CN107400707A - 多重扩增循环检测 - Google Patents

Abstract

提供了用于将多个样品孔同时扩增预定量的扩增、检测第一组孔中是否发生扩增、扩增额外量的扩增和检测第二组孔中是否发生扩增的方法和装置。还提供了用于使用多个扩增循环中所产生的熔解曲线分析靶核酸序列的方法。

Description

多重扩增循环检测

本申请是申请日为2013年9月9日，申请号为201380064847.7 (PCT/US2013/058752)，发明名称为“多重扩增循环检测”的发明专利申请的分案申请。

政府利益

本发明在国立卫生研究院授予的批准号1U01 AI082184下由政府支持完成。政府对本发明具有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月10日提交的标题为“多重扩增循环检测”的美国临时专利申请号61/699,103的权益和优先权，其整体通过引用结合到本文中。

发明背景

在美国、加拿大和西欧，传染病占人类死亡率的约7%，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的超过40%。传染病导致多种临床表现。常见的明显表现为发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和含血腹泻。尽管身体表现提示一些病原体为病原并排除其它，仍剩余多种可能的病原体，清楚的诊断常常需要进行多个测定。用于诊断病原体的传统微生物学技术可耗费数日或数周，常常延误适当的疗程。

近年来，聚合酶链反应(PCR)已经成为快速诊断传染原的方法选择。PCR可为诊断传染病的快速、灵敏和特异工具。使用PCR作为主要诊断方法的挑战为可能致病微生物的多样性和一些病理标本中所存在的生物的水平低。运行大量PCR测定板(针对每种可能的致病微生物为一个，其中多数预期为阴性)常常是不实际的。当病原体核酸处于低浓度以及需要大量样品以收集足够的反应模板时该问题恶化。在一些情况下，样品不足以测定所有可能的病原。一种解决方案为运行“多重PCR”，其中样品在单个反应中同时测定多个靶标。尽管已经证明多重PCR在一些系统中有价值，但关于高水平多重反应的健壮性和难以清楚分析多个产物存在缺陷。为了解决这些问题，可随后将测定分为多个二级PCR。将二级反应嵌套在初级产物内常常增加健壮性。然而，此进一步的操作可能很昂贵并且可导致污染或其它问题。

FilmArray^® (BioFire Diagnostics, Inc., Salt Lake City, UT)是为诊断市场开发的用户友好的、高度多重PCR系统。该单个样品仪器接受整合样品制备和嵌套多重PCR的诊断“袋”。整合的样品制备提供易用性，而高度多重PCR提供PCR灵敏性和同时检验多达30种不同生物的能力。该系统非常适合其中数种不同的病原体均表现出相似临床症状的病原体鉴定。当前可得的诊断板包括用于上呼吸道感染的呼吸板和用于血流感染的血液培养板。其它板处于开发中。

FilmArray板，以及与其它仪器一起使用的板中所靶向的许多生物通常在环境中存在。尽管这样的环境污染倾向于以显著低于临床相关样品的浓度存在，但可能难以区分环境污染和临床感染。同样，某些个体具有通过染色体整合的潜伏病毒感染，其中染色体整合的病毒DNA可能引起或可能不引起临床症状。具有用于测定阳性结果由临床相关感染还是由另一种核酸源引起的方法将是合乎需要的。

发明摘要

本公开内容涉及用于同时扩增若干靶标的方法，同时区分临床相关扩增和从其它源例如从背景污染、扩增反应的交叉反应性或染色体整合的扩增。

在本发明的一个方面，公开了用于鉴定样品中存在多个靶核酸中的哪些的方法和装置。所公开的方法包括提供多个样品孔(每个样品孔拥有用于扩增来自多个靶核酸序列中的不同序列的基因座的引物)、向多个样品孔中的每一个内提供部分样品、同时使多个样品孔经受扩增条件经历若干扩增循环、检测第一组多个样品孔的每个中是否发生扩增、使多个样品孔同时经受扩增条件经历若干额外扩增循环、检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增和通过鉴定其中发生扩增的相应孔鉴定样品中存在的靶核酸。

在另一个说明性的实施方案中，提供了方法区分样品中染色体整合和临床-相关感染，说明性地包括提供具有样品和用于从样品扩增靶核酸序列的引物的样品孔、使样品孔经受扩增条件经历若干扩增循环、检测样品孔中是否发生扩增、使样品孔经受扩增条件经历若干额外扩增循环和检测样品孔中是否发生扩增。在某些说明性实例中，第一个检测步骤中的阳性判定可指示染色体整合，第一个检测步骤中的阴性判定与第二个检测步骤中的阳性判定可指示临床-相关感染。

在又一个说明性实施方案中，提供了用于分析样品中靶核酸的方法，包括

(a) 提供其中包含样品和用于扩增靶核酸的引物的样品孔，

(b) 使样品孔经受扩增条件经历至少一个扩增循环，

(c) 产生所扩增靶核酸的熔解曲线，和

(d) 重复步骤(b)和(c)。

这些方法可进一步包括测定熔解曲线的值，和通过鉴定熔解曲线的值超过预定值的扩增循环测定Cp。在说明性的实例中，该值可通过熔解曲线负导数的峰高或峰面积测定。

在又一个实例中，提供了用于分析样品中靶核酸的方法，包括

(a) 提供包含样品、用于扩增靶核酸的引物、对照核酸、用于扩增对照核酸的引物和dsDNA结合染料的样品孔，

(b) 使样品孔经受扩增条件经历多个扩增循环，

(c) 产生所扩增靶核酸和所扩增对照核酸的熔解曲线，

(d) 测定所扩增靶核酸的值，和

(e) 重复步骤(b)、(c)和(d)。

这样的说明性方法还可包括使用步骤(d)中测定的值产生靶核酸的校准扩增曲线和绘制校准扩增曲线或测定两种核酸之间的相对浓度的步骤。

本文中还提供反应容器和装置。本发明其它特征将会在考虑下列例示目前所认为的实施本发明的最佳模式的优选实施方案的详述后对本领域技术人员显而易见。

附图简述

图1显示本公开内容的一个实施方案中所使用的说明性的袋。

图2A-B显示三个不同循环后鲍曼不动杆菌(A. baumannii)的扩增和熔解曲线。图2A显示假阳性数据，图2B显示真阳性数据。

图3A-B显示三个不同循环后热带念珠菌(C. tropicalis)的扩增和熔解曲线。图3A显示阴性样品数据，图3B显示阳性样品数据。

图4A-B显示三个不同循环后金黄色葡萄球菌(S. aureus)的扩增和熔解曲线。图4A显示阴性样品数据，图4B显示阳性样品数据。

图5显示用于检测低负载样品的说明性循环方案。

图6显示说明性的扩增曲线和截止荧光阈值。

图7显示典型的两步PCR方案期间可收集的说明性的温度数据。变性/退火段期间，温度从基线值上升至最大值，随后温度降回基线。延伸段期间，温度保持恒定。

图8显示图7的两步PCR方案期间可收集的荧光数据的说明性的连续监测。

图9显示两个典型两步PCR方案循环后可收集的荧光数据的说明性的连续监测。变性段期间，由于饱和dsDNA-结合染料从dsDNA释放，荧光数据降低，与典型的熔解曲线相似。延伸段期间，由于引物ssDNA片段引发并延伸为dsDNA片段，荧光数据上升。

图10显示若干个PCR循环变性段期间可收集的说明性的荧光数据的叠加。

图11显示若干个PCR循环变性段期间所收集的说明性的荧光数据的负一阶导数的叠加。

图12显示包含对照核酸和未知浓度靶核酸的多重PCR反应的典型扩增曲线。

图13显示包含对照核酸和靶核酸的多重PCR反应的几个循环的变性段期间可收集的荧光数据的说明性的负一阶导数的叠加。

图14显示说明性的调整后的图13对照和样品核酸的实时PCR曲线。对通过在对照窗口连续监测PCR反应所产生熔解曲线的负一阶导数进行积分，产生调整的对照核酸扩增曲线(实线)。对通过在靶窗口连续监测PCR反应所产生熔解曲线的负一阶导数进行积分，产生调整的靶核酸扩增曲线(虚线)。

图15例示了依照本公开内容的方面的热循环系统的示例性实施方案的方框图。

发明详述

如本文所使用的，术语“a”、“an”和“the”定义为指一个或多个，并且包括复数，除非上下文不合适。范围在本文中可表述为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。术语“约”在本文中用于指近似、在其区域内、大致或大约。当术语“约”与数字范围结合使用时，其通过扩展所列数字值上面和下面的界限修饰该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于修饰数值在所述值上和下达5%的差异。当表述这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至其它特定值。相似地，当值通过使用先词“约”表述为近似值时，将理解为该特定值形成另一个实施方案。将进一步理解的是，每个范围的端点相对于其它端点均显著，并且独立于其它端点。

如本文所使用的词语“或”意指特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表中成员的任何组合。

“样品”意指如本文所述进行测定的动物；动物的组织或器官；细胞(受试者体内、直接从受试者获取或维持培养的细胞或来自培养的细胞系的细胞)；细胞裂解物(或裂解物级分)或细胞提取物；包含源自细胞、细胞物质或病毒物质的一种或多种分子(例如多肽或核酸)的溶液；或包含非-天然存在的核酸的溶液。样品还可为包含细胞、细胞组分或核酸的任何体液或排泄物(例如，但不限于，血液、尿液、粪便、唾液、眼泪、胆汁、脑脊液)。

如本文所使用的短语“核酸”指能够与互补核酸通过Watson-Crick碱基-配对杂交的天然存在或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论DNA或RNA或DNA-RNA杂合物、单链或双链、有义或反义。本发明核酸还可包括核苷酸类似物(例如，BrdU)和非-磷酸二酯核苷酸间连接(例如，肽核酸(PNA)或硫二酯连接)。特别地，核酸可包括，但不限于，DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。

“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指可与包含互补序列的第二个DNA或RNA分子(“靶”)碱基-配对的定义序列的单链DNA或RNA分子。所得杂合物的稳定性取决于长度、GC含量和发生碱基配对的程度。碱基-配对的程度受参数例如探针与靶分子之间的互补性程度和杂交条件的严格性程度影响。杂交严格程度受参数例如温度、盐浓度和有机分子例如甲酰胺的浓度影响，通过本领域技术人员所已知的方法确定。探针、引物和寡核苷酸可通过本领域技术人员所熟知的方法放射性、荧光或非-放射性地可检测-标记。dsDNA结合染料可用于检测dsDNA。应理解的是“引物”特别地配置为通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以或可以不被如此配置。

“dsDNA结合染料”意指与单链DNA结合或在溶液中游离时相比，与双链DNA结合时所发出荧光不同的染料，通常发出荧光更强。当提及dsDNA结合染料时，应理解为本文中可使用任何合适的染料，一些非-限制性的说明性的染料在美国专利号7,387,887中描述，该专利通过引用结合到本文中。本领域已知其它可用于检测核酸扩增和熔解的信号产生物质，例如酶、抗体等。

“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高度严格的条件下识别基本上互补的核酸(例如，样品核酸)并与之物理上相互作用(即，碱基-配对)，并且基本上不与其它核酸碱基配对。

“高度严格的条件”意指允许杂交与使用至少40个核苷酸长的DNA探针在包含0.5M NaHPO4 pH 7.2、7% SDS、1 mM EDTA和1% BSA (Fraction V)的缓冲液中于温度65℃下或在包含48%甲酰胺、4.8X SSC、0.2 M Tris-Cl pH 7.6、1X Denhardt’s溶液、10%硫酸葡聚糖和0.1% SDS的缓冲液中于温度42℃下所获的杂交相当的条件。其它用于高度严格杂交例如用于PCR、Northern、Southern或原位杂交、DNA测序等的条件为分子生物学领域的技术人员所熟知。

当PCR为本文实施例中所使用的扩增方法时，应理解为任何使用引物的扩增方法均可为合适的。此种合适的程序包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、级联滚环扩增(CRCA)、环介导的DNA等温扩增(LAMP)、等温和嵌合引物-起始的核酸扩增(ICAN)、基于靶的解旋酶依赖性扩增(HDA)、转录介导的扩增(TMA)等。因此，当使用术语PCR时，应理解为包括其它可选的扩增方法。对于无不连续循环的扩增方法，可使用在循环或Cp中进行测量的反应时间，并且在本文所述实施方案中加入额外的PCR循环时可加入额外的反应时间。应理解的是方案可能需要相应调整。

新出现的技术，例如多重PCR或MALDI-TOF，能够迅速检测影响人类健康的许多细菌和病毒病原体。通过同时筛查多种病原体，这些技术通过减少诊断所需的实验室检验次数节约了时间和金钱。迅速、广谱而特异性的检测的一个难题是并非所有的病原体以相同的滴度存在。例如，在阳性血液培养物中革兰氏阴性细菌通常生长至较高的滴度，而酵母菌生长较缓慢，并且生长至较低滴度。潜在的检测背景环境生物使此问题进一步复杂。空气、土壤、灰尘和人类均为细菌生物携带者。此外，检验试剂盒本身可包含痕量核酸，即使该检验试剂盒及其内含物已经灭菌。同样，培养生物的生长培养基常常包含无活性生物，其不影响培养，但可产生PCR假阳性。若将系统均匀地设计为增加灵敏度以检测低滴度病原体，可能会从背景生物中产生频繁的假阳性。或者，若降低系统灵敏度以避免检测背景生物，可能会错过低滴度生物，导致假阴性检测。两步多重PCR方案使得能够检测宽范围的滴度，但此宽范围检测可能使其难以区分真阳性和少数环境污染物。通过逐一调整每个测定检测前进行的PCR循环数目，在与较高滴度靶生物相同的多重PCR反应中可容易地检测低滴度靶标，同时使来自背景污染物、交叉-反应性(在高度多重反应中可能成为问题)和其它无关扩增的假阳性判定最小化。

本文所公开的各个实施方案使用自含的核酸分析袋说明性地在单一的封闭系统中测定样品中各种生物物质(说明性地，抗原和核酸序列)的存在情况。这样的系统，包括袋和与袋一起使用的仪器，在美国专利号8,394,608、美国专利申请号2010-0056383和WO2013/074391中更详细地公开，所述专利通过引用结合到本文中。然而，应理解的是这样的袋仅为说明性的，本文所讨论的多重PCR反应可在本领域已知的多种开放或封闭系统样品容器，包括96-孔板、其它配置的板、阵列、圆盘传送带等的任一中使用本领域所知的多种扩增系统进行。当本文中使用术语“样品孔”时，该术语意指包括孔、管和各种其它反应容器，如在这些扩增系统中所使用的。在一个实施方案中，袋用于测定多种病原体。用作说明地，各个步骤可在任选一次性的袋中进行，包括核酸制备、初级大体积多重PCR、初级扩增产物的稀释和次级PCR，最后为任选的实时检测或扩增后分析例如熔解曲线分析。此外，应理解的是尽管各个步骤可在本发明袋中进行，但对于某些用途可省略一个或多个步骤，并且袋的配置可相应改变。

图1显示当前发明使用的说明性的袋510。袋510与美国专利申请号2010-0056383(已经通过引用结合)的图15相似，相似的项目编号相同。配件590拥有入口通道515a至515l，其还用作试剂槽。说明性地，试剂可在配件590中冷冻干燥并在使用前再水化。泡(Blister)522、544、546、548、564和566，以及其各自的通道538、543、552、553、562和565，与美国专利申请号2010-0056383的图15的相同编号的泡相似。图1的第二阶段反应区580与美国专利申请号2010-0056383相似，但高密度阵列581的第二阶段孔582以稍微不同的模式排列。图1的高密度阵列581的更圆的模式消除了转角，可导致第二阶段孔582更均匀填充。如图所示，高密度阵列581拥有102个第二阶段孔582。袋510适合在FilmArray仪器中使用。然而，应理解的是该袋的实施方案仅为说明性的。

袋510可以以与美国专利申请号2010-0056383中所述相似的方式使用。将包含待检验样品(100 μl)和裂解缓冲液(200 μl)的300 μl混合物注入配件590中入口通道515a附近的注射口(未示出)，样品混合物被吸入入口通道515a中。同样将水注入配件590临近入口通道515l的第二个注射口(未示出)，经由配件590中提供的通道(未示出)分布，从而使十一种不同的试剂吸水，其中每种试剂预先以干燥形式在入口通道515b至515l处提供。这些试剂说明性地可包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA提取试剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其它化学实体。说明性地，试剂用于核酸提取、第一阶段多重PCR、多重反应的稀释和第二阶段PCR试剂的制备，以及对照反应。在图1所示的实施方案中，所有需要被注入的为一个注射口的样品溶液和另一个注射口的水。注入后，可将两个注射口密封。关于袋510和配件590不同配置的更多信息，参见美国专利申请号2010-0056383，该专利已经通过引用结合。

注入后，样品从注射通道515a经由通道514移动至裂解泡522。裂解泡522拥有陶瓷珠，并且配置为使用FilmArray仪器内提供的回转叶片或桨经由撞击来涡旋。一旦细胞被充分裂解，样品通过通道538、泡544和通道543移动至泡546，样品在该处与核酸-结合的磁珠混合。让混合物孵育适当长的时间，说明性地，约10秒至10分钟。位于FilmArray仪器内临近泡546的可缩回磁体从溶液中捕获磁珠，在泡546内部表面形成沉淀。然后将液体移出泡546，通过泡544回到泡522，该泡现在用作废物容器。注射通道515c-515e的一个或多个的一种或多种洗涤缓冲液经由泡544和通道543提供至泡546。任选地，缩回磁体，通过从泡544和546经由通道543来回移动小珠洗涤磁珠。磁珠一经洗涤后，通过激活磁体将其重新捕获入泡546，然后将洗涤溶液移至泡522。该过程可按需要重复，以从核酸-结合的磁珠上洗涤裂解缓冲液和样品碎片。

洗涤后，将存储在注射通道515f的洗脱缓冲液移至泡548，并缩回磁体。使该溶液经由通道552在泡546和548之间循环，打碎泡546内的磁珠沉淀，使捕获的核酸从小珠解离并进入溶液中。再次激活磁体，捕获泡546中的磁珠，洗脱的核酸溶液移至泡548中。

来自注射通道515g的第一阶段PCR预混液在泡548中与核酸样品混合。任选地，通过在548和564之间经由通道553驱使混合物将其混合。若干个混合循环后，将溶液装在泡564中，并进行第一阶段多重PCR，泡564中提供了第一阶段PCR引物颗粒，每种靶生物至少一组引物。若存在RNA靶标，可在第一阶段多重PCR之前或与其同时进行RT步骤。FilmArray仪器中第一阶段多重PCR的温度循环说明性地进行15-20个循环，然而其它水平的扩增可能为合乎需要的，取决于具体应用的需求。

第一阶段PCR进行期需数目的循环后，样品可说明性地通过驱使大部分样品回到泡548，仅剩余小量留在泡564中并从注射通道515i加入第二阶段PCR预混液进行稀释。或者，可将稀释缓冲液从515i移至泡566，然后通过使液体在泡564和566之间来回移动与泡564中的扩增样品混合。若需要，可使用注射通道515j和515k的稀释缓冲液重复稀释若干次，然后将第二阶段PCR预混液从注射通道515h加入一些或所有稀释的扩增样品中。应理解的是，可通过改变稀释步骤数目或通过改变与稀释缓冲液或第二阶段PCR预混液混合前丢弃的样品百分比调整稀释水平，第二阶段PCR预混液包含用于扩增的组分，说明性地，聚合酶、dNTP和合适的缓冲液，然而其它组分可为合适的，特别是对于非-PCR扩增方法。若需要，可将样品与第二阶段PCR预混液的混合物在泡564中预热，然后移至第二阶段孔582进行第二阶段扩增。该预热可避免第二阶段PCR混合物中对热启动组分(抗体、化学品或其它)的需要。

说明性的第二阶段PCR预混液是不完全的，缺少引物对，102个第二阶段孔582的每个中均预先载有特异性PCR引物对。若需要，第二阶段PCR预混液可缺少其它反应组分，这些组分也可预装在第二阶段孔582中。每个引物对可与第一阶段PCR引物对相似或相同，或可嵌套在第一阶段引物对中。样品从泡564移至第二阶段孔582使PCR反应混合物完整。一旦高密度阵列581被装满，各个第二阶段反应通过本领域已知的任何手段被密封于其各自的第二阶段泡中。说明性的填充和密封高密度阵列581而无交叉污染的方式在美国专利申请号2010-0056383中讨论。说明性地，高密度阵列581的孔582中的各个反应说明性地用一个或多个peltier装置同时进行热循环，然而本领域也已知其它用于热循环的手段。

说明性的第二阶段PCR预混液包含dsDNA结合染料LCGreen® Plus以产生指示扩增的信号。然而，应理解的是该染料仅为说明性的，并且可使用其它信号，包括本领域已知的其它dsDNA结合染料和荧光、放射性、化学发光法、酶等标记的探针。

说明性的FilmArray仪器程序设计为基于PCR后熔解进行每个第二阶段反应的阳性或阴性判定。对于阳性判定，熔解曲线必须在预定义的温度范围内产生熔解峰(一阶导数极大值或负一阶导数极大值)。应理解的是该判定每个第二阶段反应的方法仅为说明性的，可使用实时扩增数据或通过本领域已知的其它方法进行判定。

实施例1

FilmArray血液培养鉴定(BCID)系统设计为提供直接从血液培养物迅速鉴定宽范围的微生物病原体。说明性的BCID板检测从阳性需氧血液培养物(PABC)分离的最常见的细菌和酵母，以及选择抗生素抗性基因，灵敏度≥ 95%。市售的BCID板可从BioFire Diagnostics,Inc.获得。本实施例使用FilmArray BCID板的研究版本说明区分真阳性和环境污染的方法。

检验了多种不同的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及假丝酵母分离物的测定反应性。通过将微生物掺加入人全血和BD BACTEC Aerobic Plus/F血液培养基的混合物中制备模拟的PABC样品。微生物以与最近BD BACTEC 9050系统指示为生长“阳性”(10³-10⁸ CFU/mL)的血液培养瓶中所观察到的相一致的浓度掺入(Becton Dickinson, Franklin Lakes,NJ)。专有样品以在血液培养仪中保持过夜(阳性信号开始后约8小时)的血液培养瓶中所期望的微生物浓度(酵母10⁸ CFU/mL和细菌10¹⁰ CFU/mL)制备。将样品装载入FilmArray BCID袋并在FilmArray仪器中处理。核酸提取、纯化、扩增和结果分析使用FilmArray系统自动化，总处理时间约1小时。

在FilmArray BCID袋中检验来自三个不同位点的儿童和成人的PABC样品。将FilmArray结果与常规血液培养和敏感性检验进行比较。将各个PABC的250 μl等分试样与500 μl裂解缓冲液混合，每个指令将300 μl的该混合物装入一个袋中并检验革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和抗生素抗性基因。

在FilmArray仪器内，样品制备后，将第一阶段多重PCR混合物在泡564中从60℃25秒至96℃ 4秒热循环20个循环。第一阶段PCR完成后，将混合物稀释并转移至每个第二阶段孔582中。第二阶段PCR反应经受63℃ 19秒至94℃ 0秒，经历额外的32个循环。该说明性实施例中熔解在每个第二阶段反应孔582的20、26和32循环后进行，以产生熔解曲线，若熔解曲线在每个第二阶段测定所预定义的温度范围内显示熔解峰(熔解曲线的负一阶导数)，则每孔判定为阳性。应指出的是其它循环可用于熔解分析，20、26和32循环仅为说明性的，每个测定可具有其自己预定义的温度范围，与期需扩增子的Tm有关。预定义的温度范围用以排除非特异性扩增产物例如引物二聚体，其常常将具有显著不同的Tm。对于具有靶序列变异性的生物，具有较广泛预定义范围可为合乎需要的，这是因为序列变异性可导致Tm轻微不同。对于具有高度保守靶序列的生物，具有较窄的预定义温度范围可为合乎需要的，从而排除多数非特异性和交叉反应性扩增。

图2A-B显示鲍曼不动杆菌检验的说明性扩增和熔解结果。图2A显示可导致假阳性判定的污染物的结果，而图2B显示血液培养后运行的真阳性结果，如上文所讨论的。应指出的是每个测定在说明性BCID板的高密度阵列581中一式三份运行，对于该系统，判定生物阳性，三个孔582中的两个必须显示阳性结果。在图2A中，在三个重复的两个中，扩增曲线显示29.2的交叉点(“Cp”)。因此，在循环29前，说明性地在循环20或26时作出的判定将为阴性的，但在循环29后，说明性地在循环32时作出的判定将为阳性。这在熔解中得到证实，使用预定义的温度范围78-83℃，循环20 (熔解1)和26 (熔解2)后无熔解峰，但循环32 (熔解3)后所有三个重复均出现清楚的熔解峰。使用扩增曲线或熔解峰，以及说明性地20或26个第二阶段扩增循环，该测定完全可被判定为阴性，但如果PCR经过说明性地32个循环，该测定可导致假阳性。在图B中，发现真阳性扩增的更早，每个孔的Cp在7.9和8.0之间，所有三个说明性循环的熔解峰都将被判定为阳性。

从图2A-B，可考虑在不迟于循环26的循环处终止第二阶段扩增。的确，若鲍曼不动杆菌为唯一测定的生物，这样将是一个好策略。然而，说明性地，由于培养时生长较缓慢、PCR效率较低或由于靶序列在阳性血液培养物中拷贝较少，BCID板和其它板中的许多生物扩增得较晚。与可以以显著较高的拷贝数存在的质粒或RNA序列相比，靶序列的较少拷贝可能存在，这是因为生物能够以较少细胞引起阳性血液培养，或因为每个细胞可能仅存在一个靶序列拷贝。

图3A-B显示热带念珠菌测定的说明性扩增和熔解结果。对于该生物，真阳性常常不出现，直至循环26后。对于热带念珠菌，假阳性将比较稀少，但如果第二阶段PCR在显著早于循环32时终止，假阴性将普遍。若为所有测定选择单个第二阶段循环，对于倾向于具有较早Cp的测定(例如鲍曼不动杆菌)将有假阳性风险，或者对于倾向于具有较晚Cp的测定(例如热带念珠菌)将会有假阴性风险，或若选择折中的循环，将会有此两种风险。对于这些生物中每个的判定使用不同的循环改善了测定的整体准确度。

图4A-B显示金黄色葡萄球菌测定的扩增和熔解结果。对于FilmArray BCID板中的该生物，真阳性有时在早达循环20时出现。图4B显示20个循环后所有三个重复通过Cp均判定为阴性，但一个重复通过熔解判定为阳性。然而，26个循环后通过Cp和熔解所有三个重复均判定为阳性。尽管图4A中示出的真阴性甚至在32个循环后未显示任何扩增，但已知金黄色葡萄球菌为中度污染风险。因此，尽管根据图4A-B中所示数据选择循环32为可接受的，循环26也是一个可行的选择，其具有较低的来自环境污染的假阳性风险。

对说明性BCID板中的每种生物均进行分析以确定熔解循环1 (第二阶段PCR循环20)、熔解循环2 (第二阶段PCR循环26)或熔解循环3 (第二阶段PCR循环32)是否将最适合用于最小化假阳性和假阴性二者。生物如下表1分配：

表1

在说明性的实施方案中，FilmArray仪器编程为仅在上述列出的熔解循环中采集每种生物的熔解结果。尽管对于每种生物仅使用表1中所确定的熔解循环，应理解的是在一些情况下获得单个孔多个循环的扩增或熔解峰信息可为有用的。

一般而言，熔解循环1靶标在阳性需氧血液培养物中以最高滴度存在，但还作为背景生物存在，对于不期需的阳性风险最高。熔解循环2靶标在阳性需氧血液培养物中以高滴度存在，但作为背景生物存在较少，对于不期需的阳性中等风险。熔解循环3靶标在阳性需氧血液培养物中以低滴度存在，但也低到不作为背景生物存在，对不期需的阳性低风险。

当使用上述讨论的三个熔解时，发现FilmArray BCID板的说明性版本显示所包含的微生物(包括含有抗生素抗性基因的那些)的板的100%的反应性(111/111)。例如，说明性的FilmArray BCID板检测17/17葡萄球菌属分离物、19/19肠球菌属分离物和30/30肠杆菌科分离物。相似地，说明性的FilmArray BCID系统不检测预期该测定不反应的62/62(100%)微生物。BCID系统中每个判读的平均特异性[真阴性/(真阴性 + 假阳性)]为100%(155/155; 95% CI 98.1-100.0%)。这些结果证明每个孔均可仅使用该反应的单个熔解循环(其可不同于同一测定中另一个孔内反应所使用的单个熔解循环)正确判定。

尽管本实施例中使用的三个熔解循环，应理解的是可使用任何数目的熔解循环，并且可选择任何循环作为熔解循环。在一些测定中假阳性与假阴性之间的分离可以仅用两个熔解循环达到，而其它测定中可能需要四个或更多个熔解循环。此外，尽管本实施例使用了培养物样品，应理解的是对于使用未培养材料的测定多重熔解循环可为适当的。此外，尽管本实施例中使用了熔解，不同循环的扩增曲线与阈值或Cp可用于测定样品对于靶标是否阳性。

另外，应理解的是对一种生物所获得的信息可用于帮助其它生物的阳性或阴性判定，特别是如果生物之间存在一些交叉反应性，或如果存在一些其它关系例如细菌和与该细菌有关的抗生素抗性基因。在上述实施例中，肠球菌属(“Entero”)和葡萄球菌属(“Staph”)均在熔解循环2中检出。然而，在许多已知的Entero测定中，由于靶序列的相似性，存在与Staph的交叉反应性，因此可能导致Staph阳性的Entero真阴性样品中Cp较迟。为了降低交叉反应性成为问题的这样的情况中潜在的交叉反应性对Entero测定的作用，Staph阳性或阴性判定可说明性地使用熔解循环2 (循环26)作出。若Staph阳性，因此影响Entero样品，可基于较早的结果，说明地，熔解循环1 (循环20)，判定Entero。若Staph阴性，则Entero测定将不受影响，可说明性地在熔解循环2作出判定，或选择对于无交叉反应性的测定最佳的无论哪个循环。然而，应指出的是，在血液培养物中，阳性瓶环(bottle ring)基于存在的所有生物的复合生物生长，一种或多种生物可能以低于任一单独感染的量存在。判定交叉反应性测定的循环可能因此需要相应调整。通过基于其它测定的阳性或阴性判定而调整判定交叉-反应性测定所用的循环，双重感染样品的交叉-反应性问题可被精确判定，说明性地无需重新设计引物以避免交叉-扩增。

应理解的是，尽管上述实施例鉴定了生物，应理解可使用相同的方法和装置通过扩增该生物的不同基因座鉴定一个或多个生物中的不同靶序列。

实施例2

在实施例1中，使用不同循环数目的熔解以区分环境污染和临床感染，其中板中的每个检验指定一个循环数，并基于所指定循环数时的结果判定阳性和阴性。使用不同的用于判定的循环数还可用于区分潜在的“假阳性”，在“假阳性”中核酸大量存在但与临床无关，临床相关的真阳性不具有交叉点，直至更晚的循环。一个这样的例子为通过染色体整合的潜伏病毒感染，其中染色体整合的病毒DNA可能或可能不引起临床症状。

例如，个体可从感染病毒的父母遗传HV6病毒，该病毒潜伏性地整合在染色体上(称作染色体-整合HHV6，“ciHHV6”)。该个体将在基本上每个有核细胞中含有整合的一些或全部HHV6，PCR检验HHV6将往往出现阳性，即使该个体为潜伏性感染而无该病毒的活动性临床症状。对于无该病毒活动性症状的这样的患者，整合的病毒染色体将为临床无关的，任何症状将均来自某些其它来源。

对于具有活动性脑膜炎病例但不含ciHHV6病毒的HHV6患者(后文“临床-相关感染”)，预期脊髓液样品的FilmArray第二阶段交叉点将为约循环25-30，而含有潜伏ciHHV6病毒的脑膜炎患者将具有约循环6-10的FilmArray第二阶段交叉点。在这样的情况下，第一个熔解循环可为说明性地约循环10，稍后的熔解循环可说明性地在约循环30。然而，应理解的是这些循环仅为说明性的，其它循环可为合适的。如果第一个熔解循环为阳性，检验可报告为“阴性”，或可报告为“染色体整合”或指示早期循环阳性结果的一些其它结果。当然，如果第一个熔解循环为阳性，稍后的熔解循环也将为阳性。然而，如果第一个熔解循环为阴性且第二个熔解循环为阳性，这将指示当前感染，将报告“阳性”结果。因此，在一些情况下，早期循环“阳性”可用于鉴定非-临床相关阳性结果。

实施例3

在实施例1和2中，使用了不同的循环数以区分环境污染、潜在的非-临床相关感染和临床-相关感染。在本实施例中，使用了额外的循环，以使得能够检测低水平的真阳性。在本方法中，检测和鉴定方法为改良的两步过程。第一步为一组扩增方案，任选含有实施例1和2中所使用的额外的熔解循环，第二步在至少一个随后的熔解期间采用较高信噪比检测。说明性的方案在图5中示出。

如图5中所示，运行一组数量的扩增循环，说明性地26个循环。在循环26时返回阳性结果的任何孔任选不需要进一步分析。阳性结果可通过扩增曲线取得，或对于显示扩增的那些样品，可通过如上所讨论的熔解曲线分析，说明性地通过超过如图6中High-Con判定所指示的阈值荧光水平，或本领域已知的其它方法取得或确认。其后，任选地在多个额外循环的每个期间运行熔解。每个循环后，如果检测到熔解峰，任选可分析扩增曲线的形状以进一步确信阳性判定。说明性的从扩增曲线的形状作出阳性判定的方法可在美国专利号6,387,621、6,730,501和7,373,253以及美国专利申请号2011-0238323中找到，所有这些专利通过引用结合到本文中。这样的方法可帮助区分真扩增和信号漂移，对低水平阳性特别有用。这些额外的循环后，说明性地循环30后，调整仪器中的光源(说明性地LED，但可使用其它激发装置)增加功率。调整LED功率后，该仪器采集熔解期间的荧光数据。进行该功率调整以增加检测低负载样品的信噪比。初始熔解不采用全功率的一个原因是这可具有提高(railing)循环26后被判定为阳性的一个或多个样品孔的信号的作用，而这些样品已经具有显著的负载。然而，任选将在循环26阳性判定后终止这些孔的数据采集，如此该提升将对报告结果无任何作用。最后，对循环26或循环30终点荧光小于既定阈值的所有反应进行熔解曲线分析(如上所述的扩增检测和/或Tm鉴定)，以确定这些样品孔中的任一是否包含真阳性结果。

应理解的是使用循环26和30仅为说明性的，可使用其它循环，如对特定应用可能期需的。此外，可省略额外的循环27-30，光源可在初期扩增后调整。

实施例4

任选地，代替或除了多重熔解循环，对于不同的测定可调整仪器光源，说明性地LED，但也可使用其它激发装置。表2中的数据显示如果降低LED功率，从而降低荧光信号，可减少背景细菌生物的检测。在一个说明性的实施例中，将LED功率从70% (近似当前FA设置)下降至50%使32个循环后FA BCID肠杆菌科检验中不期望的假阳性检测从检验的90%降至20%。

表2

FA BCID测定

10% LED 功率

30% LED 功率

50% LED 功率

70% LED 功率

90% LED 功率

历史背景检测(65% LED 功率)

鲍曼不动杆菌

0/10 (0%)

1/10 (10%)

0/10 (0%)

0/10 (0%)

0/10 (0%)

2.17%

阴沟肠杆菌

0/10 (0%)

0/10 (0%)

0/10 (0%)

0/10 (0%)

0/10 (0%)

8.70%

大肠杆菌

0/10 (0%)

0/10 (0%)

0/10 (0%)

4/10 (40%)

5/10 (50%)

23.40%

肠杆菌科

0/10 (0%)

5/10 (50%)

2/10 (20%)

9/10 (90%)

10/10 (10%)

78.72%

mecA

0/10 (0%)

0/10 (0%)

2/10 (20%)

0/10 (0%)

0/10 (0%)

22.58%

尽管说明性的设置为70% LED功率，单个设置可能或可能不适合所有测定，应理解的是对于一个阵列或板内的多个不同测定，理想的LED功率可不同。例如，更易受环境污染假阳性影响的测定在功率设置较低以降低敏感性时更好，而低水平阳性重要的测定可获益于较高的LED功率。因此，作出各个阳性或阴性判定后，可降低LED功率，说明性地降低5%、10%、15%或更多或任何其它水平，并产生熔解曲线。如果熔解曲线为阴性，则该测定可被标记为潜在的假阳性，或其可报告为阴性。或者或另外，可增加LED功率，说明性地增加5%、10%、15%或更多或任何其它水平，可审核先前被判定为阴性的测定，对于低水平测定随后的熔解曲线可能指示阳性结果。

尽管本文中讨论了LED和LED功率，应理解的是也可使用其它照明光源，包括白炽灯、荧光和其它灯，并且调整此类灯的功率和伴随的光输出也在本发明范围内。

实施例5

作为前面实施例的延伸，熔解曲线可在额外循环期间，例如在PCR的每个循环或几乎每个循环，说明性地通过在扩增期间连续获得温度和荧光数据获得。例如，说明性的两步PCR方案可分为两段：温度不断改变的变性/退火段和温度保持恒定的延伸段。变性/退火段期间，PCR反应的温度从基线值说明性地以恒定速率上升至最大温度值，接着温度迅速降回基线值。随着温度升高，dsDNA分成两个ssDNA片段。随着温度降低，PCR引物与两个ssDNA片段退火。延伸段期间，温度保持恒定在基线值，使得引物ssDNA片段延伸至形成两个dsDNA片段。图7为该说明性温度循环方案的图形化描述。然而，应理解的是可使用其它方案，其中温度在熔解温度、退火温度和延伸温度的任何或所有处保持恒定，或不保持。同样，应理解的是基线退火温度可与延伸温度相同或不同。

随着连续获得数据，仪器可连续采集所有循环中PCR方案两段期间的温度和荧光数据，如图8中所示。采集的荧光数据作为变性段的一部分可看作是一系列熔解曲线。在每个熔解曲线之间，荧光数据显示扩增，因为PCR产物延伸，并且可使用非特异性dsDNA结合染料检测扩增产物(见图9)。PCR循环开始时，dsDNA的量较低，因此变性段期间产生的信号也较低。随着循环继续，PCR产物的量开始增加。相似地，变性段产生的信号也增加。见图10随PCR循环进行熔解曲线变化的图形化描述。

一个用于定量靶核酸的方法为通过测定Cp并将CP与标准或对照相比。作为通过绝对或标准化扩增数据测定Cp的替代方案，可使用上文讨论的熔解曲线系列。图11显示一组说明性的负导数熔解曲线，其中最平滑的曲线代表最早的循环，曲线下面积随循环数增加。预期扩增期间多个循环处获得的此导数熔解曲线可用于测定Cp。在本说明性实施例中，对于每个循环可测定每个熔解曲线转变的高度或熔解曲线负一阶导数下的面积。然后可将Cp指定为该值超过预定阈值的循环。应理解的是每个循环均可用于近似的Cp，或少于所有循环可用于近似的Cp。

可应用另外的用于测定Cp的方法。例如，可使用熔解检测器(见美国专利号6,387,621、6,730,501和7,373,253，通过引用结合到本文中)。所述检测器将审查曲线形状和背景噪声以确定样品中是否存在PCR产物。熔解检测器的使用可用于提高系统的灵敏度(见Poritz等, PLos One 6(10): e26047)。任选地，额外的滤光器可应用于熔解曲线分析以打开熔解转变窗口，通过仅分析在设定温度范围内具有熔解转变(说明性地显示为熔解峰)的那些熔解曲线，增加系统的特异性。预期这样的方法将导致更精确的Cp。

实施例6

在另一个说明性的实施例中，使用连续监测温度和荧光的方法进行相对定量，说明性地在含有对照核酸的单一反应中使用dsDNA结合染料。在本实施例中，提供了多重PCR反应，包含已知起始浓度的对照核酸和未知浓度的靶核酸。说明性地，用于扩增对照核酸的引物以与用于扩增靶核酸的引物相同的起始浓度存在。此外，选择对照核酸使其熔解温度足以很好地与靶核酸的熔解温度分开是合乎需要的，使得这些核酸中每个的熔解可从其它的熔解中分辨。应理解的是多种未知浓度的靶核酸在反应中可为多重的，注意的是每个核酸的熔解曲线可与其它以及与对照核酸区分。

在一个说明性的PCR应用中，对照核酸和靶核酸的扩增产生与图12中所示相似的扩增曲线。在这样的使用dsDNA结合染料产生的曲线中，组合对照和靶信号产生所示的单个扩增曲线，单独核酸扩增的信息不可辨认。

随着连续获得数据，在PCR循环期间产生一系列的熔解曲线。如果对照核酸和靶核酸的熔解温度充分分离，则可区分此两反应每一个的熔解概况，如图13所示。说明性地，从该系列的熔解曲线可产生调整的靶核酸扩增曲线和任选调整的对照核酸扩增曲线。说明性地，为了产生校正的对照核酸扩增曲线，可计算每个循环熔解曲线的负一阶导数在预定义熔解窗口的积分并绘制为循环数的函数，Cp测定为每个值超过预定值时的循环。相似地，可通过积分预定义熔解窗口内靶熔解曲线的负一阶导数产生校正的靶核酸扩增曲线。图13显示说明性的5、10、15、20和25循环时的负导数熔解曲线，以及指示两种核酸的说明性的预定义熔解窗口。这样的校正的扩增曲线在图14中图解。其它用于将熔解曲线转化为值的方法为本领域所已知，说明性地使用负一阶导数的峰高。应理解的是预定值应根据所用方法选择。

靶核酸相对于对照核酸的浓度可使用下式计算：

相对浓度= ET*Cp,t / EC*Cp,c [等式1]

其中

ET和EC为靶和对照效率，和

Cp,t和Cp,c为靶和对照的交叉点。

两个反应的效率可经验性地测定，两个反应的Cp值可如本领域所知使用从熔解曲线系列所计算的扩增曲线的标准计算计算。

实施例7

本发明的某些实施方案还可涉及或包括配置为从扩增曲线或熔解曲线或其组合作出阳性或阴性判定的PCR系统。说明性的实例在美国专利申请号2010-0056383中描述，该专利已通过引用结合，与袋510或相似的实施方案一起使用。然而，应理解的是美国专利申请号2010-0056383中所述的实施方案仅为说明性的，根据本公开内容也可使用其它系统。例如，参见图15，示出了根据本公开内容示例性方面，包括控制元件702、热循环元件708和光学元件710的说明性系统700的框图。

在至少一个实施方案中，所述系统可包括位于样品管714中的至少一种PCR反应混合物。在某些实施方案中，样品管714可包含配置为允许和/或实现模板核酸扩增的PCR反应混合物。某些说明性的实施方案可还包含至少一个配置为接受至少一个样品管714的样品区或室716。样品管714可包含单个、条、板或其它形式的任何多个样品容器，并且，说明性地，可由样品区或室716提供或接收。

一个或多个实施方案可还包含至少一个配置为操纵和/或调节样品温度的样品温度控制装置718和/或720。这样的样品温度控制装置可配置为升高、降低和/或维持样品的温度。在一个实例中，样品控制装置718为加热系统，样品控制装置720为冷却系统。说明性的样品温度控制装置包括(但不限于)加热和/或冷却模块、元件、交换器、线圈、散热器、制冷器、灯丝、Peltier装置、强制鼓风机、处理器、排空阀、分配器、压缩机、冷凝器、水浴器、冰浴器、焰和/或其它燃烧或燃料形式的热、热袋、冰袋、干冰、干冰浴器、液氮、微波-和/或其它波发射装置、冷却装置、加热装置、其它操纵样品温度的装置和/或配置为升高、降低和/或维持样品温度的任何其它合适装置。

说明性的PCR系统700还包括配置为检测样品714 (或其部分或反应物)所发射荧光的量的光学系统710。这样的光学系统710可包括一个或多个荧光通道，如本领域所知，并且可同时或逐一检测多个样品的荧光。

PCR系统的至少一个实施方案可进一步包括程序设计为或配置为，说明性地当光学系统710采集荧光信号时，操作、控制、执行或以其它方式推进加热系统718和冷却系统720以热循环PCR反应混合物的CPU 706。CPU 706可然后产生扩增曲线、熔解曲线或任何组合，其可以或可以不打印、在屏幕上显示或以其它方式输出。任选地，阳性、阴性或其它判定可基于扩增和/或熔解曲线输出。任选地仅输出判定，说明性地每个检验靶标一个判定。

说明性PCR系统和/或热循环仪(thermocyclers)的说明性特征、组分、元件和/或成员的额外的实例为本领域已知和/或在上文中或在美国专利申请系列号13/834,056中描述，该专利通过引用以其整体结合到本文中。

尽管本发明已经参考优选的实施方案进行了详细描述，但存在如所附权利要求书中描述和定义的本发明范围和精神内的变更和修饰。

Claims (40)

1.用于鉴定样品中含有多种生物中的哪些的方法，包括

提供多个样品孔，每个样品孔含有部分样品和用于扩增来自多种生物中的不同生物的靶核酸序列的引物，

同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干扩增循环，

检测第一组多个样品孔的每个中是否发生扩增，

同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干额外的扩增循环，

检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增，

通过鉴定至少一个发生扩增的对应样品孔鉴定样品中存在的至少一种生物。

2.权利要求1的方法，其中第一个检测步骤不涉及检测第二组多个样品孔中是否发生扩增，第二个检测步骤不涉及检测第一组多个样品孔中是否发生扩增。

3.权利要求2的方法，其中第一组第一个样品孔的阳性或阴性判定决定第二个样品孔是在第一组还是在第二组中。

4.权利要求1的方法，进一步包括

同时使多个样品孔经受扩增条件，经历另一个若干额外扩增循环，

检测第三组多个样品孔的每个中是否发生扩增。

5.权利要求4的方法，其中扩增循环的数目为20个PCR循环，额外扩增循环的数目为6个额外的PCR循环，另一个额外扩增循环的数目为6个额外的PCR循环。

6.权利要求4的方法，进一步包括至少一个额外的同时使多个样品孔经受扩增条件经历又一个若干额外扩增循环的步骤和至少一个额外的检测步骤。

7.权利要求4的方法，其中第一组多个样品孔配置为扩增来自以最高滴度存在的生物的靶核酸序列并具有最高的不期望阳性的风险，第二组多个样品孔配置为扩增来自以高滴度存在的生物的靶核酸序列并具有中等的不期望阳性的风险，第三组多个样品孔配置为扩增来自以低滴度存在的生物的靶核酸序列并具有低的不期望阳性的风险。

8.权利要求1的方法，其中所述检测步骤包括使多个样品孔经受熔解条件和检测靶核酸序列是否发生熔解。

9.权利要求8的方法，其中检测是否发生熔解包括检测多个样品孔的每个在预定温度范围内的熔解峰。

10.权利要求1的方法，其中检测步骤包括分析每个样品孔的扩增曲线。

11.权利要求10的方法，其中分析扩增曲线包括测定交叉点。

12.权利要求1的方法，进一步包括在提供步骤前使样品经受多重扩增。

13.权利要求12的方法，其中所有步骤在单独的封闭系统中进行。

14.权利要求1的方法，其中所有检测步骤包括检测多个样品孔的任一中是否发生扩增。

15.权利要求1的方法，其中第一个检测步骤中的阳性判定指示染色体整合，第一个检测步骤中的阴性判定并且第二个检测步骤中的阳性判定指示临床-相关感染。

16.权利要求1的方法，其中每个样品孔进一步包含荧光染料，第一个检测步骤采用第一个水平的照明，第二个检测步骤采用第二个水平的照明。

17.权利要求16的方法，其中第二个水平比第一个水平高，并且进一步包括步骤：

同时使多个样品孔经受扩增条件，经历额外若干个额外扩增循环，

通过采用第三个水平的照明检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增，第三个水平比第二个水平高。

18.用于鉴定样品中含有多个靶核酸中的哪些的方法，包括

提供多个样品孔，每个样品孔具有用于扩增来自多个靶核酸序列中不同序列的基因座的引物，

将一部分样品移至多个样品孔的每个中，

同时使多个样品孔经受扩增条件经历若干扩增循环，

检测第一组多个样品孔的每个中是否发生扩增，

同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干额外的扩增循环，

检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增，

通过鉴定发生扩增的对应样品孔鉴定样品中存在的靶核酸。

19.权利要求18的方法，进一步包括

在单个多重扩增反应中同时扩增所有基因座，然后进行转移步骤。

20.权利要求18的方法，其中检测步骤包括检测指示扩增的荧光的变化。

21.权利要求20的方法，进一步包括在额外的扩增循环前增加光源功率的步骤。

22.权利要求21的方法，其中额外扩增循环的数目为一个循环。

23.用于检测样品中存在多个靶核酸中的哪些的系统，包括

包含多个样品孔的容器，每个样品孔配置为持有一部分样品、对靶核酸之一具有特异性的核酸引物、信号产生物质和用于扩增的组分，

配置为容纳上述容器并使该容器经受扩增条件的仪器，该仪器进一步包括用于检测扩增发生时来自信号产生物质的信号的检测器，

其中所述仪器程序设计为固定量的扩增后输出第一组多个样品孔中每个的结果，额外的固定量扩增后输出第二组多个样品孔中每个的结果。

24.权利要求23的系统，其中所述扩增为PCR，所述组分包括聚合酶和dNTP。

25.权利要求24的系统，其中固定量的扩增为特定数目的循环，额外的固定量的扩增为额外的特定数目的循环。

26.权利要求23的系统，其中所述信号产生物质为荧光染料。

27.权利要求26的系统，其中光源功率增加。

28.权利要求23的系统，其中结果基于预定温度范围内的熔解峰的存在或不存在情况，其中熔解峰存在输出阳性结果，熔解峰不存在输出阴性结果。

29.用于区分样品中染色体整合和临床-相关感染的方法，包括

提供其中包含样品和用于扩增来自样品的靶核酸序列的引物的样品孔，

使样品孔经受扩增条件经历若干扩增循环，

检测样品孔中是否发生扩增，

使样品孔经受扩增条件经历若干额外扩增循环，和

检测样品孔中是否发生扩增。

30.权利要求29的方法，其中第一个检测步骤中的阳性判定指示染色体整合，第一个检测步骤中的阴性判定与第二个检测步骤中的阳性判定指示临床-相关感染。

31.用于分析样品中靶核酸的方法，包括

(a) 提供其中包含样品和用于扩增靶核酸的引物的样品孔，

(b) 使样品孔经受扩增条件经历多个扩增循环，

(c) 产生所扩增靶核酸的熔解曲线，和

(d) 重复步骤(b)和(c)。

32.权利要求31的方法，其中步骤(c)进一步包括测定熔解曲线的值，并进一步包括步骤

(e) 通过鉴定其中熔解曲线的值超过预定值的扩增循环测定Cp。

33.权利要求32的方法，其中所述值通过熔解曲线负导数的峰高或峰面积测定。

34.用于分析样品中靶核酸的方法，包括

(a) 提供其中包含样品、用于扩增靶核酸的引物、对照核酸、用于扩增对照核酸的引物和dsDNA结合染料的样品孔，

(b) 使样品孔经受扩增条件经历至少一个扩增循环，

(c) 产生所扩增靶核酸和所扩增对照核酸的熔解曲线，

(d) 测定所扩增靶核酸的值，和

(e) 重复步骤(b)、(c)和(d)。

35.权利要求34的方法，其中步骤(d)还包括测定所扩增对照核酸的值。

36.权利要求35的方法，进一步包括使用步骤(d)中测定的值产生靶核酸的校正扩增曲线的步骤。

37.权利要求36的方法，其中所述熔解曲线绘制为负导数熔解曲线，所述值通过靶核酸和对照核酸的每个在所选温度窗口中的峰高和峰面积测定。

38.权利要求37的方法，进一步包括测定靶核酸相对于对照核酸初始浓度的相对初始浓度的步骤。

39.权利要求38的方法，其中相对起始浓度使用下式测定

ET*Cp,t / EC*Cp,c

其中

ET和EC为靶和对照效率，和

Cp,t和Cp,c为靶和对照交叉点，通过所扩增模板核酸的值超过预定值的循环和所扩增对照核酸超过预定值的循环测定。

40.权利要求35的方法，进一步包括产生对照核酸的校正扩增曲线的步骤。