宜水平的减毒时，还不得不考虑插入物的减毒效果。
HPIV1，2，和3的减毒株已经或当前处于血清阴性婴儿和儿童中的临床研究(Karron,et al.2012.Vaccine 30:3975-3981；Schmidt,et al.2011.ExpertRev.Respir.Med.5:515-526)。这些减毒HPIV1，HPIV2，和HPIV3株，或其型式是用于表达异源RSV F蛋白的潜在载体。
提供减毒表型的对副粘病毒基因组的修饰的例子是本领域知道的，而且已经记载于例如美国专利公开文本2012/0045471；2010/0119547；2009/0263883；2009/0017517；8084037；6,410,023；8,367,074；7,951,383；7,820,182；7704509；7632508；7622123；7250171；7208161；7201907；7192593；2012/0064112；20140186397；Newman etal.2002.Virus genes 24:77-92；Tang et al.,2003.J Virol,77(20):10819-10828；Basavarajappa et al.2014Vaccine,32:3555-3563；McGinnes et al.,J.Virol.,85:366-377,2011；和Jones et al.,Vaccine,30:959-968,2012，通过援引将其每一篇完整收入本文。例如，PIV3的减毒可以通过存在BPIV3衍生基因来实现，其赋予灵长动物中的宿主范围限制，包括人，诸如除了来自HPIV3的F和HN之外含有BPIV3基因的B/HPIV3病毒(Skiadopoulos MH et al J Virol 77:1141-8,2003)。由于宿主范围限制，仙台病毒也限于灵长动物(Jones BG et al Vaccine 30:959-968,2012)。减毒的另一种手段以多种基因中可以发生的错义突变例示，诸如cp45HPIV3病毒中的(Skiadopoulos MH et al J Virol73:1374-81,1999)。下文实施例2中为HPIV1提供了减毒性点突变的其它例子。删除一个或数个密码子也能赋予减毒表型，如实施例2中的HPIV1例示的。还如实施例1中例示的，存在与异源外域连接的载体TM加CT，或CT域能强烈减毒载体。HPIV1中的减毒突变的其它例子记载于Bartlett EJ et al Virol J 4:67,2007，而HPIV2的记载于Nolan SM et al,Vaccine23:4765-4774,2005。删除一种或多种辅助基因的整个或部分也是减毒的手段(Durbin AVirology 261:319-330,1999)。
可以在动物模型(诸如非人灵长动物，例如非洲绿猴)中评估重组减毒副粘病毒的免疫原性，这通过测定在一次免疫接种之后和在第二次免疫接种之后形成针对副粘病毒的抗体的动物的数目，和通过测量该响应的程度来进行。在一些实施方案中，如果约60至80％的动物在第一次免疫接种之后发生抗体且约80至100％的动物在第二次免疫接种之后发生抗体的话，重组副粘病毒具有足够的免疫原性。优选地，免疫应答针对发起副粘病毒和所衍生的重组副粘病毒中包括的异源基因来源的病毒病原体二者的感染提供保护。
I.另外的载体
会领会的是，可以在除PIV载体以外的载体上包括(或表达)重组RSV F蛋白和编码它的核酸分子。例如，可以使用质粒载体，以及其它病毒载体，例如，用于在宿主细胞中表达重组RSV F蛋白或其片段，或用于受试者的免疫接种，如本文中公开的。在一些实施方案中，可以作为初始-加强疫苗接种的一部分对受试者施用载体。在数个实施方案中，载体包括在疫苗中，诸如供初始-加强疫苗接种中使用的初始疫苗或加强疫苗。
在数个例子中，载体可以是复制胜任和/或减毒的病毒载体。病毒载体也可以是条件性复制胜任的。在其它例子中，病毒载体在宿主细胞中是复制缺陷的。
已经构建了可以用于表达重组RSV F蛋白或其免疫原性片段的一些病毒载体，包括多瘤，即SV40(Madzak et al.,1992,J.Gen.Virol.,73:1533-1536)，腺病毒(Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-6；Berliner et al.,1988,Bio Techniques,6:616-629；Gorziglia et al.,1992,J.Virol.,66:4407-4412；Quantin et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584；Rosenfeld et al.,1992,Cell,68:143-155；Wilkinson et al.,1992,Nucl.Acids Res.,20:2233-2239；Stratford-Perricaudet etal.,1990,Hum.Gene Ther.,1:241-256)，痘苗病毒(Mackett et al.,1992,Biotechnology,24:495-499)，腺伴随病毒(Muzyczka,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:91-123；On et al.,1990,Gene,89:279-282)，疱疹病毒，包括HSV和EBV(Margolskee,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-90；Johnsonet al.,1992,J.Virol.,66:2952-2965；Fink et al.,1992,Hum.Gene Ther.3:11-19；Breakfield et al.,1987,Mol.Neurobiol.,1:337-371；Fresse et al.,1990,Biochem.Pharmacol.,40:2189-2199)，辛德比斯病毒(H.Herweijer et al.,1995,HumanGene Therapy 6:1161-1167；美国专利No.5,091,309和5,2217,879)，甲病毒(S.Schlesinger,1993,Trends Biotechnol.11:18-22；I.Frolov et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11371-11377)和鸟(Brandyopadhyay et al.,1984,Mol.Cell Biol.,4:749-754；Petropouplos et al.,1992,J.Virol.,66:3391-3397)，鼠(Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24；Miller et al.,1985,Mol.CellBiol.,5:431-437；Sorge et al.,1984,Mol.Cell Biol.,4:1730-1737；Mann et al.,1985,J.Virol.,54:401-407)，和人(Page et al.,1990,J.Virol.,64:5370-5276；Buchschalcher et al.,1992,J.Virol.,66:2731-2739)起源的逆转录病毒。杆状病毒(苜蓿尺蠖(Autographa californica)多核多角体病毒；AcMNPV)载体也是本领域知道的，而且可以自商业性来源获得(诸如PharMingen,San Diego,Calif.；Protein Sciences Corp.,Meriden,Conn.；Stratagene,La Jolla,Calif.)。
在数个实施方案中，病毒载体可以包括表达所公开的重组RSV F蛋白或其免疫原性片段(诸如RSV F外域)的腺病毒载体。可以使用来自各种起源，亚型，或亚型混合物的腺病毒作为用于腺病毒载体的病毒基因组的来源。可以使用非人腺病毒(例如猿，黑猩猩，大猩猩，鸟，犬，绵羊，或牛腺病毒)来生成腺病毒载体。例如，可以使用猿腺病毒作为腺病毒载体的病毒基因组的来源。猿腺病毒可以是血清型1，3，7，11，16，18，19，20，27，33，38，39，48，49，50，或任何其它猿腺病毒血清型的。猿腺病毒可以通过使用本领域知道的任何合适缩写来提及，诸如例如SV，SAdV，SAV或sAV。在一些例子中，猿腺病毒载体是血清型3，7，11，16，18，19，20，27，33，38，或39的猿腺病毒载体。在一个例子中，使用黑猩猩血清型C Ad3载体(参见例如Peruzzi et al.,Vaccine,27:1293-1300,2009)。可以使用人腺病毒作为腺病毒载体的病毒基因组的来源。人腺病毒可以是各种亚群或血清型的。例如，腺病毒可以是A亚群(例如血清型12，18，和31)，B亚群(例如血清型3，7，11，14，16，21，34，35，和50)，C亚群(例如血清型1，2，5，和6)，D亚群(例如血清型8，9，10，13，15，17，19，20，22，23，24，25，26，27，28，29，30，32，33，36-39，和42-48)，E亚群(例如血清型4)，F亚群(例如血清型40和41)，未归类的血清群(例如血清型49和51)，或任何其它腺病毒血清型的。本领域普通技术人员熟悉复制胜任和缺陷性腺病毒载体(包括单一和多重复制缺陷性腺病毒载体)。复制缺陷性腺病毒载体(包括多重复制缺陷性腺病毒载体)的例子披露于美国专利No.5,837,511；5,851,806；5,994,106；6,127,175；6,482,616；和7,195,896，和国际专利申请No.WO 94/28152，WO95/02697，WO 95/16772，WO 95/34671，WO 96/22378，WO 97/12986，WO 97/21826，和WO 03/022311。
III.重组方法，载体，和宿主细胞
可以通过合成和重组方法来生成本文中公开的重组副粘病毒和多核苷酸。因而，还提供了编码感染性副粘病毒克隆的多核苷酸和包括感染性克隆的宿主细胞，以及通过重组方法生成此类载体和宿主细胞的方法。
还提供了编码本文中公开的任何重组RSV F蛋白的分离的核酸分子。
如上文讨论的，可以通过本领域公知的技术来合成或准备所公开的副粘病毒或多核苷酸。参见例如WO94/027037和US20130052718。野生型副粘病毒基因组的核苷酸序列是知道的且容易得到的，例如在因特网上在GenBank处(www-ncbi-nlm-nihgov/entrez)。可以使用本领域普通技术人员知道的方法来合成或扩增编码所公开的重组副粘病毒的核苷酸序列，包括在无细胞环境中利用DNA聚合酶。进一步地，本领域技术人员能容易地使用遗传代码来构建多种功能性等同核酸，诸如序列不同但编码相同蛋白质序列的核酸。
可以通过克隆技术来制备例示性核酸。适宜的克隆和测序技术的例子，和足以指导通过许多克隆训练的技术人员的用法说明是知道的(参见例如Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012，和Ausubel et al.(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,through supplement 104,2013)。来自生物学试剂和实验设备的制造商的产品信息也提供有用的信息。此类制造商包括SIGMA Chemical Company(Saint Louis，MO)，R&D Systems(Minneapolis，MN)，Pharmacia Amersham(Piscataway，NJ)，CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)，Chem Genes Corp.，Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)，Glen Research，Inc.，GIBCO BRL Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)，Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)，Invitrogen(Carlsbad，CA)，和Applied Biosystems(Foster City，CA)，以及技术人员知道的许多其它商业性来源。
重组副粘病毒的基因组可以包括一处或多处变异(例如引起氨基酸删除，替代，或插入的突变)，只要所得重组副粘病毒保留期望的生物学功能，诸如某一水平的减毒或免疫原性。序列中的这些变异可以是天然发生变异，或者它们可以是经由使用本领域技术人员知道的遗传工程技术而工程化改造的。此类技术的例子可见于参见例如Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor,New York,2012)和Ausubel et al.(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,through supplement 104,2013，通过援引将二者完整收入本文。
可以对编码本文中描述的核酸进行修饰而不降低它的生物学活性。可以使用已知的重组方法来进行氨基酸替代，插入，和删除，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变，丙氨酸扫描，PCR诱变，定点诱变，盒式诱变，限制性选择诱变，等等(参见例如Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012，和Ausubel et al.(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,through supplement 104,2013)。可以进行一些修饰以便于靶向分子在融合蛋白中的克隆，表达，或掺入。此类修饰是本领域技术人员公知的，而且包括例如终止密码子，在氨基端添加甲硫氨酸以提供起始位点，置于任一末端的另外的核苷酸以创建方便定位的限制性位点。
“保守”氨基酸替代是那些没有实质性影响或降低蛋白质的功能，诸如蛋白质当施用于受试者时诱导免疫应答的能力的替代。术语保守变异还包括使用替代的(substituted)氨基酸代替未替代的(unsubstituted)亲本氨基酸。而且，普通技术人员会认识到，在改变导致氨基酸用化学相似氨基酸替代的情况中，改变，添加或删除所编码的序列中的一个氨基酸或小百分比氨基酸(例如少于5％，在一些实施方案中少于1％)的个别替代，删除或添加是保守变异。
提供功能相似氨基酸的保守氨基酸替代表是本领域普通技术人员公知的。下述六组是认为是彼此的保守替代的氨基酸的例子：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
可以自分离自生物学样品的病毒生成所公开的重组副粘病毒。可以通过本领域知道的标准重组方法来生成多核苷酸和载体，诸如聚合酶链式反应(Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012，和Ausubel et al.(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,through supplement 104,2013)。本领域技术人员还知道改变或修饰核酸序列的方法。
可以自顺序克隆入包括用于在宿主中繁殖的选择标志的载体的聚合酶链式反应盒装配副粘病毒基因组。此类标志包括二氢叶酸脱氢酶或用于真核细胞培养的新霉素抗性基因和用于大肠杆菌和其它细菌中的培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。
可以使用标准重组方法将多核苷酸插入用于克隆的可复制载体。多种载体是公众可得的。例如，载体可以处于质粒，粘粒，病毒颗粒，或噬菌体的形式。可以通过多种规程将适宜的核酸序列插入载体。一般而言，使用本领域知道的技术将核酸插入适宜的限制性内切核酸酶位点。载体成分一般包括但不限于一种或多种信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。包括一个或多个这些成分的合适载体的构建采用技术人员知道的标准连接技术。
合适的可复制载体的例子包括但不限于pUC19或pTM1。多核苷酸可以与适宜的启动子可操作连接，诸如例如T7聚合酶启动子，巨细胞病毒启动子，细胞聚合酶II启动子，或SP1启动子。可复制载体可以进一步包括用于转录起始，转录终止的位点，和用于翻译的核糖体结合位点。
由副粘病毒基因组或编码副粘病毒蛋白的多核苷酸构成的重组载体导入宿主细胞(诸如例如细菌细胞或真核细胞)可以通过磷酸钙转染，DEAE-右旋糖酐介导的转染，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，电核转运，化学转导，电转导，感染，或其它方法来实现。此类方法记载于标准实验室手册，诸如Sambrook et al.(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012，和Ausubel et al.(In CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,through supplement104,2013。商业性转染试剂也是可得的，诸如Lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)和FuGENE 6TM(Roche Diagnostics，Indianapolis，Ind.)。合适的宿主细胞包括但不限于HEp-2细胞，FRhL-DBS2细胞，LLC-MK2细胞，MRC-5细胞，和Vero细胞。
IV.免疫原性组合物
还提供了包含本文中描述的重组副粘病毒(诸如包括编码异源重组RSV F蛋白的基因组的重组PIV)和药学可接受载剂的免疫原性组合物。可以通过本领域普通技术人员知道的多种施用模式来对受试者施用此类组合物，例如通过鼻内路径。用于制备可施用组合物的实际方法会是本领域技术人员知道或清楚的，而且更加详细地记载于诸如RemingtonsPharmaceutical Sciences,19th Ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,1995等出版物。
因而，本文中描述的重组副粘病毒可以与药学可接受载剂一起配制以帮助保留生物学活性，同时还促进在可接受温度范围内贮存期间升高的稳定性。潜在的载剂包括但不限于生理学平衡的培养基，磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳状液(例如油/水或水/油乳状液)，各种类型的润湿剂，防冻添加剂或稳定剂诸如蛋白质，肽或水解产物(例如清蛋白，明胶)，糖(例如蔗糖，乳糖，山梨醇)，氨基酸(例如谷氨酸钠)，或其它保护剂。所得水性溶液可以就这样包装供使用或冻干。冻干制剂在施用前与无菌溶液组合，用于一次或多次剂量给药任一。
所配制的组合物(尤其是液体配制剂)可以含有抑菌剂以防止或最小化贮存期间的降解，包括但不限于有效浓度(通常≦1％w/v)的苄醇，酚，间甲酚，氯丁醇，对羟基苯甲酸甲酯，和/或对羟基苯甲酸丙酯。抑菌剂对于有些患者可能是禁忌的；因此，冻干配制剂可以在含或不含此类成分的溶液任一中重建。
所公开的药物组合物可以根据接近生理学条件的需要而含有药学可接受媒介物质，诸如pH调节和缓冲剂，张力调节剂，润湿剂，等等，例如乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，单月桂酸山梨聚糖酯，和油酸三乙醇胺酯。
药物组合物可以任选包括佐剂以增强宿主的免疫应答。合适的佐剂是例如toll样受体激动剂，明矾，AlPO4，铝胶，脂质A和其衍生物或变体，油-乳状液，皂苷，中性脂质体，含有疫苗和细胞因子的脂质体，非离子嵌段共聚物，和趋化因子。在本领域公知的许多其它合适佐剂中，可以使用含有聚氧乙烯(POE)和聚氧丙烯(POP)的非离子嵌段聚合物，诸如POE-POP-POE嵌段共聚物，MPLTM(3-O-脱酰单磷酰基脂质A；Corixa，Hamilton，IN)和IL-12(Genetics Institute，Cambridge，MA)作为佐剂(Newman et al.,1998,Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142)。这些佐剂具有优势，即它们帮助以非特异性方式刺激免疫系统，由此增强对药物产品的免疫应答。
在一些实施方案中，组合物可以包括编码来自一种特定RSV亚群或株的RSV F外域的重组副粘病毒，而且还有编码来自不同RSV亚群或株的RSV F外域的重组副粘病毒。例如，组合物可以包括包括来自A亚型和B亚型RSV的重组RSV F蛋白的重组副粘病毒。不同载体可以在混合物中同时施用，或分开施用。由于RSV的某些株之间的交叉保护现象，编码来自第一株的RSV F外域的一种副粘病毒的免疫接种可能针对相同或不同亚群的数个不同株提供保护。
在一些情况中，可能想要组合重组病毒载体或其组合物与诱导针对其它因子(特别是那些引起其它儿童病的)的保护性应答的其它药物产品(例如疫苗)。例如，包括本文中描述的重组副粘病毒的组合物可以与免疫接种实践咨询委员会(Advisory Committee onImmunization Practices，ACIP；cdc.gov/vaccines/acip/index.html)对目标年龄组(例如大约1至6个月大的婴儿)推荐的其它疫苗同时(典型地是分开的)或顺序施用。这些另外的疫苗包括但不限于IN施用的疫苗。照此，包括本文中描述的重组RSV F蛋白的重组副粘病毒可以与针对例如乙型肝炎(HepB)，白喉，破伤风和百日咳(DTaP)，肺炎球菌(PCV)，b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)，脊髓灰质炎，流感和轮状病毒的疫苗同时或顺序施用。
基于它们的减毒和免疫原性来选择供免疫原性组合物(诸如例如疫苗)中使用的重组副粘病毒。这些疫苗选择标准是依照公知方法确定的。优选地，候选病毒具有稳定的减毒表型，在接受了免疫接种的宿主中展现复制，且在接受者中有效引发免疫应答的产生，优选保护性免疫应答。优选地，候选病毒刺激并扩张免疫应答，例如诱导针对不同病毒株或亚群的免疫应答和/或刺激由不同免疫学基础(例如分泌对血清免疫球蛋白，细胞免疫，等等)介导的免疫应答。
药物组合物典型地含有有效量的所公开的副粘病毒，而且可以通过常规技术来制备。典型地，每剂免疫原性组合物中的重组病毒的量选择成在没有显著，不利副作用的情况下诱导免疫应答的量。在一些实施方案中，可以以用于在受试者中诱导免疫应答(例如在受试者中预防PIV和/或RSV感染)的单位剂量形式提供组合物。单位剂量形式含有对于施用于受试者合适的一个预选择剂量，或合适标记或计量倍数的两个或更多个预选择单位剂量，和/或用于施用单位剂量或其倍数的计量装置。在其它实施方案中，组合物进一步包括佐剂。
V.引发免疫应答的方法
本文中提供的是在受试者中引发免疫应答的方法，其通过对该受试者施用一种或多种所公开的重组副粘病毒来进行。在一个特定例子中，受试者是人。免疫应答可以是保护性免疫应答，例如预防或减轻副粘病毒或重组副粘病毒中包括的异源基因的病毒的后续感染的应答。还可以使用引发免疫应答来治疗或抑制病毒感染和与其相关的病。在数个实施方案中，该方法包括施用包括减毒重组副流感病毒的免疫原性组合物，该减毒重组副流感病毒包括包括异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与PIV F蛋白跨膜(TM)域和胞质尾连接的重组RSV F外域。
可以为治疗选择具有副粘病毒感染(诸如RSV和/或PIV感染)或处于其发生风险(例如由于暴露或有可能暴露于RSV和/或PIV)的受试者。在施用所公开的免疫原之后，可以对受试者监测副粘病毒感染或与其相关的症状，或二者。
对受试者鼻内施用重组副粘病毒的方法是本领域普通技术人员知道的，就像为施用选择受试者，制备用于鼻内施用的包括重组副粘病毒的免疫原性组合物，和对受试者评估针对重组副粘病毒的免疫应答的方法。此类方法的例示性描述可见于例如Karron etal,2012.Vaccine,30(26),3975-3981，通过援引将其完整收入本文。
意图用本公开文本的治疗剂和方法治疗的典型受试者包括人，以及非人灵长动物和其它动物。因为几乎所有人到5岁时感染有RSV和PIV，所以包括整个出生群组作为免疫接种的有关群体。这可以例如通过在出生至6月龄，6月龄至5岁龄的任何时间，在妊娠妇女(或育龄妇女)(通过抗体的被动转移来保护她们的婴儿)，新生婴儿或胎儿的家庭成员，和年龄大于50岁的受试者中开始免疫接种方案来进行。本公开文本的范围意图包括母体免疫接种。在数个实施方案中，受试者是RSV或PIV3特异性抗体呈血清阴性的人受试者。在另外的实施方案中，受试者不超过1岁龄，诸如不超过6月龄，不超过3月龄，或不超过1月龄。
处于具有严重症状(例如需要住院)的RSV和/或PIV感染的最大风险的受试者包括对严重疾病最易感的具有早产，支气管肺发育异常，和先天性心脏病的儿童。在儿童期和成人期期间，疾病是较温和的，但是可以与下气道疾病有关且常常因鼻窦炎而变得复杂。疾病严重性在收容的老年人(例如超过65岁龄的人)中升高。严重疾病还在具有严重联合免疫缺陷疾病的人中或在骨髓或肺移植后发生。因而，可以为所公开的重组副粘病毒的施用选择这些受试者。
为了为依照本公开文本的方法的预防或治疗鉴定受试者，采用公认的筛选方法来确定与目标或怀疑疾病或状况相关的风险因素，或确定受试者中现有疾病或状况的状态。这些筛选方法包括例如确定可能与目标或怀疑疾病或状况相关的环境，家族，职业，和其它此类风险因素的常规检查，以及诊断方法，诸如本领域可得的且公知的用于检测和/或表征副粘病毒感染的各种ELISA和其它免疫测定方法。这些和其它例行方法容许临床医师选择需要使用本公开文本的方法和药物组合物来治疗的患者。与这些方法和原理一致，可以依照本文中的教导或本领域普通技术人员知道的其它常规方法作为独立的预防或治疗程序，或作为其它治疗的跟踪，辅助或配合治疗方案施用组合物。
所公开的重组副粘病毒的施用可以是出于预防或治疗目的。当预防性提供时，可以在任何症状之前，例如在感染之前提供免疫原。预防性施用用来引发能预防或改善任何后续感染的免疫应答。在一些实施方案中，该方法可以涉及选择处于招致副粘病毒感染风险的受试者，并对该受试者施用有效量的所公开的重组副粘病毒。可以在预期的暴露于副粘病毒之前(从而引发能削弱感染和/或相关疾病症状的预期严重性，持续时间或程度的免疫应答)，在暴露或怀疑暴露于该病毒之后，或在感染实际起始之后提供重组副粘病毒。在一些例子中，使用本文中公开的方法的治疗延长受试者的存活时间。
当受试者随后感染或再感染野生型RSV或PIV时，对受试者施用所公开的包括RSV和PIV抗原的重组副粘病毒能引发产生针对严重下呼吸道疾病(诸如肺炎和细支气管炎，或哮吼)保护性的免疫应答。虽然自然循环的病毒仍然能够引起感染，特别是在上呼吸道中，但是作为疫苗接种和可能的后续野生型病毒感染所致抗性加强的结果，鼻炎的可能性降低了。在疫苗接种之后，有可检测水平的能够在体外和在体内中和同源(相同亚群的)野生型病毒的宿主生成血清和分泌型抗体。在许多情况中，宿主抗体还会中和不同的非疫苗亚群的野生型病毒。为了实现更高水平的交叉保护，例如针对另一个亚群的异源株的，可以给受试者疫苗接种包括包括来自RSV A和B亚群二者的至少一种优势株的RSV F蛋白的重组病毒载体的组合物。
以有效诱导或增强针对受试者(优选人)中的病毒中包括的抗原的免疫应答的量对受试者提供本文中描述的重组病毒载体，和其免疫原性组合物。有效量会容许病毒的一些生长和繁殖以产生期望的免疫应答，但是不会生成病毒相关症状或病。基于本文中提供的指导和本领域的知识，本领域技术人员会容易地能够确定活疫苗中要使用的病毒的适当量。精确量会取决于数个因素，例如受试者的健康状态和重量，施用的模式，病毒的减毒程度，配制剂的性质，和受试者的免疫系统是否是受损的。
可以在配合(或初始-加强)疫苗接种方案或组合配制剂中使用包括一种或多种所公开的重组副粘病毒的免疫原性组合物。在某些实施方案中，新颖的组合免疫原性组合物和配合免疫接种方案采用分开的免疫原或配制剂，每一种均致力于引发抗病毒免疫应答，诸如针对RSV和PIV蛋白的免疫应答。分开的引发抗病毒免疫应答的免疫原性组合物可以在在一个免疫接种步骤中施用于受试者的多价免疫原性组合物中组合，或者它们可以在配合(或初始-加强)免疫接种方案中分开(在单价免疫原性组合物中)施用。
涵盖的是，可以有数次加强，而且每次加强可以是不同的所公开的免疫原。在一些例子中还涵盖的是，加强可以是与另一次加强或初始相同的免疫原。
一旦施用所公开的重组副粘病毒，受试者的免疫系统典型地通过生成对病毒蛋白特异性的抗体来响应免疫原性组合物。此类应答意味着对受试者投递了免疫学有效剂量。
对于每位特定受试者，可以根据个体需要和施用免疫原性组合物或监督免疫原性组合物施用的人员的专业判断随时间评估和调整特定剂量方案。在一些实施方案中，会在评估有效剂量/免疫接种方案的背景中测定受试者的抗体应答。在大多数情况中，评估受试者获得的血清或血浆中的抗体滴度会是足够的。是否施用加强接种和/或改变施用于个体的治疗剂的量的决策可以至少部分基于抗体滴度水平。抗体滴度水平可以基于例如免疫结合测定法，其测量血清中结合至抗原(包括例如RSV F蛋白)的抗体的浓度。所公开的免疫原的实际剂量会随诸如受试者的疾病适应证和特定状态(例如该受试者的年龄，体型，健康，症状的程度，易感性因子，等等)，施用的时间和路径，正在并行施用的其它药物或治疗，以及用于在受试者中引发期望活性或生物学应答的组合物的具体药理学等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的预防或治疗应答。
有效剂量的确定典型地基于动物模型研究，接着是人体临床试验，而且受到显著降低受试者中目标疾病症状或状况的发生率或严重性，或在受试者中诱导期望应答(诸如中和性免疫应答)的施用方案指导。在这点上合适的模型包括例如鼠，大鼠，猪，猫，雪貂，非人灵长动物，和本领域知道的其它公认动物模型受试者。或者，可以使用体外模型(例如免疫学和组织病理学测定法)来确定有效剂量。使用此类模型时，只需要普通计算和调整来确定用于施用治疗有效量的组合物(例如有效引发期望的免疫应答或减轻目标疾病的一种或多种症状的量)的适宜浓度和剂量。在备选实施方案中，出于治疗或诊断目的任一，有效量或有效剂量的组合物可以仅仅抑制或增强一种或多种与本文中所列疾病或状况相关的选定生物学活性。在一个实施方案中，病毒施用的通用范围是约103至约107个噬斑形成单位(PFU)或更多的病毒每位人受试者，包括约104至约105PFU病毒每位人受试者。
诱导降低或预防感染的免疫应答的免疫原性组合物的施用可以但是并非必须完全消除此类感染，只要感染可测量地降低，例如降低至少约50％，诸如至少约70％，或约80％，或甚至约90％在该药剂缺失下的感染，或与参照药剂相比。那些需要治疗的包括一般群体和/或感染有副粘病毒(诸如RSV和/或PIV)或处于其感染风险的患者。
在一个例子中，期望应答是抑制或降低或预防RSV和/或PIV感染或再感染。有效的方法不需要完全消除或降低或预防RSV和/或PIV感染。例如，与合适对照相比，施用有效量的所公开的重组副粘病毒可以将后续RSV和/或PIV感染(例如如通过细胞感染或通过受到RSV和/或PIV感染的受试者的数目或百分比测量的)降低期望量，例如至少10％，至少20％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，或甚至至少100％(消除或预防可检测的RSV和/或PIV感染)。
剂量和剂数会取决于设置，例如，在通过在先副粘病毒感染或免疫接种而初始的成人或任何人，一剂可能是足够的加强剂。在未接触的受试者中，在一些例子中，可以给予至少两剂，例如至少三剂。在一些实施方案中，给予每年加强，例如随同每年流感疫苗接种。
在受试者的免疫接种之后，可以在适宜时间点自受试者收集血清，冷冻，并贮存，供抗体滴度测定法和/或中和测试用。抗体水平的定量可以通过亚型特异性中和测定法或ELISA来实施。测定中和活性的方法是本领域普通技术人员知道的，而且本文中有进一步描述，包括但不限于噬斑减少中和(PRNT)测定法，微量中和测定法，基于流式细胞术的测定法，单周期感染测定法。在一些实施方案中，可以使用一组RSV或PIV假pseudo病毒来测定血清中和活性。通过先前记载的PRVN测定法(de Graaf et al.,J.Virol Methods,143:169-174,2007)在血清样品中测定病毒中和性抗体滴度。简言之，可以稀释血清样品并与大约50p.f.u.表达增强型绿色荧光蛋白的NL/1/00或NL/1/99一起于37℃温育60分钟。随后，将病毒-血清混合物添加至24孔板中的Vero-118细胞并于37℃温育。2小时后，用等量的感染培养基和2％甲基纤维素的混合物替换上清液。6天后，使用Typhoon 9410可变模式成像仪(GE Healthcare)对荧光噬斑计数。抗体滴度表述为依照Reed&Muench,Am.J.Hyg.,27,493-497,1938的方法计算的，导致噬斑数目减少50％的稀释度。
另外的实施方案：
条款1。一种重组副粘病毒，其包含(a)包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的跨膜域(TM)和胞质尾(CT)连接的异源病毒的I型跨膜蛋白的外域；或(b)包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的HN蛋白的TM和CT连接的异源病毒的II型跨膜蛋白的外域。
条款2。条款1的重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒是重组人/牛副流感病毒3(B/HPIV3)，重组人副流感病毒1(HPIV1)，重组人副流感病毒1(HPIV2)，重组人副流感病毒1(HPIV3)，重组副流感病毒5(PIV5)，重组仙台病毒，或重组新城疫病毒(NDV)。
条款3。条款2的重组副粘病毒，其包含：包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组副流感病毒(PIV)，该异源基因编码与PIV F蛋白TM和CT连接的重组呼吸道合胞病毒(RSV)F外域；包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组NDV，该异源基因编码与NDV F蛋白TM和CT连接的重组RSV F外域；或包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组仙台病毒，该异源基因编码与仙台病毒F蛋白TM和CT连接的重组RSV F外域。
条款4。条款1-3任一项的重组副粘病毒，其包含：包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组PIV，该异源基因编码与PIV F蛋白TM和CT连接的重组RSV F外域。
条款5。条款4的重组副粘病毒，其中该RSV F外域来自人RSV(hRSV)F蛋白。
条款6。条款4或条款5的重组副粘病毒，其中该hRSV F蛋白来自A亚型hRSV或B亚型hRSV。
条款7。条款4-6任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域通过与天然RSV F蛋白序列相比的一处或多处氨基酸替代而稳定化于RSV F融合前构象。
条款8。条款4-7任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含下列氨基酸：(a)66E；(b)101P；(c)155C和290C；(d)190F；(e)207L；或(f)(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)，(d)，和(e)；(a)，(c)，(d)，和(e)；(a)，(b)，和(c)；(a)，(b)，和(d)；(a)，(b)，和(e)；(a)，(b)，(e)，和(d)；(a)，(b)，(c)，(d)，和(e)；(c)和(d)；或(c)和(e)；或(c)，(d)，和(e)的组合，其中氨基酸编号方式对应于SEQ ID NO：1所列RSV F蛋白序列。
条款9。条款8的重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含下列氨基酸替代：(a)K66E；(b)Q101P；(c)S155C和S290C；(d)S190F；(e)V207L；或(f)(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)，(d)，和(e)；(a)，(c)，(d)，和(e)；(a)，(b)，和(c)；(a)，(b)，和(d)；(a)，(b)，和(e)；(a)，(b)，(e)，和(d)；(a)，(b)，(c)，(d)，和(e)；(c)和(d)；或(c)和(e)；或(c)，(d)，和(e)的组合。
条款10。条款8或条款9的重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含66E，101P，115C，290C，190F，和207L。
条款11。条款4-10任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含与SEQ ID NO：1(WT RSV F A)，2(WT RSV F B)，12(A2HEK)，14(A2HEK+DS)，或21(A2HEK+DS-Cav1)之一的RSV外域至少85％同一的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：12，14，或21的RSV外域的氨基酸序列。
条款12。条款4-11任一项的重组副粘病毒，其中该PIV是重组PIV1，重组PIV2，或重组PIV3。
条款13。条款12的重组副粘病毒，其中该重组PIV是：重组PIV1，且与RSV F外域连接的TM和CT来自PIV1F蛋白；重组PIV2，且与RSV F外域连接的TM和CT来自PIV2F蛋白；或重组PIV3，且与RSV F外域连接的TM和CT来自PIV3F蛋白。
条款14。条款12或条款13的重组副粘病毒，其中该重组PIV是：重组HPIV1且与RSVF外域连接的PIV F TM和CT来自HPIV1F蛋白；重组HPIV2且与RSV F外域连接的PIV F TM和CT来自HPIV2F蛋白；重组HPIV3且与RSV F外域连接的PIV F TM和CT来自HPIV3 F蛋白；或重组B/HPIV3且与RSV F外域连接的PIV F TM和CT来自BPIV3 F蛋白。
条款15。条款4-14任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域来自hRSV F蛋白，且该TM和CT来自BPIV3 F蛋白。
条款16。条款4-15任一项的重组副粘病毒，其中该重组PIV是：重组HPIV1且与RSVF外域连接的PIV F TM和CT包含SEQ ID NO：31所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：31至少90％同一的氨基酸序列；重组HPIV2且与RSV F外域连接的PIV F TM和CT包含SEQ ID NO：39所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：39至少90％同一的氨基酸序列；重组HPIV3且与RSV F外域连接的PIV F TM和CT包含SEQ ID NO：46所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46至少90％同一的氨基酸序列；或重组B/HPIV3且与RSV F外域连接的PIV F TM和CT包含SEQ ID NO：53所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：53至少90％同一的氨基酸序列。
条款17。条款4-16任一项的重组副粘病毒，其中该重组PIV是：重组HPIV3且编码与HPIV3 F TM和CT连接的hRSV F外域的异源基因包含SEQ ID NO：10所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；或重组B/HPIV3且编码与BPIV3 F TM和CT连接的hRSV F外域的异源基因包含SEQ ID NO：21所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列。
条款18。条款4-17任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域来自hRSV F蛋白且该重组PIV包含编码下述各项的病毒基因组：HPIV3 F和HN蛋白和BPIV3 N，P，C，V，M，和L蛋白，且其中与RSV F外域连接的TM和CT来自BPIV3 F蛋白；HPIV1N，P，C，M，F，HN和L蛋白，且其中与RSV F外域连接的TM和CT来自HPIV1F蛋白；HPIV2N，P，V，M，F，HN和L蛋白，且其中与RSV F外域连接的TM和CT来自HPIV2F蛋白；或HPIV3 N，P，C，M，F，HN和L蛋白，且其中与RSV F外域连接的TM和CT来自HPIV3 F蛋白。
条款19。条款4-18任一项的重组副粘病毒，其中与PIV TM和CT连接的重组RSV F外域是由PIV基因组的基因组启动子下游的第一或第二基因编码的。
条款20。条款18或条款19的重组副粘病毒，其中该病毒基因组从上游到下游包含：PIV基因组启动子，接着是N，P，C/V，M，F，HN，和L基因；且其中编码与PIV TM和CT连接的重组RSV F外域的基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，或编码N和P蛋白的基因之间。
条款21。条款18-19任一项的重组副粘病毒，其包含编码下述各项的病毒基因组：分别包含SEQ ID NO：21，101，47，48，49，52所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的序列的HPIV3 F和HN基因和BPIV3 N，P，C，V，M，和L基因。
条款22。在前条款任一项的重组副粘病毒，其中该异源基因是为了人细胞中的表达而密码子优化的。
条款23。条款22的重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒是：重组HPIV3且该异源基因编码与HPIV3 F TM和CT连接的RSV F外域，且包含SEQ ID NO：11(GenScript RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)所列核苷酸序列；或重组B/HPIV3且该异源基因编码与BPIV3 F TM和CT连接的RSV F外域，且包含SEQ ID NO：22(GenArt RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)或SEQ ID NO：23(GenScript RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)所列核苷酸序列。
条款24。一种重组病毒载体，其包含：包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与病毒基因组的I型膜蛋白的TM和CT连接的RSV F外域。
条款25。条款24的病毒载体，其中该RSV F外域包含K66E和Q101P氨基酸替代。
条款26。一种重组病毒载体，其包含包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码包含K66E和Q101P氨基酸替代的RSV F外域。
条款27。条款24-26任一项的病毒载体，其中该RSV F蛋白通过一处或多处氨基酸替代而稳定化于融合前或融合后构象。
条款28。条款24-27任一项的病毒载体，其中该RSV F外域通过S155C，S290C，S190F，和V207L氨基酸替代而稳定化于融合前构象。
条款29。条款26-28任一项的病毒载体，其中该RSV F外域是可溶性的且可以自包含该病毒载体的宿主细胞分泌。
条款30。条款24-29任一项的病毒载体，其中该病毒载体是重组人/牛副流感病毒3(B/HPIV3)，重组人副流感病毒1(HPIV1)，重组人副流感病毒1(HPIV2)，重组人副流感病毒1(HPIV3)，重组副流感病毒5(PIV5)，重组仙台病毒，或重组新城疫病毒(NDV)。
条款31。条款24-30任一项的病毒载体，其中该RSV F外域来自人RSV(hRSV)F蛋白。
条款32。条款24-31任一项的病毒载体，其中编码RSV F蛋白的异源基因包含SEQID NO：18核苷酸1-1587所列核酸序列(外域由GenScript优化的RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3CT DNA序列编码)。
条款33。在前条款任一项的重组副粘病毒或病毒载体，其中由感染有该重组副粘病毒或病毒载体的宿主细胞生成的病毒颗粒至少90％包含包含由该异源基因编码的外域的病毒包膜。
条款34。在先条款任一项的重组副粘病毒或病毒载体，其中该重组副粘病毒或病毒载体是减毒的。
条款35。一种免疫原性组合物，其包含在前条款任一项的重组副粘病毒或病毒载体和药学可接受载剂。
条款36。条款35的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
条款37。一种在受试者中引发针对病毒和由其编码的异源抗原的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的条款35或条款36的免疫原性组合物。
条款38。一种在受试者中引发针对副粘病毒和由其编码的异源抗原的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的条款35或条款36的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含包含编码异源抗原的异源基因的重组副粘病毒。
条款39。一种在受试者中引发针对RSV和PIV的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用包含治疗有效量的条款35或条款36的免疫原性组合物的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含包含编码RSV抗原的异源基因的重组副粘病毒。
条款40。条款37-39任一项的方法，其中该免疫应答是保护性免疫应答。
条款41。条款37-40任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的初始-加强施用。
条款42。条款37-41任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的鼻内或胃肠外施用。
条款43。条款37-42任一项的方法，其中该受试者是人或兽医受试者。
条款44。条款37-43任一项的方法，其中该受试者具有RSV或PIV感染或处于其风险。
条款45。条款37-44任一项的方法，其中该受试者小于1岁龄。
条款46。一种核酸分子，其包含条款1-25任一项的重组副粘病毒的基因组。
条款47。一种重组RSV F蛋白或其免疫原性片段，其包含K66E和Q101P氨基酸替代。
条款48。条款47的重组RSV F蛋白或其免疫原性片段，其进一步包含：(a)S155C和S290C；(b)S190F；(c)V207L；或(f)(a)和(b)；(a)和(c)；(b)和(c)；或(a)，(b)，和(c)的组合。
条款49。条款47或条款48的重组RSV F蛋白的免疫原性片段，其包含RSV F外域。
条款50。一种核酸分子，其编码条款47-49任一项的重组RSV F蛋白。
实施例
提供以下实施例以例示某些实施方案的特定特征，但是权利要求的范围不应限于所例示的那些特征。
实施例1
由减毒副流感病毒载体表达的呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)糖蛋白的改善的表达和免疫原性
这个实施例描述通过使用RSV F序列来自早期传代病毒，通过密码子优化，通过使用稳定且高度免疫原性的融合前和融合后形式的RSV F，和通过改造RSV F蛋白TM和CT使其更加有效地掺入载体颗粒来增强由重组B/HPIV3表达的RSV F的免疫原性和稳定性的办法。
引言。所施用的活减毒RSV株代表用于RSV疫苗的一种策略，而且这些当前处于开发中(Hurwitz.2011.Expert.Rev.Vaccines.10:1415-1433；Collins andMelero.2011.Virus Res.162:80-99；Karron,et al.2013.Current Topics Microbiologyand Immunology 372:259-284)。活减毒RSV株典型地会通过鼻内(IN)路径来施用。然而，减毒一般导致抗原合成降低，导致免疫原性降低。获得减毒和免疫原性之间的合适平衡对于RSV是挑战性的。
完全的，感染性的HPIV可以整个自转染细胞培养物中克隆的cDNA生成(使用反求遗传学)。为了表达而设计的外来基因会进行修饰，使得它的侧翼是HPIV转录信号(称作基因起点和基因终点信号，分别位于每一种基因的起点和终点)，而且会通过反求遗传学作为另外的基因插入HPIV基因组。然后外来基因会转录成分开的mRNA，像其它HPIV基因一样。HPIV能容纳和表达数个添加的外来基因(Skiadopoulos,et al.2002.Virology 297:136-152)。然而，多种基因可以是过度减毒性的，而且能搜集点突变(Skiadopoulos,etal.2002.Virology 297:136-152)。
HPIV转录在基因组的3’末端处的单一启动子处起始并顺序行进。一部分聚合酶在每一个基因接点处脱离模板，导致基因转录的负梯度。因此，启动子邻近基因表达比下游基因更加频繁。接近启动子放置外来基因会提高表达，但是具有影响下游载体基因表达的潜力。诸如基因起点或基因终点转录信号的效率的差异或RNA模板中有时存在但了解较少的其它结构性特征的影响等其它特征也能无法预测地影响插入基因或可读框(ORF)的表达(Whelan,et al.2004.Current Topics Microbiology and Immunology 283:61-119)。另外，在一些情况中，病毒构建物的特性可以受到仍然有待鉴定的因素的极大影响；例如，RSVF基因插入PIV3载体的P-M基因接点产生实质性温度敏感性的且减毒的病毒(Liang B,etal.2014.J Virol 88:4237-4250)。因而，虽然来自HPIV基因组的表达的广泛细节一般是知道的，但是具体构建物可以给出无法预测的结果。
在先前的研究中，使用B/HPIV3载体作为载体，自启动子之后第一和第二基因组位置中添加的基因表达RSV G基因和F蛋白或自N和P基因之间的第二基因组位置中添加的基因表达RSV F基因。后一种病毒(称作MEDI-534)已经在血清阴性儿童中的临床研究中评估，而且是减毒的，耐受较好，且感染性的，但是针对RSV的免疫原性比希望的要低(Bernstein,et al.2012.Pediatric Infectious Disease Journal 31:109-114)。来自疫苗接受者的脱落疫苗病毒的分析显示～50％的标本含有带有预测会扰乱RSV F表达的突变的疫苗病毒。这很可能降低免疫原性。临床试验材料(CTM)的回顾性分析显示2.5％的这种病毒不表达RSV F(Yang,et al.2013.Vaccine 31:2822-2827)。另外，RSV F插入物积累在蛋白质水平灭活其表达的突变及这些突变在生长期间扩增的观察结果提示使RSV F蛋白的表达沉默具有选择性优势。这很可能是由于RSV F蛋白的高融合原性性质，它有效介导合胞体形成。在体外，这导致破坏细胞基质(cell substrate)，会降低载体复制。另外，高水平的外来糖蛋白的合成能干扰载体糖蛋白经由内质网和胞吐途径的合成，加工和转运，而且能在位阻上干扰病毒粒体形态发生，等等。这些作用可以在体外和在体内发生。
早期传代(HEK)型式的RSV F蛋白和密码子优化型式的RSV F可读框(ORF)的表达。升高的病毒抗原表达典型地提供增强的免疫原性。编码载体抗原的ORF的密码子优化能提高它的表达，继而增强它的免疫原性，例如自病毒或DNA载体表达的人免疫缺陷病毒抗原已经显示的(Gao,et al.2003.AIDS research and human retroviruses 19:817-823；Carnero,et al.2009.J Virol 83:584-597)。然而，这些序列变化可以具有超出改善翻译的作用，诸如对mRNA稳定性和转运的作用，所以改变mRNA的核苷酸序列的作用可能是复杂的且无法预测的。因此，使用GeneArt(GA)算法设计密码子优化型式的RSV F序列并评估以确定它是否赋予蛋白质表达。
在设计这个密码子优化的ORF时，错误使用了1960年代的一种早期传代型式的RSV株A2的氨基酸序列(Connors,et al.1995.Virology 208:478-484；Whitehead,etal.1998.J Virol 72:4467-4471)。这种1960年代的早期传代(或低传代)株在它的繁殖中使用人胚肾(HEK)细胞培养物之后称作HEK。HEK病毒与当前的高传代的实验室型式的RSV株A2的区别在于两处氨基酸指派(Connors,et al.1995.Virology 208:478-484；Whitehead,et al.1998.J Virol 72:4467-4471)。HEK型式具有指派66E和101P，而高传代的实验室A2株具有指派66K和101Q(以下称作“非HEK”指派)(图1)。然而，鉴于它们的高突变率，病毒株之间或给定株的原种之间序列差异的发生对于RNA病毒是常见的，而且HEK差异先前没有知道的重要性。进一步地，称作RSV NIHΔM2-2的减毒RSV疫苗候选中HEK指派的存在与细胞培养物复制效率的较小降低相关。另外，位置66处的HEK指派鉴定为影响RSV感染期间的合胞体形成。因而，鉴于它们与复制降低的关联，意图避免HEK指派。然而，因为含有HEK指派的型式的RSV F意外地用于初始密码子优化，所以构建平行的GA优化的非HEK型式并比较两种型式(图1)。两种型式的RSV F放置在BPIV3基因起点和基因终点转录信号的控制下并插入rB/HPIV3载体的第2位置(图1)。在所有后续的表达RSV F的rB/HPIV3构建物中使用该转录信号和插入物位置，从而始终提供直接比较。
用两种不同载体(称作“HEK/GA-opt”和“非HEK/GA-opt”)感染Vero细胞，在感染后48小时制备细胞裂解物，并将蛋白质提交变性去污剂存在下及还原性或非还原性条件下的凝胶电泳。通过Western印迹将分开的蛋白质转移至膜并使用对RSV F特异性的抗体进行分析(图2)。这显示了HEK指派的存在与较小(～2倍)但一致的RSV F蛋白表达升高相关(图2)。这一发现的一种非限制性解释是HEK指派提高F蛋白稳定性，尽管对蛋白质合成的影响是可能的但看来不太可能，原因在于HEK和非HEK型式的F ORF除了两个密码子以外是同一的。另外，当在非还原性条件下分析时，HEK指派的存在与RSV F三聚体的凝胶迁移率的降低相关(图2)。这提示这些指派改变F蛋白三聚体结构。更引人注目地，HEK型式的RSV F的表达与同非HEK型式相比合胞体形成的剧烈降低相关(图3)，即使正如早就注意到的，HEK型式以略微升高的水平表达。这种测定法利用受到rB/HPIV3空载体感染的细胞中诱导的明显合胞体的普遍缺失，而来自载体的RSV F蛋白表达导致一般与RSV F蛋白表达量成比例的合胞体形成。这为自PIV载体表达的RSV F蛋白的数量和功能提供一种测定法。这些关注HEK的观察结果指示HEK指派与RSV F的合成/稳定性，结构，和融合原性活性中的差异相关，而且这些作用在任何其它RSV蛋白缺失下发生，因而与来自异源载体的表达直接有关。
因为HEK指派来自1960年代的RSV株A2的低传代原种，所以它们很可能代表原始临床分离物，而非HEK指派在后续年代里在广泛体外传代期间出现。这提示HEK型式的F的低融合原性表型更加代表原始生物学病毒。非HEK型式可能代表在细胞培养物中传代期间选择的高融合原性变体。高融合原性型式的RSV F在自然界中可能不太有利，因为它可能去稳定化病毒，但是可能在细胞单层中的快速生长的实验室设置中得到选择。检查了来自GenBank数据库中的临床分离物的RSV F的226种序列，发现临床分离物通常含有HEK指派。这与这些指派代表循环中的RSV一致。无论如何，HEK指派提供F蛋白表达的适度升高且提供低融合原性形式的RSV F。合胞体形成降低是有利的，因为它降低可能另外干扰HPIV载体复制且有利于选择RSV F插入物沉默的载体的细胞病原性。因此，HEK指派具有三重优势，代表更加天然且临床有关形式的F蛋白，提供蛋白质表达的适度升高，和降低使RSV F插入物沉默的选择压力。
还评估了密码子优化对RSV F表达和免疫原性的作用。连同通过两种其它不同算法生成的两种其它密码子优化的RSV HEK F序列，使用上文描述的含有HEK且GA优化的型式(HEK/GA-opt)。评估多种优化型式不是典型实践，因为它提高花费和不便且尚未显示是有用的。两种其它来源是DNA2.0(D2)和GenScript(GS)算法；比较还包括非HEK，非密码子优化的型式(图4)。密码子优化导致RSV F蛋白合成显著增强，令人惊讶的是不同型式的程度不同。对含有HEK的GenScript优化的F蛋白(HEK/GS-opt)观察到最高表达，比未修饰的RSV F(non-HEK/non-opt)高10倍(Vero细胞)和16倍(LLC-MK2细胞)(图5)。更加有效的ORF的表达水平如此之高，使得逐渐升高水平的合胞体形成明显与升高水平的F表达有关，不管HEK指派的存在(图6)，尽管可以假设合胞体形成在HEK指派缺失下甚至会更快且更加广泛。
还使用先前记载的算法(Coleman,et al.2008.Science 320:1784-1787)作为提高F蛋白表达的手段评估了密码子对优化。密码子对优化提高与高表达相关的密码子对的频率。然而，这在RSV F的情况中没有赋予任何表达升高。
与预期相反，RSV F表达升高10至16倍和伴随的合胞体形成升高对细胞培养物中的载体复制没有显著的负面影响(图7)。可能预期高水平的RSV F表达和合胞体形成会在早就注意到的多个步骤任一干扰载体，包括载体糖蛋白合成，加工，胞吐，载体颗粒形成，和细胞存活力，但是情况不是这样。这是特别令人惊讶的，因为正如早就注意到的，MEDI-534中使RSV F基因的表达沉默的突变的积累和扩增提示存在针对RSV F蛋白的表达的实质性选择压力。与空载体相比，所有具有RSV F插入物的载体适度减毒(图7)–或许涉及共同的减毒效果，诸如提高基因组长度和基因数目–但是以彼此相似的动力学复制且生长至比空载体的峰滴度略微更低的较高的峰滴度(图7)。峰滴度的适度变异很可能代表实验性变异性。
在仓鼠模型中评估rB/HPIV3载体的体内复制，免疫原性，和保护功效。以一剂105个TCID50(组织-培养-感染-剂量-50)单位每只动物给多组仓鼠鼻内免疫接种rB/HPIV3载体。另外，包括以一剂106个噬斑形成单位(pfu)给予的野生型(wt)RSV作为诱导RSV特异性免疫的阳性对照。包括wt RSV对照时要警告wt RSV是非减毒病毒，而载体是减毒的且因该原因而可能是免疫原性相对较低的。在感染后第3和5天对6只动物每种病毒每天处以安乐死，并收集鼻甲和肺用于病毒滴定以测量体内复制。这显示与空载体相比，携带RSV F插入物的载体在鼻甲中(上呼吸道)适度减毒，而且在肺中(下呼吸道)实质性减毒(图8)。与空载体相比升高的减毒显现为病毒脱落的值更低。它还显现为第3天和第5天滴度的比较：对于空载体，第3和5天的滴度是相当的，而对于携带RSV F的载体，第3天滴度比第5天滴度要低，指示这些构建物实现它们的最大滴度需要更久。令人惊讶地，在具有RSV F插入物的载体中，那些具有增强的RSV F表达的没有比具有更少RSV F表达的(即non-HEK/non-opt)减毒更多。因而，将RSV F插入物添加至rB/HPIV3载体在体内是减毒性的–或许是由于一些共同特征，诸如基因组长度或基因数目升高–但是这看来没有受到RSV F蛋白的合成水平的实质性影响。
通过使用补充有豚鼠补体的60％噬斑减少测定法(它是一种标准测定法)测量RSV中和性抗体的血清滴度来评估载体的免疫原性。所有表达RSV F的载体均诱导相似高滴度的RSV中和性血清抗体，不管HEK指派或密码子优化(图9)。存在与提高RSV F表达相关的中和性滴度的适度渐进性升高，但是差异不是统计学显著的。作为对照平行感染的WT RSV诱导比载体显著更高滴度的RSV中和性抗体。然而，重要的是要注意，通过RSV感染诱导的中和性抗体包括来自F和G中和抗原二者的贡献，而载体仅仅具有对中和性滴度做出贡献的F特异性抗体。另外，非减毒的wt RSV对照比减毒的载体更加有效地复制，尤其是在肺中(图8)，这会与载体相比提高它的免疫原性。
为了评估这些载体的保护功效，免疫接种后30天通过鼻内感染106pfu wt RSV每只动物攻击来自图9中的实验，以6只动物分组的免疫接种仓鼠。在攻击后3天自处以安乐死的动物收集鼻甲和肺，制备组织匀浆物，并通过噬斑测定法评估以测量攻击RSV复制的水平。表达RSV F的载体赋予肺中几乎完全的保护和鼻甲中中等水平的保护，而wt RSV赋予这两个解剖学部位中几乎完全的保护(图10)。表达RSV F的载体间在针对RSV攻击的保护功效方面没有显著差异。应当注意的是，由RSV赋予的保护会包括来自针对F和G蛋白二者的中和性抗体以及针对潜在所有RSV蛋白的细胞免疫的贡献，而由载体赋予的保护会包括仅仅针对F蛋白的体液和细胞免疫。另外，正如注意到的，RSV对照是在免疫接种期间复制至比载体更高滴度的非减毒野生型病毒(图8)，尤其在肺中，这会提高它的免疫原性和保护功效。
这些结果显示使用HEK指派和密码子优化的序列所致RSV F蛋白表达升高10至16倍没有导致RSV中和性血清抗体的诱导显著升高(尽管观察到升高的趋势)或针对wt RSV攻击的保护显著升高。与之对比，相似水平的人免疫缺陷病毒抗原表达升高导致不同动物模型中其它病毒载体和DNA疫苗的保护增强(Gao,et al.2003.AIDS research and humanretroviruses 19:817-823；Carnero,et al.2009.J Virol 83:584-597)。先前还观察到rB/HPIV3载体中位置1或2较之6处的插入所致RSV F表达的30至69倍差异诱导仓鼠中保护功效的显著差异(Liang B,et al.2014.J Virol 88:4237-4250)。因而，一般认为抗原合成升高会赋予免疫原性升高。然而，在一些情况中，这种作用的程度可能不足以不含糊地检测到，或者可能是给定的体内模型可能不够敏感。因而，本研究中的10至16倍差异可能不足以诱导在半允许性仓鼠模型中是统计学显著的足够程度的作用。更高RSV F表达的有益效果可能与其它特征组合时，或在临床前和临床评估中具有更大样品尺寸的允许性宿主(即灵长动物和人)中更加突出。特别地，在这项研究中观察到的F蛋白表达的10至16倍升高是在Vero(非洲绿猴)或LLC-MK2(恒河猴)细胞中，其中为了人使用的密码子优化鉴于这些灵长动物与人相对较近的系统发生学关联性很可能会是有效的。与之对比，体内免疫原性测定法采用仓鼠，其中为了人使用的密码子优化可能不会有效提高表达和由此免疫原性。
由rB/HPIV3载体表达的融合前和融合后形式的RSV F的免疫原性的评估。像所有副粘病毒F蛋白一样，RSV F蛋白首先装配成融合前构象，即首先在感染细胞的表面上积累并掺入病毒粒体的型式。诸如通过与邻近靶细胞膜接触，可以触发融合前F经历介导膜融合的大量构象变化，以融合后构象的F蛋白收场(Calder,et al.2000.Virology 271:122-131；McLellan,et al.2013.Science 340:1113-1117；McLellan,et al.2011.J Virol 85:7788-7796；Swanson,et al.2011.Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.108:9619-9624)。RSV F蛋白在副粘病毒中是值得注意的，在于对触发高度易感且能容易地过早触发，这可能促成RSV感染性的显著不稳定性。还有证据显示感染细胞中积累的RSV F蛋白多是构象上异质的，这可以起降低病毒中和性抗体的诱导的诱饵的作用(Sakurai,et al.1999.J Virol 73:2956-2962)。因此，出于超过一个原因表达稳定化构象的RSV F会是有利的。
最近记载了稳定的融合后形式的RSV F(McLellan,et al.2011.J Virol 85:7788-7796；Swanson,et al.2011.Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.108:9619-9624)。这种稳定的融合后形式是通过截短疏水性融合肽和去除C端跨膜域(TM)和胞质尾(CT)而重组生成的(Ruiz-Arguello,et al.2004.J General Virology 85:3677-3687)。由于缺少TM和CT，这种融合后形式不会是膜锚定的且会是分泌的。融合后形式的RSV F显示出在小鼠中是免疫原性的且保护性的(Swanson,et al.2011.Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.108:9619-9624)。
然而，认为融合前形式的RSV F的免疫原性比融合后形式高得多(McLellan,etal.2013.Science 340:1113-1117)。这是基于康复期动物和人血清中的绝大部分中和活性是由不结合融合后F蛋白且推测是对融合前形式特异性的抗体赋予的观察结果(McLellan,et al.2013.Science 340:1113-1117；Magro,et al.2012.Proc Nat’lAcad.Sci.U.S.A.109:3089-3094)。最近测定了融合前形式的RSV F的结构，而且经由基于结构的突变来稳定化这种融合前构象成为可能：这些之一涉及引入二硫键(DS)，且另一涉及三聚体结构中的预测空腔中的氨基酸替代(Cav1)，而且这些的组合称作DS-Cav1(McLellan,et al.2013.Science 342:592-598)。在小鼠和短尾恒河猴(macaques)中作为亚基疫苗评估了重组DS和DS-Cav1形式的RSV F蛋白，而且显示出诱导比融合后形式显著更高水平的RSV中和性血清抗体，其中DS-Cav1形式的免疫原性比DS形式要高(McLellan,etal.2013.Science 342:592-598)。
评估了当自活减毒rB/HPIV3载体表达时融合后和融合前形式的RSV F的免疫原性。将具有HEK指派的融合后和稳定化的融合前形式(DS和DS-Cav1)的RSV F进行GA密码子优化并插入rB/HPIV3载体的第2基因组位置(图11)。将这些与HEK/GA-opt以及删除了CT和TM，留下外域的含有HEK的，GA优化的F蛋白的一种型式(Ecto)比较(图11)。还将这些构建物与non-HEK/non-opt构建物比较。
图11中呈现的数据和后续实验中使用了GA优化的F ORF。在一些情况中构建了具有GS优化的ORF的平行构建物(见图35)，但是有待评估。鉴于GS优化的ORF的卓越表达(图5)，GS优化型式可能更具免疫原性和保护性。还有，为了简要，有时自图11和后续图中的和后续正文中的构建物名称省略标识符“HEK”和“GA-opt”，但是图中指示了这些特征的存在(即“所有上述型式的RSV F是HEK，GA优化的”，图11)。
挽救具有这些各式各样形式的RSV F的载体，并使每一种在体外生长至较高的，相似的滴度(图12)。这些一般就生长动力学和终产量而言与空rB/HPIV3载体相比略微减毒，正如先前对其它载体构建物注意到的(见图7)。
在感染有各种构建物的Vero和LLC-MK2细胞中评估了各种形式的RSV F蛋白的表达效率(图13A和B)。感染后48小时收获感染细胞培养物并通过Western印迹进行分析。正如预期的，天然形式的RSV F(即HEK/GA-opt)是细胞相关的。发现融合后和Ecto形式是分泌的以及细胞相关的。融合后F的分泌一致地比Ecto形式更加有效：后者可能更多地保持细胞相关的，因为它含有更高含量的疏水性序列。出乎意料地，DS和DS-Cav1形式的F更加有效地表达(图13B)。既然这些病毒以相似的动力学复制且既然ORF是相似GA优化的，那么这种表达升高很可能反映DS和DS-Cav1形式升高的蛋白稳定性。蛋白质工程能实质性影响糖蛋白的表达，加工，和稳定性，而且常常是负面方式，因此通过这种活载体有效表达DS和DS-Cav1是一项不能可靠预测的本质特性。
在仓鼠中评估了这些载体的体内复制(图14)。在鼻甲中，所有具有RSV F插入物的载体适度地比空载体减毒更多(图14A)。与空载体相比升高的减毒显现为病毒脱落的值更低。它还显现为第3天和第5天滴度的比较：对于空载体，这些值是相当的，而对于携带RSV F的载体，第5天滴度比第3天滴度要高，指示这些构建物实现它们的最大滴度需要更久。具有融合后F的载体复制至比具有其它形式的F的载体更高的滴度，而具有融合前F的载体(DS)复制至更低的滴度，这可能代表实验变异性或可能代表对载体复制的可信全异影响。在肺中，所有具有RSV F插入物的载体比空载体减毒实质性更多(图14B)。与鼻甲一致，具有融合后F的载体在肺中也复制至比其它载体有点更高的滴度，而表达融合前(DS)型式的载体表现出减毒有点更多。RSV对照(它是完全野生型病毒)比表达RSV F的减毒rB/HPIV3载体更加有效地复制；例如，wt RSV在鼻甲和肺中分别复制至比表达融合前(DS)F的载体要高100和1000倍的滴度。通过60％噬斑减少测定法测定了RSV中和性血清抗体滴度。这是以两种方式实施的：(i)在添加的补体存在下(这是通常的实践，正如图9中早就显示的)，和(ii)在添加的补体缺失下(分别为图15A和B)。添加的补体的存在提供病毒特异性抗体的最灵敏检测，因为补体潜在地对所有结合至病毒粒体的抗体赋予病毒裂解能力，而且还能发挥位阻效应(Yoder et al 2004J Med Virol 72:688-694)。与之对比，补体不依赖性中和测定法会只检测在不涉及补体蛋白的病毒裂解功能或位阻效应的情况下能够中和RSV的高质量中和性抗体。已经提出“在没有补体的情况下实施的中和测定法可能最能反映呼吸道中的生理学条件”(Yoder et al 2004J Med Virol 72:688-694)。在含有补体的测定法中(图15A)，具有融合后F的载体在各载体中免疫原性较差，尽管它在仓鼠中复制至最高滴度；而具有融合前(DS)F的载体在所测试的载体中免疫原性最高，尽管它减毒最多。在补体不依赖性测定法中(图15B)，在各载体中，只有表达融合前(DS)F的载体诱导高滴度的中和性抗体。具有未修饰，融合后，或Ecto F的其它载体无一有效诱导高质量中和性抗体。wt RSV对照有效诱导在含有补体和不依赖于补体的测定法二者中均为中和性的抗体。引人注目地，具有融合前(DS)F的载体在诱导高质量RSV中和性抗体方面在统计学上与wt RSV相似(图15B)。这是值得注意的，因为这种减毒载体的复制效率比非减毒wt RSV低100至1000倍，而且由wt RSV赋予的中和性活性具有另外的来自RSV G蛋白的贡献。这提示表达融合前(DS)形式的RSV F的载体在诱导非常有效的中和性抗体方面是非常有力的且高免疫原性的。
为了评估这些载体的保护功效，免疫接种后30天通过鼻内感染106pfu wt RSV每只动物攻击来自图15中的实验的免疫接种仓鼠。感染后3天处死动物，收获鼻甲和肺，并加工成通过噬斑滴定测定的组织匀浆物(图16)。在鼻甲中(图16A)，表达non-HEK/non-opt F，或HEK/GA-opt，或Ecto F的构建物赋予适度水平的保护，而融合后F和尤其是融合前(DS)F是有点更高保护性的。在肺中(图16B)，所有载体构建物提供针对RSV攻击的实质性保护，除了融合后形式，它赋予最少的保护(图16B)。wt RSV对照提供鼻甲中接近完全的保护和肺中完全的保护；然而，正如早就注意到的，在表达所有RSV蛋白作为细胞免疫的潜在抗原，以及高至1000倍更加有效地复制以外，wt RSV具有表达F和G中和抗原二者的优势(图14)。
将Cav-1突变添加至DS构建物提供升高的免疫原性作为亚基疫苗(McLellan,etal.2013.Science 342:592-598)，而且预期进一步增强自病毒载体表达的融合前RSV F的免疫原性。还有，DS和DS-Cav1形式的RSV F有待在提供最大表达升高的GS优化的背景中评估免疫原性和保护功效(图5和6)。已经构建并回收了这些进一步的构建物，并制备成工作池(working pool)(图35)。
通过推动RSV F蛋白掺入rB/HPIV3载体的病毒粒体颗粒来增强它的免疫原性。抗原掺入病毒样颗粒(VLP)或腺伴随病毒颗粒已经显示出提高它们的免疫原性(Rybniker,etal.2012.J Virol 86:13800-13804；McGinnes,et al.2011.J Virol 85:366-377)。但是不清楚异源抗原掺入感染性病毒的病毒包膜是否能增强它的免疫原性。当由rB/HPIV3表达时，天然RSV F蛋白(即HEK/GA-opt)仅仅以痕量掺入载体颗粒(见下文)。
Zimmer等人的一项在先研究(Zimmer et al J Virol 2005 79:10467-77)评估了来自仙台病毒中添加的基因的RSV F蛋白的表达，仙台病毒是HPIV1的鼠亲戚而且还与HPIV3密切相关。该研究显示，就像rB/HPIV3，很少的RSV F蛋白掺入仙台病毒载体颗粒。调查人员将RSV F蛋白的CT或CT加TM用来自仙台F蛋白的对应序列替换，前提是这会改善外来RSV F蛋白与载体颗粒相互作用的效率。这些修饰确实提高工程化RSV F掺入仙台颗粒，但是仅在仙台F蛋白基因删除的情况中。该删除载体F蛋白的要求在本研究中会是不想要的，因为自rB/HPIV3删除载体F蛋白会具有实质性改变它的复制特性的可能，尤其是在体内，而且还会去除HPIV3保护性抗原之一。
尽管有这种清楚的先例指示这种策略会是不合适的，还是生成了如下rB/HPIV3构建物，其中RSV F蛋白的CT或CT加TM用载体(PIV)F蛋白的替换(分别产生称作B3CT和B3TMCT的构建物，图17)。来自rB/HPIV3的TM和CT区的长度分别为21和26个氨基酸。本研究中的构建是用在天然F蛋白中含有HEK指派和GA优化的F蛋白的型式(HEK/GA-opt)，还有用融合前DS和DS-Cav1形式进行(图17)。(使用GA优化F ORF)。所有嵌合F基因插入rB/HPIV3的第2位置，用于与上文描述的构建物直接比较。
所有病毒容易通过反求遗传学来回收。为了对RSV F和它的修饰衍生物的包装效率定量，制备蔗糖纯化的病毒，用于Western印迹分析以测定颗粒中RSV F的量(图18)。将等量的每一种蔗糖纯化原种(0.5ug蛋白质每份样品)提交变性，还原性凝胶电泳并通过Western印迹进行分析。这显示非嵌合F蛋白(来自HEK/GA-opt)相对较差地掺入rB/HPIV3病毒粒体(图18，2道)。然而，B3CT和B3TMCT修饰将掺入效率剧烈增强19至20倍(图18，3和4道)。确实，当与等蛋白质量的wt RSV病毒粒体(图18，5道)相比时，载体颗粒中掺入的B3CT和B3TMCT F蛋白的量看来与RSV颗粒中天然F的量相等。对具有B3CT或B3TMCT的嵌合融合前(DS)形式的RSV F也观察到类似增强的包装效率(图18，6和7道)。因而，RSV F B3CT和B3TMCT进入rB/HPIV3载体的有效包装不要求删除载体F蛋白，且因而显著不同于仙台先例。
还使用RSV特异性抗体和免疫金标记用透射电子显微术(TEM)检查了RSV F的包装(图19A-F)。RSV颗粒的表面上的RSV F刺突得到标记(图19A)，而在空rB/HPIV3载体的表面上无法观察到标记(图19B)。在载体包膜中检测到非常有限的天然RSV F的标记(图19C)，与图18中的结果一致，其显示通过Western印迹分析在纯化的rB/HPIV3病毒粒体中检测到很少的天然F。与之对比，表达具有B3CT或B3TMCT的嵌合F的载体显示增强的标记(图19D和E)，指示这些嵌合形式有效包装入载体包膜。同样地，具有B3TMCT的融合前(DS)RSV F也有效包装入载体颗粒(图19F)。这确认了B3CT和B3TMCT修饰导致RSV F掺入rB/HPIV3颗粒剧烈升高。另外，这显示掺入的RSV F蛋白存在于外观与可信RSV颗粒相似的免疫学活性表面刺突中。而且，稳定化的融合前DS F蛋白还有效出现于病毒粒体表面。
RSV F B3CT和B3TMCT进入载体颗粒的高包装效率提出了这对于载体复制会是削弱性的可能性，因为一般假设病毒粒体表面出于效率是有组织的且在它的容量方面限于表面蛋白，所以表面蛋白的组成的变化会是削弱性的，尤其因为已修饰的B3CT和B3TMCT RSVF蛋白含有认为与内部病毒蛋白相互作用的载体F蛋白的CT或TMCT区。例如，RSV F有效掺入载体包膜可能置换载体HN和F糖蛋白，或者可能干扰各载体成分之间(诸如病毒粒体装配期间载体F和HN糖蛋白和内部M蛋白之间，或必须相互作用以有效起始病毒进入的载体F和HN蛋白之间)的相互作用。令人惊讶地，发现所有携带RSV F B3CT和B3TMCT的载体在体外有效复制至与具有在TM和CT方面未修饰的RSV F蛋白的载体(HEK/GA-opt，图20)无法区分的高滴度。因而，没有证据显示RSV F掺入载体颗粒升高导致体外复制有任何降低。这是重要的，因为载体的有效体外复制对于有效疫苗制造和临床评估会是本质性的。它还提示高掺入效率不会对使RSV F表达沉默的突变设置强选择压力。
通过Western印迹检查了嵌合形式的RSV F通过rB/HPIV3载体的细胞内表达。这是在感染后48小时收获的Vero细胞中评估的(图21)。有趣的是，B3CT和B3TMCT型式的F均有效表达，而且确实表现出比天然F(即HEK/GA-opt)略微更加有效地表达(图21A)。另外，DS或DS-Cav1修饰表现出进一步提高表达(图21B)，正如在先注意到的(图13B)。这些作用看来是叠加的，因为具有B3CT或B3TMCT的DS或DS-Cav1构建物甚至比单独具有DS或DS-Cav1的构建物更加有效地表达。这种升高的表达对于疫苗目的会是有利的，因为它提供更高水平的抗原。正如注意到的，蛋白质工程和域交换具有负面影响糖蛋白的表达，加工，和稳定性的可能，因而这些具有DS，DS-Cav1，B3CT，和B3TMCT修饰的糖蛋白通过这种活载体的有效表达是一种无法可靠预测的特性。
测定了这些构建物在Vero细胞中诱导合胞体形成的能力。出乎意料地，携带B3CT替代的RSV F展现高融合原性表型，而携带B3TMCT替代的RSV F在低融合原性方面类似天然F(例如HEK/GA-opt)(图22；还见图3)。一旦延长温育，B3TMCT确实在细胞单层中诱导合胞体形成，指示它仍然是功能性的且因而是构象上完整的。这些发现提示，在B3CT和B3TMCT构建物之间，后者会是优选的，因为广泛的合胞体形成和所致细胞病理学可能通过过早破坏细胞基质而在体外和在体内降低载体生成，而且还可能由于过早触发而干扰感染性的稳定性。融合前DS形式无一在细胞单层中诱导合胞体。这是完全出乎意料的，因为稳定化型式的融合前F蛋白经历介导融合所需要的大量构象变化的能力应当更低。这些发现提示融合前DS形式的RSV F确实在载体感染细胞的背景中得到实质性稳定化。
通过鼻内感染在仓鼠中检查了表达B3CT和B3TMCT RSV F构建物的载体的复制(图23)。具有非HEK非优化的F(non-HEK/non-opt)或HEK和GA优化的F(HEK/GA-opt)的载体在鼻甲中与空rB/HPIV3载体相比有点减毒更多，说明插入物的减毒作用。与空载体相比升高的减毒显现为病毒脱落的值更低。它还显现为第3天和第5天滴度的比较：对于空载体，这些值是相当的，而对于携带RSV F的载体，第3天滴度比第5天滴度要低，指示这些构建物实现它们的最大滴度需要更久。表达B3CT，或B3TMCT，或具有B3CT(DS/B3CT)或B3TMCT(DS/B3TMCT)的融合前F(DS)的载体在鼻甲中减毒实质性(而且在大多数情况中显著)更多(图23A)。这很可能反映RSV F蛋白掺入载体颗粒的减毒作用：在体外没有观察到这种减毒作用(图20)。在肺中，所有表达RSV F的载体与空载体相比减毒实质性更多(图23B)。引人注目的是，高融合原性B3CT构建物在鼻甲和肺二者中比平行稳定化DS/B3CT构建物减毒显著更多，提示融合升高在这些条件下在体内确实是减毒性的(即干扰复制)。如果这在半允许性宿主诸如仓鼠中是明显的，那么它在人宿主中可能实质性更加突出。与减毒载体相比，非减毒wt RSV(A2)对照在鼻甲中复制至高100至1000倍的滴度，而在肺中复制至高1000至10,000倍的滴度。
通过在添加的补体存在或缺失下使用60％噬斑减少测定法对仓鼠血清分析RSV中和性抗体，测定了载体的免疫原性(分别为图24A和B)。所有表达具有B3CT或B3TMCT修饰的F蛋白的构建物诱导在补体存在下检测的RSV中和性血清抗体的实质性滴度(图24A)。组合B3CT或B3TMCT与融合前DS突变的构建物给出与没有DS突变的平行构建物相比有点更高水平的中和性抗体。当在补体存在下测定时(图24A)，所有减毒载体构建物诱导与非减毒wtRSV相比更低滴度的RSV中和性抗体，尽管正如注意到的，wt RSV具有G中和抗原的进一步贡献和复制效率比减毒载体高100至10,000倍的优势。
在没有补体的情况下实施的测定法的型式中(图24B)，三种载体有效诱导在这些条件下检测的RSV中和性抗体，即表达B3TMCT F的载体和表达含有B3CT和B3TMCT修饰的融合前DS F的载体。B3TMCT和DS/B3TMCT构建物诱导比wt RSV有点更多的高质量RSV中和性血清抗体，尽管这种差异不显著。不过，鉴于这些载体只表达两种RSV中和性抗原之一且复制效率与wt RSV相比低10至10,000倍，这一发现是值得注意的(图22)。与B3TMCT载体形成对比，B3CT当在补体缺失下测定时没有诱导显著的抗体应答(图24B)，尽管它以与B3TMCT相似的效率掺入病毒粒体(图18)。类似地，DS/B3CT的免疫原性也比B3TMCT，DS低(图24B)。这指示B3TMCT可能是结构上或抗原上与B3CT相比卓越的RSV F形式，或者可能是B3CT的高融合原性表型在体内降低它的表达和免疫原性。这些研究清楚地显示B3TMCT大大增强RSV F的免疫原性。
为了评估载体的保护功效，免疫接种后30天用106pfu wt RSV鼻内攻击免疫接种仓鼠(图25)。与免疫原性数据一致，B3CT在鼻甲和肺二者中的保护性均更低。B3TMCT针对RSV攻击更具保护性，而且DS/B3TMCT是载体构建物中保护性最高的(尽管差异较小)，只有一只免疫接种仓鼠显示鼻甲中可检测的RSV复制且均在肺中得到完全保护，提供与非减毒wt RSV对照所赋予相似的保护(图24)。DS/B3TMCT构建物和wt RSV之间相当水平的保护功效是特别引人注目的，因为后者复制至比DS/B3TMCT高2-4个log的滴度，表达F和G RSV中和抗原二者，且表达所有RSV蛋白作为细胞免疫的潜在抗原。这指示具有包装的融合前形式的RSV F的rB/HPIV3载体(DS/B3TMCT)具有很高的免疫原性和保护性。
rB/HPIV3-RSV-F构建物在仓鼠中的稳定性。鉴于MEDI-534在临床研究中的遗传不稳定性的经验(Yang et al 2013Vaccine 31:2822-2827)，关键问题是RSV F插入物的表达是否在体内复制期间保持稳定。测定了已经在图8，14，和23中的仓鼠中进行了分析的所有12种不同rB/HPIV3-RSV-F构建物的遗传稳定性。通过能同时检测病毒噬斑中RSV F蛋白和载体蛋白的表达的荧光双重染色噬斑测定法来分析感染后第3和5天收集的肺和鼻甲的组织匀浆物(图26)。在这种测定法中，用以红色荧光显现的F特异性抗体检测RSV F表达，并用以绿色荧光显现的HPIV3特异性抗血清(来自用纯化的HPIV3病毒粒体超免疫的家兔)检测PIV3抗原的表达。当合并时，维持RSV F表达的rB/HPIV3噬斑表现为黄色，而丧失RSV F插入物表达的那些保持绿色(图26)。这项分析显示，RSV F插入物在仓鼠中复制期间一般是稳定的(图26)。对于大多数样品，较高稀释度孔(其中能辨别个别噬斑)中所有回收的病毒表现为黄色噬斑，且因而表达RSV F蛋白。在其它标本的一个子集中，噬斑的一个子集中有RSV F表达的零星丧失，产生小百分比的绿色噬斑(通常<12％)。另外，没有证据显示RSV F表达的丧失随时间逐渐增加；换言之，来自第5天的标本上表达的丧失频率与第3天相比没有更高。在一种情况中，在来自第3天的一份鼻甲标本中有高水平的表达丧失(14％剩余表达，#9组中的#511仓鼠)，而来自相同动物的肺标本具有100％表达。一般而言，这指示RSV F插入物的表达对于所有测试的构建物是实质性稳定的。它还显示构建物无一表现为不成比例地不稳定的。因而，高水平的RSV F表达和合胞体形成，或稳定化形式的RSV的表达，或高水平的已修饰F掺入对于rB/HPIV3载体是减毒性的载体颗粒没有表现为有利于RSV F表达沉默的突变体的出现。
对图1-26中描述和评估的12种rB/HPIV3构建物进一步评估可能的温度敏感性表型。对于每一种载体，使相等的小样于32，35，36，37，38，39，和40℃在甲基纤维素下形成噬斑(图27)。≥100倍的噬斑形成减少指示该温度处的温度敏感性。空rB/HPIV3载体在40℃是温度敏感性的(图27)，而HPIV3和BPIV3无一在这个温度是温度敏感性的。这指示嵌合化(即将HPIV3 F和HN基因替换入BPIV3主链)赋予轻微的温度敏感性表型。每一种另外含有RSV F插入物的载体在37-38℃是温度敏感性的，指示另外的基因的存在提升温度敏感性表型。最ts的构建物是B3CT，B3TMCT，和DS/B3CT(图27中的#7，8，12)。这暗示RSV F包装入病毒颗粒提示这种表型。一种可能的解释会是载体中RSV F的存在使得颗粒有点不稳定且对升高的温度易感。具有RSV F的有效包装的其余构建物，即DS/B3TMCT(图27中的构建物13)是略微更低温度敏感性的，提示与DS和B3TMCT相关的低融合原性表型一定程度地改善不稳定性。总之，这些发现提供一种手段来赋予减毒或减轻减毒，这取决于构建物设计，而且无论如何提供在设计疫苗病毒中重要的信息。
恒河猴中选定rB/HPIV3-RSV-F构建物的评估。为了进一步调查“DS”和“B3TMCT”突变对载体复制，免疫原性，和保护功效的影响，在恒河猴中对两种候选(HEK/GA-opt/DS和HEK/GA-opt/DS/B3TMCT)评估复制和免疫原性(图28)。包括具有未修饰RSV F的B/HPIV3载体(non-HEK/non-opt)作为比较的基线对照。鉴于灵长动物中的研究的花费和伦理考虑，评估了有限数目的构建物。通过组合的IN和气管内(IT)路径对猴免疫接种总共2X106TCID50每一种rBHPIV3载体。在指示日(图29)收集鼻咽拭样和气管灌洗样品以监测病毒脱落作为复制的测量。在第0，14，21，和28天收集血清。在第28天以106pfu每个部位用wt RSV IN和IT攻击所有动物，并在第35和56天收集血清样品。
non-HEK/non-opt和HEK/GA-opt/DS病毒在上和下呼吸道中复制至大约105和103TCID50单位每ml的峰滴度(分别为图29A和B)。与之对比，HEK/GA-opt/DS/B3TMCT构建物在恒河猴的上和下呼吸道二者中剧烈更多减毒(图29A和B)。这指示B3TMCT对rB/HPIV3构建物赋予实质性减毒，而DS突变没有表现出赋予显著减毒。因而，B3TMCT修饰在仓鼠中赋予减毒的温和趋势(图23)在非人灵长动物中实质性更大。
正如注意到的，在第0，14，21，28，35，和56天收集血清。通过针对HPIV3的60％噬斑减少测定法分析对rB/HPIV3载体特异性的血清抗体(图30)。这显示针对高度减毒的HEK/GA-opt/DS/B3TMCT构建物的载体特异性中和性血清抗体应答与non-HEK/non-opt和HEK/GA-opt/DS构建物相比更慢且有点降低。这与降低的抗原负载会降低免疫原性的预期一致。在28天后滴度变得更加相似，而且正如预期的，没有来自第28天的RSV攻击的载体特异性免疫的加强(因为RSV不含任何载体抗原)。
通过在补体存在和缺失下实施的噬斑减少测定法对RSV特异性中和性血清抗体应答定量(分别为图31和32)。在补体存在下的测定法显示响应HEK/GA-opt/DS/B3TMCT构建物的RSV中和性血清抗体诱导比其它两种构建物更加快速且达到显著更高的滴度(图31)。RSV特异性中和性血清抗体的这种更大诱导是引人注目且令人惊讶的，因为这种构建物在复制方面受限制高得多(图29)。当先前在仓鼠中测定时(图24)，这种构建物给出与HEK/GA-opt/DS相比并非统计上显著的明显升高：在非人灵长动物中观察到的更大升高与仓鼠模型是这些人和牛/人病毒的较低敏感性模型的观念一致。例如，当在第28天在补体缺失下实施测定法以测量高质量抗体时也观察到恒河猴中响应HEK/GA-opt/DS/B3TMCT构建物的RSV中和性血清抗体的更大诱导：确实，这种构建物较之其它两种构建物的滴度差异比在补体存在下观察到的实质性更大(图32)。总之，这些结果指示DS突变没有实质性提高RSV中和性血清抗体的数量(图31)但确实提高质量(图32)，而进一步添加B3TMCT修饰剧烈提高RSV中和性血清抗体的数量(图31)和质量(图32)二者。
第28天施用的RSV攻击病毒受到所有载体的完全限制，而且未能自来自任何动物的鼻咽拭样和气管灌洗样品回收到感染性攻击RSV，因此这项实验没有提供这些病毒的比较特性的进一步信息。有时观察到实验动物中针对短期RSV攻击的完全保护，因为这些模型中RSV复制的半允许性性质推动复制的限制。RSV特异性抗体应答在第28天后继续升高，但是不清楚这种应答是否是由于首要感染或攻击。
使用荧光双重染色噬斑测定法对在第4，5，和6天(峰脱落的时间)自恒河猴回收的病毒分析RSV F蛋白的表达。数据的汇总显示于图33。这项分析显示RSV F插入物在猴中复制期间一般是稳定的。结果与图26中关于仓鼠研究显示的那些非常相似。对于大多数来自恒河猴的样品，几乎所有回收的病毒表现为黄色噬斑且因而表达RSV F蛋白。有些标本中有RSV F表达的零星丧失，典型的是给定标本中<10％回收的噬斑。没有证据显示表达丧失随时间显著升高，而且有时在早期时间点观察到表达丧失的证据，但是在来自相同动物的较晚时间点没有。也没有证据显示特定构建物与较之另一种构建物不成比例的更大RSV F表达丧失相关。例如，尽管HEK/GA-opt/B3TMCT的表达对于rB/HPIV3载体是高度减毒性的，然而没有证据显示RSV F表达丧失的病毒的选择升高。
还生成了表达具有GenScript(GS)优化且含有HEK指派和DS-Cav1修饰的RSV F外域(氨基酸1-513，缺少TM和CT域)的rB/HPIV3载体。将外域融合至4个氨基酸的接头，接着是在它C端的三聚体稳定化折叠子序列，即构建物#19(HEK/GS-opt/DS-Cav1/[1-513]折叠子)。先前在小鼠和恒河猴中作为亚基疫苗评估了这种形式的融合前RSV F(McLellan,etal.2013.Science 342:592-598)。这种RSV F蛋白应当作为部分分泌形式表达，类似构建物#8(HEK/GA-opt/Ecto)，但是具有下述改善，即GS优化所致更加有效的翻译，DS-Cav1修饰所致更好的免疫原性，和折叠子稳定化域所致更大的三聚体稳定性。可以使用这种构建物来比较分泌DS-Cav1形式与膜锚定形式，即#16(HEK/GS-opt/DS-Cav1)和病毒粒体掺入形式，即#18(HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT)相比的免疫原性如何。
来自这项研究的点：(1)仓鼠模型，虽然方便，但是可能对各种构建物的复制，表达，和免疫原性的变化有点不敏感性，而且可能的情况是与这些构建物相关的效果(诸如减毒和免疫原性)在这些疫苗构建物意图的人宿主中会实质性更大。例如，虽然HEK/GA-opt/DS/B3TMCT构建物中B3TMCT修饰的存在在仓鼠模型中只赋予减毒的适度升高(图23)，但是它在与可信的人宿主更加密切相关的恒河猴中减毒实质性更多(图29)。而且，HEK/GA-opt/DS/B3TMCT和其它构建物之间对于RSV中和性抗体的免疫原性的差异在恒河猴中(图31)比在仓鼠中(图24)实质性更大，尽管该构建物在恒河猴中减毒实质性更多(图29)。因而，内在免疫原性每pfu HEK/GA-opt/DS/B3TMCT表现为在恒河猴中比在仓鼠中大得多，且因而可能类似地在人中更大。在仓鼠中的这种明显不敏感性可能解释了例如为什么仓鼠模型没有可靠地提供与RSV F表达升高16倍相关的免疫原性差异(图9)。还应当注意的是为了人使用的密码子优化可能不为仓鼠中的表达提供与灵长动物细胞(和人疫苗接种者)相比相当的升高，这可能有助于与灵长动物相比降低在仓鼠模型中的免疫原性。(2)另一个主题是降低由RSV F诱导的合胞体形成的量的合意性。在体外，合胞体形成没有表现出限制单层培养物中的复制，尽管可能的是它可能变成用于制造的微载体细胞培养物系统中的一个因素，因此控制合胞体形成看来是谨慎的。对于大多数构建物，存在HEK指派，它们强烈遏制合胞体形成。像HEK指派一样，DS和DS-Cav1构建物也强烈遏制合胞体形成且因而提供出乎意料的好处。一种与合胞体形成上调相关的构建物，即HEK/GA-opt/B3CT，确实在仓鼠中展现降低的复制(图23)和免疫原性(图24)，给出合胞体形成升高在体内可能是有害的指示。这在灵长动物宿主中可能更加突出。因此，GS-opt，HEK，DS或DS-Cav1，和B3TMCT的组合鉴定为在合胞体形成的两种遏制物的背景中(HEK和DS-Cav1)，及在并非高融合原性的包装信号存在下(B3TMCT)会给出最高水平的RSV F表达的组合(由于HEK加GS-opt，加表现为提供升高的F蛋白积累的融合前F蛋白稳定化)。(3)两种特征(即B3TMCT和DS突变)独立地与高质量RSV中和性血清抗体的实质性诱导相关。恒河猴研究提示B3TMCT在与人中的预期疫苗性能有关的灵长动物宿主中是这两个因素中更加重要的(图32)。重要的是，B3TMCT修饰还剧烈提高RSV中和性血清抗体应答的数量(图31)。(4)出乎意料地且幸运地，当通过双重免疫荧光测定法评估时，改善RSV F表达和包装的特征没有表现为赋予针对RSV F表达丧失的显著选择压力。正如早就注意到的，RSV F插入物表达丧失是MEDI-534的一个问题，但是在本研究中采用MEDI-534中没有采用的许多特征来下调融合，而且这可能在稳定化RSV F插入物中发挥主要作用。另外，通过评估包装信号的两个交叠集合，有可能鉴定并避免具有高融合原性的包装信号，及鉴定并选择具有实质性降低的融合的包装信号。(5)特别是，B3TMCT修饰作为提高免疫原性的一个重要因素出现。HEK，GA-opt或GS-opt，和DS或DS-Cav1修饰作为次要改善出现。正如注意到的，B3TMCT具有在恒河猴中强烈减毒载体的作用。在高度减毒的rB/HPIV3载体的背景中使用这种修饰产生表现为实质性过减毒的载体。然而，使用反求遗传学，B3TMCT F蛋白(在需要时，具有HEK，加GA-或GS-opt，加DS或DS-Cav1修饰)可以与减毒较少的载体主链，诸如携带一处或多处已知的稳定化减毒突变的野生型HPIV1，2，或3或型式组合以创建减毒较少的构建物。既然rB/HPIV3中的B3TMCT构建物具有很高的免疫原性，尽管是非常过减毒的，那么复制好10至100倍的表达这种蛋白的构建物应当是恰当减毒的且实质性更高免疫原性的。
表达已修饰型式的RSV F ORF和蛋白质的重组rB/HPIV3载体的另外的测定法。
实施了另外的测定法来评估：(i)包括DS融合前稳定化突变和B3TMCT包装信号的GS-opt型式的构建物，和(ii)包括两处空腔填充突变S190F和V270L与DS突变的组合的DS-Cav1融合前稳定化突变。所测定的F蛋白还含有两处HEK氨基酸指派，它们产生与上文描述的A2株的早期传代(称作HEK-7)的氨基酸序列同一的氨基酸序列。这些测定法显示：
1.DS-Cav1和B3TMCT独立赋予诱导显著水平的补体不依赖性RSV中和性抗体(认为与体内保护最有关)的能力。
2.DS-Cav1加B3TMCT的组合给出免疫原性的进一步升高。
3.两种最高免疫原性的构建物是HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(图53，#7组)和HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#10组)，区别仅在于密码子优化的来源，其中GS-opt表现为最高免疫原性。
4.虽然HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#7组)和HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(图53，#10组)在成对比较中并非统计上可区分的，但是后者的免疫原性比wt RSV显著更高。这些发现显示HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#10组)是仓鼠模型中免疫原性最高的构建物，特别是对于在不需要添加补体的情况下检测的高度有效的中和性抗体(图53)，而且因而GS-opt和DS-Cav1的进一步修饰表现出提高免疫原性。这也是仓鼠攻击研究中保护性最高的构建物。
5.rB/HPIV3载体获取赋予大噬斑表型和减毒的突变的倾向通过载体HN蛋白中的三处核苷酸和两处氨基酸突变得到本质上消除。
6.自第一基因位置(N前)表达HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT插入物，产生的构建物在Vero细胞中有效复制，能在具有高百分比的RSV F表达的制备物中获得，且有效表达RSVF蛋白。
动物研究的汇总。如指示的，图35指示已经在仓鼠中的两项不同研究和恒河猴中的两项不同研究中评估的构建物：“第1仓鼠研究”涵盖图8-9，14-16，和23-26；“第1NHP研究”涵盖图29-33；“第2仓鼠研究”涵盖图51-54；“第2NHP研究”涵盖图55和57。
GA-opt病毒的体外多周期复制。图46和47图示与空载体相比，HEK/GA-opt/DS-Cav1构建物自身或进一步添加B3TMCT包装信号的构建物(图35中的构建物#13和15)的多周期复制。这是在非洲绿猴肾Vero细胞中(图46)(它是用于疫苗制造的细胞基质)，及在恒河猴肾LLC-MK2细胞中(B)(它是一种常用实验室细胞系，与Vero细胞不同，它典型地通过病毒感染而诱导表达I型干扰素)进行的。这项实验显示两种含有DS-Cav1的构建物(有或无B3TMCT)有效且彼此相似地复制，而且与空载体相比适度减毒。尽管有这种适度减毒，两种含有DS-Cav1的构建物均复制至比107TCID50/ml更高的滴度。这种适度减毒样式与用表达不同型式的RSV F的其它rB/HPIV3载体获得的结果非常相似(例如图7，12，和20)。因而，这些结果显示携带这些已修饰插入物的rB/HPIV3以完全满足疫苗制造的有效方式复制。
GS-opt病毒的体外多周期复制。图48图示HEK/GS-opt主链(图35中的构建物#5)的多周期复制，与进一步添加DS-Cav1(#16)，DS-Cav1/B3TMCT的组合(#18)，和DS-Cav1，外域1-513，和促进外域寡聚化的C端“折叠子”域的组合(#19)的型式比较，与空载体比较。Vero(图48A)和LLC-MK2(B)细胞中的评估显示表达各种形式的RSV F的载体以非常相似的动力学和产率复制，而且与空载体相比适度减毒。它们在细胞培养物中均复制至比107TCID50/mL更高的滴度。这些结果显示携带这些已修饰插入物的rB/HPIV3以完全满足疫苗制造的有效方式复制。
GA-和GS-opt病毒的体外多周期复制。图49图示区别在于GA优化或GS优化的多对构建物的多周期复制：具体而言：HEK/GS-opt/DS-Cav1较之HEK/GA-opt/DS-Cav1(顶部小图，分别为来自图35的构建物#16和13)，和HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT较之HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(底部小图，分别为来自图35的构建物#18和15)。在Vero(图49A，C)和LLC-MK2(B，D)细胞中评估两对构建物中每一个。GS-opt构建物有时复制比GA-opt构建物边缘性更加有效(例如图49C和49D)，尤其在第一次3-4天温育期间。
体外RSV F表达。图50图示Vero和LLC-MK2细胞中RSV F和载体蛋白通过rB/HPIV3构建物的表达。这比较通过HEK/GA-opt(图50，2道；图35，构建物#3)较之HEK/GS-opt(图50，3道；图35，构建物5)进行的表达：与实施例1(图5)中描述的结果一致，GS优化导致有点更高的RSV F蛋白表达。HEK/GS-opt构建物还与另外含有DS-Cav1(图50，3道；图35，构建物#16)，或DS-Cav1/B3TMCT(图50，5道；图35，构建物#18)，或DS-Cav1/(1-513)折叠子(图50，8道；图35，构建物#19)的型式比较。比较还包括wt RSV感染的(图50，6道)或模拟感染的(7道)细胞。结果显示每一种GS-opt构建物均指导RSV F的有效表达，而且确实表达比wt RSV多得多的RSV F(图50，6道)。三种编码全长DS-Cav1F蛋白的GS-opt构建物感染的细胞(图50，4，5，和8道)具有有点更多的RSV F蛋白F0前体积累，提示它的融合前稳定化可能具有边缘性降低的切割效率。然而，一般而言，每一种构建物均非常有效地表达RSV F蛋白。融合前折叠子构建物，HEK/GS-opt/DS-Cav1/(1-513)折叠子(图50，8道)，仅仅部分分泌入培养基(图50A，下部小图)，而且分泌形式完全是已切割F1链(图4A，下部小图，8道)，而所有细胞伴随形式是未切割F0(图4A，上部小图，B和C，8道)。在培养基上清液中没有检测到其它测试形式的RSV F，指示它们不分泌。DS-Cav1/(1-513)折叠子构建物的无效/低效切割和分泌是出乎意料的，因为这种三聚化域先前已经成功用于制备纯化的F蛋白(McLellan et al Science2013Nov 1；342(6158):592-8.doi:10.1126/science.1243283)。这说明外来蛋白通过导向(vectored)构建物的表达可能是不可预测的，而本文中多种构建物的详细评估提供综合评估，导致多种合适，成功构建物的鉴定。
仓鼠研究。在仓鼠中对多种含有B3TMCT，DS，和DS-Cav1的进一步添加的GA-opt和GS-opt构建物(构建物在图35中标识为“第2仓鼠研究”)评估复制效率(图51)，RSV F蛋白表达稳定性，RSV中和性血清抗体刺激(图52和53)，和针对RSV攻击的保护功效(图54)。
仓鼠中的复制。评估GA-opt和GS-opt构建物在仓鼠上(鼻甲)和下(肺)呼吸道中的复制(图51)。在鼻甲中，HEK/GA-opt/B3TMCT(#5组)和HEK/GA-opt/DS/B3TMCT(#6组)比其它更受限制。在肺中，具有B3TMCT的GA-opt构建物(HEK/GA-opt/B3TMCT，#5组，HEK/GA-opt/DS/B3TMCT，#6组，和HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT，#7组)更受限制。类似地，具有B3TMCT的GS-opt构建物，即HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#10组)与比HEK/GS-opt/DS-Cav1(#9组)减毒更多。这些观察结果提示B3TMCT提高减毒水平。另外，GA-opt构建物表现为比GS-opt构建物减毒更多。例如，DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT的GS-opt构建物，即HEK/GS-opt/DS-Cav1(#9组)和HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#10组)在LRT中复制至5.0和4.2Log10TCID50/g的均值峰滴度，比等同GA-opt构建物的均值滴度，即4.0和3.4Log10TCID50/g(#4和7组)更高。这提示GS-opt RSV F插入物比GA-opt RSV F减毒更少。
RSV F蛋白的表达的稳定性。通过分析免疫接种后第5天收获的免疫接种仓鼠的鼻甲和肺样品用双重染色噬斑测定法评估它们体内复制期间通过rB/HPIV3载体的RSV F表达的稳定性。大多数样品(107份中的92份)具有超过90％的复制载体仍然表达RSV F；107份中的6份具有89-80％的载体表达RSV F；107份中的9份具有少于79％的复制载体表达RSV F；仅7份样品具有＞50％的载体丧失RSV F表达。在有＞50％载体丧失RSV F表达的这7份样品中，4份是GA-opt构建物，3份是GS-opt构建物。没有证据显示GA-opt，或GS-opt，或DS，或DS-Cav1，或TMCT与不稳定性的任何特定升高相关。很可能的是个别制备物间不同水平的不稳定性反映很大程度上不依赖于具体构建物的零星突变，且因而每一种构建物的数份独立制备物的评估很可能会鉴定具有很高百分比的RSV F蛋白表达的一份或多份。
RSV中和性血清抗体的滴度。在添加豚鼠补体下(图52)或在补体缺失下(图53)通过RSV中和测定法测定RSV中和性血清抗体滴度。在添加补体下实施的测定法常常用于RSV和HPIV3中和测定法，因为它容许灵敏检测病毒特异性抗体，因为补体能对在其它情况下在体外可能不是中和性的抗体赋予病毒裂解和空间位阻能力(Yoder et al J Med Virol72:688-694,2004)。与之对比，已经提出在体外在补体缺失下中和RSV的抗体对于保护是最有关的(Yoder et al J Med Virol 72:688-694,2004)，而且在之前的研究中已经与针对RSV攻击的更高水平的保护关联起来(Liang et al J Virol 89:9499-9510,2015)。认为在体外不依赖于添加补体而中和的抗体是“高质量”的且指示性质上卓越的免疫原性。
在补体依赖性测定法中(图52)，所有表达RSV F的rB/HPIV3载体诱导高滴度的RSV中和性抗体，除了免疫原性较差的HEK/GS-opt/DS-Cav/(1-513)折叠子构建物。GS-opt构建物诱导比它们的GA-opt构建物对应物更高滴度的RSV血清中和性抗体(#9组HEK/GS-opt/DS-Cav1的11.0Log2PRNT60对#4组HEK/GA-opt/DS-Cav1的10.2Log2PRNT60；#10组HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT的11.8Log2PRNT60对#7组HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT的10.4Log2PRNT60)。在补体依赖性测定法中(图52)，引人注目的是，在统计上免疫原性与wtRSV(黄金标准)一样的三种构建物是GS-opt构建物HEK/GS-opt(#8组)，HEK/GS-opt/DS-Cav1(#9组)，和HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#10组)。
在补体不依赖性测定法中(图53)，表达天然形式的RSV F的载体(non-HEK/non-opt和HEK/GS-opt)没有诱导可检测的RSV中和性抗体，确认并扩充来自实施例1的结果。融合前稳定化突变(DS，DS-Cav1)和包装信号B3TMCT独立提高对于高质量RSV中和性抗体而言的免疫原性(例如，在B3TMCT缺失下具有DS和/或Cav1的构建物以#3，4，和9组例示，而在DS/Cav-1缺失下具有B3TMCT的构建物以#5组例示)。融合前稳定化突变加B3TMCT的组合具有免疫原性的叠加性改善，这是对GA-opt以及GS-opt构建物观察到的(例如#6，7，和10组)。在补体不依赖性测定法中，HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT构建物(#10组)诱导比任何其它载体所诱导的显著更高滴度的RSV中和性血清抗体(7.6Log2PRNT60)，除了它的GA-opt对应物HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#7组)，其诱导更低的滴度(6.8Log2PRNT60)但并非显著更低。然而，由HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT构建物(#10组)，而非HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#7组)诱导的抗体滴度比wt RSV(#12组)显著更高，且因此HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT构建物(#10组)是载体和wt RSV中对于高质量RSV中和性抗体而言免疫原性最高的。
RSV攻击。用wt RSVIN攻击免疫接种仓鼠以评估保护功效(图54)。正如图54中显示的，除了DS-Cav1/(1-513)折叠子构建物，所有表达RSV F的载体在URT(图54A)和LRT(图54B)中诱导显著保护。DS-Cav1/(1-513)折叠子缺少保护符合它在RSV血清中和测定法中显示的较差免疫原性(图52和53)。与由wt RSV赋予的无菌免疫(sterile immunity)相比，HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT在所有测试载体中赋予最大保护且与wt RSV几乎等同：只有1只免疫接种这种载体的仓鼠具有可检测的wt RSV，而且仅仅在鼻甲中以很低的水平。在鼻甲中HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#10组)的保护功效与来自wt RSV(#12组)的在统计上不可区分，而HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(#7组)具有显著更低的保护性，支持前一种构建物是免疫原性最高的构建物的想法。在保护方面与wt RSV的这种等同是值得注意的，因为wtRSV表达两种中和抗原，G和F，而且还表达所有病毒蛋白作为细胞免疫的潜在抗原，而载体只表达RSV F蛋白。已经显示细胞免疫在啮齿动物中的RSV攻击研究中赋予有力保护(例如Connors et al J Virol 66:1277-1281,1992)。
恒河猴中的评估。选择在仓鼠中具有最高免疫原性的三种载体来评估它们在恒河猴中的复制和免疫原性(图55)。这些构建物包括HEK/GA-opt/DS/B3TMCT(图55的顶部处的构建物)，它在第1NHP研究中鉴定为特别有效(图28-32，实施例1中)。第二种构建物是HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT，它与第一种构建物相同，只是它具有DS-Cav1代替DS。第三种构建物是HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT，它与前面的构建物的区别在于具有GS-opt代替GA-opt。这后两种构建物在图53中诱导最高滴度的“高质量”RSV中和性血清抗体。
恒河猴中的复制。具有GA-opt和GS-opt型式的HEK/DS-Cav1/B3TMCT的平行构建物在URT中以相似的动力学复制，如通过鼻咽拭样采样的(图56A)。然而，在LRT中没有观察到这种等同，如通过气管灌洗采样的：GS-opt型式比GA-opt型式减毒更少(图56B)。这些结果与在图51中的仓鼠中观察到的一致。关于具有DS较之DS-Cav1的平行构建物(HEK/GA-opt/DS/B3TMCT较之HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT)的比较，前一种病毒在URT中减毒更多(图56A)；但是它们在LRT中以相似的效率复制(图56B)。这些结果也与在图51中的仓鼠中观察到的一致。值得注意的是，与在第1NHP研究中测试的相同构建物(图29，实施例1)相比，HEK/GA-opt/DS/B3TMCT在这项研究中在URT和LRT二者中复制至显著更高的滴度(高～10倍)。先前的研究(图29)中的猴比图56中使用的猴老6岁且重量大2-3倍。可能是这些病毒的复制在年轻的猴中更加有效，或者差异可能反映这两项实验之间的变异性。
RSV中和性血清抗体。虽然图56中的三种载体在恒河猴中以略微不同的效率复制，但是它们诱导相当的高水平的RSV中和性血清抗体，是通过补体依赖性(图57A)和补体不依赖性(图57B)测定法测定的。
在第一基因位置处插入RSV F。实施例1和本实施例中的所有在先B/HPIV3-RSV-F构建物均涉及在载体N和P基因之间的第二基因位置中插入的RSV基因。在第一位置处插入未修饰RSV F与生长受损或RSV F蛋白表达稳定性降低的任何明显问题不相关。调查了优化，改造形式的RSV F是否能自第一基因位置有效且稳定表达。具体而言，将HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT型式的RSV F插入N前位置(图58A)。
HN中赋予载体的表型不稳定性的两处氨基酸指派的鉴定和修饰。先前注意到rB/HPIV3载体在体外传代后展现出表型不稳定性(Liang et al J Virol 88:4237-4250)。具体而言，实质性比例的载体在传代期间获取了大噬斑表型。这发生于不同插入物以及空载体，指示它是载体独自的一项特性且不是外来基因特异性的。6个克隆的大噬斑病毒的全基因组序列分析显示每一个获取了HN中的H552Q错义突变，以及F中的三处不同错义突变中的一处，及一些情况中L中的一处或两处错义突变(Liang et al J Virol 88:4237-4250)。11个另外的大噬斑克隆的部分测序显示这些中的7个含有HN中的H552Q突变，而其它4个均含有HN中的四处其它错义突变(N240K，P241L，R242K，或F558L)中的一处。与HPIV3 HN蛋白的晶体结构(Lawrence et al J Mol Biol 335:1343-1357,2004)的比较指示所有这些HN突变位于HN球状头的二聚体界面中。另外，先前记载了通过神经氨酸酶处理细胞上的生长选择的一种HPIV3变体中的H552Q突变，该HPIV3变体具有大噬斑表型，具有更高的对含有唾液酸的受体的亲合力，具有增强的F蛋白触发，而且在啮齿动物中是减毒的(Moscona et al JVirol 67:6463-6468；Porotto et al J Virol 81:3216-3228；Palermo et al J Virol83:6900-6908)。这提示rB/HIPIV3载体中的HPIV3 HN基因中的偶然突变是相似的且大概是因为它们提高rB/HPIV3载体对Vero细胞的结合亲和力而选择的。然而，其他人关于大噬斑表型与体内实质性减毒相关的观察结果(Moscona et al J Virol 67:6463-6468；Porottoet al J Virol 81:3216-3228；Palermo et al J Virol 83:6900-6908)对于本载体会是不利的，因为这很可能会导致过减毒。HPIV3反求遗传学系统含有HN基因中的两处突变：cDNA克隆中有导致T263I错义突变的偶然的C7589T核苷酸突变(相对于完整反基因组序列)，和作为标志物有目的地引入的导致P370T突变的C7913A和A7915T突变(Durbin et alVirology 235:323-332,1997)。这后一种错义突变已经设计成消融受到两种可得HPIV3中和性单克隆抗体(单抗423/6和170/7)识别的表位。将这些突变恢复成它们的野生型指派，即7593C(263T)和7913C+7915A(370P)(图58B)。引人注目地，这些变化防止在Vero细胞中传代期间获取大噬斑表型(未显示)。因此，别的携带HPIV3 HN基因的载体构建物(包括但不限于基于rB/HPIV3和HPIV3的载体)优选应当含有这些指派。例如，将I263T和T370P突变掺入图58A中所示HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT/pre-N构建物。会修饰所有携带HPIV3 HN基因的感兴趣载体以含有263T和370P指派。
病毒回收。回收有HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT插入N前位置的rB/HPIV3载体(图58A)并生长至高至8.2log10TCID50/mL的滴度，且因而就病毒产量而言具有很少的生长限制或没有生长限制，这对于疫苗制造是重要的。这种病毒的噬斑尺寸一般比插入第二位置的相同型式的RSV F(未显示)更小，指示对生长有在病毒产量方面不明显的适度限制。
RSV F蛋白的表达的稳定性。通过双重染色噬斑测定法分析病毒的两份制备物以评估RSV F蛋白的表达的稳定性。实施两个独立挽救病毒集合(称作CL20a和CL24a)的双重染色噬斑表型。在感染10倍连续稀释病毒的24孔板中的Vero单层上进行噬斑测定法。用含有0.8％甲基纤维素的培养基覆盖感染单层并于32℃温育6天。在冰冷的80％甲醇中混合后，将单层与三种针对RSV F的小鼠单克隆抗体(1129，1109，1243)的混合物和家兔抗HPIV3超免疫血清一起温育，接着与IRDye 680(红色，检测RSV F)缀合的山羊抗小鼠和IRDye 800(绿色，检测HPIV3)缀合的山羊抗家兔抗体一起温育。
一份制备物在细胞培养物中传代后是稳定的，而第二份制备物在～40％的病毒中具有绿色染色且因而具有RSV F表达丧失的证据。这些结果指示RSV F表达丧失在病毒制备物中可发生且可放大，但是它表现为零星的且仔细监测能鉴定具有高比例的表达的制备物。
细胞内蛋白质表达。在Vero(图59A)和LLC-MK2(图59B)细胞中分析来自N前位置的RSV F表达。在Vero细胞中，HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT型式的RSV F作为F1和F0链表达(图59A)，而且来自N前位置的总表达与自N-P位置表达的相当。但是在LLC-MK2细胞中(图59B)，这种型式的RSV F作为F0链优势表达，而且来自N前的表达比来自N-P位置的(图59B，3，4，5道)实质性更加有效。在这两种类型的细胞中，这种型式的RSV F以比未修饰RSV F(non-HEK/non-opt，图59A，59B，3和4道较之6道)高得多的水平表达。
实施例2：
作为二价HPIV1/RSV疫苗的表达人呼吸道合胞病毒(RSV)的融合F糖蛋白的减毒人副流感病毒1型(HPIV1)
这个实施例例示自两种减毒rHPIV1主链的三个基因组位置表达RSV F抗原的活减毒rHPIV1载体的RSV疫苗的开发和临床前评估。仓鼠中的临床前评估指示携带P/C基因中的减毒删除突变(CΔ170)且自N前位置表达RSV F的rHPIV1 CΔ170-F1载体是充分减毒，稳定且针对RSV和HPIV1免疫原性的并针对RSV攻击感染提供显著保护。这项研究证明rHPIV1能作为RSV疫苗载体用于实现针对两种主要儿童疾病的二价保护。
引言。与包含RSV的减毒株的RSV疫苗相比，包含表达RSV F蛋白的活减毒HPIV载体(诸如自HPIV1开发的)的RSV疫苗提供数项优势。一项优势是它提供针对RSV和作为载体使用的HPIV血清型的二价疫苗。这是重要的，因为，正如注意到的，HPIV也是儿科呼吸道疾病的重要的，未受控制的因子，流行病学和发病机理的特征与RSV的那些交叠。因而，组合的HPIV/RSV疫苗是会扩宽针对儿科呼吸道疾病的覆盖的一种合乎逻辑的组合。另外，RSV感染性是臭名昭著的，因为它倾向于在操作期间不稳定，这使疫苗开发，制造，和投递变得复杂。HPIV是实质性更加稳定的，这对于将RSV疫苗延伸至最需要它们的发展中国家可能是至关紧要的。在体外生长的RSV常常形成长丝，使制造变得复杂，而HPIV形成更小的球形颗粒。还可能的是，与HPIV相比，RSV是内在致病性更高且甚至可能免疫抑制性的，这会是HPIV为载体的RSV疫苗的另一项优势。还已经发现，在啮齿动物中，在活减毒RSV株之后施用的作为加强使用的HPIV为载体的疫苗具有比第二剂相同减毒RSV株更高的免疫原性。因而，源自初次免疫接种的RSV特异性免疫可能预期比HPIV为载体的病毒更加有效地限制第二剂减毒RSV株的复制，并且指示HPIV为载体的RSV疫苗的另一项潜在优势。
HPIV1基因组是单链负义RNA。它由短3’前导区，接着是编码N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的6个基因，和短尾随区组成。每种基因编码一种主要病毒蛋白：N，核蛋白；P，磷蛋白；M，内部基质蛋白；F，融合糖蛋白；HN，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白；和L，主要聚合酶亚基。另外，P基因携带表达抑制宿主干扰素(IFN)应答并阻断凋亡的一组羧基-共末端C辅助蛋白(carboxy-co-terminal C accessory protein)的一个交叠ORF(Bartlett,et al.2008.Jvirology 82:8965-8977)。像其它不分段负链RNA病毒一样，HPIV1转录起始于3’末端启动子并以受到基因终点(GE)-基因间(IG)-基因起点(GS)信号调节的开始-终止过程沿着基因组行进以生成一系列单顺反子mRNA。有转录降低的3’至5’梯度，接近启动子的基因以更高水平表达(Nagai.1999.Reviews in medical virology 9:83-99)。像其它副粘病毒一样，可以在来自转染cDNA的细胞培养物中回收完整的感染性的，复制胜任的HPIV1(反求遗传学)。
先前的研究已经记载了牛和人PIV3的嵌合物作为RSV F蛋白的载体的开发(Schmidt et al 2000J Virol 74:8922-8929；Schmidt et al 2001J Virol 75:4594-4603；Schmidt et al 2002J Virol 76:1088-1089；Tang et al 2002J Virol 78:11198-11207；Bernstein et al 2012Pediatr Infect Dis 31:109-114；还见实施例1)。这种称作rB/HPIV3的病毒由如下的BPIV3组成，其中使用反求遗传学将F和HN基因用HPIV3的那些替换，组合灵长动物中的BPIV3的减毒表型与HPIV3的主要中和抗原(Schmidt et al 2001JVirol 75:4594-4603；Schmidt et al 2002J Virol 76:1088-1089；Tang et al 2002JVirol 78:11198-11207；Bernstein et al 2012Pediatr Infect Dis 31:109-114)。rB/HPIV3显示出有效表达RSV F和G基因。引导rB/HPIV3/RSV-F构建物作为RSV和HPIV3的二价疫苗在血清阴性儿童中的临床评估显示它是感染性的，耐受较好，且减毒的，但是针对RSVF的免疫原性比希望的要低(Bernstein et al 2012Pediatr Infect Dis 31:109-114)。这看来是至少部分由于临床试验材料中使RSV F插入物的表达沉默的遗传不稳定性(Yang,etal.2013.Vaccine 31:2822-2827)。然而，正在进行进一步的研究，通过表征和优化载体构建的各种参数稳定化RSV F插入物及获得升高的免疫原性(Liang,et al.2014.J virology88:4237-4250)。HPIV1是另一种有吸引力的用于表达RSV F抗原的载体。特别是，HPIV1在儿童中感染比RSV或HPIV3有点晚(Counihan,et al.2001.Pediatric infectious diseasejournal 20:646-653；Reed,et al.1997.J Infect Dis 175:807-813)，因此HPIV1为载体的RSV疫苗可能在活减毒RSV或rB/HPIV3为载体的疫苗之后用于加强针对RSV的免疫应答。
在本研究中，评估了用于开发表达RSV F蛋白的HPIV1为载体的疫苗的两项参数(图36和42)：(i)比较两种不同减毒HPIV1主链，和(ii)比较在HPIV1载体的第一，第二，和第三基因组位置处插入RSV F基因。第一项参数，减毒的水平，是重要的，因为它与安全性有联系且与免疫原性有相反的联系。具体而言，HPIV1载体必须足够减毒，从而是非致病性的且耐受较好的，但是必须足够好地复制和表达抗原，从而实现令人满意的免疫原性。将外来基因(诸如RSV F)添加至HPIV载体也典型地赋予减毒且还能赋予温度敏感性(ts)表型(Liang,et al.2014.J virology 88:4237-4250)，因此不得不测定插入物和具体减毒性突变的组合效果。本研究中使用的两种不同HPIV1主链各自含有在先前的研究(1，3，25)中开发的单一减毒性突变(CΔ170或LY942A)。这些突变各自已经显示出在体内适度减毒(Bartlett,et al.2006.Vaccine 24:2674-2684；Bartlett,et al.2007.Virology J 4:67；Newman,etal.2004.J Virol 78:2017-2028)。CΔ170突变不是温度敏感性的。它降低C蛋白抑制宿主I型干扰素应答和凋亡的能力(Bartlett,et al.2006.Vaccine 24:2674-2684；Bartlett,etal.2008.J virology 82:8965-8977；Newman,et al.2004.J Virol 78:2017-2028)，导致病毒减毒。减毒的机制具有提高构建物的内在免疫原性的潜力，因为C中的这种突变提高宿主干扰素应答和凋亡应答，二者均具有提高免疫原性的潜力。CΔ170突变由交叠的P和C ORF中6个核苷酸的删除组成。在C ORF中，这导致删除两个氨基酸和替代第三个氨基酸(具体而言，三联体168-RDF-170变成单个氨基酸S)，而在交叠的P ORF中，它导致删除两个氨基酸(172-GF-173)。认为删除突变提高了稳定性，因为它们由于相同位点反转的低风险而提供更大的基因型和表型稳定性。LY942A突变是温度敏感性的。它是L ORF中的错义突变(942-Y至A)，设计涉及3个核苷酸的替代，从而对去减毒有高度抗性(图42)，正如已经直接证明的(McAuliffe et al 2004.J Virol 78:2029-2036)。(ii)本研究中调查的第二项参数，HPIV基因组中插入外来基因的位置，是重要的，因为它影响外来基因的表达水平以及它对载体的减毒性影响。在HPIV基因组中，由于转录梯度，更接近启动子插入RSV F基因预期会提供更高水平的表达。然而，外来基因离启动子越接近，它能影响的下游载体基因的数目越多，因为这些载体基因现在均成为自启动子进一步去除的一个位置且因此表达效率更低。另外，在第一位置中放置外来基因具有影响启动子功能的潜力。插入外来基因还能具有不可预测的效果。它还能是经由诸如提高基因组长度和基因数目等作用而减毒性的。
构建了代表两种不同减毒HPIV1主链中RSV F的三个不同插入位点的六种病毒，通过反求遗传学挽救，并分析体外复制和RSV F和载体蛋白表达。使用仓鼠模型来评估体内复制(上和下呼吸道)，疫苗病毒稳定性，免疫原性，和针对wt RSV攻击的保护。
材料和方法
细胞和病毒。在补充有5％胎牛血清(FBS；HyClone/Logan,UT)和1mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)的具有GlutaMAX(Life Technologies,Grand Island,NY)的Opti-MEMI培养基中维持LLC-MK2(ATCC CCL-7)恒河猴肾和Vero(ATCC CCL-81)非洲绿猴肾细胞系。BSR T7/5细胞是组成性表达T7 RNA聚合酶的幼仓鼠肾21(BHK-21)细胞(Buchholz,etal.1999.J Virol 73:251-259)。在补充有10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和2％MEM氨基酸(LifeTechnologies)的Glasgow极限必需培养基(GMEM；Life Technologies)中维持这些细胞。培养基每隔一传代还补充有2％遗传霉素(Life Technologies)以选择拥有T7聚合酶构建物的细胞。
在LLC-MK2细胞中繁殖HPIV1。在病毒接种之前，将在含有5％FBS的培养基中生长的LLC-MK2细胞用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两次以去除FBS。总是在含有1.2％胰蛋白酶(TrypLE Select；Life Technologies)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)和1mM L-谷氨酰胺的无血清Opti-MEMI培养基中实施HPIV1感染。于32℃温育感染细胞直至细胞病变效应出现。对于病毒原种收获，收获培养物上清液并通过于4℃以1500rpm离心10分钟来澄清。病毒原种的小样在干冰上骤冻并保存于-80℃。如下测定HPIV1滴度，即在96孔板中在LLC-MK2细胞上用上文所述含有1.2％胰蛋白酶的无血清Opti-MEMI培养基10倍连续稀释，接着于32℃温育7天。如先前所述(Bartlett,et al.2006.Vaccine24:2674-2684)使用豚鼠红细胞通过血细胞吸附(HAD)检测感染细胞并作为log10TCID50(组织培养物感染性剂量50％)/ml计算滴度。通过如先前所述(Skiadopoulos,etal.1999.Vaccine 18:503-510)评估它们在32，35，36，37，38，39，和40℃复制的效率来研究每一种病毒的温度敏感性(ts)表型。如上文所述在LLC-MK2细胞的96孔重复板中实施每一种病毒的滴定，并在控温水浴中在密封容器中于各种温度温育7天。通过HAD测定滴度并作为TCID50/ml报告。
表达RSV F抗原的rHPIV1-CΔ170和rHPIV1-LY942A病毒的设计。使用自野生型(wt)HPIV1株华盛顿/20993/1964(GenBank登录号AF457102)(Newman,et al.2002.Virus Genes24:77-92)衍生的反求遗传系统构建rHPIV1病毒。通过定点诱变修饰HPIV1的重组全长反基因组cDNA克隆(pFLC)以含有3个另外的独特的限制性位点：MluI(ACGCGT，N前位置，核苷酸编号113-118)，AscI(GGCGCGCC，N-P位置，核苷酸编号1776-1783)和NotI(GCGGCCGC，P-M位置，核苷酸编号3609-3616)。使用QuikChange Lightning诱变试剂盒(Agilent,SantaClara,CA)遵照制造商的说明书分别将CΔ170(Bartlett,et al.2007.Virology J 4:67)或LY942A(Bartlett,et al.2007.Virology J 4:67；McAuliffe,et al.2004.J virology 78:2029-2036)突变任一引入P/C或L ORF，生成两种减毒cDNA主链。使用下述诱变引物来生成减毒HPIV1主链。对于HPIV1 CΔ170突变，正向引物是AAGAAGACCAAGTTGAGCCAGAAGAGGTACGAAG(SEQ ID NO：121)且反向引物是CTTCGTACCTCTTCTGGCTCAACTTGGTCTTCTT(SEQ ID NO：122)。与P/C ORF相比，这些引物在位置17和18之间引入6个核苷酸的删除(GGATTT)(图42)，与六法则一致(Calain,et al.1993.J Virol 67:4822-4830；Kolakofsky,et al.1998.J Virol72:891-899)。如先前描述的(Bartlett,et al.2007.Virology J 4:67)，P/C ORF中的CΔ170删除包括R168S替代和自位置169-170删除D和F，导致C蛋白的氨基酸序列自RDF变成S。这种突变还影响P ORF，涉及删除自位置172-173两个残基(G和F)。对于LY942A突变，正向引物是CCAGCTAACATAGGAGGGTTCAACGCGATGTCTACAGCTAGATGTTTTGTC(SEQ ID NO：123)且反向引物是GACAAAACATCTAGCTGTAGACATCGCGTTGAACCCTCCTATGTTAGCTGG(SEQ ID NO：124)。在这些引物序列中，L ORF中aa 942处TAT(Y)变成GCG(A)的突变位点标有下划线。诱变引物对是PAGE两步纯化的(Operon,Huntsville,AL)。然后通过质粒大量制备(EndoFree Plasmid MaxiKit；Qiagen)纯化根据测序测定具有期望突变的克隆并完整序列。将具有CΔ170或LY942A突变任一的rHPIV1pFLC用MluI，AscI，或NotI酶(New England Biolabs,Ipswich MA)消化，用小牛肠磷酸酶(New England Biolabs)处理，并通过凝胶提取(QIAEX II Gel ExtractionKit；Qiagen，Valencia CA)来纯化。
为人密码子选择优化(GeneArt,Life Technologies,Grand Island,NY)来自具有HEK氨基酸指派：分别在aa位置66和101处的Glu和Pro(Whitehead,et al.1998.J virology72:4467-4471)的株A2的RSV F基因。RSV F基因插入物设计(图36)成包括HPIV1转录调节序列：基因终点(GE)-基因间(IG)-基因起点(GS)信号以容许RSV F作为独立转录物表达。对于所有构建物，RSV F基因插入物设计成包括HPIV1N GE(AAGTAAGAAAAA，SEQ ID NO：125)和PGS(AGGGTGAATG，SEQ ID NO：126)序列连同保守的IG序列(CTT)，同时对于P GS保持+1定相。通过PCR生成RSV F插入物，对应的侧翼MluI，AscI，或NotI限制性位点分别与HPIV1FLC中用于在第一N前(F1)，第二N-P(F2)，或第三P-M(F3)位置中插入的那些互补(图36)。使用下述PCR引物来生成RSV F插入物。对于含有用于插入第一F1基因位置的MluI限制性位点的RSVF片段，正向引物是ACGCGTCCCGGGAACAATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCC(SEQ ID NO：127)且反向引物是ACGCGTCGTACGCATTCACCCTAAGTTTTTCTTACTTTCTATCAGTTGGAGAAGGCGATATTGTTGATGCCGG(SEQ ID NO：128)。对于含有用于插入第二F2基因位置的AscI限制性位点的RSV F片段，正向引物是GGCGCGCCCCCGGGAACAATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCC(SEQ ID NO：129)且反向引物是GGCGCGCCCGTACGCCATTCACCCTAAGTTTTTCTTACTTGATTCTATCAGTTGGAGAAGGCGATATTGTTGATGCCGG(SEQ ID NO：130)。对于含有用于插入第三F3基因位置的NotI限制性位点的RSV F片段，正向引物是GCGGCCGCCCGGGAAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAATGAACAATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCC(SEQ ID NO：131)且反向引物是GCGGCCGCCGTACGCTATCAGTTGGAGAAGGCGATATTGTTGATGCCGG(SEQ ID NO：111)。
表达RSV F抗原的rHPIV1 CΔ170和rHPIV1 LY942A病毒的回收。在组成性表达T7RNA聚合酶的BSRT7/5细胞中(Buchholz et al.1999.J.Virology 73:251-259)通过使用HPIV1反求遗传学系统(Newman,et al.2002.Virus Genes 24:77-92)自cDNA挽救自第一(HPIV1 CΔ170-F1)，第二(HPIV1 CΔ170-F2)，和第三(HPIV1 CΔ170-F3)位置表达RSV F的rHPIV1 CΔ170主链和自第一(HPIV1 LY942A-F1)，第二(HPIV1 LY942A-F2)，和第三(HPIV1 LY942A-F3)位置表达RSV F的rHPIV1 LY942A病毒。这种rHPIV1cDNA是自华盛顿/20993/1964(HPIV1 WASH/64)临床分离物衍生的。BSR T7/5细胞在6孔板中生长90％汇合，并如先前所述(Bartlett,etal.2005.Vaccine 23:4631-4646；Newman,et al.2002.Virus Genes 24:77-92)，使用Lipofectamine 2000(20ul)(Life Technologies)用要挽救的反基因组pFLC质粒(5ug)连同分别表达HPIV1N，P和L蛋白的pTM-N(0.8ug)，pTM-P(0.8ug)和pTM-L(0.1ug)支持质粒共转染。转染细胞于37℃温育过夜，用OptiMEM培养基(Life Technologies,Grand Island,NY)清洗两次，并将含有1mM L-谷氨酰胺和1.2％胰蛋白酶的新鲜OptiMEM添加至细胞，接着于32℃温育。在转染后48小时时，通过刮入培养基来收获细胞，将细胞悬浮液添加至LLC-MK2细胞在OptiMEM，1mM L-谷氨酰胺，1.2％胰蛋白酶(Life Technologies)中的50％汇合单层，并于32℃温育。7天后收获病毒并通过于32℃在LLC-MK2细胞中的一次(HPIV1-CΔ170)或两次(HPIV1-LY942A)传代进一步扩增。通过上文描述的96孔板中的LLC-MK2细胞上的10倍连续稀释来测定病毒滴度。对所有重组病毒测序以确认缺少偶然突变。为此，自病毒原种提取病毒RNA(QiaAmp Viral RNA Mini Kit；Qiagen,Valencia,CA)并用无RNA酶的DNA酶I(Qiagen)处理以去除用于病毒挽救的质粒DNA。将RNA逆转录(SuperScript First-StrandSynthesis System for RT-PCR；Invitrogen/Life Technologies)并通过RT-PCR扩增交叠基因组区(Advantage-HF 2PCR Kit；Clontech Laboratories)。对于所有病毒包括缺少逆转录酶的RT-PCR对照，其显示自病毒RNA而非用于病毒回收的pFLC cDNA衍生的扩增产物。通过交叠扩增RT-PCR产物的直接Sanger测序来测定每一种病毒构建物的基因组序列。使用5.1版Sequencher程序(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)比对序列读出并装配基因组序列。
嵌合rHPIV1病毒在Vero和LLC-MK2细胞中的复制。以0.01TCID50的感染复数(MOI)用表达RSV F(F1，F2，或F3)的HPIV1(CΔ170或LY942A)病毒或空HPIV1 CΔ170或HPIV1 LY942A载体，或wt HPIV1感染Vero或LLC-MK2细胞单层在6孔板中的一式三份重复孔。于32℃温育培养物。以24小时间隔自每一个孔自总共2ml细胞培养物上清液培养基收集0.5ml小样并用新鲜培养基替换。将样品闪冻并保存于-80℃。通过上文所述LLC-MK2细胞上的连续稀释，接着是通过HAD检测感染细胞来测定病毒滴度(log10TCID50/ml)。
通过Western印迹分析RSV F和HPIV1载体蛋白表达。用自三个基因组位置(F1，F2，或F3)任一表达RSV F的HPIV1 CΔ170或HPIV1 LY942A构建物感染Vero细胞(1x 106)。使用空HPIV1 CΔ170和HPIV1 LY942A载体，wt HPIV1，和模拟处理细胞作为对照。以5TCID50每细胞的MOI实施感染并于32℃温育。在感染后48小时时(感染后)，将单层用PBS清洗两次并用400ul1X LDS样品缓冲液(Life Technologies)裂解。对于电泳，通过与混合1x还原性试剂(LifeTechnologies)并于37℃温育30分钟来使裂解物还原和变性。将还原变性裂解物(40μl)加载到4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Novex-Life Technologies)上并在1X MOPS缓冲液中实施电泳。使用iBlot蛋白质转移系统(Life Technologies)将蛋白质转移到PVDF膜上。将膜在Licor封闭缓冲液(Licor Inc.Lincoln,NE)中封闭1小时并用在封闭缓冲液中1:1000稀释的鼠单克隆RSV F特异性抗体(ab43812；Abcam,Cambridge,MA)和家兔多克隆HPIV1N特异性抗体(HPIV1-N-485)探查。HPIV1-N-485是如先前所述(Bartlett,et al.2010.Vaccine28:767-779)通过给家兔免疫接种KLH缀合的跨越N的氨基酸(aa)残基485-499的N肽而生成的。用针对HPIV1P(SKIA-1)，F(SKIA-15)，或HN(SKIA-13)的家兔多克隆抗血清探查用同一套裂解物实施的重复印迹，该家兔多克隆抗血清也是通过给家兔重复免疫接种KLH缀合的肽而生成的，而且以1:200稀释度使用。与上述抗体一起温育过夜后，将膜清洗四次，每次5分钟，接着与在Licor封闭缓冲液中稀释的二抗一起温育1小时。对应的红外线染料缀合的二抗是山羊抗小鼠IRDye 680LT和山羊抗家兔IRDye 800CW(Licor)。使用Odyssey红外线成像系统(Licor)扫描膜并获取印迹图像。通过使用Licor图像分析套组(Image Studio)对自三项独立实验衍生的蛋白质条带的荧光强度定量并作为RSV F或HPIV1载体蛋白(N，P，F，和HN)相对于F3病毒的表达报告。
通过荧光双重染色噬斑测定法测定为表达RSV F的病毒粒体的百分比。开发了一种基于红外线荧光的双色噬斑测定法来同时检测由表达RSV F的HPIV1载体在Vero细胞单层上形成的噬斑中RSV F和HPIV1蛋白的表达。将每一种病毒在含有1mM L-谷氨酰胺和1.2％胰蛋白酶的OptiMEM培养基中10倍连续稀释并一式两份将100μl每一种稀释液添加至在24孔板中生长的Vero细胞单层。将接种细胞在摇床上于32℃温育2小时，之后对每个孔添加含有0.8％甲基纤维素(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)，1mM L-谷氨酰胺，4％胰蛋白酶，100U/ml青霉素，和100μg/ml链霉素的覆盖OptiMEMI培养基。对于动物组织衍生的病毒样品，在甲基纤维素覆盖中包括替门汀(200mg/ml)，氨苄青霉素(100mg/ml)，氯洁霉素(150mg/ml)，和两性霉素B(250μg/ml)代替青霉素和链霉素。于32℃温育6天后，将细胞用80％冷甲醇固定两次。使用在Licor封闭缓冲液中1:1600稀释的一种HPIV1特异性山羊多克隆抗体(ab20791；Abcam)和各自1:2000稀释的先前所述(Murphy,et al.1990.Vaccine 8:497-502)三种RSV F特异性单克隆抗体的混合物，通过共免疫染色在感染Vero细胞单层上检测rHPIV1-RSV F噬斑。温育1小时后，将细胞用1ml封闭缓冲液清洗一次并与含有各自在封闭缓冲液中1:800稀释的红外线染料缀合的山羊抗小鼠680LT和驴抗山羊800CW(Licor)的二抗混合物一起温育。将细胞用1X PBS清洗两次，并通过在Odyssey红外线成像系统(Licor)上扫描板来获取共染色噬斑的图像。选择含有少于50个噬斑的孔用于分析，并测定RSV F表达呈阳性的rHPIV1噬斑的百分比。通过测定疫苗接种体中以及体内复制后自仓鼠分离的病毒中表达RSV F的百分比群体，采用这种测定法来评估RSV F表达的稳定性。
仓鼠研究
仓鼠中的病毒复制。所有动物研究得到了(美国)国立卫生研究院(NIH)科研动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。在仓鼠中评估了每一种病毒在感染后3和5天时的体内复制以及免疫原性。分别通过血细胞凝集抑制(HAI)测定法和RSV中和测定法(Coates,etal.1966.Am J Epidemiol 83:299-313；Coates,et al.1966.J Bacteriol 91:1263-1269；van Wyke Coelingh,et al.1988.J Infect Dis 157:655-662)，6周龄金黄叙利亚仓鼠通过分析免疫前血清确认是HPIV1和RSV呈血清阴性。麻醉多组6只仓鼠每种病毒并鼻内接种0.1ml含有105TCID50病毒每只动物的L15培养基(Life Technologies)。为了评估复制，在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死并收集鼻甲和肺用于病毒滴定。通过LLC-MK2细胞上的连续稀释，接着是通过HAD检测病毒感染，滴定含有替门汀(200mg/ml)，氨苄青霉素(100mg/ml)，氯洁霉素(150mg/ml)，和两性霉素B(250ug/ml)的L15培养基中的组织匀浆物。作为TCID50/克仓鼠组织报告病毒滴度。还通过Vero细胞上的噬斑测定法来滴定组织匀浆物，并通过使用上文所述荧光双重染色噬斑测定法针对RSV F和HPIV1蛋白的表达染色。作为百分比表达RSV F的HPIV1噬斑报告结果。
免疫原性
血清中针对RSV和HPIV1的病毒中和性抗体(NAb)的诱导[60％噬斑减少中和测试(PRNT60)]。为了评估疫苗候选的免疫原性，如上文所述免疫接种仓鼠并在免疫接种后第28天自仓鼠收集血清。使用表达eGFP的RSV(Munir,et al.2008.J Virol 82:8780-8796)，如先前所述(Coates,et al.1966.Am J Epidemiol 83:299-313)，通过Vero细胞上的PRNT60来测定RSV特异性中和性抗体(NAb)的滴度。将仓鼠血清于56℃温育30分钟以灭活补体蛋白，接着在96孔板中在Opti-MEMI，2％FBS，1X艮他霉素培养基中连续稀释。通过与等体积的连续稀释的血清样品混合，将在Opti-MEM，2％FBS，1X艮他霉素，10％豚鼠补体(Yoder,etal.2004.J medical virology 72:688-694)(Lonza,Walkersville,MD)中稀释的RSV-eGFP进一步1:1稀释，接着于37℃温育30分钟。将100μl体积的血清-病毒混合物添加至在24孔板中生长的Vero细胞并在摇床上于32℃容许病毒吸附2小时。添加Opti-MEMI，8％甲基纤维素，2％FBS，1X艮他霉素的覆盖并温育5-6天以容许噬斑形成。通过使用Typhoon成像仪(GEHealthcare,Piscataway,NJ)扫描和获取图像来显现单层上的RSV噬斑。测定每一份样品的噬斑计数并如描述的那样(Coates,et al.1966.Am J Epidemiol 83:299-313)测定NAb滴度。还使用为RSV描述的方法，使用表达GFP的rHPIV1及下述修饰：第一，在HPIV1中和测定法的情况中，不使用豚鼠补体，因为发现它中和病毒；第二，在病毒吸附后将接种Vero细胞用1X PBS清洗两次以去除血清；和第三，使用含有4％胰蛋白酶且缺少FBS的甲基纤维素覆盖培养基，通过Vero细胞上的60％噬斑减少测定法来测定HPIV1特异性Nab的滴度。
通过在免疫接种后30天通过鼻内接种含有106PFU wt RSV株A2的0.1ml L15培养基攻击感染仓鼠来测试疫苗候选针对RSV感染提供保护的能力。对仓鼠处以安乐死，在攻击后3天收获鼻甲和肺，并通过Vero细胞上的噬斑测定法(Durbin,et al.2003.Clinicalinfectious diseases 37:1668-1677；Luongo,et al.2013.J virology 87:1985-1996)来测定这些组织中攻击RSV的病毒载荷。
结果
自三个不同基因组位置表达RSV F蛋白的两种减毒HPIV1主链(rHPIV1 CΔ170和rHPIV1 LY942A)的创建。制备了两种减毒HPIV1主链，各自含有不同的，先前鉴定的减毒性突变(即CΔ170和LY942A)，它们是为了针对去减毒的稳定性设计的(引言，图36和42)。CΔ170突变没有赋予温度敏感性，而LY942A突变是温度敏感性突变。接着，将株A2的RSV F ORF为了人表达而密码子优化，改造成在HPIV1基因起点和基因终点信号控制下，并在三个不同的，平行的基因组位置插入rHPIV1 CΔ170和rHPIV1 LY942A主链：即在第一基因位置处(N前，产生rHPIV1CΔ170-F1和rHPIV1 LY942A-F1)；在第二基因位置处(N-P，产生rHPIV1 CΔ170-F2和rHPIV1LY942A-F2)；和在第三基因位置处(P-M，产生rHPIV1 CΔ170-F3和rHPIV1 LY942A-F3)(图36)。每一种构建物均符合“六法则”(Calain,et al.1993.J Virol 67:4822-4830)。每一种载体基因维持它的原始六聚物间距(spacing)，而F1，F2，和F3插入物分别采取N，P，和P基因的原始六聚物间距。RSV F蛋白还携带HEK氨基酸指派，即残基66和101分别为Glu和Pro(Whitehead,et al.1998.J virology 72:4467-4471)，这与来自A2株的早期传代的RSV F的序列匹配，而且也与大多数其它临床分离物一致。
通过反求遗传学回收rHPIV1/RSV F病毒。所有病毒均容易挽救，rHPIV1 LY942A-F2构建物除外，它表现为以低效率回收且需要多次传代来生成工作集合。测定每一种病毒的完整序列以验证偶然突变的缺失。所有rHPIV1/RSV-F病毒工作集合均没有明显的偶然突变，rHPIV1 LY942A-F2病毒除外：对于这种病毒，挽救了9个克隆，其中只有一个具有缺少偶然突变的正确基因组序列。其它8个克隆含有偶然突变，主要在HPIV1转录信号中，在HPIV1 N基因下游(N基因终点-基因间-P基因起点)且在RSV F ORF之前。既然RSV F基因在平行rHPIV1 LY942A-F2和rHPIV1 CΔ170-F2构建物的第二位置中的插入位点是同一的，这提示前一种病毒的问题是对LY942A突变(例如改变的聚合酶功能)而非插入位点自身特异性的。
HPIV1/RSV F病毒在Vero和LLC-MK2细胞中的复制。通过测定它们在Vero(图37A和37C)和LLC-MK2(图37B和37D)细胞中的多步生长动力学，在体外评估HPIV1/RSV病毒的复制。以0.01TCID50的MOI感染细胞并于32℃温育。在7天以24小时间隔收获上清液，通过HAD测定病毒滴度，并作为TCID50/ml报告(图37)。使用Student t检验来确定感染后第2和7天每一种病毒较之wt HPIV1之间的滴度差异的统计学显著性。在第7天，所有病毒复制至Vero细胞中大于7.2log10TCID50/ml和LLC-MK2细胞中大于7.4log10TCID50/ml的最终滴度，病毒间有在这两种细胞系中与wt HPIV1相比统计学上不显著的略微差异(图37)。然而，在更早的时间点观察到差异，尤其是感染后第2天。在rHPIV1 CΔ170病毒的情况中(图37A和B)，rHPIV1 CΔ170空载体和rHPIV1 CΔ170-F3在感染后第2天在这两种细胞系中与wt HPIV1相似地复制。然而，rHPIV1 CΔ170-F1在Vero(p<0.001)和LLC-MK2(p<0.05)细胞中的复制显著降低，而且rHPIV1CΔ170-F2在Vero细胞中的复制显著降低(p<0.01)。对于rHPIV1 LY942A病毒(图37C和37D)，rHPIV1 LY942A空载体在Vero细胞中的复制比wt rHPIV1的复制显著更低，但是二者在感染后第2天在LLC-MK2细胞中生长至相似的滴度。对于Vero细胞中的rHPIV1 LY942A-F1，-F2和-F3病毒观察到与wt rHPIV1相比复制的高度显著降低(p<0.0001)。同样地，LLC-MK2细胞中的rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3病毒显示显著降低的(p<0.01，p<0.0001，和p<0.01，分别)复制。在Vero细胞中，rHPIV1 LY942A-F1以与它的亲本rHPIV1 LY942A空载体相同的速率生长，而rHPIV1 LY942A-F2和-F3病毒的生长(图37C)相对降低，但是嵌合病毒间的这些差异是统计学上不显著的。
RSV F和HPIV载体蛋白通过嵌合rHPIV1/RSV-F病毒的表达。通过Western印迹分析对所有病毒评估RSV F蛋白和HPIV1载体N，P，F和HN蛋白的表达。以5TCID50的MOI感染Vero细胞并于32℃温育48小时。将变性和还原裂解物提交SDS-PAGE和Western印迹，并使用对每一种个别蛋白特异性的抗体进行分析。RSV F首先翻译成F0前体，它被弗林蛋白酶样蛋白酶翻译后切割成二硫化物连接的F1和F2亚基。对RSV F特异性的单克隆抗体的免疫染色检测F0(70kD)和F1(48kD)二者。用对应的抗肽多克隆抗体检测HPIV1 N，P，F，和HN蛋白。来自三项独立实验之一的代表性印迹显示于图38A，而且对于分别在图38B和C中的rHPIV1 CΔ170和rHPIV1 LY942A构建物对来自所有三项实验的结果定量，数值是相对于每一个系列中的F3构建物的数值作为1.0标准化的。
HPIV1 CΔ170-F1，-F2，和F3病毒表达实质性量的RSV F(图38A，1-3道，和图38B)，F1和F2与F3相比只有略微更高，如通过蛋白质条带定量指示的(图38B)，差异在统计学上不显著。因而，出乎意料地，没有观察到来自F1至F3的表达的3’-5’极性梯度。然而，与之对比，在HPIV1 LY942A病毒的情况中观察到RSV F表达的强极性梯度，F1病毒的RSV F表达与F2(p<0.01)和F3(p<0.05)病毒相比显著更高(图38A，5-6道，和图38C)。
对wt HPIV1，空载体，和CΔ170和LY942A系列中的F1，F2，和F3构建物评估了载体N，P，F，和HN蛋白的表达。一般而言，CΔ170突变不影响载体蛋白表达，结果是rHPIV1 CΔ170空载体具有与wt rHPIV1相似的载体蛋白表达概况(图38B)。在三种型式的表达RSV F的rHPIV1CΔ170载体的情况中，F3病毒以与空rHPIV1CΔ170载体相似的水平表达N，P，F，和HN。F2病毒与空rHPIV1CΔ170载体相似地表达N蛋白但显示与空载体相比降低的P，F，和HN蛋白表达，其中只有HN降低是统计学上显著的。F1病毒展现所有载体蛋白与空载体相比的显著降低，包括N(p<0.05)，P(p<0.01)，F(p<0.05)，和HN(p<0.05)。因而，将RSV F基因插入rHPIV1 CΔ170载体降低下游载体基因的表达，F3病毒除外。F1和F2病毒均在Vero细胞感染期间早期展现显著降低的复制(图37A)，而且降低的载体蛋白合成提供似是而非的解释。
与CΔ170突变形成对比，LY942A突变不影响载体蛋白的表达：具体而言，与wt HPIV1相比，rHPIV1 LY942A空载体具有显著降低的P(p<0.05)，F(p<0.05)，和HN(P<0.01)蛋白，N蛋白没有显著差异(图38A，C)。在三种型式的表达RSV F的rHPIV1 LY942A的情况中，F3病毒具有载体蛋白丰度与空主链相比的适度降低，但是降低无一是显著的。有趣的是，这种缺少显著的载体蛋白降低与rHPIV1 CΔ170-F3病毒一致，提示F3插入物位置不干扰载体蛋白表达并提供对载体具有最小限度干扰的位点。另一方面，F2病毒展现N，P，F，和HN蛋白与rHPIV1 LY942A空载体相比高度突出且显著的降低。比较而言，rHPIV1 CΔ170-F2病毒还显示P，F，和HN蛋白而非N蛋白降低的表达。这是预期的，因为在第二F2位置处在N之后的插入可能预期由于3’-5’极性转录梯度而降低下游基因的表达，而上游N基因可能预期不受影响，正如观察到的。然而，出乎意料地，在rHPIV1 LY942A-F2的情况中，虽然RSV F插入N基因下游，但是N蛋白的表达也受到负面影响。rHPIV1 LY942A-F1只在N蛋白的情况中具有显著降低的表达，而P，F，和HN蛋白的表达与rHPIV1 LY942A空载体相当。
rHPIV1/RSV-F载体所致合胞体形成的比较。体外RSV感染的一项标志是由RSV F蛋白介导的特征性合胞体形成。wt HPIV3或rHPIV1 CΔ170或LY942A空载体感染LLC-MK2细胞单层不诱导明显的合胞体形成(图39，分别是小图I，D，或H)。形成尖锐对比的是，表达高水平的RSV F蛋白的HPIV1载体，即rHPIV1 CΔ170-F1和-F2病毒(图39A和39B)和rHPIV1-LY942A-F1病毒(图39E)，诱导高水平的合胞体。rHPIV1 CΔ170-F3病毒的合胞体形成不明显(图39C)，尽管RSV F蛋白的表达水平只是F1和F2病毒适度更低(图38)。rHPIV1-LY942A-F2和-F3病毒的合胞体形成也不明显(图39F和39G)，它们表达很低水平的RSV F蛋白(图38)。这种功能测定法(合胞体形成)提示自HPIV1载体表达的RSV F蛋白正确折叠和加工并以活性形式在细胞表面积累。
另外，CΔ170突变与第二细胞病变效应，即升高的凋亡相关。这对rHPIV1-CΔ170空载体最明显(图39D)，因为在合胞体形成缺失下更加容易观察到增强的凋亡。CΔ170突变所致增强的凋亡诱导可以解释为什么rHPIV1-LY942A-F3病毒在诱导合胞体形成方面是无效/低效的(图39C)，尽管表达高水平的RSV-F(图38B)：合理地提示，与CΔ170介导的增强的凋亡相关的细胞变圆(例如图39D)可能降低合胞体形成所必需的细胞-细胞接触，但是其它构建物非常有效的RSV F表达可能容许足够早地开始合胞体形成以克服凋亡效应(例如图39B较之图39C)。
对Vero细胞也获得图39中LLC-MK2细胞的观察结果。
rHPIV1/RSV-F病毒的温度敏感性。正如注意到的，CΔ170突变在先前的研究中没有赋予温度敏感性表型，而LY942A突变做到了(McAuliffe,et al.2004.J virology 78:2029-2036；Newman,et al.2004.J Virol 78:2017-2028)。将RSV F插入HPIV载体也显示出赋予温度敏感性表型(Liang,et al.2014.J virology 88:4237-4250)。因此对HPIV1/RSV-F构建物评估温度敏感性表型的存在和程度。具体而言，制备10倍连续稀释液并用于感染LLC-MK2细胞，于32，35，36，37，38，39，和40℃温育，一式七份。使用豚鼠红细胞通过HAD测定病毒滴度，并作为log10TCID50/ml报告滴度(图43)。计算每一个限制性温度时的滴度(log10)与允许性温度32℃时的滴度相比的降低。给定病毒的关闭(shut-off)温度定义为如下的最低限制性温度，即该温度时的病毒滴度较之32℃的均值log10降低与wt rHPIV1在相同两个温度的降低相比≥2.0log10(Bartlett,et al.2005.Vaccine 23:4631-4646)。温度敏感性表型定义为具有≤40℃的关闭温度。
虽然CΔ170突变在先前的研究中不赋予温度敏感性表型，但是在本研究中rHPIV1 CΔ170空载体具有40℃的关闭温度(图39)且因而与wt HPIV1相比是温度敏感性的，但是作用较小。rHPIV1 CΔ170-F2和-F3构建物也具有40℃的关闭温度且因而与空载体没有显著不同。然而，rHPIV1 CΔ170-F1病毒具有39℃的更低关闭温度(图43)。在本研究中，rHPIV1 LY942A空载体具有36℃的关闭温度，与在先前的研究中与这种突变相关的35-37℃的值相似(McAuliffe et al JVI 78:2029-2036,2004；Bartlett et al Virol J 4:67,2007)。rHPIV1 LY942A-F1和-F2构建物的温度敏感性比空载体更高，具有35℃的关闭温度，而rHPIV1LY942A-F3载体具有与空载体相同的36℃的关闭温度(图43)。因而，将RSV F基因插入任一减毒主链的F1位置提高温度敏感性表型，插入任一主链的F3位置没有提高温度敏感性表型，而插入F2位置只对LY942A主链提高表型。
疫苗接种体中表达RSV-F的病毒粒体的百分比(体外疫苗稳定性)。使用荧光双重染色噬斑测定法对rHPIV1/RSV-F构建物的工作集合评估个别病毒噬斑中RSV F表达的频率。给Vero细胞接种10倍连续稀释的病毒并于32℃的允许性温度容许噬斑在甲基纤维素覆盖下形成6天。通过使用三种RSV F特异性鼠单克隆抗体和一种山羊HPIV1特异性多克隆抗血清的混合物(见材料和方法)对病毒噬斑针对RSV F和HPIV1蛋白免疫共染色。使用缀合有红色和绿色红外线染料的抗小鼠IgG和抗山羊IgG二抗检测一抗，并测定表达RSV F的HPIV1噬斑的百分比。分别对rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3计数总共140，77，和59个噬斑，而且发现都具有100％的HPIV1噬斑表达RSV F蛋白。F1生成的噬斑的尺寸比F2和F3要小，而F2和F3的噬斑尺寸彼此相似。分别对rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3计数总共214，70，和192个噬斑，它们显示100％，100％，和97％的HPIV1噬斑表达RSV F抗原。总的说来，rHPIV1 LY942A病毒形成尺寸与rHPIV1 CΔ170病毒相比小得多的噬斑。既然测定法是在允许性温度(32℃)实施的，那么更小的噬斑表型(提示相对更多减毒的表型和更慢的传播)可能不是温度敏感性效应。这还与它们相对更慢的复制概况一致(图37)。
rHPIV1/RSV-F病毒在仓鼠的呼吸道中的复制。对病毒评估它们在仓鼠的上和下呼吸道(分别为URT和LRT)中复制的能力。给仓鼠鼻内接种一剂105TCID50/0.1ml每动物。为了评估病毒复制，在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死(6只动物每种病毒每天)并收集鼻甲(URT)和肺(LRT)。使用HAD测定法通过LLC-MK2细胞上的滴定对个别鼻甲和肺的匀浆物分析病毒复制，并作为log10TCID50/ml报告滴度。分别作为空心三角形和实心圆形显示第3和5天URT(图40A)和LRT(图40B)中的病毒滴度。每一个符号代表一只个别动物。
总的说来，所有表达RSV F的rHPIV1载体的峰病毒滴度比wt HPIV1更低，提示主链突变(CΔ170或LY942A)以及所插入的RSV F基因的减毒效果。在URT中，与wt HPIV1相比，rHPIV1CΔ170空载体在第5天而非在第3天显著减毒，但是在这两天在肺中显著受限。在URT中，只在第3天对rHPIV1 CΔ170-F1(p<0.05)和在这两天对-F2(p<0.0001)观察到显著降低的复制；-F3在这两天以与wt rHPIV1相似的水平复制。rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3在第3和5天在肺中都显著(p<0.0001)减毒；F1和F3在所有动物中检测不到且F2在6只动物中的5只中检测不到。rHPIV1 LY942A空载体复制在URT中在第3天显著降低且在第5天没有检测到病毒而在这两天在肺中没有检测到病毒，提示与LY942A突变的温度敏感性表型一致的显著减毒(McAuliffe,et al.2004.J virology 78:2029-2036)(图43)。rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3病毒还在第3和5天在URT和肺二者中显著(p<0.0001)减毒，在大多数动物中检测不到病毒复制。
包括先前证明在AGM中强减毒(Bartlett,et al.2007.Virology J 4:67)且在血清阴性儿童中过减毒的HPIV1疫苗候选(rHPIV1-CR84G/Δ170HN553ALY942A)作为复制比较的对照及评估正在开发的疫苗候选的减毒水平。正如预期的，这种病毒在仓鼠中显著减毒，在第3和5天在URT和肺中没有观察到复制。本研究中开发的大多数构建物具有削弱但可检测的复制的观察结果提示它们减毒比先前的在儿童中过减毒的疫苗候选有点更少，提示本研究中开发的构建物可能具有合适的减毒表型。正在作为活RSV疫苗开发自第二基因组位置表达RSV F的嵌合牛/人PIV3(rB/HPIV3-F2)(引言和实施例1)。在临床试验中，发现这种疫苗候选在6-24月龄RSV血清阴性儿童中是安全的，具有安全且耐受较好的复制水平(Bernstein,et al.2012.Pediatric infectious disease journal 31:109-114)。包括rB/HPIV3-F2病毒作为参照病毒，用于正在测试的rHPIV1疫苗候选的减毒和免疫原性的比较性评估。rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，或-F3在这两天的复制水平与rB/HPIV3-F2相比在URT和肺二者中或是统计学上相似的或是显著更低的。同样，rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3病毒还在第3和5天在URT和肺二者中显示与rB/HPIV3-F2相比显著降低的复制。这些数据提示具有CΔ170或LY942A主链突变任一的HPIV1载体在体内充分减毒并显示与rB/HPIV3-F2病毒相比相似或甚至更加减毒的复制表型。
在URT中，所有病毒(除了rHPIV1 LY942A-F1和-F3，它们不复制)的滴度在第3天(图40A)比在第5天更高。与之对比，rB/HPIV3-F2在第5天达到峰滴度。总的说来，在肺中，所有表达RSV F的载体在感染后第3和5天与wt HPIV1相比显著(p≤0.0001)受限制(图40B)且在第5天与rB/HPIV3-F2相比也显著受限制。
体内复制后嵌合rHPIV1病毒的RSV F蛋白表达的稳定性。体内复制期间可能发生对RSV F表达沉默的病毒的正选择，可能损害RSV F免疫原性(Yang,et al.2013.Vaccine31:2822-2827)。RSV F ORF或控制其表达的调节转录信号中可能发生突变使得RSV F蛋白表达或是降低或是消除。为了对rHPIV1载体评估体内稳定性，用连续稀释的感染仓鼠的鼻甲和肺的匀浆物感染Vero细胞。实施荧光双重免疫染色噬斑测定法来测定表达RSV F的病毒颗粒的百分比。与肺中缺少复制(图40B)一致，在肺匀浆物中对所有表达RSV F的载体没能检测到噬斑。相似地，由于复制较差，在URT中对表达RSV F的rHPIV1 LY942A病毒没能检测到噬斑。显示了在URT中有效复制的rHPIV1 CΔ170病毒的稳定性结果(图44)。这些病毒在体内复制后是稳定的，在感染后第3和5天有总体＞98％噬斑表达RSV F。在所分析的30份样品中，29份具有100％且只有1份样品具有98％(2％丧失)PFU表达RSV F。这些数据提示表达RSV F的rHPIV1 CΔ170载体在仓鼠模型中是相当稳定的，而且没有显示选择在体内复制后RSV F表达沉默至少5天的突变体的证据。
免疫原性
免疫接种表达RSV F的嵌合rHPIV1病毒诱导针对RSV和HPIV1的血清病毒中和性抗体(NAb)。为了测定表达RSV F的rHPIV1病毒的免疫原性，给多组6只仓鼠每种病毒鼻内接种105TCID50每只动物。包括wt RSV，rHPIV1 CΔ170，rHPIV1 LY942A，和rB/HPIV3-F2作为对照。在感染后28天收集来自免疫接种仓鼠的血清并通过PRNT60测定法测定针对RSV和HPIV1的NAb滴度(图45)。rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3以彼此没有统计学差异的滴度诱导RSV特异性Nab。这并不令人惊讶，因为三种病毒均显示相似水平的RSV F蛋白表达(图38A和38B)。rHPIV1 CΔ170-F1和-F2具有比-F3病毒略微更高的RSV F表达但是这种差异不是统计学上显著的(图38B)。同样，-F1和-F2病毒还显示比-F3病毒相对更高的融合活性和合胞体形成，推测与感染期间合成的RSV F的量有关(图39A-39C)。虽然统计学上不显著，但是F1和F3病毒的NAb滴度看来与F2相比略微更高，这与它们的体内复制概况(图40A)而非RSV F表达的量更加一致。由rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3诱导的RSV NAb滴度比由rB/HPIV3-F2诱导的显著更低，该差异很可能源自这些病毒与rB/HPIV3-F2相比显著降低的复制(图40A和40B)。
rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3病毒未能诱导针对RSV的NAb应答。这是出乎意料的，因为在Vero细胞的体外感染上rHPIV1 LY942A-F1显示与rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3相似的RSV F表达(图38A)。然而，重要的是要注意，LY942A突变是高减毒性的且赋予关闭温度为36℃的温度敏感性表型(图43)。LY942A突变体病毒预期在仓鼠(体温：36.7-38.3℃；The MerckManual)中显示最低限度的复制或不显示可检测的复制。与主链表型一致，rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3也是温度敏感性的，关闭温度分别为35℃，35℃，和36℃，指示在F1和F2位置处插入RSV F将关闭温度降低1℃，使得它们的温度敏感性甚至更高。因此，虽然rHPIV1LY942A-F1能够在允许性温度以与rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3病毒相当的水平表达RSV F(图38A)，但是它未能诱导RSV NAb，很可能是由于它的强温度敏感性表型和没有能力在体内复制。rHPIV1 LY942A-F2和-F3病毒看来具有两项令人困惑的因素：它们显示相对较差的RSV F表达(图38A和38C)，而且另外是温度敏感性的且在体内不复制(图40A和40B)，导致缺少RSVNAb应答。因而，rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3病毒没有免疫原性且不生成疫苗候选，因为它们过度削弱温度敏感性表型且在体内缺少复制和免疫原性。
还通过PRNT60测定法评估了仓鼠中的HPIV1特异性NAb应答(图45)。总的说来，HPIV1NAb滴度的水平与RSV NAb滴度相比更低。正如方法中指出的，豚鼠补体包括在针对RSV的中和测定法中，但是排除在HPIV1中和测定法外，因为它中和HPIV1。缺少补体可能是HPIV1NAb滴度普遍降低的原因。rHPIV1 CΔ170-F2和-F3病毒不诱导可检测水平的HPIV1NAb。只有rHPIV1 CΔ170空载体和rHPIV1 CΔ170-F1诱导可检测的HPIV1特异性NAb应答，它们的滴度彼此没有统计学差异。这与预期相反，因为所有载体蛋白的表达对于rHPIV1 CΔ170-F1均显著降低(图38A和38B)。它还具有与F2或F3病毒相比要低1℃的关闭温度且它以与F3病毒相似的水平在体内复制。因而，rHPIV1 CΔ170-F1预期诱导与-F3病毒相比相似或更弱的HPIV1特异性NAb应答。然而，CΔ170-F2较差的HPIV1免疫原性与它降低的F和HN蛋白表达(图38B)和URT和LRT中较差的复制(图40)一致。CΔ170-F3病毒缺少HPIV1NAb应答是出乎意料的。它以与空载体相似的水平表达所有HPIV1蛋白(图38A和38B)，相似地复制，且具有与空载体相似的关闭温度，但是不显示可检测的NAb应答。
所有rHPIV1 LY942A病毒，包括空载体，不诱导可检测水平的HPIV1特异性NAb。所有rHPIV1 LY942A病毒在体外表达降低水平的HPIV1蛋白(图38A和38C)且在体内显示较差的复制或不显示复制。与此一致，这些病毒还显示缺少针对RSV的免疫原性。它们较差的免疫原性很可能是它们强温度敏感性表型(图43)和缺少体内复制(图40)的结果。
免疫接种表达RSV F的rHPIV1载体提供针对wt RSV攻击的保护。如上文所述给仓鼠免疫接种表达RSV F的rHPIV1并在免疫接种后第30天用106PFU wt RSV攻击。在攻击后第3天对仓鼠处以安乐死并通过Vero细胞上的噬斑测定法测定鼻甲和肺中的RSV滴度以评估针对攻击RSV复制的保护(图41A和41B)。由疫苗候选提供的针对RSV感染和复制的保护与它们诱导RSV特异性血清NAb的能力有关。在URT中，与rHPIV1 CΔ170空载体相比，rHPIV1 CΔ170-F1和-F3提供针对RSV复制的显著保护且显示显著降低的(分别为p<0.0001和p<0.05)RSV滴度，而-F2病毒没有效果。在肺中，虽然所有三种rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3病毒均具有与rHPIV1 CΔ170空载体相比降低的均值RSV滴度，但是只有-F1病毒的RSV降低是统计学上显著的(p<0.05)。正如预期的，rB/HPIV3-F2在URT(P<0.0001)和肺(p<0.05)中提供针对RSV攻击的显著保护，与先前的报告(Liang,et al.2014.J virology 88:4237-4250，和实施例1)一致。
rHPIV1疫苗候选与rB/HPIV3-F2病毒的统计学比较显示在URT和肺二者中由rHPIV1 CΔ170-F1提供的保护与rB/HPIV3-F2在统计学上相似。rHPIV1 CΔ170-F1在仓鼠中在感染后第3天复制至与rB/HPIV3-F2相似的滴度，但是在感染后第5天展现显著降低的复制，提示rHPIV1 CΔ170-F1可能在体内充分减毒。这连同它与rB/HPIV3-F2相似的针对RSV攻击提供保护的能力一起还指示rHPIV1 CΔ170-F1具有期望的减毒和免疫原性特征且应当作为活减毒RSV疫苗候选进一步开发。
rHPIV1 LY942A-F1，-F2，和-F3病毒在URT和肺中不提供针对RSV攻击的保护且显示与rHPIV1 LY942A空载体相似的攻击RSV载荷。这与它们缺少体内复制和针对RSV的免疫原性一致。
讨论
先前开发了在啮齿动物和/或非人灵长动物中免疫原性的多种减毒型式的携带减毒性和/或温度敏感性突变的rHPIV1。测定了含有分别涉及删除6个核苷酸和替代3个核苷酸的CΔ170或LY942A突变的两种减毒rHPIV1主链。在每种主链的第一，第二，或第三基因组位置处插入RSV F，目的是鉴定适当减毒且仍然具有足够免疫原性且针对wt RSV攻击提供保护的构建物。通过反求遗传学成功挽救了所有表达RSV F的rHPIV1病毒。Vero和LLC-MK2细胞中的生长动力学指示所有病毒生长至非常相似的且统计学上无法区分的在感染后7天测定的最终滴度(图37)。然而，在这两种细胞系中在第2天观察到复制的显著差异。至少在Vero细胞中，LY942A突变看来具有比CΔ170突变更强的减毒效果。与预期相反，rHPIV1CΔ170病毒在I型干扰素(IFN-I)胜任性LLC-MK2中与IFN-I缺陷性Vero细胞相比没有减毒。在表达RSV F的rHPIV1CΔ170病毒中，对Vero中的-F1和-F2病毒(图37A)和LLC-MK2细胞中的-F1病毒(图37B)观察到与wt HPIV1相比的显著减毒，而-F3复制与空载体和wt HPIV1相似。这些数据提示-F1或-F2病毒中在更接近3’近端位置插入RSV F可能是减毒性的，但是这种效果是瞬时的且所有病毒生长至相似的最终滴度(图37A和37B)。所有rHPIV1 LY942A主链载体(包括-F1，-F2和-F3)在第7天生长至相似的最终滴度。然而，它们还在第2，3，和4天在Vero和LLC-MK2细胞二者中展现降低的复制，但是在5-7天之间与wt HPIV1相似。关于RSV F插入物诱导的减毒，rHPIV1 LY942A的程度与rHPIV1CΔ170载体相比高得多(图37D)，指示RSV F插入对早就显著减毒的主链具有更强的减毒效果。
通过于允许性温度32℃温育的感染Vero细胞的Western印迹分析对所有病毒检查它们表达RSV F蛋白的能力。还评估HPIV1N，P，F，和HN蛋白的表达以测定各个位置处的RSVF插入对载体蛋白表达的影响。出乎意料地，对rHPIV1CΔ170载体没有观察到RSV F表达的极性梯度。rHPIV1CΔ170-F1展现所测试的所有载体蛋白的表达均显著降低。相似地，除N蛋白以外，rHPIV1CΔ170-F2还显示降低的P，F，和HN蛋白表达(图38A和38B)。与此一致，-F1和-F2病毒二者在Vero细胞中在感染期间早期均显示降低的复制(图37A)。这些数据提示对于F1和F2病毒，载体蛋白合成降低和因此复制削弱的组合效果可能引起RSV F表达降低及其极性梯度缺失。rHPIV1 CΔ170-F3显示RSV F表达与F1和F2相比适度降低，很可能是由于它的远端基因组位置。对于展现表达的强极性梯度的rHPIV1 LY942A载体(图38A和38C)与显示与F2和F3相比显著更高的RSV F表达的F1病毒，RSV F表达概况非常不同。正如预期的，在第一位置中插入RSV F对于F1载体显著降低N蛋白表达，而P，F和HN蛋白不受影响且具有与它们的空载体对应物相似的表达(图38A和38C)。rHPIV1 LY942A-F2显示很差的RSV F以及所有载体蛋白的表达(图38A和38C)。如上所述，由于它的高度减毒表型和挽救期间突变的积累，这种病毒最难以挽救。然而，通过基因组测序确认，实验中最终使用的病毒没有偶然突变。因此，看来在rHPIV1 LY942A主链中的F2位置处插入RSV F似乎相当有害，病毒显示所测试的所有载体蛋白的剧烈的显著降低，包括RSV F。这一结果的一种非限制性解释是，这是插入物位置和高度减毒主链的组合效果，因为对rHPIV1 CΔ170-F2没有观察到此类效果。提到它的生长动力学(图37C-37D)，rHPIV1 LY942A-F2是所有rHPIV1 LY942A载体中减毒最多的。因而，看来载体蛋白合成的总体降低显著降低它的复制，导致RSV F表达降低。rHPIV1 LY942A-F3病毒以与空载体相似的水平表达载体蛋白，但是显示RSV F表达与F1相比降低＞10倍(图38A和38C)。这指示第三基因组位置处的RSV F插入对载体蛋白表达没有负面影响(图38A和38C)但展现较差的RSV F表达，很可能是由于它在极性转录梯度中的远端位置。
天然RSV F引起相邻感染细胞的质膜融合，导致合胞体形成。HPIV1载体F蛋白不引起合胞体形成，因此能用作RSV F功能性和天然形式以及表达数量的指标。在Vero和LLC-MK2细胞中评估了自rHPIV1 CΔ170或LY942A载体表达的RSV F引起的合胞体形成。对rHPIV1 CΔ170-F1和-F2以及rHPIV1 LY942A-F1观察到广泛合胞体形成，显示单层中的大多数细胞融合(图39)，提示重组RSV F蛋白是功能性的且大概处于天然构象。rHPIV1 CΔ170-F3和LY942A-F2和-F3不显示显而易见的合胞体形成。合胞体形成的程度与通过Western印迹检测的RSV F表达的水平一致(图38A-38C)。
既然温度敏感性表型在体内病毒复制中发挥重要作用且可能决定免疫原性，那么评估了表达RSV F的载体的温度敏感性表型。与甚至在40℃都不是温度敏感性的wt HPIV1形成对比，rHPIV1 CΔ170和LY942A主链分别在40℃和36℃是温度敏感性的(图43)。重要的是要注意，在rHPIV1 CΔ170中在F1处和在rHPIV1 LY942A中在F1或F2位置处插入RSV F将关闭温度降低1℃，因而使得它们的温度敏感性略微更高。这种效果可能不是HPIV1独特的，因为在一些先前的研究(Liang,et al.2014.J virology 88:4237-4250)中对RSV F插入rB/HPIV3载体观察到相似的效果。对rHPIV1 LY942A-F2而非rHPIV1 CΔ170-F2观察到温度敏感性表型的增强，指示插入外来基因可能增强早就显著是温度敏感性的病毒的温度敏感性表型。
在仓鼠中评估rHPIV1载体以评价它们的复制和免疫原性。rHPIV1 LY942A病毒均是过减毒的且大多数动物的URT和肺中的病毒复制是不可检测的。这与它们关闭温度为35-36℃的高度温度敏感性表型一致。不能复制看来不是由于RSV F插入，而很可能是它们的温度敏感性表型的效果，因为甚至空载体也在肺中不复制且在URT中具有较差的复制。rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3总的说来在肺中高度受限制且不可检测，而空rHPIV1 CΔ170载体确实显示比wt HPIV1显著更低的低水平复制，提示RSV F插入物的存在在肺中对早就减毒的rHPIV1 CΔ170主链具有另外的减毒效果。与肺形成对比，所有rHPIV1 CΔ170在所有动物的URT中载体复制较好。F1和F2病毒(而非F3)与wt HPIV1相比显著减毒，F2比F1减毒更多。这是出乎意料的，因为一般而言更接近基因组的3’末端的插入导致更高的减毒。这也与在体外F1和F2而非F3相对更慢的早期生长一致(图37)，指示在F1中和特别是在F2位置处插入RSV F具有叠加性减毒效果。F1病毒表现出具有期望程度的减毒，而F2和F3病毒分别是减毒过度或不足的。
达到减毒和免疫原性之间的最佳平衡对于活减毒疫苗是一项挑战。为了评估减毒rHPIV1载体是否充分减毒，与rB/HPIV3-F2，自第二基因组位置表达RSV F的先导RSV疫苗载体(Liang,et al.2014.J virology 88:4237-4250)比较它们的复制。在第3和5天在URT和肺二者中rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，或-F3复制与rB/HPIV3-F2相比或是统计学上相似的或是显著更低的。这提示CΔ170突变与RSV F插入一起看来至少在这种动物模型中实现了期望水平的减毒，使得所有三种载体在肺中高度受限制但确实在URT中展现免疫原性会需要的与rB/HPIV3-F2相似的削弱的复制。
RNA病毒为载体的疫苗遭遇的一项困难是在体内外来抗原基因的不稳定性(Yang,et al.2013.Vaccine 31:2822-2827)。突变由于易错聚合酶及缺少维持插入物表达的需要而发生。可以正选择外来抗原中由于RNA依赖性RNA聚合酶的失真而获取的任何突变，因为它们提供选择优势。为了测定在体内免疫接种后RSV F表达的稳定性，通过荧光双重染色噬斑测定法分析自仓鼠的呼吸组织回收的病毒。这只能对在URT中显示可检测复制的HPIV1 CΔ170-F1，-F2，和F3病毒实施(图44)。对于大多数样品，对所有三种病毒观察到稳定的RSV F表达，除了1份HPIV1 CΔ170-F1样品对其98％噬斑检测到RSV F表达。这些数据指示rHPIV1 CΔ170载体在体内复制期间维持稳定的RSV F表达。
通过实施PRNT60测定法评估了rHPIV1载体的免疫原性。在豚鼠补体存在下实施了针对RSV的测定法，豚鼠补体排除在HPIV1中和测定法之外，因为补体独自直接中和HPIV1。rHPIV1 CΔ170-F1，-F2，和-F3分别以7.3，4.7，和6.7的PRNT60(log2)滴度诱导RSV中和性抗体(图45)。虽然F1展现最高的抗体滴度，但是它与F2和F3诱导的在统计学上相似。这些滴度比rB/HPIV3-F2或wt RSV对照诱导的显著更低，这可能是它们总的说来在URT和肺二者中相对降低的复制的结果。rHPIV1 LY942A-F1，F2，和F3病毒不诱导可检测的RSV或HPIV1中和性抗体应答，这与它们缺少体内复制一致。只有rHPIV1 CΔ170-F1(而非F2或F3)诱导可检测的HPIV1中和性抗体。这是出乎意料的，因为F2和F3确实在仓鼠中显示复制(图40)且诱导RSV NAb。正如上文指出的，已知增强PRNT60读出的豚鼠补体不能包括在HPIV1中和测定法中。甚至对于在仓鼠中复制的病毒而言，总体较低的HPIV1抗体滴度和缺少可检测应答可能是由于缺少补体的测定法的灵敏度更弱。
为了测定载体针对RSV感染的保护功效，在免疫接种后30天时用一剂高(106pfu)wt RSV每只动物鼻内攻击所有免疫接种仓鼠。通过测定鼻甲和肺中的RSV复制来评估针对攻击的保护(图41A和41B)。保护与免疫原性直接相关(图45)。与RSV NAb滴度高度一致，rHPIV1 CΔ170-F1的保护性比F3更高且F2不提供保护。F1在URT和肺二者中的保护是统计学上显著的而F3只在URT中是显著的。重要的是，rHPIV1 CΔ170-F1在URT和肺中提供与rB/HPIV3-F2在统计学上无法区分的保护。这有点出乎意料，因为rHPIV1 CΔ170-F1诱导比rB/HPIV3-F2显著更低的RSV NAb滴度，提示相对更低的NAb滴度足以实现相似的保护。这种解释得到如下证据的支持，即棉鼠的呼吸道中的RSV复制在血清NAb滴度为1:100或更大时能降低(Prince,et al.1985.J Virol 55:517-520)。再次，与它们缺少血清转化一致，rHPIV1LY942A-F1，F2，和F3不提供针对攻击的任何保护且具有与空载体相似的RSV载荷。这些数据清楚显示rHPIV1 LY942A载体由于它们的温度敏感性表型是过减毒的，而且在仓鼠中不复制，导致缺少针对RSV和HPIV1二者的免疫原性。与之对比，rHPIV1 CΔ170载体，虽然在肺中高度受限制，但是确实在URT中复制。在这项研究中测试的载体中，rHPIV1 CΔ170-F1表现为充分减毒且仍然具有足够的针对RSV的免疫原性。认识到在仓鼠中表现为过减毒的构建物当在更加允许性的灵长动物宿主中时评估可能性能更加合适。
总而言之，这个实施例将rHPIV1 CΔ170鉴定为有希望的减毒主链，适合于自插入基因表达RSV F抗原。还系统性确定了rHPIV1 CΔ170载体的F1(N前)基因组位置在为了插入RSVF而测试的位置中是优选的。这项研究还证明rHPIV1 CΔ170-F1是一种有希望的疫苗候选且拥有数项期望特征：(i)它基于一种在非人灵长动物(3)中较好表征了减毒的主链，(ii)它在Vero细胞中复制至与wt HPIV1相似的最终滴度，这是疫苗制造的一项必需特征，(iii)插入RSV F使其减毒比空CΔ170主链略微更多至与rB/HPIV3-F2相似的水平，(iv)构建物在体内复制后是稳定的且维持RSV F表达，和(v)它是免疫原性最高的HPIV1载体，诱导最高的RSV和HPIV1中和性抗体滴度，而且还是针对wt RSV攻击的保护性最高的。
上述发现指示有可能使用表达RSV F的HPIV1载体作为用于针对RSV和HPIV1的粘膜免疫接种的二价疫苗。HPIV1为载体的RSV疫苗可以用作首要RSV疫苗或用于加强主要由活减毒RSV诱导的免疫。HPIV1为载体的RSV疫苗办法会规避与开发减毒RSV株相关的内在问题，而且可能推动RSV免疫接种程序，甚至在资源受限的设置中。
实施例3：
表达优化型式的RSV F蛋白的rHPIV1-CΔ170载体的开发
这个实施例呈现测定法，显示可以将编码已修饰RSV F外域的基因插入HPIV1载体主链以生成在它的包膜上表达RSV F外域的重组病毒，它是减毒的，感染性的，且能诱导保护性抗体应答。F2位置也鉴定为有效插入位点。这些发现指示：
1.已经鉴定了HPIV1F TMCT域的操作边界(图60)。
2.可以将HPIV1F TMCT域添加至重组RSV F外域(例如HEK/GS-opt/DS-Cav1)以实现在细胞表面处有效表达且与抗RSV-F抗体反应性的蛋白。
3.含有HPIV1F TMCT的RSV F(HEK/GS-opt/DS-Cav1/H1TMCT)有效包装入HPIV1载体颗粒(即以比RSV更高的水平每μg病毒粒体蛋白，图64)。这与基于先前用仙台病毒(HPIV1的鼠亲戚，因而假定是紧密的预测模型)进行的研究的预期完全相反，其中含有仙台病毒CT或TMCT的RSV F只在内源仙台病毒F蛋白删除的情况中有效包装入颗粒(Zimmer et al2005J Virol 79:10467-10477)。
3.可以将HEK/GS-opt/DS-Cav1和HEK/GS-opt/DS-Cav1/H1TMCT形式的RSV F蛋白插入第一或第二基因位置以产生稳定表达RSV F，在体外有效复制(图63)，且有效掺入载体颗粒(当HPIV1F TMCT存在时，图64)的载体构建物。
4.出乎意料地，虽然F1或F2位置任一有效表达融合原性的RSV F蛋白(例如HEK/GA-opt，实施例2)，但是F2位置对于非融合原性的RSV F(例如HEK/GS-opt/DS-Cav1)的细胞内表达特别有效。
5.rHPIV1-CΔ170-F2/HEK/GS-opt/DS-Cav1和rHPIV1-CΔ170-F2/HEK/GS-op t/DS-Cav1/H1TMCT构建物鉴定为有效表达RSV F蛋白，而且，特别是在后一种情况中，将RSV F有效掺入载体颗粒。
HEK/GS-opt/DS-Cav1。在本实施例中，使用rHPIV1-CΔ170载体来表达进一步修饰型式的RSV F蛋白。所有插入物含有为了人表达由Genecript密码子优化(GS-opt)且具有两处HEK氨基酸指派(即残基66和101处的Glu和Pro)的RSV F。另外，HEK/GS-opt RSV F蛋白含有稳定化融合前突变DS(S155C和S290C)和Cav1(S190F，和V207L)以稳定化已经显示负责RSV中和性抗体的优势的RSV F融合前头和抗原性位点(McLellan et al 2013Science 342:592-598)。
HPIV1TMCT。另外，生成HEK/GS-opt/DS-Cav1RSV F蛋白的一种型式，其中它的TMCT域用HPIV1F蛋白的替换。HPIV1TM和CT域的构成先前尚未测定。图60指示RSV F蛋白(顶部的线)和HPIV1F蛋白(第二条线)的TM和CT域，并显示RSV F蛋白的预测外域附着至HPIV1F蛋白的预测TMCT域的嵌合物。这样做的目的是提高RSV F蛋白掺入HPIV1载体，前提是HPIV1 F特异性TMCT域在病毒装配期间会更加有效地与其它载体蛋白相互作用，而且会推动嵌合RSVF蛋白的掺入。
rHPIV1-CΔ170载体构建物。图61和62显示使用来自实施例2的rHPIV1-CΔ170载体来接受放置在第一基因位置(F1)处的两种插入物任一的构建物：表达RSV F HEK/GS-opt/DS-Cav1，产生rHPIV1-CΔ170-F1/HEK/GS-opt/DS-Cav1(图61和62，顶部构建物)；或RSV FHEK/GS-opt/DS-Cav1/H1TMCT，产生rHPIV1-CΔ170-F1/HEK/GS-opt/DS-Cav1/H1TMCT(底部构建物)。注意，这两种构建物区别仅在于第二构建物中的RSV F具有来自HPIV1F蛋白的TMCT。图62显示插入物任一放置在rHPIV1-CΔ170载体的第二基因位置(F2)的两种平行构建物。所有病毒设计成保持六聚物基因组核苷酸长度(六法则)(Kolakofsky et al 1998J Virol 72:891-899)。每一种载体基因维持它的野生型六聚物定相(phasing)；F1和F2插入物分别具有N和P基因的六聚物定相。
病毒回收。通过用全长反基因组质粒和三种表达HPIV1N，P，和L蛋白的表达质粒中的每一种共转染BHK BSR T7/5细胞(组成性表达T7RNA聚合酶的幼仓鼠肾细胞(Buchholzet al 1999J Virol 73:251-259))来挽救4种构建物。实施检测HPIV1和RSV F蛋白共表达的双重染色噬斑测定法来测定RSV F表达的稳定性。绝大多数噬斑有效表达RSV F蛋白。将这些相同的4种制备物提交通过自动化测序进行的共有序列分析(完整分析每一个基因组，除了被引物遮蔽的分别在3’和5’末端的22和26个核苷酸)。发现病毒没有通过这种方法可检测的偶然突变。
体外多周期复制。如下对4种所回收的病毒(即在F1或F2位置中有或无H1TMCT的HEK/GS-opt/DS-Cav1)评估体外多周期复制，即一式三份以MOI＝0.01TCID50每个细胞用每一种病毒感染Vero细胞并每24小时收集培养物上清液达7天。通过在LLC-MK2细胞上的连续稀释和血细胞吸附测定法来测定所收集的样品中的病毒滴度。所有具有RSV F插入物的载体与wt HPIV1和rHPIV1-CΔ170相比是相对减毒的且生长至7.0TCID50/mL左右的终滴度(图63)。F1/DS-Cav1和F1/DS-Cav1/H1TMCT(注意，为了简要，名称中的“HEK/GS-opt”部分在正文和图中可以省略)在感染后(p.i.)第1和2天比F2/DS-Cav1和F2/DS-Cav1/H1TMCT复制更慢(指数式复制期期间)但到第7天(收获日)达到与F2/DS-Cav1和F2/DS-Cav1/H1TMCT相似的高滴度。因而，所有构建物生长至符合Vero细胞中的疫苗制造的较高的最终滴度。
蛋白掺入病毒粒体。使那组4种构建物连同wt HPIV1，和rHPIV1-CΔ170空载体在LLC-MK2细胞中生长并通过蔗糖梯度离心来纯化。使wt RSV在Vero细胞中繁殖，接着是蔗糖梯度纯化，作为对照包括在内。在RIPA缓冲液中裂解大约1μg每一种蔗糖纯化的病毒，还原，变性并提交SDS-PAGE和Western印迹分析。如在先所述(实施例2；Mackow et al 2015JVirol 89:10319-10332)，分别用小鼠单克隆(Abcam)和家兔多克隆肽特异性抗体(见实施例2)，连同它们对应的红外染料缀合的二抗检测RSV F蛋白和HPIV1蛋白(N，F，和HN)(图64)。对分别表达来自第1和第2位置的全长RSV F的F1/DS-Cav1和F2/DS-Cav1纯化病毒粒体的分析没有显示HPIV1载体病毒粒体中RSV F的可检测包装(图64，顶部小图，3和5道)。相反，F1/DS Cav1-H1TMCT和F2/DS Cav1-H1TMCT病毒粒体(图64，4和6道)二者显示可观的掺入，F1/DS Cav1-H1TMCT比F2/DS Cav1-H1TMCT更高。有趣的是，两种H1TMCT型式均显示与wtRSV相比病毒粒体中包装更大量的RSV F(图64，7道)每μg病毒粒体蛋白。
在相同实验中，还评估HPIV1N，HN，和F蛋白在HPIV1载体病毒粒体中的掺入(图64)。HPIV1N蛋白的病毒粒体掺入受到任何插入物表达的很小影响(图64，自顶部起第二幅小图)。F1/DS-Cav1/H1TMCT，F2/DS-Cav1，和F2/DS-Cav1/H1TMCT构建物的HN蛋白减少(图64，自顶部起第三幅小图，4，5，和6道)。F2/DS-Cav1和F2/DS-Cav1/H1TMCT的HPIV1F蛋白的病毒粒体掺入减少(图64，自顶部起第四幅小图，5和6道)。注意，已经针对含有HPIV1 F蛋白的CT域的最后18个氨基酸的肽生成了HPIV1F蛋白的抗血清，因而，在HPIV1F0和F1蛋白以外，这种抗血清检测，含有HPIV1F蛋白TMCT的形式的RSV F蛋白，即F1/DS-Cav1/H1TMCT和F2/DS-Cav1/TMCT。通过与抗RSV F单克隆抗体的共染色来确认RSV F条带的身份；这确认了RSVF确实与HPIV1F TMCT域一起表达。
细胞内蛋白质表达。接着，评估载体感染细胞中RSV F蛋白和HPIV1载体蛋白的细胞内表达。以MOI＝10TCID50每个细胞用每一种构建物感染Vero细胞并于32℃温育48小时。收获细胞蛋白质，即用1X LDS缓冲液直接裂解单层，还原，变性，并提交SDS-PAGE和Western印迹分析(图65)。使用与图64中所述相同的抗体来检测RSV F和HPIV1蛋白。所有构建物均能够在感染细胞中表达RSV F蛋白；F2/DS-Cav1/H1TMCT具有最高表达，接着是F2/DS-Cav1，F1/DS-Cav1/H1TMCT，和F1/DS-Cav1(图65，4，3，2，和1道)。与将RSV F插入物插入第一基因位置会导致最高水平的表达(由于转录梯度)的预期相反，F1/DS-Cav1和F1/DS-Cav1/H1TMCT病毒(图64，1和2道)具有与F2病毒相比降低的RSV F表达(3和4道)。正如早就注意到的，F1病毒在指数式生长期间复制比F2病毒有点更慢(图63)，这很可能促成RSV F表达降低。F1病毒感染细胞中低水平的细胞内RSV F表达与病毒粒体掺入概况(图64)形成对比，后者显示F1/DS-Cav1/H1TMCT与F2/DS-Cav1/H1TMCT相比更高的RSV F掺入(4对6道)。在F1和F2位置二者中，具有TMCT的DS-Cav1以比单独的DS-Cav1有点更高的水平表达，提示TMCT可能通过使得蛋白质或mRNA转录物更加稳定来增强RSV F表达。对受到B/HPIV3载体感染的Vero细胞中的具有BPIV3 F TMCT的RSV F也观察到类似作用(图50A)。还值得注意的是，F1病毒的HPIV1N，P，F，和HN蛋白的细胞内表达与F2病毒相比也很低(图65，第二，第三，和第四幅小图，1和2对3和4道)。这揭示了F1病毒的基因表达很低(图65，道1和2)，尽管在携带HPIV1TMCT的RSV F的情况中，所生成的RSV F蛋白明显非常有效地掺入HPIV1病毒粒体(图64，4道)。
这个本实验中F1病毒降低的RSV F表达与实施例2中报告的涉及来自这种相同载体的第一基因位置的HEK/GA-opt形式的RSV F蛋白的表达的结果形成对比。在那种情况中，RSV F蛋白的细胞内表达是有效的且F1与F2构建物相比非常相似，而F1与F2相比HPIV1载体蛋白表达有点降低，但是没有如此剧烈(图38A，左边的头两道，和图38B)。差异可能在于图38中表达的RSV F型式是融合原性的，而且这可能帮助病毒更加有效地穿过细胞单层传播并促进更加有效的感染，导致更多的蛋白质合成，而图64中表达的F蛋白是冻结于融合前构象，因而会是非融合原性的DS-Cav1型式。虽然表达DS-Cav1的构建物可能没有有效传播，但是每一种感染细胞可能生成更多RSV F蛋白，这会引起更高水平的病毒粒体掺入。然而，既然在每一项实验中使用相对较高的感染MOI(MOI＝5)，因而极大多数细胞应当受到感染且传播可能不是主要因素。因此，来自F1位置的DS-Cav1形式的F蛋白降低的细胞内表达是出乎意料的，并且指出F2位置很可能更加适合载体使用。
实施例4
表达优化型式的RSV F蛋白的wt rHPIV3株JS载体的开发
如上文讨论的，将BPIV3 F蛋白的TMCT(B3TMCT)添加至RSV F HEK/GA-opt/DS构建物导致rB/HPIV3载体在恒河猴中实质性减毒(图29)。还有B3TMCT在仓鼠中导致减毒的证据(图51)。这提出了这会使得rB/HPIV3载体过减毒的可能性。一种解决方案会是使用较少减毒的病毒作为载体，诸如wt HPIV3。另外，如果使用HPIV3载体(即所有主链基因衍生自HPIV3)，那么这会提供完全补足HPIV3蛋白作为针对HPIV3的细胞免疫的抗原，因而基于HPIV3的载体可能比基于rB/HPIV3的载体更具针对HPIV3的保护性。这个实施例中讨论的发现指示，出乎意料地，RSV F插入物F1-HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT的表达的稳定性表现为比它的缺少TMCT的型式(即F1-HEK/GS-opt/DS-Cav1)更加稳定。这与预期相反，可能预期掺入载体颗粒针对维持RSV F表达设置增加的选择压力，但是没有观察到这一点。
wt rHPIV3 JS株载体。选择野生型(wt)重组(r)HPIV3 JS株(它也是rB/HPIV3中的F和HN基因的来源)作为载体。与先前评估的株(Kapikian et al 1961JAMA 178:123-127)相比，这种病毒的生物学型式先前显示在成人中天然减毒(Clements et al.J ClinMicrobiol 29:1175-1182,1991)，推测是由于有待鉴定的一处或多处偶然减毒突变。这种病毒的重组型式(rHPIV3)具有HN中的两处突变(A263T和T370P)，是在建立HPIV3反求遗传系统时引入的。在本研究中，修饰rHPIV3载体以含有HN蛋白中的263T和370P氨基酸指派，发现它们阻止rB/HPIV3载体的大型噬斑形成(突变详细显示于图58B)。另外，如下修饰rHPIV3载体，即创建位置103-109处的独特BlpI位点(图67A，顶部构建物)，用于在第一基因位置中插入RSV F(或潜在的任何其它插入物)，或创建位置1675-1682处的独特AscI位点(图67B，顶部构建物)，用于在第二基因位置中插入RSV F。
HEK/GS-opt/DS-Cav1+/-H3TMCT。使用wt rHPIV3 JS载体来表达RSV F HEK/GS-opt/DS-Cav1蛋白，就这样表达或具有进一步修饰，其中RSV F蛋白的TMCT域用HPIV3 F蛋白的替换(称作H3TMCT，图66)。HPIV3 F蛋白的TM和CT域(H3TMCT)在RSV F蛋白的背景中的活性是未知的。图66还显示了将H3TMCT引入RSV F蛋白的嵌合物。
4种表达RSV F的基于rHPIV3的构建物的例子显示于图67。具体而言，例子是：
HEK/GS-opt/DS-Cav1插入第一基因位置(F1)(图67A)；
HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT插入第一基因位置(F1)(图67A)；
HEK/GS-opt/DS-Cav1插入第二基因位置(F2)(图67B)；
HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT插入第二基因位置(F2)(图67B)。
注意，这些RSV F ORF与图61和62中插入rHPIV1-CΔ170载体的相同，只是图67中的TMCT是衍生自HPIV3 F蛋白的H3TMCT。另外，图67中的每一个RSV F插入物均在HPIV3转录信号控制下，用于作为分开的mRNA表达。核苷酸编号方式(图67)是相对于每一种最终构建物的完整反基因组RNA序列的。所有病毒设计成维持六聚物基因组长度和野生型六聚物定相；F1和F2插入物分别具有原始N和P基因(正常情况下在第一和第二基因位置中)的六聚物定相。所有插入物是合成衍生的(Genscript)。
病毒回收和双重染色分析。通过用全长反基因组质粒和三种表达HPIV3 N，P，和L蛋白的表达质粒中的每一种共转染BHK BSR T7/5细胞来挽救病毒。成功挽救了所有病毒，并且为4种构建物中的每一种制备了2份P2(即第二传代)病毒原种。
对实施例1-4中显示的结果的评论
下面的实施例显示，可以使用数种不同PIV载体系统(包括rB/HPIV3，rHPIV1，和rHPIV3 JS)作为添加的基因有效表达RSV F蛋白。构建了多组突变体以系统性评估载体(例如插入物位置，减毒水平，等)和RSV F插入物(例如融合前稳定化，包装入载体颗粒，等)的多个变量。将多组突变体提交细胞培养物中的，仓鼠中的，和非人灵长动物中的详细分析以鉴定就表达水平，体外和体内稳定性，体内减毒，免疫原性，和保护功效而言的有效突变体。
先前的研究显示，高融合原性的蛋白(像RSV F)在不分段负链病毒载体中可能是不稳定的，因为它们高水平的合胞体形成干扰载体复制：例如，当由原型病毒水泡性口炎病毒(VSV)表达时，麻疹病毒的融合F蛋白显示出展现“极端不稳定性”(Quinones-Kochs etal 2001Virology 287；427-435)。既然呼吸道合胞病毒因其高水平的合胞体形成而声名狼藉，而且既然当功能性RSV F蛋白来自PIV载体表达时(例如实施例1)确实观察到高水平的合胞体形成，那么非常令人惊讶的是，这没有在体外干扰载体复制。因而，所公开的构建物的复制效率容许Vero细胞中的有效疫苗制造。而且，引入了降低(HEK指派)或本质上消除(DS，DS-Cav1)全部合胞体形成的修饰，这因而会回避高水平的合胞体形成引起的任何问题。
多种具体策略显示出提高外来RSV F基因的表达，包括纳入HEK指派，密码子优化，和放置在启动子邻近位置中。然而，结果并非必然可预测的，说明本公开文本中提供的广泛实验的重要性。另外，虽然来自第一基因位置的表达会预期产生最高水平的表达，但是当它表达因DS-Cav1突变而非融合原性的RSV F蛋白时HPIV1载体并非如此(图65)。因而，载体的性质和插入物的性质有助于产生新的特征。
调查了多种减毒手段，包括使用牛/人嵌合物rB/HPIV3，使用天然减毒的HPIV3 JS株，和使用以HPIV1(CΔ170和LY942A)例示的稳定化点和删除突变。另外，存在外来插入物在一些情况中提供了减毒，而且B3TMCT修饰是实质性减毒的。因而，试剂和生物学表征提供展现一系列有用减毒表型的载体。重要的是，感兴趣载体显示出保留了对于疫苗制造必须的Vero细胞中的有效复制和稳定性。
RSV F插入物的表达的稳定性对于之前的构建物是一个主要问题(Bernstein etal 2012,Pediatr Infect Dis 31:109-114)。然而，本公开文本中描述的已修饰构建物是实质性稳定的。诸如降低或抑制合胞体形成等因素很可能有助于稳定性。在一些情况中，鉴定了无法预测的因素。例如，发现rB/HPIV3载体中的HN基因展现实质性不稳定性，导致大噬斑表型。然而，HN基因中的I263T和T370P替代消除了这个问题(图58)。关于稳定性的出乎意料的发现的另一个例子是自rHPIV3 JS的F1位置表达的HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT构建物的组合中RSV F表达升高的稳定性(图68A)。可能预期，由于高水平的表达，来自F1位置的表达会是最不稳定的，但是没有观察到这一点。还可能预期，RSV F蛋白包装入载体也会对表达丧失设置选择压力，但是没有观察到这一点。
两处修饰显示出对于提高免疫原性是第一重要的：即，稳定化RSV F蛋白的融合前构象的突变DS和Cav1，和充当包装信号来指导外来糖蛋白有效掺入载体颗粒的TMCT修饰。不知道稳定化于融合前构象的RSV F是否会有效表达及是否会与病毒感染相容，但是情况就是这样。同样令人惊讶的是，TMCT包装信号以如此高度的包装效率工作，其等于或超过平行检查的RSV颗粒。同样令人惊讶的是，这种高效包装没有破坏载体颗粒生成，诸如通过置换内源F和HN表面糖蛋白。
特别出乎意料的是如下发现，即一方面的DS和DS-Cav1修饰和另一方面的TMCT修饰各自提供了认为是对于体内保护最有关联的高质量RSV中和性抗体生成的非常实质性的升高。这两种类型的修饰很可能经由不同机制实现这种效果：具体而言，DS和Cav1修饰推测通过稳定化抗原性位点来发挥它们的作用，而由TMCT介导的包装很可能提供以颗粒形式生成的RSV F抗原的紧密包装的高度重复的阵列，提供升高的抗原呈递。重要的是，这些作用在非人灵长动物中是非常明显的(图31)，对于补体不依赖性抗体自单一首剂(singleprimary dose)产生＞250的倒数滴度。另外，两种作用(DS-Cav1和TMCT)在一定程度上是叠加的。
显而易见的是，可以在不背离所描述的实施方案的精神的情况下改变或更改所描述的方法或组合物的精确细节。我们请求保护落在所附权利要求的范围和精神内的所有此类更改和改变。
序列表
<110> 美利坚合众国,由健康及人类服务部部长代表
P·柯林斯（Collins, Peter）
梁波（Liang, Bo）
S·穆尼尔（Munir, Shirin）
A·S·纳特（Schaap-Nutt, Anne）
U·巴克霍尔兹（Buchholz, Ursula）
N·马克夫（Mackow, Natalie）
P·邝（Kwong, Peter）
B·格拉哈姆（McLellan, Jason）
J·麦克莱伦（Graham, Barney）
<120> 表达嵌合RSV/BPIV3 F蛋白的重组人/牛副流感病毒3 (B/HPIV3)及其用途
<130> 4239-93586-02
<150> US 62/105,667
<151> 2015-01-20
<160> 150
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 1
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 2
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 2
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1 5 10 15
Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro
100 105 110
Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser
115 120 125
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130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
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245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
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Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
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Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
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Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly
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<210> 3
<211> 1725
<212> RNA
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 3
auggagcugc ugauccacag guuaagugca aucuuccuaa cucuugcuau uaaugcauug 60
uaccucaccu caagucagaa cauaacugag gaguuuuacc aaucgacaug uagugcaguu 120
agcagagguu auuuuagugc uuuaagaaca gguugguaua ccagugucau aacaauagaa 180
uuaaguaaua uaaaagaaac caaaugcaau ggaacugaca cuaaaguaaa acuuauaaaa 240
caagaauuag auaaguauaa gaaugcagug acagaauuac agcuacuuau gcaaaacaca 300
ccagcugcca acaaccgggc cagaagagaa gcaccacagu auaugaacua uacaaucaau 360
accacuaaaa accuaaaugu aucaauaagc aagaagagga aacgaagauu ucugggcuuc 420
uuguuaggug uaggaucugc aauagcaagu gguauagcug uauccaaagu ucuacaccuu 480
gaaggagaag ugaacaagau caaaaaugcu uuguuaucua caaacaaagc uguagucagu 540
cuaucaaaug gggucagugu uuuaaccagc aaaguguuag aucucaagaa uuacauaaau 600
aaccaauuau uacccauagu aaaucaacag agcugucgca ucuccaacau ugaaacaguu 660
auagaauucc agcagaagaa cagcagauug uuggaaauca acagagaauu cagugucaau 720
gcagguguaa caacaccuuu aagcacuuac auguuaacaa acagugaguu acuaucauug 780
aucaaugaua ugccuauaac aaaugaucag aaaaaauuaa ugucaagcaa uguucagaua 840
guaaggcaac aaaguuauuc uaucaugucu auaauaaagg aagaaguccu ugcauauguu 900
guacagcuac cuaucuaugg uguaauagau acaccuugcu ggaaauuaca cacaucaccu 960
cuaugcacca ccaacaucaa agaaggauca aauauuuguu uaacaaggac ugauagagga 1020
ugguauugug auaaugcagg aucaguaucc uucuuuccac aggcugacac uuguaaagua 1080
caguccaauc gaguauuuug ugacacuaug aacaguuuga cauuaccaag ugaagucagc 1140
cuuuguaaca cugacauauu caauuccaag uaugacugca aaauuaugac aucaaaaaca 1200
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uuaauagcua uugguuugcu guuguauugc aaagccaaaa acacaccagu uacacuaagc 1680
aaagaccaac uaaguggaau caauaauauu gcauucagca aauag 1725
<210> 4
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 4
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcacaacaa tcctgaccgc cgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
tccaagggct acctgagcgc cctgagaacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag 180
ctgtccaaca tcaaagaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaagtgaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagtccacc 300
cccgccacca acaaccgggc cagaagagaa ctgccccggt tcatgaacta caccctcaac 360
aacgccaaaa agaccaacgt gaccctgagc aagaagcgga agcggcggtt cctgggcttc 420
ctgctgggcg tgggcagcgc cattgcctct ggcgtggccg tgtctaaggt gctgcacctg 480
gaaggcgaag tgaacaagat caagagcgcc ctgctgtcca caaacaaggc cgtggtgtcc 540
ctgagcaacg gcgtgtccgt gctgacctcc aaggtgctgg atctgaagaa ctacatcgac 600
aagcagctgc tgcccatcgt gaacaagcag agctgcagca tcagcaacat cgagacagtg 660
atcgagttcc agcagaagaa caaccggctg ctggaaatca cccgcgagtt cagcgtgaac 720
gccggcgtga ccacccccgt gtccacctac atgctgacca acagcgagct gctgtccctg 780
atcaatgaca tgcccatcac caacgaccag aaaaagctga tgagcaacaa cgtgcagatc 840
gtgcggcagc agagctactc catcatgagc atcatcaaag aagaggtgct ggcctacgtg 900
gtgcagctgc ccctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagcccc 960
ctgtgcacca ccaacacaaa agagggcagc aacatctgcc tgacccggac cgaccggggc 1020
tggtactgcg ataatgccgg cagcgtgtca ttctttccac aggccgagac atgcaaggtg 1080
cagagcaacc gggtgttctg cgacaccatg aacagcctga ccctgccctc cgaagtgaac 1140
ctgtgcaacg tggacatctt caaccctaag tacgactgca agatcatgac cagcaagacc 1200
gacgtgtcca gctccgtgat cacctccctg ggcgccatcg tgtcctgcta cggcaagacc 1260
aagtgcaccg ccagcaacaa gaaccggggc atcatcaaga ccttcagcaa cggctgcgac 1320
tacgtgtcca acaagggggt ggacaccgtg tccgtgggca acaccctgta ctacgtgaac 1380
aaacaggaag gcaagagcct gtacgtgaag ggcgagccca tcatcaactt ctacgacccc 1440
ctggtgttcc ccagcgacga gttcgacgcc agcatcagcc aggtcaacga gaagatcaac 1500
cagagcctgg ccttcatcag aaagagcgac gagctgctgc acaatgtgaa tgccggcaag 1560
agcaccacaa acatcatgat caccactatc atcatcgtga tcatcgtcat cctgctgagt 1620
ctgatcgccg tgggcctgct gctgtactgc aaggccagat ccacccctgt gaccctgtcc 1680
aaggatcagc tgtccggcat caacaatatc gccttctcca actga 1725
<210> 5
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 5
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ctgtccaaca tcaaggaaaa caaatgtaat gggaccgacg caaaggtgaa actgatcaag 240
caggagctgg ataagtacaa aaatgccgtg acagaactgc agctgctgat gcagtccaca 300
ccagcaacta acaatcgcgc ccggagagag ctgccccggt tcatgaacta taccctgaac 360
aatgctaaga aaaccaatgt gacactgtcc aagaaacgca agaggcgctt cctgggattt 420
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<210> 6
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 6
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agcaccacaa acatcatgat caccactatc atcatcgtga tcatcgtcat cctgctgagt 1620
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attaacgaca tgcctatcac caatgatcag aagaaactga tgtccaacaa tgtgcagatc 840
gtcagacagc agagttactc aatcatgtct atcattaagg aggaagtcct ggcctacgtg 900
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Asp Gln Asn Asp Lys Asn Ser Glu Pro Tyr Ile Leu Thr Asn Arg Gln
565 570 575
<210> 22
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 22
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacca tcctgaccgc cgtgaccttc 60
tgctttgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
tccaagggct acctgagcgc cctgagaacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag 180
ctgagcaaca tcaaagaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaagtgaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaatgccgtg accgaactgc agctgctgat gcagagcacc 300
cccgccacca acaaccgggc cagaagagaa ctgcccagat tcatgaacta caccctgaac 360
aacgccaaaa agaccaacgt gaccctgagc aagaagcgga agcggcggtt cctgggcttt 420
ctgctgggag tgggaagcgc cattgctagc ggagtggccg tgtgcaaggt gctgcacctg 480
gaaggcgaag tgaacaagat caagtccgcc ctgctgagca ccaacaaggc cgtggtgtct 540
ctgagcaacg gcgtgtccgt gctgaccttc aaggtgctgg atctgaagaa ctacatcgac 600
aaacagctgc tgcccatctt gaacaagcag agctgcagca tcagcaacat cgagacagtg 660
atcgagttcc agcagaagaa caaccggctg ctggaaatca cccgcgagtt cagcgtgaac 720
gctggcgtga ccacccccgt gtccacctac atgctgacca acagcgagct gctgtccctg 780
atcaacgaca tgcccatcac caacgaccag aaaaagctga tgagcaacaa cgtgcagatc 840
gtgcggcagc agagctactc catcatgtgc atcatcaaag aagaggtgct ggcctacgtg 900
gtgcagctgc ctctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagccct 960
ctgtgcacca ccaacaccaa agagggctcc aacatctgcc tgacccggac cgacagaggc 1020
tggtactgcg ataatgccgg ctccgtctca ttctttccac aagccgagac atgcaaggtg 1080
cagagcaacc gggtgttctg cgacaccatg aacagcctga ccctgccctc cgaagtgaat 1140
ctgtgcaacg tggacatctt caaccctaag tacgactgca agatcatgac ctccaagacc 1200
gacgtgtcca gctccgtgat cacaagcctg ggcgccatcg tgtcctgcta cggcaagacc 1260
aagtgcaccg ccagcaacaa gaaccggggc atcatcaaga ccttcagcaa cggctgcgac 1320
tacgtgtcca acaagggggt ggacaccgtg tctgtgggca acaccctgta ctacgtgaac 1380
aaacaggaag gcaagagcct gtacgtgaag ggcgagccca tcatcaactt ctacgacccc 1440
ctggtgttcc ccagcgacga gttcgatgcc agcatctccc aagtgaacga gaagatcaac 1500
cagagcctgg ccttcatcag aaagtccgat gagctgctgc acaatgtgaa cgccggcaag 1560
tccaccacca atatcatgat caccacaatc accatcatca ttgtgatgat tatcatcctc 1620
gtgatcatca acatcacaat catcgtcgtg attattaagt tccaccggat ccagggcaag 1680
gaccagaacg acaagaactc cgagccctac atcctgacaa accggcagtg a 1731
<210> 23
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 23
atggaactgc tgatcctgaa agccaacgct attactacta tcctgaccgc cgtgacattt 60
tgcttcgcat ctggacagaa cattactgag gaattctacc agtcaacatg cagcgccgtg 120
tccaaaggat acctgagcgc cctgcggacc ggctggtata catcagtgat tactatcgag 180
ctgtccaaca tcaaggaaaa caaatgtaat gggaccgacg caaaggtgaa actgatcaag 240
caggagctgg ataagtacaa aaatgccgtg acagaactgc agctgctgat gcagtccaca 300
ccagcaacta acaatcgcgc ccggagagag ctgccccggt tcatgaacta taccctgaac 360
aatgctaaga aaaccaatgt gacactgtcc aagaaacgca agaggcgctt cctgggattt 420
ctgctgggcg tggggtctgc catcgctagt ggagtggccg tctgcaaagt cctgcacctg 480
gagggcgaag tgaacaagat caaaagcgcc ctgctgtcca ctaacaaggc agtggtcagt 540
ctgtcaaatg gcgtgtccgt cctgaccttc aaggtgctgg acctgaaaaa ttatattgat 600
aagcagctgc tgcctatcct gaacaaacag agctgctcca tttctaatat cgagacagtg 660
atcgaattcc agcagaagaa caatagactg ctggagatta ccagagagtt cagcgtgaac 720
gccggcgtca ccacacccgt gtccacctac atgctgacaa atagtgagct gctgtcactg 780
attaacgaca tgcctatcac caatgatcag aagaaactga tgtccaacaa tgtgcagatc 840
gtcagacagc agagttactc aatcatgtgc atcattaagg aggaagtcct ggcctacgtg 900
gtccagctgc cactgtatgg cgtgatcgac accccctgct ggaaactgca tacatctcct 960
ctgtgcacta ccaacacaaa ggaaggaagt aatatctgcc tgactcgaac cgaccgggga 1020
tggtactgtg ataacgcagg cagcgtgtcc ttctttccac aggccgagac ctgcaaggtc 1080
cagagcaaca gggtgttctg tgacactatg aatagcctga ccctgccttc cgaagtcaac 1140
ctgtgcaatg tggacatctt taatccaaag tacgattgta agatcatgac tagcaagacc 1200
gatgtcagct cctctgtgat tacttctctg ggggccatcg tgagttgcta cggaaagaca 1260
aaatgtactg ccagcaacaa aaatcgcggc atcattaaga ccttctccaa cgggtgcgac 1320
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ctggtgttcc cttccgacga gtttgatgca tctattagtc aggtgaacga aaaaatcaat 1500
cagagtctgg cctttattcg gaagtcagat gagctgctgc acaacgtgaa tgctggcaaa 1560
tctacaacta acatcatgat caccacaatc accatcatta tcgtgatgat tatcattctg 1620
gtcatcatta acatcacaat cattgtggtc atcattaagt tccaccggat tcagggcaag 1680
gaccagaacg ataaaaatag cgagccctac atcctgacca atagacagtg a 1731
<210> 24
<211> 524
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 24
Met Ala Gly Leu Leu Ser Thr Phe Asp Thr Phe Ser Ser Arg Arg Ser
1 5 10 15
Glu Ser Ile Asn Lys Ser Gly Gly Gly Ala Ile Ile Pro Gly Gln Arg
20 25 30
Ser Thr Val Ser Val Phe Thr Leu Gly Pro Ser Val Thr Asp Asp Ala
35 40 45
Asp Lys Leu Leu Ile Ala Thr Thr Phe Leu Ala His Ser Leu Asp Thr
50 55 60
Asp Lys Gln His Ser Gln Arg Gly Gly Phe Leu Val Ser Leu Leu Ala
65 70 75 80
Met Ala Tyr Ser Ser Pro Glu Leu Tyr Leu Thr Thr Asn Gly Val Asn
85 90 95
Ala Asp Val Lys Tyr Val Ile Tyr Asn Ile Glu Arg Asp Pro Lys Arg
100 105 110
Thr Lys Thr Asp Gly Phe Ile Val Lys Thr Arg Asp Met Glu Tyr Glu
115 120 125
Arg Thr Thr Glu Trp Leu Phe Gly Pro Met Ile Asn Lys Asn Pro Leu
130 135 140
Phe Gln Gly Gln Arg Glu Asn Ala Asp Leu Glu Ala Leu Leu Gln Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Tyr Pro Ala Cys Leu Gly Ala Ile Ile Val Gln Val Trp Ile
165 170 175
Val Leu Val Lys Ala Ile Thr Ser Ser Ala Gly Leu Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Phe Asn Arg Leu Glu Ala Phe Arg Gln Asp Gly Thr Val Lys Ser Ala
195 200 205
Leu Val Phe Thr Gly Asp Thr Val Glu Gly Ile Gly Ala Val Met Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Ser Leu Val Ser Leu Met Val Glu Thr Leu Val Thr Met
225 230 235 240
Asn Thr Ser Arg Ser Asp Leu Thr Thr Leu Glu Lys Asn Ile Gln Ile
245 250 255
Val Gly Asn Tyr Ile Arg Asp Ala Gly Leu Ala Ser Phe Met Asn Thr
260 265 270
Ile Lys Tyr Gly Val Glu Thr Lys Met Ala Ala Leu Thr Leu Ser Asn
275 280 285
Leu Arg Pro Asp Ile Asn Lys Leu Arg Ser Leu Val Asp Ile Tyr Leu
290 295 300
Ser Lys Gly Ala Arg Ala Pro Phe Ile Cys Ile Leu Arg Asp Pro Val
305 310 315 320
His Gly Asp Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu Trp Ser Tyr Ala
325 330 335
Met Gly Val Ala Val Val Gln Asn Lys Ala Met Gln Gln Tyr Val Thr
340 345 350
Gly Arg Thr Tyr Leu Asp Met Glu Met Phe Leu Leu Gly Gln Ala Val
355 360 365
Ala Lys Asp Ala Asp Ser Lys Ile Ser Ser Ala Leu Glu Glu Glu Leu
370 375 380
Gly Val Thr Asp Thr Ala Lys Glu Arg Leu Arg His His Leu Thr Asn
385 390 395 400
Leu Ser Gly Gly Asp Gly Ala Tyr His Lys Pro Thr Gly Gly Gly Ala
405 410 415
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Thr Ala Asp Arg Asp Asn Lys Asn Trp Thr Asn Asp Ser Asn Glu Arg
435 440 445
Trp Met Asn His Ser Ile Ser Asn His Thr Ile Thr Ile Arg Gly Ala
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Glu Glu Thr Asn Asp Glu Asp Ile Thr Asp Ile Glu
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Asn Lys Ile Ala Arg Arg Leu Ala Asp Arg Lys Gln Arg Leu Ser Gln
485 490 495
Ala Asn Asn Lys Arg Asp Thr Ser Ser Asp Ala Asp Tyr Glu Asn Asp
500 505 510
Asp Asp Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ile Gly Gly Ile
515 520
<210> 25
<211> 568
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 25
Met Asp Gln Asp Ala Phe Phe Phe Glu Arg Asp Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Glu Ala Pro Arg Lys Gln Glu Ser Leu Ser Asp Val Ile Gly Leu Leu
20 25 30
Asp Val Val Leu Ser Tyr Lys Pro Thr Glu Ile Gly Glu Asp Arg Ser
35 40 45
Trp Leu His Gly Ile Ile Asp Asn Pro Lys Glu Asn Lys Pro Ser Cys
50 55 60
Lys Ala Asp Asp Asn Asn Lys Asp Arg Ala Ile Ser Thr Ser Thr Gln
65 70 75 80
Asp His Arg Ser Ser Glu Glu Ser Gly Ile Ser Arg Arg Thr Ser Glu
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100 105 110
Arg Ala Ser Arg Arg Gly Thr Ser Pro Asn Pro Leu Pro Glu Asn Met
115 120 125
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130 135 140
Arg His Gln Arg Ser Val Leu Thr Asp Glu Asp Arg Lys Met Ala Glu
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Asn Ser Asn Lys Arg Glu Glu Asp Gln Val Glu Gly Phe Pro Glu Glu
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Val Arg Arg Ser Thr Pro Leu Ser Asp Asp Gly Glu Gly Arg Thr Asn
180 185 190
Asn Asn Gly Arg Ser Met Glu Thr Ser Ser Thr His Ser Thr Arg Ile
195 200 205
Thr Asp Val Ile Thr Asn Pro Ser Pro Glu Leu Glu Asp Ala Val Leu
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Gln Arg Asn Lys Arg Arg Pro Thr Thr Ile Lys Arg Asn Gln Thr Arg
225 230 235 240
Ser Glu Arg Thr Gln Ser Ser Glu Leu His Lys Ser Thr Ser Glu Asn
245 250 255
Ser Ser Asn Leu Glu Asp His Asn Thr Lys Thr Ser Pro Lys Val Pro
260 265 270
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275 280 285
His Arg Lys Thr Arg Tyr Thr Thr Asn Asn Ala Asn Asn Asn Thr Lys
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305 310 315 320
Ser Asn Thr Ser Val Asp Glu Met Ala Lys Leu Leu Val Ser Leu Gly
325 330 335
Val Met Lys Ser Gln His Glu Phe Glu Leu Ser Arg Ser Ala Ser His
340 345 350
Val Phe Ala Lys Arg Met Leu Lys Ser Ala Asn Tyr Lys Glu Met Thr
355 360 365
Phe Asn Leu Cys Gly Met Leu Ile Ser Val Glu Lys Ser Leu Glu Asn
370 375 380
Lys Val Glu Glu Asn Arg Thr Leu Leu Lys Gln Ile Gln Glu Glu Ile
385 390 395 400
Asn Ser Ser Arg Asp Leu His Lys Arg Phe Ser Glu Tyr Gln Lys Glu
405 410 415
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Asp Arg Gly Gly Lys Thr Gly Asn Pro Ser Asp Thr Thr Arg Ser Pro
435 440 445
Ser Val Phe Thr Lys Gly Lys Asp Asn Lys Val Lys Lys Thr Arg Phe
450 455 460
Asp Pro Ser Met Glu Ala Leu Gly Gly Gln Glu Phe Lys Pro Asp Leu
465 470 475 480
Ile Arg Glu Asp Glu Leu Arg Asp Asp Ile Lys Asn Pro Val Leu Glu
485 490 495
Glu Asn Asn Asn Glu Pro Gln Ala Ser Asn Ala Ser Arg Leu Ile Pro
500 505 510
Ser Thr Glu Lys His Thr Leu His Ser Leu Lys Leu Val Ile Glu Asn
515 520 525
Ser Pro Leu Ser Arg Val Glu Lys Lys Ala Tyr Ile Lys Ser Leu Tyr
530 535 540
Lys Cys Arg Thr Asn Gln Glu Val Lys Asn Val Met Glu Leu Phe Glu
545 550 555 560
Glu Asp Ile Asp Ser Leu Thr Asn
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<210> 26
<211> 204
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 26
Met Pro Ser Phe Leu Arg Gly Ile Leu Lys Pro Lys Glu Arg His His
1 5 10 15
Glu Asn Lys Asn His Ser Gln Met Ser Ser Asp Ser Leu Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Lys Leu Glu Lys Thr Glu Ala Gly Ser Met
35 40 45
Val Ser Ser Thr Thr Gln Lys Lys Thr Ser His His Ala Lys Pro Thr
50 55 60
Ile Thr Thr Lys Thr Glu Gln Ser Gln Arg Arg Pro Lys Ile Ile Asp
65 70 75 80
Gln Val Arg Arg Val Glu Ser Leu Gly Glu Gln Val Ser Gln Lys Gln
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Arg His Met Leu Glu Ser Leu Ile Asn Lys Val Tyr Thr Gly Pro Leu
100 105 110
Gly Glu Glu Leu Val Gln Thr Leu Tyr Leu Arg Ile Trp Ala Met Lys
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Glu Thr Pro Glu Ser Thr Lys Ile Leu Gln Met Arg Glu Asp Ile Arg
130 135 140
Asp Gln Tyr Leu Arg Met Lys Thr Glu Arg Trp Leu Arg Thr Leu Ile
145 150 155 160
Arg Gly Lys Lys Thr Lys Leu Arg Asp Phe Gln Lys Arg Tyr Glu Glu
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Val His Pro Tyr Leu Met Met Glu Arg Val Glu Gln Ile Ile Met Glu
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Glu Ala Trp Lys Leu Ala Ala His Ile Val Gln Glu
195 200
<210> 27
<211> 348
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 27
Met Ala Glu Thr Tyr Arg Phe Pro Arg Phe Ser His Glu Glu Asn Gly
1 5 10 15
Thr Val Glu Pro Leu Pro Leu Lys Thr Gly Pro Asp Lys Lys Ala Ile
20 25 30
Pro His Ile Arg Ile Val Lys Val Gly Asp Pro Pro Lys His Gly Val
35 40 45
Arg Tyr Leu Asp Val Leu Leu Leu Gly Phe Phe Glu Thr Pro Lys Gln
50 55 60
Gly Pro Leu Ser Gly Ser Ile Ser Asp Leu Thr Glu Ser Thr Ser Tyr
65 70 75 80
Ser Ile Cys Gly Ser Gly Ser Leu Pro Ile Gly Ile Ala Lys Tyr Tyr
85 90 95
Gly Thr Asp Gln Glu Leu Leu Lys Ala Cys Ile Asp Leu Lys Ile Thr
100 105 110
Val Arg Arg Thr Val Arg Ser Gly Glu Met Ile Val Tyr Met Val Asp
115 120 125
Ser Ile His Ala Pro Leu Leu Pro Trp Ser Ser Arg Leu Arg Gln Gly
130 135 140
Met Ile Tyr Asn Ala Asn Lys Val Ala Leu Ala Pro Gln Cys Leu Pro
145 150 155 160
Val Asp Lys Asp Ile Arg Phe Arg Val Val Phe Val Asn Gly Thr Ser
165 170 175
Leu Gly Thr Ile Thr Ile Ala Lys Val Pro Lys Thr Leu Ala Asp Leu
180 185 190
Ala Leu Pro Asn Ser Ile Ser Val Asn Leu Leu Val Thr Leu Arg Ala
195 200 205
Gly Val Ser Thr Glu Gln Lys Gly Ile Leu Pro Val Leu Asp Asp Asp
210 215 220
Gly Glu Lys Lys Leu Asn Phe Met Val His Leu Gly Ile Ile Arg Arg
225 230 235 240
Lys Val Gly Lys Ile Tyr Ser Val Glu Tyr Cys Lys Asn Lys Ile Glu
245 250 255
Lys Met Lys Leu Ile Phe Ser Leu Gly Leu Val Gly Gly Ile Ser Phe
260 265 270
His Val His Ala Thr Gly Thr Leu Ser Lys Thr Leu Met Ser Gln Leu
275 280 285
Ala Trp Lys Lys Ala Val Cys Tyr Pro Leu Met Asp Val Asn Pro His
290 295 300
Met Asn Leu Val Ile Trp Ala Ala Ser Val Glu Ile Thr Ser Val Asp
305 310 315 320
Ala Val Phe Gln Pro Ala Ile Pro Lys Glu Phe Arg Tyr Tyr Pro Asn
325 330 335
Val Val Ala Lys Ser Ile Gly Lys Ile Arg Arg Ile
340 345
<210> 28
<211> 555
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 28
Met Gln Lys Ser Glu Ile Leu Phe Leu Val Tyr Ser Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Leu Cys Gln Ile Pro Val Glu Lys Leu Ser Asn Val Gly
20 25 30
Val Ile Ile Asn Glu Gly Lys Leu Leu Lys Ile Ala Gly Ser Tyr Glu
35 40 45
Ser Arg Tyr Ile Val Leu Ser Leu Val Pro Ser Ile Asp Leu Gln Asp
50 55 60
Gly Cys Gly Thr Thr Gln Ile Ile Gln Tyr Lys Asn Leu Leu Asn Arg
65 70 75 80
Leu Leu Ile Pro Leu Lys Asp Ala Leu Asp Leu Gln Glu Ser Leu Ile
85 90 95
Thr Ile Thr Asn Asp Thr Thr Val Thr Asn Asp Asn Pro Gln Thr Arg
100 105 110
Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala
115 120 125
Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu Ala Glu Ala Arg Glu Ala Arg
130 135 140
Lys Asp Ile Ala Leu Ile Lys Asp Ser Ile Val Lys Thr His Asn Ser
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Val Glu Leu Ile Gln Arg Gly Ile Gly Glu Gln Ile Ile Ala Leu Lys
165 170 175
Thr Leu Gln Asp Phe Val Asn Asp Glu Ile Arg Pro Ala Ile Gly Glu
180 185 190
Leu Arg Cys Glu Thr Thr Ala Leu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Gln
195 200 205
His Tyr Ser Glu Leu Ala Thr Ala Phe Ser Ser Asn Leu Gly Thr Ile
210 215 220
Gly Glu Lys Ser Leu Thr Leu Gln Ala Leu Ser Ser Leu Tyr Ser Ala
225 230 235 240
Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ser Thr Thr Lys Lys Asp Lys Ser Asp Ile
245 250 255
Tyr Asp Ile Ile Tyr Thr Glu Gln Val Lys Gly Thr Val Ile Asp Val
260 265 270
Asp Leu Glu Lys Tyr Met Val Thr Leu Leu Val Lys Ile Pro Ile Leu
275 280 285
Ser Glu Ile Pro Gly Val Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Ile Ser Tyr
290 295 300
Asn Ile Glu Gly Glu Glu Trp His Val Ala Ile Pro Asn Tyr Ile Ile
305 310 315 320
Asn Lys Ala Ser Ser Leu Gly Gly Ala Asp Val Thr Asn Cys Ile Glu
325 330 335
Ser Lys Leu Ala Tyr Ile Cys Pro Arg Asp Pro Thr Gln Leu Ile Pro
340 345 350
Asp Asn Gln Gln Lys Cys Ile Leu Gly Asp Val Ser Lys Cys Pro Val
355 360 365
Thr Lys Val Ile Asn Asn Leu Val Pro Lys Phe Ala Phe Ile Asn Gly
370 375 380
Gly Val Val Ala Asn Cys Ile Ala Ser Thr Cys Thr Cys Gly Thr Asn
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Arg Ile Pro Val Asn Gln Asp Arg Ser Arg Gly Val Thr Phe Leu Thr
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Tyr Thr Asn Cys Gly Leu Ile Gly Ile Asn Gly Ile Glu Leu Tyr Ala
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Asn Lys Arg Gly Arg Asp Thr Thr Trp Gly Asn Gln Ile Ile Lys Val
435 440 445
Gly Pro Ala Val Ser Ile Arg Pro Val Asp Ile Ser Leu Asn Leu Ala
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Ser Ala Thr Asn Phe Leu Glu Glu Ser Lys Thr Glu Leu Met Lys Ala
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Arg Ala Ile Ile Ser Ala Val Gly Gly Trp His Asn Thr Glu Ser Thr
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Gln Ile Ile Met Ile Ile Ile Val Cys Ile Leu Ile Ile Ile Ile Cys
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Gly Ile Leu Tyr Tyr Leu Tyr Arg Val Arg Arg Leu Leu Val Met Ile
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Asn Ser Thr His Asn Ser Pro Val Asn Ala Tyr Thr Leu Glu Ser Arg
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Met Arg Asn Pro Tyr Met Gly Asn Asn Ser Asn
545 550 555
<210> 29
<211> 575
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 29
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Asn Asp Asn Ser Thr Val Asn Thr His Ile Asn Thr Pro Ala Gly Arg
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Thr His Ile Trp Leu Leu Ile Ala Thr Thr Met His Thr Val Leu Ser
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Phe Ile Ile Met Ile Leu Cys Ile Asp Leu Ile Ile Lys Gln Asp Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Ile Ile Lys Glu Thr Ile Thr Glu Leu Ile Arg Gln Glu Val Ile
85 90 95
Ser Arg Thr Ile Asn Ile Gln Ser Ser Val Gln Ser Gly Ile Pro Ile
100 105 110
Leu Leu Asn Lys Gln Ser Arg Asp Leu Thr Gln Leu Ile Glu Lys Ser
115 120 125
Cys Asn Arg Gln Glu Leu Ala Gln Ile Cys Glu Asn Thr Ile Ala Ile
130 135 140
His His Ala Asp Gly Ile Ser Pro Leu Asp Pro His Asp Phe Trp Arg
145 150 155 160
Cys Pro Val Gly Glu Pro Leu Leu Ser Asn Asn Pro Asn Ile Ser Leu
165 170 175
Leu Pro Gly Pro Ser Leu Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Ser Gly Cys
180 185 190
Val Arg Leu Pro Ser Leu Ser Ile Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Tyr Ser
195 200 205
Ser Asn Leu Ile Thr Gln Gly Cys Ala Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln
210 215 220
Val Leu Gln Leu Gly Tyr Ile Ser Leu Asn Ser Asp Met Tyr Pro Asp
225 230 235 240
Leu Asn Pro Val Ile Ser His Thr Tyr Asp Ile Asn Asp Asn Arg Lys
245 250 255
Ser Cys Ser Val Ile Ala Ala Gly Thr Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ser
260 265 270
Leu Pro Thr Val Asn Glu Thr Thr Asp Tyr Ser Ser Glu Gly Ile Glu
275 280 285
Asp Leu Val Phe Asp Ile Leu Asp Leu Lys Gly Lys Thr Lys Ser His
290 295 300
Arg Tyr Lys Asn Glu Asp Ile Thr Phe Asp His Pro Phe Ser Ala Met
305 310 315 320
Tyr Pro Ser Val Gly Ser Gly Ile Lys Ile Glu Asn Thr Leu Ile Phe
325 330 335
Leu Gly Tyr Gly Gly Leu Thr Thr Pro Leu Gln Gly Asp Thr Lys Cys
340 345 350
Val Ile Asn Arg Cys Thr Asn Val Asn Gln Ser Val Cys Asn Asp Ala
355 360 365
Leu Lys Ile Thr Trp Leu Lys Lys Arg Gln Val Val Asn Val Leu Ile
370 375 380
Arg Ile Asn Asn Tyr Leu Ser Asp Arg Pro Lys Ile Val Val Glu Thr
385 390 395 400
Ile Pro Ile Thr Gln Asn Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Arg Leu Leu Lys
405 410 415
Leu Gly Lys Lys Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Ser Gly Trp His Ser
420 425 430
Asn Leu Gln Ile Gly Ser Leu Asp Ile Asn Asn Pro Met Thr Ile Lys
435 440 445
Trp Ala Pro His Glu Val Leu Ser Arg Pro Gly Asn Gln Asp Cys Asn
450 455 460
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465 470 475 480
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<210> 30
<211> 2223
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 30
Met Asp Lys Gln Glu Ser Thr Gln Asn Ser Ser Asp Ile Leu Tyr Pro
1 5 10 15
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20 25 30
His Val Leu Leu Asp Ile Asn Gln Pro Tyr Asp Leu Lys Asp Asn Ser
35 40 45
Ile Ile Asn Ile Thr Lys Tyr Lys Ile Arg Asn Gly Gly Leu Ser Pro
50 55 60
Arg Gln Ile Lys Ile Arg Ser Leu Gly Lys Ile Leu Lys Gln Glu Ile
65 70 75 80
Lys Asp Ile Asp Arg Tyr Thr Phe Glu Pro Tyr Pro Ile Phe Ser Leu
85 90 95
Glu Leu Leu Arg Leu Asp Ile Pro Glu Ile Cys Asp Lys Ile Arg Ser
100 105 110
Ile Phe Ser Val Ser Asp Arg Leu Ile Arg Glu Leu Ser Ser Gly Phe
115 120 125
Gln Glu Leu Trp Leu Asn Ile Leu Arg Gln Leu Gly Cys Val Glu Gly
130 135 140
Lys Glu Gly Phe Asp Ser Leu Lys Asp Val Asp Ile Ile Pro Asp Ile
145 150 155 160
Thr Asp Lys Tyr Asn Lys Asn Thr Trp Tyr Arg Pro Phe Leu Thr Trp
165 170 175
Phe Ser Ile Lys Tyr Asp Met Arg Trp Met Gln Lys Asn Lys Ser Gly
180 185 190
Asn His Leu Asp Val Ser Asn Ser His Asn Phe Leu Asp Cys Lys Ser
195 200 205
Tyr Ile Leu Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Val Ile Ile Ile Asn Lys Leu
210 215 220
Lys Leu Thr Gly Tyr Val Leu Thr Pro Glu Leu Val Leu Met Tyr Cys
225 230 235 240
Asp Val Val Glu Gly Arg Trp Asn Met Ser Ser Ala Gly Arg Leu Asp
245 250 255
Lys Arg Ser Ser Lys Ile Thr Cys Lys Gly Glu Glu Leu Trp Glu Leu
260 265 270
Ile Asp Ser Leu Phe Pro Asn Leu Gly Glu Asp Val Tyr Asn Ile Ile
275 280 285
Ser Leu Leu Glu Pro Leu Ser Leu Ala Leu Ile Gln Leu Asp Asp Pro
290 295 300
Val Thr Asn Leu Lys Gly Ala Phe Met Arg His Val Leu Thr Glu Leu
305 310 315 320
His Thr Ile Leu Ile Lys Asp Asn Ile Tyr Thr Asp Ser Glu Ala Asp
325 330 335
Ser Ile Met Glu Ser Leu Ile Lys Ile Phe Arg Glu Thr Ser Ile Asp
340 345 350
Glu Lys Ala Glu Ile Phe Ser Phe Phe Arg Thr Phe Gly His Pro Ser
355 360 365
Leu Glu Ala Ile Thr Ala Ala Asp Lys Val Arg Thr His Met Tyr Ser
370 375 380
Ser Lys Lys Ile Ile Leu Lys Thr Leu Tyr Glu Cys His Ala Ile Phe
385 390 395 400
Cys Ala Ile Ile Ile Asn Gly Tyr Arg Glu Arg His Gly Gly Gln Trp
405 410 415
Pro Pro Cys Glu Phe Pro Asn His Val Cys Leu Glu Leu Lys Asn Ala
420 425 430
Gln Gly Ser Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Glu Cys Ala Val Asp Asn Tyr
435 440 445
Ser Ser Phe Ile Gly Phe Lys Phe Leu Lys Phe Ile Glu Pro Gln Leu
450 455 460
Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr Met Lys Asp Lys Ala Leu Ser Pro Arg
465 470 475 480
Lys Ala Ala Trp Asp Ser Val Tyr Pro Asp Ser Asn Leu Tyr Tyr Lys
485 490 495
Val Pro Glu Ser Glu Glu Thr Arg Arg Leu Ile Glu Val Phe Ile Asn
500 505 510
Asp Asn Asn Phe Asn Pro Ala Asp Ile Ile Asn Tyr Val Glu Ser Gly
515 520 525
Glu Trp Leu Asn Asp Asp Ser Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Leu Lys Glu
530 535 540
Lys Glu Ile Lys Gln Glu Gly Arg Leu Phe Ala Lys Met Thr Tyr Lys
545 550 555 560
Met Arg Ala Val Gln Val Leu Ala Glu Thr Leu Leu Ala Lys Gly Val
565 570 575
Gly Glu Leu Phe Ser Glu Asn Gly Met Val Lys Gly Glu Ile Asp Leu
580 585 590
Leu Lys Arg Leu Thr Thr Leu Ser Val Ser Gly Val Pro Arg Ser Asn
595 600 605
Ser Val Tyr Asn Asn Pro Ile Leu His Glu Lys Leu Ile Lys Asn Met
610 615 620
Asn Lys Cys Asn Ser Asn Gly Tyr Trp Asp Glu Arg Lys Lys Ser Lys
625 630 635 640
Asn Glu Phe Lys Ala Ala Asp Ser Ser Thr Glu Gly Tyr Glu Thr Leu
645 650 655
Ser Cys Phe Leu Thr Thr Asp Leu Lys Lys Tyr Cys Leu Asn Trp Arg
660 665 670
Phe Glu Ser Thr Ala Leu Phe Gly Gln Arg Cys Asn Glu Ile Phe Gly
675 680 685
Phe Lys Thr Phe Phe Asn Trp Met His Pro Ile Leu Glu Lys Ser Thr
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725 730 735
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740 745 750
Ser Ala Ile His Leu Ala Ala Val Lys Val Gly Val Arg Val Ser Ala
755 760 765
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785 790 795 800
Thr Arg Tyr Phe Gly Ala Leu Arg Glu Val Met Phe Asp Ile Gly His
805 810 815
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Ser Lys Arg Ile Tyr Tyr Asp Gly Lys Ile Leu Pro Gln Cys Leu Lys
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930 935 940
Thr Ala Arg Cys Phe Val Arg Asn Ile Gly Asp Pro Ala Val Ala Ala
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Leu Ala Asp Leu Lys Arg Phe Ile Lys Ala Gly Leu Leu Asp Lys Gln
965 970 975
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1040 1045 1050
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Ser Leu Val Arg Ala Ser Val Arg Arg Gly Gly Leu Ser Tyr Ser
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Ala Leu Ser His Pro Lys Ile Phe Lys Arg Phe Trp Asp Ala Gly
1535 1540 1545
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1550 1555 1560
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1565 1570 1575
Met Arg Asp Trp Gln Glu Gly Ile Pro Leu Glu Ile Phe Ile Cys
1580 1585 1590
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1610 1615 1620
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1625 1630 1635
Ser Leu Lys Glu Tyr Leu Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Pro Ile
1640 1645 1650
Leu Arg Tyr Ser Gln Leu Thr Gly Leu Val Ile Lys Ile Phe Pro
1655 1660 1665
Ser Thr Leu Thr Tyr Ile Arg Lys Ser Ser Ile Lys Val Leu Arg
1670 1675 1680
Val Arg Gly Ile Gly Ile Pro Glu Val Leu Glu Asp Trp Asp Pro
1685 1690 1695
Asp Ala Asp Ser Met Leu Leu Asp Asn Ile Thr Ala Glu Val Gln
1700 1705 1710
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1715 1720 1725
Leu Arg Val Ser Lys Ser Gln Val Leu Arg Leu Arg Gly Tyr Glu
1730 1735 1740
Glu Ile Lys Arg Glu Glu Arg Gly Arg Ser Gly Val Gly Leu Thr
1745 1750 1755
Leu Pro Phe Asp Gly Arg Tyr Leu Ser His Gln Leu Arg Leu Phe
1760 1765 1770
Gly Ile Asn Ser Thr Ser Cys Leu Lys Ala Leu Glu Leu Thr Tyr
1775 1780 1785
Leu Leu Asn Pro Leu Val Asn Lys Asp Lys Asp Arg Leu Tyr Leu
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Gly Glu Gly Ala Gly Ala Met Leu Ser Cys Tyr Asp Ala Thr Leu
1805 1810 1815
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1820 1825 1830
Leu Asn Gly Gln Arg Glu Leu Asn Ile Tyr Pro Ser Glu Val Ala
1835 1840 1845
Leu Val Gly Lys Lys Leu Asn Asn Val Thr Ser Leu Cys Gln Arg
1850 1855 1860
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1865 1870 1875
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1880 1885 1890
Ser Ile Gly Phe Ile His Cys Asp Met Glu Gly Gly Glu His Lys
1895 1900 1905
Cys Asp Gln Val Val Leu His Glu His Tyr Ser Val Ile Arg Ile
1910 1915 1920
Ala Tyr Leu Val Gly Asp Lys Asp Val Ile Leu Val Ser Lys Ile
1925 1930 1935
Ala Pro Arg Leu Gly Thr Asp Trp Thr Lys Gln Leu Ser Leu Tyr
1940 1945 1950
Leu Arg Tyr Trp Arg Asp Val Ser Leu Ile Val Leu Lys Thr Ser
1955 1960 1965
Asn Pro Ala Ser Thr Glu Met Tyr Leu Ile Ser Lys Asp Pro Lys
1970 1975 1980
Ser Asp Ile Ile Glu Asp Ser Asn Thr Val Leu Ala Asn Leu Leu
1985 1990 1995
Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ser Ile Lys Ile Glu Lys Trp Ile Leu
2000 2005 2010
Val Glu Lys Ala Lys Val His Asp Trp Ile Val Arg Glu Leu Lys
2015 2020 2025
Glu Gly Ser Ala Ser Ser Gly Met Leu Arg Pro Tyr His Gln Ala
2030 2035 2040
Leu Gln Ile Phe Gly Phe Glu Pro Asn Leu Asn Lys Leu Cys Arg
2045 2050 2055
Asp Phe Leu Ser Thr Leu Asn Ile Val Asp Thr Lys Asn Cys Ile
2060 2065 2070
Ile Thr Phe Asp Arg Val Leu Arg Asp Thr Ile Phe Glu Trp Thr
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Arg Ile Lys Asp Ala Asp Lys Lys Leu Arg Leu Thr Gly Lys Tyr
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Asp Leu Tyr Pro Leu Arg Asp Ser Gly Lys Leu Lys Val Ile Ser
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Arg Arg Leu Val Ile Ser Trp Ile Ala Leu Ser Met Ser Thr Arg
2120 2125 2130
Leu Val Thr Gly Ser Phe Pro Asp Ile Lys Phe Glu Ser Arg Leu
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Gln Leu Gly Ile Val Ser Ile Ser Ser Arg Glu Ile Lys Asn Leu
2150 2155 2160
Arg Val Ile Ser Lys Ile Val Ile Asp Lys Phe Glu Asp Ile Ile
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His Ser Val Thr Tyr Arg Phe Leu Thr Lys Glu Ile Lys Ile Leu
2180 2185 2190
Met Lys Ile Leu Gly Ala Val Lys Leu Phe Gly Ala Arg Gln Ser
2195 2200 2205
Thr Ser Ala Asp Ile Thr Asn Ile Asp Thr Ser Asp Ser Ile Gln
2210 2215 2220
<210> 31
<211> 59
<212> PRT
<213> 人副流感病毒1
<400> 31
Gln Ile Ile Met Ile Ile Ile Val Cys Ile Leu Ile Ile Ile Ile Cys
1 5 10 15
Gly Ile Leu Tyr Tyr Leu Tyr Arg Val Arg Arg Leu Leu Val Met Ile
20 25 30
Asn Ser Thr His Asn Ser Pro Val Asn Ala Tyr Thr Leu Glu Ser Arg
35 40 45
Met Arg Asn Pro Tyr Met Gly Asn Asn Ser Asn
50 55
<210> 32
<211> 543
<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 32
Met Ser Ser Val Leu Lys Thr Phe Glu Arg Phe Thr Ile Gln Gln Glu
1 5 10 15
Leu Gln Glu Gln Ser Glu Asp Thr Pro Ile Pro Leu Glu Thr Ile Arg
20 25 30
Pro Thr Ile Arg Val Phe Val Ile Asn Asn Asn Asp Pro Ile Val Arg
35 40 45
Ser Arg Leu Leu Phe Phe Asn Leu Arg Ile Ile Met Ser Asn Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Gly His Arg Ala Gly Ala Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro
65 70 75 80
Ser Ala Ala Met Ser Asn His Ile Lys Leu Ala Met His Ser Pro Glu
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Ala Ser Ile Asp Arg Val Glu Ile Thr Gly Phe Glu Asn Asn Ser Phe
100 105 110
Arg Val Ile Pro Asp Ala Arg Ser Thr Met Ser Arg Gly Glu Val Leu
115 120 125
Ala Phe Glu Ala Leu Ala Glu Asp Ile Pro Asp Thr Leu Asn His Gln
130 135 140
Thr Pro Phe Val Asn Asn Asp Val Glu Asp Asp Ile Phe Asp Glu Thr
145 150 155 160
Glu Lys Phe Leu Asp Val Cys Tyr Ser Val Leu Met Gln Ala Trp Ile
165 170 175
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195 200 205
Tyr Val Leu Gln Pro Glu Ala Gln Arg Leu Ile Gln Asn Ala Ile Arg
210 215 220
Lys Ser Met Val Val Arg His Phe Met Thr Tyr Glu Leu Gln Leu Ser
225 230 235 240
Gln Ser Arg Ser Leu Leu Ala Asn Arg Tyr Tyr Ala Met Val Gly Asp
245 250 255
Ile Gly Lys Tyr Ile Glu His Ser Gly Met Gly Gly Phe Phe Leu Thr
260 265 270
Leu Lys Tyr Gly Leu Gly Thr Arg Trp Pro Thr Leu Ala Leu Ala Ala
275 280 285
Phe Ser Gly Glu Leu Gln Lys Leu Lys Ala Leu Met Leu His Tyr Gln
290 295 300
Ser Leu Gly Pro Met Ala Lys Tyr Met Ala Leu Leu Glu Ser Pro Lys
305 310 315 320
Leu Met Asp Phe Val Pro Ser Glu Tyr Pro Leu Val Tyr Ser Tyr Ala
325 330 335
Met Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Thr Asn Met Arg Asn Tyr Ala Tyr
340 345 350
Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Pro Gln Tyr Phe Gln Leu Gly Val Glu Thr
355 360 365
Ala Arg Lys Gln Gln Gly Ala Val Asp Asn Arg Thr Ala Glu Asp Leu
370 375 380
Gly Met Thr Ala Ala Asp Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ile Ser Lys
385 390 395 400
Leu Ser Leu Ser Gln Leu Pro Arg Gly Arg Gln Pro Ile Ser Asp Pro
405 410 415
Phe Ala Gly Ala Asn Asp Arg Glu Thr Gly Gly Gln Ala Thr Asp Thr
420 425 430
Pro Val Tyr Asn Phe Asn Pro Ile Asn Asn Arg Arg Tyr Asp Asn Tyr
435 440 445
Asp Ser Asp Ser Glu Asp Arg Ile Asp Asn Asp Gln Asp Gln Ala Ile
450 455 460
Arg Glu Asn Arg Gly Glu Pro Gly Gln Pro Asn Asn Gln Thr Ser Glu
465 470 475 480
Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Pro Val Pro Gln Arg Thr Ser Gly Met
485 490 495
Ser Ser Glu Glu Phe Gln His Ser Met Asn Gln Tyr Ile Arg Ala Met
500 505 510
His Glu Gln Tyr Arg Gly Ser Gln Asp Asp Asp Ala Asn Asp Ala Thr
515 520 525
Asp Gly Asn Asp Ile Ser Leu Glu Leu Val Gly Asp Phe Asp Ser
530 535 540
<210> 33
<211> 395
<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 33
Met Ala Glu Glu Pro Thr Tyr Thr Thr Glu Gln Val Asp Glu Leu Ile
1 5 10 15
His Ala Gly Leu Gly Thr Val Asp Phe Phe Leu Ser Arg Pro Ile Asp
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Lys Arg Gly Gly Glu Leu Ile Glu Lys Glu Gln Glu Ala Thr Ile Gly
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Gly Val Ile Pro Gly Val Pro Gln Ser Arg Leu Gln Leu Ala Ser Ser
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210 215 220
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245 250 255
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Met Ile Thr Thr Ile Lys Ile Met Asp Pro Ser Thr Pro Thr Asn Val
275 280 285
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305 310 315 320
Ser Met Asp Glu Leu Ala Arg Pro Thr Leu Ser Ser Thr Lys Lys Ile
325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
Glu Ile Lys Arg Ser Ile Ile Arg Ser Ala Ile
385 390 395
<210> 34
<211> 225
<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 34
Met Ala Glu Glu Pro Thr Tyr Thr Thr Glu Gln Val Asp Glu Leu Ile
1 5 10 15
His Ala Gly Leu Gly Thr Val Asp Phe Phe Leu Ser Arg Pro Ile Asp
20 25 30
Ala Gln Ser Ser Leu Gly Lys Gly Ser Ile Pro Pro Gly Val Thr Ala
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Asp Ile Asp Ile Val Thr Gly Asn Ile Thr Glu Gly Ser Tyr Lys Gly
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Val Glu Leu Ala Lys Leu Gly Lys Gln Thr Leu Leu Thr Arg Phe Thr
130 135 140
Ser Asn Glu Pro Val Ser Ser Ala Gly Ser Ala Gln Asp Pro Asn Phe
145 150 155 160
Lys Arg Gly Gly Ala Asn Arg Glu Arg Ala Arg Gly Asn His Arg Arg
165 170 175
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195 200 205
Cys Thr Cys Gly Ser Cys Pro Ser Ile Cys Gly Glu Cys Glu Gly Asp
210 215 220
His
225
<210> 35
<211> 377
<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 35
Met Pro Ile Ile Ser Leu Pro Ala Asp Pro Thr Ser Pro Ser Gln Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Phe Pro Ile Gln Leu Asp Thr Lys Asp Gly Lys Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Leu Lys Gln Ile Arg Ile Arg Tyr Leu Asn Glu Pro Asn Ser
35 40 45
Arg His Thr Pro Ile Thr Phe Ile Asn Thr Tyr Gly Phe Val Tyr Ala
50 55 60
Arg Asp Thr Ser Gly Gly Ile His Ser Glu Ile Ser Ser Asp Leu Ala
65 70 75 80
Ala Gly Ser Ile Thr Ala Cys Met Met Thr Leu Gly Pro Gly Pro Asn
85 90 95
Ile Gln Asn Ala Asn Leu Val Leu Arg Ser Leu Asn Glu Phe Tyr Val
100 105 110
Lys Val Lys Lys Thr Ser Ser Gln Arg Glu Glu Ala Val Phe Glu Leu
115 120 125
Val Asn Ile Pro Thr Leu Leu Arg Glu His Ala Leu Cys Lys Arg Lys
130 135 140
Thr Leu Val Cys Ser Ala Glu Lys Phe Leu Lys Asn Pro Ser Lys Leu
145 150 155 160
Gln Ala Gly Phe Glu Tyr Val Tyr Ile Pro Thr Phe Val Ser Ile Thr
165 170 175
Tyr Ser Pro Arg Asn Leu Asn Tyr Gln Val Ala Arg Pro Ile Leu Lys
180 185 190
Phe Arg Ser Arg Phe Val Tyr Ser Ile His Leu Glu Leu Ile Leu Arg
195 200 205
Leu Leu Cys Lys Ser Asp Ser Pro Leu Met Lys Ser Tyr Asn Ala Asp
210 215 220
Arg Thr Gly Arg Gly Cys Leu Ala Ser Val Trp Ile His Val Cys Asn
225 230 235 240
Ile Leu Lys Asn Lys Ser Ile Lys Gln Gln Gly Arg Glu Ser Tyr Phe
245 250 255
Ile Ala Lys Cys Met Ser Met Gln Leu Gln Val Ser Ile Ala Asp Leu
260 265 270
Trp Gly Pro Thr Ile Ile Ile Lys Ser Leu Gly His Ile Pro Lys Thr
275 280 285
Ala Leu Pro Phe Phe Ser Lys Asp Gly Ile Ala Cys His Pro Leu Gln
290 295 300
Asp Val Ser Pro Thr Leu Thr Lys Ser Leu Trp Ser Val Gly Cys Glu
305 310 315 320
Ile Glu Ser Ala Lys Leu Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ile Asn Glu Leu
325 330 335
Met Gly His Gln Asp Leu Ile Thr Asp Lys Ile Ala Ile Arg Ser Gly
340 345 350
Gln Arg Thr Phe Glu Arg Ser Lys Phe Ser Pro Phe Lys Lys Tyr Ala
355 360 365
Ser Ile Pro Asn Leu Glu Ala Ile Asn
370 375
<210> 36
<211> 551
<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 36
Met His His Leu His Pro Met Ile Val Cys Ile Phe Val Met Tyr Thr
1 5 10 15
Gly Ile Val Gly Ser Asp Ala Ile Ala Gly Asp Gln Leu Leu Asn Val
20 25 30
Gly Val Ile Gln Ser Lys Ile Arg Ser Leu Met Tyr Tyr Thr Asp Gly
35 40 45
Gly Ala Ser Phe Ile Val Val Lys Leu Leu Pro Asn Leu Pro Pro Ser
50 55 60
Asn Gly Thr Cys Asn Ile Thr Ser Leu Asp Ala Tyr Asn Val Thr Leu
65 70 75 80
Phe Lys Leu Leu Thr Pro Leu Ile Glu Asn Leu Ser Lys Ile Ser Ala
85 90 95
Val Thr Asp Thr Lys Pro Arg Arg Glu Arg Phe Ala Gly Val Val Ile
100 105 110
Gly Leu Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala
115 120 125
Val Ala Ile Val Lys Ala Asn Ala Asn Ala Ala Ala Ile Asn Asn Leu
130 135 140
Ala Ser Ser Ile Gln Ser Thr Asn Lys Ala Val Ser Asp Val Ile Thr
145 150 155 160
Ala Ser Arg Thr Ile Ala Thr Ala Val Gln Ala Ile Gln Asp His Ile
165 170 175
Asn Gly Ala Ile Val Asn Gly Ile Thr Ser Ala Ser Cys Arg Ala His
180 185 190
Asp Ala Leu Ile Gly Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr
195 200 205
Thr Ile Phe His Asn Gln Ile Thr Asn Pro Ala Leu Thr Pro Leu Ser
210 215 220
Ile Gln Ala Leu Arg Ile Leu Leu Gly Ser Thr Leu Pro Ile Val Ile
225 230 235 240
Glu Ser Lys Leu Asn Thr Lys Leu Asn Thr Ala Glu Leu Leu Ser Ser
245 250 255
Gly Leu Leu Thr Gly Gln Ile Ile Ser Ile Ser Pro Met Tyr Met Gln
260 265 270
Met Leu Ile Gln Ile Asn Val Pro Thr Phe Ile Met Gln Pro Gly Ala
275 280 285
Lys Val Ile Asp Leu Ile Ala Ile Ser Ala Asn His Lys Leu Gln Glu
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Val Val Val Gln Val Pro Asn Arg Ile Leu Glu Tyr Ala Asn Glu Leu
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325 330 335
Cys Arg Tyr Asn Glu Gly Ser Pro Ile Pro Glu Ser Gln Tyr Gln Cys
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Leu Arg Gly Asn Leu Asn Ser Cys Thr Phe Thr Pro Ile Ile Gly Asn
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Phe Leu Lys Arg Phe Ala Phe Ala Asn Gly Val Leu Tyr Ala Asn Cys
370 375 380
Lys Ser Leu Leu Cys Lys Cys Ala Asp Pro Pro His Val Val Ser Gln
385 390 395 400
Asp Asp Asn Gln Gly Ile Ser Ile Ile Asp Ile Lys Arg Cys Ser Glu
405 410 415
Met Met Leu Asp Thr Phe Ser Phe Arg Ile Thr Ser Thr Phe Asn Ala
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Thr Tyr Val Thr Asp Phe Ser Met Ile Asn Ala Asn Ile Val His Leu
435 440 445
Ser Pro Leu Asp Leu Ser Asn Gln Ile Asn Ser Ile Asn Lys Ser Leu
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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Ile Lys Leu Val Ser Gln Ile His Gln Phe Arg Ala Leu Ala Ala Thr
515 520 525
Thr Met Phe His Arg Glu Asn Pro Ala Val Phe Ser Lys Asn Asn His
530 535 540
Gly Asn Ile Tyr Gly Ile Ser
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<211> 571
<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 37
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1 5 10 15
Cys Arg Ile Ile Phe Arg Thr Ala Thr Ile Leu Gly Ile Cys Thr Leu
20 25 30
Ile Val Leu Cys Ser Ser Ile Leu His Glu Ile Ile His Leu Asp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Tyr Asn Val Ala Ile Val Ile Pro Leu Lys Ile Asp Ser Ile Glu
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Thr Val Ile Leu Ser Ala Leu Lys Asp Met His Thr Gly Ser Met Ser
100 105 110
Asn Ala Asn Cys Thr Pro Gly Asn Leu Leu Leu His Asp Ala Ala Tyr
115 120 125
Ile Asn Gly Ile Asn Lys Phe Leu Val Leu Glu Ser Tyr Asn Gly Thr
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asp Gly Ile Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val Thr Ala Ile Pro Gly Gly
225 230 235 240
Cys Val Leu Tyr Cys Tyr Val Ala Thr Arg Ser Glu Lys Glu Asp Tyr
245 250 255
Ala Thr Thr Asp Leu Ala Glu Leu Arg Leu Ala Phe Tyr Tyr Tyr Asn
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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Ile Cys Pro Leu Ser Asp Met His Thr Glu Glu Cys Asn Leu Val Met
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435 440 445
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<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 38
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Leu Phe Ser Ile Val Asp Glu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Asp Thr Val
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Leu Lys Asp Pro Val Val Glu Leu Thr Gly Ser Phe His Ser Phe Ile
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Leu Ser Pro Asp Leu Ile Ala Glu Met Leu Cys Leu Met Arg Leu Trp
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Ala Leu Gly Ser Val Ile Tyr Cys Ser Glu Thr Val Asp Ile Pro
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Leu Ile Arg Asp Ile Gln Ile Glu Asp Ile Asn Asp Phe Glu Asp
2240 2245 2250
Ile Glu Arg Gly Ile Asp Gly Glu Glu Leu
2255 2260
<210> 39
<211> 66
<212> PRT
<213> 人副流感病毒2
<400> 39
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Ile Ser
65
<210> 40
<211> 515
<212> PRT
<213> 人副流感病毒3
<400> 40
Met Leu Ser Leu Phe Asp Thr Phe Asn Ala Arg Arg Gln Glu Asn Ile
1 5 10 15
Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ala Ile Ile Pro Gly Gln Lys Asn Thr Val
20 25 30
Ser Ile Phe Ala Leu Gly Pro Thr Ile Thr Asp Asp Asn Glu Lys Met
35 40 45
Thr Leu Ala Leu Leu Phe Leu Ser His Ser Leu Asp Asn Glu Lys Gln
50 55 60
His Ala Gln Arg Ala Gly Phe Leu Val Ser Leu Leu Ser Met Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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Gly Tyr Pro Ser Cys Leu Gly Ala Leu Ile Ile Gln Ile Trp Ile Val
165 170 175
Leu Val Lys Ala Ile Thr Ser Ile Ser Gly Leu Arg Lys Gly Phe Phe
180 185 190
Thr Arg Leu Glu Ala Phe Arg Gln Asp Gly Thr Val Gln Ala Gly Leu
195 200 205
Val Leu Ser Gly Asp Thr Val Asp Gln Ile Gly Ser Ile Met Arg Ser
210 215 220
Gln Gln Ser Leu Val Thr Leu Met Val Glu Thr Leu Ile Thr Met Asn
225 230 235 240
Thr Ser Arg Asn Asp Leu Thr Thr Ile Glu Lys Asn Ile Gln Ile Val
245 250 255
Gly Asn Tyr Ile Arg Asp Ala Gly Leu Ala Ser Phe Phe Asn Thr Ile
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Arg Tyr Gly Ile Glu Thr Arg Met Ala Ala Leu Thr Leu Ser Thr Leu
275 280 285
Arg Pro Asp Ile Asn Arg Leu Lys Ala Leu Met Glu Leu Tyr Leu Ser
290 295 300
Lys Gly Pro Arg Ala Pro Phe Ile Cys Ile Leu Arg Asp Pro Ile His
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Gly Glu Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Ile Trp Ser Tyr Ala Met
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Gly Val Ala Val Val Gln Asn Arg Ala Met Gln Gln Tyr Val Thr Gly
340 345 350
Arg Ser Tyr Leu Asp Ile Asp Met Phe Gln Leu Gly Gln Ala Val Ala
355 360 365
Arg Asp Ala Glu Ala Gln Met Ser Ser Thr Leu Glu Asp Glu Leu Gly
370 375 380
Val Thr His Glu Ser Lys Glu Ser Leu Lys Arg His Ile Arg Asn Ile
385 390 395 400
Asn Ser Ser Glu Thr Ser Phe His Lys Pro Thr Gly Gly Ser Ala Ile
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Glu Met Ala Ile Asp Glu Glu Pro Glu Gln Phe Glu His Arg Ala Asp
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Gln Glu Gln Asn Gly Glu Pro Gln Ser Ser Ile Ile Gln Tyr Ala Trp
435 440 445
Ala Glu Gly Asn Arg Ser Asp Asp Gln Thr Glu Gln Ala Thr Glu Ser
450 455 460
Asp Asn Ile Lys Thr Glu Gln Gln Asn Ile Arg Asp Arg Leu Asn Lys
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Arg Leu Asn Asp Lys Lys Lys Gln Ser Ser Gln Pro Pro Thr Asn Pro
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Thr Asn Arg Thr Asn Gln Asp Glu Ile Asp Asp Leu Phe Asn Ala Phe
500 505 510
Gly Ser Asn
515
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<212> PRT
<213> 人副流感病毒3
<400> 41
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Glu Ser Arg Asp Lys Ser Thr Asn Ile Ser Ser Ala Leu Asn Ile Ile
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Met Arg Gln Ser Ala Asn Val Pro Ser Glu Ile Ser Gly Ser Asp Asp
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Ile Phe Thr Thr Glu Gln Ser Arg Asn Ser Asp His Gly Arg Ser Leu
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Glu Ser Ile Ser Thr Pro Asp Thr Arg Ser Ile Ser Val Val Thr Ala
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305 310 315 320
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385 390 395 400
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405 410 415
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Lys Ala Asp Leu Lys Lys Met Asp Glu Ser His Arg Arg Leu Ile Glu
435 440 445
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450 455 460
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<400> 42
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<213> 人副流感病毒3
<400> 44
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50 55 60
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Pro Arg Ile Ser His Thr Phe Asn Ile Asn Asp Asn Arg Lys Ser Cys
245 250 255
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260 265 270
Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Glu Asp Ile
275 280 285
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Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Lys Gly Lys Ile Ile Phe Leu Gly
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<213> 人副流感病毒3
<400> 45
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Asn Phe Leu Leu Ile His Pro Glu Leu Val Leu Ile Leu Asp Lys Gln
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Asn Tyr Asn Gly Tyr Leu Ile Thr Pro Glu Leu Val Leu Met Tyr Cys
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Gly Lys Gln Leu Lys Phe Asp Thr Ile Asn Lys Cys His Ala Ile Phe
385 390 395 400
Cys Thr Ile Ile Ile Asn Gly Tyr Arg Glu Arg His Gly Gly Gln Trp
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Tyr Gly Ser Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Glu Asn Ala Val Asp Tyr Tyr
435 440 445
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515 520 525
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Gly Lys Phe Phe Gln Glu Asn Gly Met Val Lys Gly Glu Ile Glu Leu
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Ile Lys Leu Ala Leu Ser Ile Cys Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Phe
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Asp Ser Asp Met Glu Val Ala Asn Asp Arg Lys Gln Ala Phe Ile
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Ser Arg His Leu Ser Phe Val Cys Cys Leu Ala Glu Ile Ala Ser
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Phe Gly Pro Asn Leu Leu Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Arg Leu Asp
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Leu Leu Lys Gln Tyr Leu Glu Leu Asn Ile Lys Glu Asp Pro Thr
1640 1645 1650
Leu Lys Tyr Val Gln Ile Ser Gly Leu Leu Ile Lys Ser Phe Pro
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Ser Thr Val Thr Tyr Val Arg Lys Thr Ala Ile Lys Tyr Leu Arg
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Ile Arg Gly Ile Ser Pro Pro Glu Val Ile Asp Asp Trp Asp Pro
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<212> PRT
<213> 牛副流感病毒3
<400> 47
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1 5 10 15
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35 40 45
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<213> 牛副流感病毒3
<400> 48
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<213> 牛副流感病毒3
<400> 49
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<213> 牛副流感病毒3
<400> 50
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<212> PRT
<213> 牛副流感病毒3
<400> 51
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<212> PRT
<213> 牛副流感病毒3
<400> 52
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Lys Ser Asn Trp Asp Thr Val Tyr Pro Ala Ser Asn Leu Leu Tyr Arg
485 490 495
Thr Asn Val Ser His Asp Ser Arg Arg Leu Val Glu Val Phe Ile Ala
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Asp Ser Lys Phe Asp Pro His Gln Val Leu Asp Tyr Val Glu Ser Gly
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Tyr Trp Leu Asp Asp Pro Glu Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Leu Lys Glu
530 535 540
Lys Glu Ile Lys Gln Glu Gly Arg Leu Phe Ala Lys Met Thr Tyr Lys
545 550 555 560
Met Arg Ala Thr Gln Val Leu Ser Glu Thr Leu Leu Ala Asn Asn Ile
565 570 575
Gly Lys Phe Phe Gln Glu Asn Gly Met Val Lys Gly Glu Ile Glu Leu
580 585 590
Leu Lys Arg Leu Thr Thr Ile Ser Met Ser Gly Val Pro Arg Tyr Asn
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Glu Val Tyr Asn Asn Ser Lys Ser His Thr Glu Glu Leu Gln Ala Tyr
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Asn Ala Ile Ser Ser Ser Asn Leu Ser Ser Asn Gln Lys Ser Lys Lys
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Phe Glu Phe Lys Ser Thr Asp Ile Tyr Asn Asp Gly Tyr Glu Thr Val
645 650 655
Ser Cys Phe Leu Thr Thr Asp Leu Lys Lys Tyr Cys Leu Asn Trp Arg
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Tyr Glu Ser Thr Ala Leu Phe Gly Asp Thr Cys Asn Gln Ile Phe Gly
675 680 685
Leu Lys Glu Leu Phe Asn Trp Leu His Pro Arg Leu Glu Lys Ser Thr
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Ile Tyr Val Gly Asp Pro Tyr Cys Pro Pro Ser Asp Ile Glu His Leu
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Pro Leu Asp Asp His Pro Asp Ser Gly Phe Tyr Val His Asn Pro Lys
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Gly Gly Ile Glu Gly Phe Cys Gln Lys Leu Trp Thr Leu Ile Ser Ile
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Ser Ala Ile His Leu Ala Ala Val Lys Ile Gly Val Arg Val Thr Ala
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Met Val Gln Gly Asp Asn Gln Ala Ile Ala Val Thr Thr Arg Val Pro
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Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys Val Lys Lys Glu Ile Val Tyr Lys Asp Val
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Ser Lys Arg Ile Tyr Tyr Asp Gly Arg Ile Leu Pro Gln Ala Leu Lys
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Gly Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Ile Thr His Tyr Asn Lys Gly Tyr Cys
530 535 540
Phe His Ile Val Glu Ile Asn His Lys Ser Leu Asn Thr Phe Gln Pro
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Met Leu Phe Lys Thr Glu Ile Pro Lys Ser Cys Ser
565 570
<210> 102
<211> 1719
<212> PRT
<213> 人副流感病毒3
<400> 102
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys
1 5 10 15
Ala Thr Ala Cys Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Gly
35 40 45
Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly
50 55 60
Cys Thr Ala Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala
65 70 75 80
Gly Cys Thr Cys Ala Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala Thr Ala
85 90 95
Ala Thr Ala Thr Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala
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130 135 140
Ala Thr Cys Ala Thr Ala Gly Thr Gly Cys Thr Ala Ala Thr Thr Ala
145 150 155 160
Ala Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Thr Cys Ala
180 185 190
Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Ala
195 200 205
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Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Gly Ala Thr Ala
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Ala Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr
275 280 285
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Thr Thr Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala
305 310 315 320
Gly Ala Ala Thr Thr Ala Cys Ala Thr Ala Cys Cys Ala Ala Thr Ala
325 330 335
Thr Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala
340 345 350
Thr Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ala Ala
355 360 365
Ala Thr Thr Cys Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Thr Thr
370 375 380
Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Ala
385 390 395 400
Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys
405 410 415
Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr
420 425 430
Gly Ala Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Cys
435 440 445
Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala
450 455 460
Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Gly
465 470 475 480
Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr
485 490 495
Thr Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala
500 505 510
Ala Ala Thr Ala Ala Gly Gly Thr Thr Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala
515 520 525
Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Gly
530 535 540
Cys Thr Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Gly Thr
545 550 555 560
Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Thr Ala Gly Ala
565 570 575
Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Cys Thr Thr Thr Ala Gly Thr Thr Ala
580 585 590
Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Ala
595 600 605
Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Thr
610 615 620
Cys Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Thr Cys Gly Ala Gly Gly Thr Thr
625 630 635 640
Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Gly Ala Ala Ala
645 650 655
Ala Thr Cys Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Ala
660 665 670
Cys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala
675 680 685
Cys Thr Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr
690 695 700
Gly Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Ala Ala Ala Thr
705 710 715 720
Cys Cys Thr Ala Gly Gly Ala Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr Ala
725 730 735
Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala
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Cys Ala Ala Thr Ala Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Thr Gly Thr
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Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr
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Gly Thr Ala Cys Thr Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala
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Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr
885 890 895
Cys Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr
900 905 910
Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Thr Ala Ala
915 920 925
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930 935 940
Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Ala Thr Ala Cys Cys Cys Ala
945 950 955 960
Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala
965 970 975
Thr Ala Thr Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Ala
980 985 990
Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly
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Thr Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala
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Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala
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Gly Ala Cys Thr Gly Thr Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala
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Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Gly Ala Gly Gly
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Ala Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Ala Ala Ala
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Gly Gly Cys Thr Thr Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Ala Thr Thr
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Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala
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Thr Ala Cys Ala Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ala Gly Gly
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1340 1345 1350
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1535 1540 1545
Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys
1550 1555 1560
Cys Thr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys
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1670 1675 1680
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65
<210> 104
<211> 49
<212> PRT
<213> 新城疫病毒
<400> 104
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<210> 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
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530 535 540
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545 550 555 560
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<211> 594
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<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
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Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
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245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
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420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
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515 520 525
Thr Val Ile Thr Ile Ile Val Val Met Val Val Ile Leu Val Val Ile
530 535 540
Ile Val Ile Ile Ile Val Leu Tyr Arg Leu Arg Arg Ser Met Leu Met
545 550 555 560
Gly Asn Pro Asp Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu Pro
565 570 575
Lys Ile Arg His Met Tyr Thr Asn Gly Gly Phe Asp Ala Met Ala Glu
580 585 590
Lys Arg
<210> 107
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 107
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
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Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
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Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
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Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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435 440 445
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465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
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Lys Arg
<210> 108
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 108
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1 5 10 15
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Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
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Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
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275 280 285
Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
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Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
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Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
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370 375 380
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385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
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420 425 430
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450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Ile Val Ile Ile Ile Val Leu Tyr Arg Leu Arg Arg Ser Met Leu Met
545 550 555 560
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565 570 575
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Lys Arg
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<211> 578
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<220>
<223> 重组RSV F
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<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
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Lys Met
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
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435 440 445
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485 490 495
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Ile Val Ile Ile Ile Val Leu Tyr Arg Leu Arg Arg Ser Met Leu Met
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565 570 575
Lys Ile Arg His Met Tyr Thr Asn Gly Gly Phe Asp Ala Met Ala Glu
580 585 590
Lys Arg
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<211> 199
<212> PRT
<213> 人副流感病毒3
<400> 114
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<400> 115
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<211> 412
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<213> 牛副流感病毒3
<400> 116
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65 70 75 80
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100 105 110
Ser Ser Pro Asp Ser Arg Thr Glu Thr Met Val Thr Arg Arg Ile Ser
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Ile Pro Pro Thr Lys Gln Asp Gly Asp Gly Asp Asp Gly Arg Gly Leu
180 185 190
Glu Ser Ile Ser Thr Phe Asp Ser Gly Tyr Thr Ser Ile Val Thr Ala
195 200 205
Ala Thr Leu Asp Asp Glu Glu Glu Leu Leu Met Lys Asn Asn Arg Pro
210 215 220
Arg Lys Tyr Gln Ser Thr Pro Gln Asn Ser Asp Lys Gly Ile Lys Lys
225 230 235 240
Gly Gly Trp Lys Ala Lys Arg His Arg Gln Thr Ile Ile Asn Ile Gly
245 250 255
Leu Arg Thr Gln Leu Gln Arg Ile Glu Glu Glu Pro Glu Asn Pro Gln
260 265 270
Ser Gln His Glu Tyr Arg Arg Thr Asn Lys Thr Thr Glu Trp Ile Pro
275 280 285
Gly Glu Glu Asn His Ile Leu Glu His Pro Gln Gln Arg Glu Arg Gln
290 295 300
Ser Asn Arg Ile Asn Lys Pro Asn Pro Ser Asp Ile Asn Leu Gly Thr
305 310 315 320
Glu Pro His Asn Gly Thr Lys Gln Asn Asn Leu Arg Thr Lys Asp Gln
325 330 335
Asp Thr Lys Asp Gly Trp Lys Gly Lys Arg Gly His Arg Arg Glu His
340 345 350
Ser Ile Tyr Arg Lys Gly Asp Tyr Ile Ile Thr Glu Ser Trp Cys Asn
355 360 365
Pro Ile Cys Ser Lys Ile Arg Pro Ile Pro Arg Gln Glu Ser Cys Val
370 375 380
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<212> DNA
<213> 人副流感病毒2
<400> 118
ctaaacattc aataataaat caaagttc 28
<210> 119
<211> 8
<212> DNA
<213> 人副流感病毒2
<400> 119
cctaaaat 8
<210> 120
<211> 42
<212> DNA
<213> 人副流感病毒2
<400> 120
taatctttat ataatgtaac aatactacta agattataat at 42
<210> 121
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 121
aagaagacca agttgagcca gaagaggtac gaag 34
<210> 122
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 122
cttcgtacct cttctggctc aacttggtct tctt 34
<210> 123
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 123
ccagctaaca taggagggtt caacgcgatg tctacagcta gatgttttgt c 51
<210> 124
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 124
gacaaaacat ctagctgtag acatcgcgtt gaaccctcct atgttagctg g 51
<210> 125
<211> 12
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 125
aagtaagaaa aa 12
<210> 126
<211> 10
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 126
agggtgaatg 10
<210> 127
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 127
acgcgtcccg ggaacaatgg aactgctgat cctgaaggcc aacgcc 46
<210> 128
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 128
acgcgtcgta cgcattcacc ctaagttttt cttactttct atcagttgga gaaggcgata 60
ttgttgatgc cgg 73
<210> 129
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 129
ggcgcgcccc cgggaacaat ggaactgctg atcctgaagg ccaacgcc 48
<210> 130
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 130
ggcgcgcccg tacgccattc accctaagtt tttcttactt gattctatca gttggagaag 60
gcgatattgt tgatgccgg 79
<210> 131
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 131
gcggccgccc gggaagtaag aaaaacttag ggtgaatgaa caatggaact gctgatcctg 60
aaggccaacg cc 72
<210> 132
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头和折叠子域
<400> 132
Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala
1 5 10 15
Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25 30
<210> 133
<211> 586
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 133
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Arg Val Arg Arg Leu Leu Val Met Ile Asn
545 550 555 560
Ser Thr His Asn Ser Pro Val Asn Ala Tyr Thr Leu Glu Ser Arg Met
565 570 575
Arg Asn Pro Tyr Met Gly Asn Asn Ser Asn
580 585
<210> 134
<211> 1764
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 134
atggaactgc tgatcctgaa agccaacgct attactacta tcctgaccgc cgtgacattt 60
tgcttcgcat ctggacagaa cattactgag gaattctacc agtcaacatg cagcgccgtg 120
tccaaaggat acctgagcgc cctgcggacc ggctggtata catcagtgat tactatcgag 180
ctgtccaaca tcaaggaaaa caaatgtaat gggaccgacg caaaggtgaa actgatcaag 240
caggagctgg ataagtacaa aaatgccgtg acagaactgc agctgctgat gcagtccaca 300
ccagcaacta acaatcgcgc ccggagagag ctgccccggt tcatgaacta taccctgaac 360
aatgctaaga aaaccaatgt gacactgtcc aagaaacgca agaggcgctt cctgggattt 420
ctgctgggcg tggggtctgc catcgctagt ggagtggccg tctgcaaagt cctgcacctg 480
gagggcgaag tgaacaagat caaaagcgcc ctgctgtcca ctaacaaggc agtggtcagt 540
ctgtcaaatg gcgtgtccgt cctgaccttc aaggtgctgg acctgaaaaa ttatattgat 600
aagcagctgc tgcctatcct gaacaaacag agctgctcca tttctaatat cgagacagtg 660
atcgaattcc agcagaagaa caatagactg ctggagatta ccagagagtt cagcgtgaac 720
gccggcgtca ccacacccgt gtccacctac atgctgacaa atagtgagct gctgtcactg 780
attaacgaca tgcctatcac caatgatcag aagaaactga tgtccaacaa tgtgcagatc 840
gtcagacagc agagttactc aatcatgtgc atcattaagg aggaagtcct ggcctacgtg 900
gtccagctgc cactgtatgg cgtgatcgac accccctgct ggaaactgca tacatctcct 960
ctgtgcacta ccaacacaaa ggaaggaagt aatatctgcc tgactcgaac cgaccgggga 1020
tggtactgtg ataacgcagg cagcgtgtcc ttctttccac aggccgagac ctgcaaggtc 1080
cagagcaaca gggtgttctg tgacactatg aatagcctga ccctgccttc cgaagtcaac 1140
ctgtgcaatg tggacatctt taatccaaag tacgattgta agatcatgac tagcaagacc 1200
gatgtcagct cctctgtgat tacttctctg ggggccatcg tgagttgcta cggaaagaca 1260
aaatgtactg ccagcaacaa aaatcgcggc atcattaaga ccttctccaa cgggtgcgac 1320
tatgtctcta acaagggcgt ggatacagtg agtgtcggga acactctgta ctatgtcaat 1380
aagcaggagg gaaaaagcct gtacgtgaag ggcgaaccca tcattaactt ctatgacccc 1440
ctggtgttcc cttccgacga gtttgatgca tctattagtc aggtgaacga aaaaatcaat 1500
cagagtctgg cctttattcg gaagtcagat gagctgctgc acaacgtgaa tgctggcaaa 1560
tctacaacta acatcatgat caccacaatc atcatcgtga ttatcgtcat tctgctgtca 1620
ctgatcgctg tggggctgct gctgtactgt cgagtgcgga gactgctggt catgattaac 1680
agcacccaca attcccccgt caacgcctac acactggagt ctaggatgcg caatccttat 1740
atggggaaca atagcaactg atag 1764
<210> 135
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 135
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Gln Ile Ile Met Ile Ile Ile Val Cys Ile Leu Ile Ile Ile Ile
530 535 540
Cys Gly Ile Leu Tyr Tyr Leu Tyr Arg Val Arg Arg Leu Leu Val Met
545 550 555 560
Ile Asn Ser Thr His Asn Ser Pro Val Asn Ala Tyr Thr Leu Glu Ser
565 570 575
Arg Met Arg Asn Pro Tyr Met Gly Asn Asn Ser Asn
580 585
<210> 136
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 136
atggaactgc tgatcctgaa agccaacgct attactacta tcctgaccgc cgtgacattt 60
tgcttcgcat ctggacagaa cattactgag gaattctacc agtcaacatg cagcgccgtg 120
tccaaaggat acctgagcgc cctgcggacc ggctggtata catcagtgat tactatcgag 180
ctgtccaaca tcaaggaaaa caaatgtaat gggaccgacg caaaggtgaa actgatcaag 240
caggagctgg ataagtacaa aaatgccgtg acagaactgc agctgctgat gcagtccaca 300
ccagcaacta acaatcgcgc ccggagagag ctgccccggt tcatgaacta taccctgaac 360
aatgctaaga aaaccaatgt gacactgtcc aagaaacgca agaggcgctt cctgggattt 420
ctgctgggcg tggggtctgc catcgctagt ggagtggccg tctgcaaagt cctgcacctg 480
gagggcgaag tgaacaagat caaaagcgcc ctgctgtcca ctaacaaggc agtggtcagt 540
ctgtcaaatg gcgtgtccgt cctgaccttc aaggtgctgg acctgaaaaa ttatattgat 600
aagcagctgc tgcctatcct gaacaaacag agctgctcca tttctaatat cgagacagtg 660
atcgaattcc agcagaagaa caatagactg ctggagatta ccagagagtt cagcgtgaac 720
gccggcgtca ccacacccgt gtccacctac atgctgacaa atagtgagct gctgtcactg 780
attaacgaca tgcctatcac caatgatcag aagaaactga tgtccaacaa tgtgcagatc 840
gtcagacagc agagttactc aatcatgtgc atcattaagg aggaagtcct ggcctacgtg 900
gtccagctgc cactgtatgg cgtgatcgac accccctgct ggaaactgca tacatctcct 960
ctgtgcacta ccaacacaaa ggaaggaagt aatatctgcc tgactcgaac cgaccgggga 1020
tggtactgtg ataacgcagg cagcgtgtcc ttctttccac aggccgagac ctgcaaggtc 1080
cagagcaaca gggtgttctg tgacactatg aatagcctga ccctgccttc cgaagtcaac 1140
ctgtgcaatg tggacatctt taatccaaag tacgattgta agatcatgac tagcaagacc 1200
gatgtcagct cctctgtgat tacttctctg ggggccatcg tgagttgcta cggaaagaca 1260
aaatgtactg ccagcaacaa aaatcgcggc atcattaaga ccttctccaa cgggtgcgac 1320
tatgtctcta acaagggcgt ggatacagtg agtgtcggga acactctgta ctatgtcaat 1380
aagcaggagg gaaaaagcct gtacgtgaag ggcgaaccca tcattaactt ctatgacccc 1440
ctggtgttcc cttccgacga gtttgatgca tctattagtc aggtgaacga aaaaatcaat 1500
cagagtctgg cctttattcg gaagtcagat gagctgctgc acaacgtgaa tgctggcaaa 1560
tctacaacta acatcatgat caccacacag atcattatga tcattatcgt gtgcattctg 1620
attatcatta tctgtggcat cctgtactat ctgtaccgag tgcggagact gctggtcatg 1680
attaacagca cccacaattc ccccgtcaac gcctacacac tggagtctag gatgcgcaat 1740
ccttatatgg ggaacaatag caactgatag 1770
<210> 137
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV F
<400> 137
atggaactgc tgatcctgaa agccaacgct attactacta tcctgaccgc cgtgacattt 60
tgcttcgcat ctggacagaa cattactgag gaattctacc agtcaacatg cagcgccgtg 120
tccaaaggat acctgagcgc cctgcggacc ggctggtata catcagtgat tactatcgag 180
ctgtccaaca tcaaggaaaa caaatgtaat gggaccgacg caaaggtgaa actgatcaag 240
caggagctgg ataagtacaa aaatgccgtg acagaactgc agctgctgat gcagtccaca 300
ccagcaacta acaatcgcgc ccggagagag ctgccccggt tcatgaacta taccctgaac 360
aatgctaaga aaaccaatgt gacactgtcc aagaaacgca agaggcgctt cctgggattt 420
ctgctgggcg tggggtctgc catcgctagt ggagtggccg tctgcaaagt cctgcacctg 480
gagggcgaag tgaacaagat caaaagcgcc ctgctgtcca ctaacaaggc agtggtcagt 540
ctgtcaaatg gcgtgtccgt cctgacctcc aaggtgctgg acctgaaaaa ttatattgat 600
aagcagctgc tgcctatcgt caacaaacag agctgctcca tttctaatat cgagacagtg 660
atcgaattcc agcagaagaa caatagactg ctggagatta ccagagagtt cagcgtgaac 720
gccggcgtca ccacacccgt gtccacctac atgctgacaa atagtgagct gctgtcactg 780
attaacgaca tgcctatcac caatgatcag aagaaactga tgtccaacaa tgtgcagatc 840
gtcagacagc agagttactc aatcatgtgc atcattaagg aggaagtcct ggcctacgtg 900
gtccagctgc cactgtatgg cgtgatcgac accccctgct ggaaactgca tacatctcct 960
ctgtgcacta ccaacacaaa ggaaggaagt aatatctgcc tgactcgaac cgaccgggga 1020
tggtactgtg ataacgcagg cagcgtgtcc ttctttccac aggccgagac ctgcaaggtc 1080
cagagcaaca gggtgttctg tgacactatg aatagcctga ccctgccttc cgaagtcaac 1140
ctgtgcaatg tggacatctt taatccaaag tacgattgta agatcatgac tagcaagacc 1200
gatgtcagct cctctgtgat tacttctctg ggggccatcg tgagttgcta cggaaagaca 1260
aaatgtactg ccagcaacaa aaatcgcggc atcattaaga ccttctccaa cgggtgcgac 1320
tatgtctcta acaagggcgt ggatacagtg agtgtcggga acactctgta ctatgtcaat 1380
aagcaggagg gaaaaagcct gtacgtgaag ggcgaaccca tcattaactt ctatgacccc 1440
ctggtgttcc cttccgacga gtttgatgca tctattagtc aggtgaacga aaaaatcaat 1500
cagagtctgg cctttattcg gaagtcagat gagctgctgc acaacgtgaa tgctggcaaa 1560
tctacaacta acatcatgat caccacaatc accatcatta tcgtgatgat tatcattctg 1620
gtcatcatta acatcacaat cattgtggtc atcattaagt tccaccggat tcagggcaag 1680
gaccagaacg ataaaaatag cgagccctac atcctgacca atagacagtg a 1731
<210> 138
<211> 15
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 138
agggttaaag taata 15
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 139
taaatacgcg tcccgggaac a 21
<210> 140
<211> 38
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 140
aaagtaagaa aaacttaggg tgaatgcgta cgacgcgt 38
<210> 141
<211> 14
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 141
agggtgaatg acaa 14
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 142
cagggcgcgc ccccgggaac a 21
<210> 143
<211> 44
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 143
aatcaagtaa gaaaaactta gggtgaatgg cgtacgggcg cgcc 44
<210> 144
<211> 42
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 144
gcggccgccc gggaagtaag aaaaacttag ggtgaatgaa ca 42
<210> 145
<211> 31
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 145
cgtacggcgg ccgcaaaaca attaagaaaa a 31
<210> 146
<211> 15
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 146
acgcgtgccg ccacc 15
<210> 147
<211> 37
<212> DNA
<213> 人副流感病毒1
<400> 147
aaaagtaaga aaaacttagg gtgaatgacg cgtaatg 37
<210> 148
<211> 64
<212> DNA
<213> 人副流感病毒3
<400> 148
cttaggatta aagacattga ctagaaggtc aagaaaaggg aactctataa tttcaaaaat 60
gttg 64
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人副流感病毒3
<400> 149
gcttagcgcc gccaccatgg 20
<210> 150
<211> 49
<212> DNA
<213> 人副流感病毒3
<400> 150
tgatagataa taaataagaa aaacttagga ttaaagaagc ttagcaatg 49
Claims (47)
1.一种重组副粘病毒，其包含：
包含编码I型膜蛋白的异源基因的病毒基因组，该I型膜蛋白包含与副粘病毒的F蛋白的胞质尾(CT)，或跨膜域(TM)和CT连接的重组呼吸道合胞病毒RSV F外域；且
其中该重组副粘病毒是重组人/牛副流感病毒3(B/HPIV3)，重组人副流感病毒1(HPIV1)，重组人副流感病毒2(HPIV2)，重组人副流感病毒3(HPIV3)，或重组牛副流感病毒3(BPIV3)。
2.权利要求1的重组副粘病毒，其包含与副粘病毒的F蛋白的TM和CT连接的RSV F外域。
3.权利要求1的重组副粘病毒，其包含与副粘病毒的F蛋白的CT连接的RSV F外域，其中该RSV F外域是经RSV F跨膜域与副粘病毒的F蛋白的CT连接的。
4.权利要求1-3任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域来自人A亚型RSV或人B亚型RSV。
5.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域通过与天然RSV F蛋白序列相比的一处或多处氨基酸替代而稳定化于RSV F融合前构象。
6.权利要求5的重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含下列氨基酸：
(a)66E；
(b)101P；
(c)155C和290C；
(d)190F；
(e)207L；或
(f)(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)，(d)，和(e)；(a)，(c)，(d)，和(e)；(a)，(b)，和(c)；(a)，(b)，和(d)；(a)，(b)，和(e)；(a)，(b)，(e)，和(d)；(a)，(b)，(c)，(d)，和(e)；(c)和(d)；或(c)和(e)；或(c)，(d)，和(e)的组合，其中氨基酸编号方式对应于SEQID NO：1所列RSV F蛋白序列。
7.权利要求6的重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含下列氨基酸替代：
(a)K66E；
(b)Q101P；
(c)S155C和S290C；
(d)S190F；
(e)V207L；或
(f)(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)，(d)，和(e)；(a)，(c)，(d)，和(e)；(a)，(b)，和(c)；(a)，(b)，和(d)；(a)，(b)，和(e)；(a)，(b)，(e)，和(d)；(a)，(b)，(c)，(d)，和(e)；(c)和(d)；或(c)和(e)；或(c)，(d)，和(e)的组合。
8.权利要求6或权利要求7的重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L。
9.权利要求1-5任一项重组副粘病毒，其中该RSV F外域包含SEQ ID NO：1(WT RSV FA)，2(WT RSV F B)，12(A2HEK)，14(A2HEK DS)，或21(A2HEK DS-Cav1)之一，或与SEQ IDNO：1，2，12，14，或21之一的RSV外域至少90％同一的氨基酸序列的RSV外域或由其组成。
10.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其包含：
(a)重组HPIV1，其中RSV F外域是与HPIV1F蛋白的CT连接的；
(b)重组HPIV2，其中RSV F外域是与HPIV2F蛋白的CT连接的；
(c)重组HPIV3，其中RSV F外域是与HPIV3F蛋白的CT连接的；
(d)重组HPIV3，其中RSV F外域是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
(e)重组BPIV3，其中RSV F外域是与HPIV3F蛋白的CT连接的；
(f)重组BPIV3，其中RSV F外域是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
(h)重组B/HPIV3，其中RSV F外域是与HPIV3F蛋白的CT连接的；或
(g)重组B/HPIV3，其中RSV F外域是与BPIV3F蛋白的CT连接的。
11.权利要求10的重组副粘病毒，其包含：
(a)，且其中与RSV F外域连接的HPIV1F蛋白的CT包含SEQ ID NO：31残基24-59所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：31残基24-59至少90％同一的氨基酸序列；
(b)，且其中与RSV F外域连接的HPIV2F蛋白的CT包含SEQ ID NO：39残基29-66所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：39残基29-66至少90％同一的氨基酸序列；
(c)，且其中与RSV F外域连接的HPIV3F蛋白的CT包含SEQ ID NO：46残基24-46所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46残基24-46至少90％同一的氨基酸序列；
(d)，且其中与RSV F外域连接的BPIV3F蛋白的CT包含SEQ ID NO：53残基22-57所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：53残基22-57至少90％同一的氨基酸序列；
(e)，且其中与RSV F外域连接的HPIV3F蛋白的CT包含SEQ ID NO：46残基24-46所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46残基24-46至少90％同一的氨基酸序列；
(f)，且其中与RSV F外域连接的BPIV3F蛋白的CT包含SEQ ID NO：53残基22-57所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：53残基22-57至少90％同一的氨基酸序列；
(g)，且其中与RSV F外域连接的HPIV3F蛋白的CT包含SEQ ID NO：46残基24-46所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46残基24-46至少90％同一的氨基酸序列；或
(h)，且其中与RSV F外域连接的BPIV3F蛋白的CT包含SEQ ID NO：53残基22-57所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：53残基22-57至少90％同一的氨基酸序列。
12.权利要求10的重组副粘病毒，其包含：
(a)，且其中与HPIV1F CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：133所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(c)，且其中与HPIV3F CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：8所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(d)，且其中与BPIV3F CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：16所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(e)，且其中与HPIV3F CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：8所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(f)，且其中与BPIV3F CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：16所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(g)，且其中与HPIV3F CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：8所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；或
(h)，且其中与BPIV3F CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：16所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列。
13.权利要求1-9任一项重组副粘病毒，其包含：
(a)重组HPIV1，其中RSV F外域是与HPIV1F蛋白的TM和CT连接的；
(b)重组HPIV2，其中RSV F外域是与HPIV2F蛋白的TM和CT连接的；
(c)重组HPIV3，其中RSV F外域是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
(d)重组HPIV3，其中RSV F外域是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
(e)重组BPIV3，其中RSV F外域是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
(f)重组BPIV3，其中RSV F外域是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
(g)重组B/HPIV3，其中RSV F外域是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；或
(h)重组B/HPIV3，其中RSV F外域是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。
14.权利要求13的重组副粘病毒，其包含：
(a)，且其中与RSV F外域连接的HPIV1F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：31所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：31至少90％同一的氨基酸序列；
(b)，且其中与RSV F外域连接的HPIV2F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：39所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：39至少90％同一的氨基酸序列；
(c)，且其中与RSV F外域连接的HPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：46所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46至少90％同一的氨基酸序列；
(d)，且其中与RSV F外域连接的BPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：53所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：53至少90％同一的氨基酸序列；
(e)，且其中与RSV F外域连接的HPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：46所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46至少90％同一的氨基酸序列；
(f)，且其中与RSV F外域连接的BPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：53所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：53至少90％同一的氨基酸序列；
(g)，且其中与RSV F外域连接的HPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：46所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46至少90％同一的氨基酸序列；或
(h)，且其中与RSV F外域连接的BPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQ ID NO：53所列氨基酸序列，或与SEQ ID NO：53至少90％同一的氨基酸序列。
15.权利要求13的重组副粘病毒，其包含：
(a)，且其中与HPIV1F TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：135所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(c)，且其中与HPIV3F TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：10所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(d)，且其中与BPIV3F TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：21所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列。
(e)，且其中与HPIV3F TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：10所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(f)，且其中与BPIV3F TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：21所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；
(g)，且其中与HPIV3F TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：10所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列；或
(h)，且其中与BPIV3F TM和CT连接的RSV F外域包含SEQ ID NO：21所列氨基酸序列，或与其至少90％同一的氨基酸序列。
16.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其包含：
重组HPIV1，其中病毒基因组包含编码HPIV1N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSV F外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV1F蛋白；
重组HPIV2，其中病毒基因组包含编码HPIV2N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSV F外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV2F蛋白；
重组HPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSV F外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV3F蛋白；
重组HPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSV F外域连接的CT，或TM和CT来自BPIV3F蛋白；
重组BPIV3，其中病毒基因组包含编码BPIV3N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的基因，且与RSV F外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV3F蛋白；
重组BPIV3，其中病毒基因组包含编码BPIV3N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的基因，且与RSV F外域连接的CT，或TM和CT来自BPIV3F蛋白；
重组B/HPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，V，M，和L蛋白的基因，且与RSV F外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV3 F蛋白；或
重组B/HPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，V，M，和L蛋白的基因，且其中与RSV F外域连接的TM和CT来自BPIV3 F蛋白。
17.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该编码重组RSV F外域的异源基因是病毒基因组的基因组启动子下游的第一或第二基因。
18.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中该病毒基因组包含编码副流感病毒F蛋白的基因，特别是其中该副流感病毒F蛋白是重组副粘病毒的F蛋白。
19.权利要求16-18任一项重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒包含
重组HPIV1，其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是编码HPIV1N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；
重组HPIV2，其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV2基因组启动子，接着是编码HPIV2N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；
重组HPIV3，其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是编码HPIV3N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；
重组BPIV3，其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是编码BPIV3N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；或
重组B/HPIV3，其中毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是编码BPIV3N，P，和M蛋白，HPIV3F和HN蛋白，和BPIV3L蛋白的基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间。
20.权利要求16-19任一项重组副粘病毒，其包含重组B/HPIV3，其中HPIV3F和HN基因和BPIV3N，P，M，和L蛋白分别包含SEQ ID NO：43，101，47，48，49，52所列氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：43，101，47，48，49，52至少90％同一的序列。
21.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其包含重组B/HPIV3或重组HPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3HN蛋白的基因，且其中该HPIV3 HN蛋白分别在残基263和307处包含苏氨酸和脯氨酸。
22.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中该编码RSV F外域的异源基因为了人细胞中的表达而密码子优化的。
23.权利要求22的重组副粘病毒，其包含：
重组HPIV3，其中该异源基因包含SEQ ID NO：11(GS RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)所列核苷酸序列；
重组B/HPIV3，其中该异源基因包含SEQ ID NO：11(GS RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)所列核苷酸序列；或
重组B/HPIV3，其中该异源基因包含SEQ ID NO：22(GA RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)或SEQ ID NO：23(GS RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)所列核苷酸序列；
重组B/HPIV3，其中该异源基因包含SEQ ID NO：20(GA RSV F_HEK_DS_B3TMCT)或SEQID NO：137(GS RSV F_HEK_DS_B3TMCT)所列核苷酸序列。
24.权利要求1的重组副粘病毒，其包含：
重组HPIV1，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的TM和CT连接的；
重组HPIV1，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的TM和CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组BPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组BPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；
重组HPIV1，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的CT连接的；
重组HPIV1，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV1基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
重组HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
重组BPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
重组BPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的；或
重组B/HPIV3，且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSV F外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSV F外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。
25.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中：
该HPIV1包含CΔ170或LY942A减毒突变；
该HPIV3是HPIV3JS株；
该HPIV3包含HN蛋白中的I263T和T370P替代；或
该B/HPIV3包含HN蛋白中的I263T和T370P替代。
26.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该重组RSV F外域包含RSV F位置1-529；
特别是，其中该重组RSV F外域包含与SEQ ID NO：21残基1-529至少90％同一的氨基酸序列；
特别是，其中该重组RSV F外域包含与SEQ ID NO：21残基1-529至少95％同一的氨基酸序列；和
特别是，其中该重组RSV F外域包含SEQ ID NO：21残基1-529的氨基酸序列。
27.权利要求1的重组副粘病毒，其包含rB/HPIV3-F2-HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT，进一步包含HN蛋白中的I263T和T370P替代。
28.一种重组副粘病毒，其包含
(a)包含异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的跨膜域(TM)和胞质尾(CT)连接的异源病毒的I型跨膜蛋白的外域；或
(b)包含异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的HN蛋白的TM和CT连接的异源病毒的II型跨膜蛋白的外域。
29.权利要求28的重组副粘病毒，其中：
该异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的胞质尾(CT)，或跨膜域(TM)和CT连接的重组呼吸道合胞病毒RSV F外域，且
其中该重组副粘病毒是重组人/牛副流感病毒3(B/HPIV3)，重组人副流感病毒1(HPIV1)，重组人副流感病毒2(HPIV2)，重组人副流感病毒3(HPIV3)，重组牛副流感病毒3(BPIV3)，重组PIV5，重组仙台病毒，或重组新城疫病毒。
30.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中由感染有该重组副粘病毒或病毒载体的宿主细胞生成的病毒颗粒至少90％包含包含由该异源基因编码的外域的病毒包膜。
31.在先权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒是感染性，减毒，和自我复制性病毒。
32.在先权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该RSV F外域是存在于副粘病毒的病毒包膜上。
33.一种免疫原性组合物，其包含在前权利要求任一项重组副粘病毒和药学可接受载剂。
34.权利要求33的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
35.一种在受试者中引发针对RSV F蛋白的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的权利要求33或权利要求34的免疫原性组合物。
36.一种在受试者中引发针对呼吸道合胞病毒和副流感病毒的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的权利要求33或权利要求34的免疫原性组合物。
37.权利要求35或权利要求36的方法，其中该免疫应答是保护性免疫应答。
38.权利要求35-37任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的初始-加强施用。
39.权利要求35-38任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的鼻内或胃肠外施用。
40.权利要求35-39任一项的方法，其中该受试者是人或兽医受试者。
41.权利要求35-40任一项的方法，其中该受试者具有RSV或PIV感染或处于其风险。
42.权利要求35-41任一项的方法，其中该受试者小于1岁龄。
43.权利要求35-41任一项的方法，其中该受试者是免疫受损的或是年老的。
44.一种核酸分子，其包含权利要求1-32任一项的重组副粘病毒的基因组。
45.一种重组RSV F外域，其包含K66E和Q101P氨基酸替代，且任选进一步包含(a)-(d)之一：
(a)S155C和S290C；
(b)S190F；
(c)V207L；或
(d)(a)和(b)；(a)和(c)；(b)和(c)；或(a)，(b)，和(c)的组合。
46.一种核酸分子，其编码权利要求44的重组RSV F外域。
47.权利要求1-32任一项的重组副粘病毒在受试者中引发针对RSV，或RSV和PIV的免疫应答的用途。
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