CN107375904B - β-arrestin1在防治色素障碍性皮肤病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了β‑arrestin1在防治色素障碍性皮肤病中的应用，属于医药技术领域。本发明首次发现NK1R通过β‑arrestin1影响色素合成，为了解色素障碍性皮肤病的发病机制提供新的思路，为合理有效治疗该病提供新的生物学靶点，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。

Description

β-arrestin1在防治色素障碍性皮肤病中的应用

技术领域

本发明涉及β-arrestin1在防治色素障碍性皮肤病中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

色素障碍性皮肤病是临床上较为常见的皮肤病，一般分为色素减少性和色素增加性皮肤病，以白癜风、黄褐斑、黑病变、雀斑的发病率最高。尽管此类疾病不会对个体造成很大的生命威胁和明显的生理不适，但由于其严重影响患者外观，对患者的心理健康造成巨大的负担，明显降低患者的生活质量。该病属于慢性、难治的疾病，其病因及发病机理不明，至今国内外尚无理想的治疗药物。因此，明确色素障碍性皮肤病的发病机制，寻找能够促进或抑制色素合成的有效生物学靶点，是基础研究和临床实践亟待解决的重大问题之一。

神经激肽(neurokinin，NK)，也称速激肽(tachykinins)，属于羧基端含有保守Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2(X代表任意氨基酸)序列的多肽家族，包含P物质(SP)、神经激肽A和神经激肽B。神经激肽通过与细胞膜上的神经激肽受体(neurokinin receptor)结合，从而发挥相应的生理功能。神经激肽受体可分为3种：神经激肽1受体(neurokinin1receptor，NK1R)、神经激肽2受体(neurokinin 2receptor，NK2R)和神经激肽3受体(neurokinin 3receptor，NK3R)。这三种受体均为G蛋白偶联受体，其中NK1R分布最广，也最为重要，只有少数细胞表达NK2R和NK3R。NK1R广泛存在于中枢和周围神经系统，分布于神经元、脑干、血管内皮细胞、肌肉、胃肠道、泌尿生殖道、肺组织、甲状腺和各种免疫细胞中。由于NK1R与SP的选择性最高，结合能力最强，因此也被称为SP受体。当NK1R与SP结合后，通过G蛋白偶联的磷脂酰肌醇二磷酸第二信使系统，作用于膜上的钙离子通道，引起膜电位的去极化和蛋白激酶活性的改变，进而参与疼痛和应激信号，在炎症反应和平滑肌收缩过程中发挥复杂的生理功能。申请人在前期工作中首次证实：小鼠B16黑素瘤细胞和人原代黑素细胞中均表达NK1R。

β-arrestins是在提纯肾上腺素受体激酶的过程中发现的一种重要的接头蛋白和信号转导调控蛋白，主要包括两个家庭成员：β-arrestin1和β-arrestin2。β-arrestins广泛表达于全身多种细胞，介导GPCR的内吞和脱敏、参与许多细胞功能的调控，包括调节细胞增殖化、促进细胞迁移、介导细胞调控信号通路，甚至可以直接进入细胞核内促进某些基因的转录等等。β-arrestin与心血管、呼吸、内分泌、神经、免疫等系统的多种疾病的发生发展密切相关，但是在色素障碍性皮肤病中的表达变化及作用机制尚不清楚。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了β-抑制蛋白1(β-arrestin1)和肝细胞核因子(HNF4α)在制备预防、治疗或者辅助治疗色素障碍性皮肤病的药物方面的应用。

本发明的第一个目的是提供一种预防、治疗或者辅助治疗色素障碍性皮肤病的药物或者药物组合物，所述药物或者药物组合物以以下任意一种或者多种物质作为有效成分或者主要有效成分：β-arrestin1、影响β-arrestin1活性的物质、HNF4α、影响HNF4α活性的物质。

在一种实施方式中，所述色素障碍性皮肤病为色素减少性或者色素增加性皮肤病，包括但不限于白癜风、黄褐斑、黑病变、雀斑等。

在一种实施方式中，所述色素障碍性皮肤病为色素减少性皮肤病，以β-arrestin1、能够提高β-arrestin1活性的物质、能够抑制HNF4α活性的物质中的任意一种或者多种作为有效成分或者主要有效成分。

在一种实施方式中，所述色素障碍性皮肤病为色素增加性皮肤病，以能够抑制β-arrestin1活性的物质、HNF4α、能够提高HNF4α活性的物质中的任意一种或者多种作为有效成分或者主要有效成分。

在一种实施方式中，所述影响HNF4α活性的物质为β-arrestin1。

在一种实施方式中，所述β-arrestin1的序列，是NCBI上Gene ID:109689(Musmusculus(house mouse)或者Gene ID:408(Homo sapiens(human))的序列；或者uniprot上，登录号P49407(人的arrb1)、登录号Q8BWG8(小鼠的arrb1)的序列。

在一种实施方式中，所述HNF4α的序列，是NCBI上Gene ID:3172(Homo sapiens(human))或者Gene ID:15378(Mus musculus(house mouse))的序列；或者uniprot上，登录号P41235(人的HNF4α)、登录号P49698(小鼠的HNF4α)的序列。

在一种实施方式中，所述β-arrestin1过表达可促进黑色素形成，敲除可抑制黑色素形成。

在一种实施方式中，所述药物中还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在一种实施方式中，本发明的β-arrestin1可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

在一种实施方式中，所述药物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。

在一种实施方式中，用于药物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

本发明的第二个目的是提供一种β-arrestin1在制备预防、治疗或者辅助治疗色素障碍性皮肤病的药物方面的应用，所述应用是调控β-arrestin1的活性。

在一种实施方式中，所述调控β-arrestin1的活性，是以β-arrestin1、能够提高β-arrestin1活性的物质、能够抑制HNF4α活性的物质中的任意一种或者多种作为有效成分或者主要有效成分制备药物，提高β-arrestin1的活性；所述药物用于色素减少性皮肤病。

在一种实施方式中，所述调控β-arrestin1的活性，以能够抑制β-arrestin1活性的物质、HNF4α、能够提高HNF4α活性的物质中的任意一种或者多种作为有效成分或者主要有效成分制备药物，抑制β-arrestin1的活性；所述药物用于色素减少性皮肤病。

本发明的第三个目的是提供一种提高酪氨酸酶TYR的活性的药物，所述药物以β-arrestin1、能够提高β-arrestin1活性的物质或者能够抑制HNF4α活性的物质作为有效成分或者主要有效成分。

本发明的第四个目的是提供一种增加细胞内黑素含量的药物，所述药物以能够抑制β-arrestin1活性的物质、HNF4α或者能够提高HNF4α活性的物质作为有效成分或者主要有效成分。

本发明的优点和效果：

本发明首次发现β-arrestin1影响色素合成(而β-arrestin2没有效果)，为了解色素障碍性皮肤病的发病机制提供新的思路，为合理有效治疗该病提供新的生物学靶点，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。

附图说明

图1为定量蛋白质组学技术筛选与NK1R调控黑素合成相关的蛋白；

图2对与NK1R调控黑素合成相关的、有显著差异的蛋白进行通路分析；

图3为β-arrestin1的质谱图；

图4为SP对NK1R与β-arrestin1相互作用的影响；

图5为β-arrestin1对对HNF4α表达水平、酪氨酸酶活性、黑色素含量的影响；其中，A为人原代黑素细胞和人皮肤样本中存在HNF4α(Western blot检测结果)；B为β-arrestin1过表达后对HNF4α表达的影响(Western blot检测和半定量分析结果)；C为β-arrestin1敲减后对HNF4α表达的影响(Western blot检测和半定量分析结果)；D和E为β-arrestin1过表达后对酪氨酸酶活性和黑素含量的影响；E和G为β-arrestin1敲减后对酪氨酸酶活性和黑素含量的影响。

具体实施方案

发明人筛选并发现了NK1R参与调控黑素合成的蛋白质分子(转录因子/信号通路蛋白)。采用TMT(Tandem Mass Tag，Thermo Scientific)结合LC-MS(液相色谱-质谱联用)的定量蛋白质组学技术，对三组细胞的蛋白质样品(空白对照组Control、NK1R激动剂组SP和NK1R抑制剂组L-733060)进行了高通量的系统分析，依据质谱(MS)的定量结果和数据统计分析，在总共鉴定到的6211个蛋白质中，筛选到了与NK1R调控黑素合成相关的、有显著差异的蛋白共74个(图1)。GO(Gene Ontology)分析包括生物学过程、细胞定位和分子功能分析，结果提示差异蛋白主要为线粒体蛋白，在细胞质中合成后转运到线粒体发挥相应的功能。在通路分析中，发明人通过KEGG Pathway(基于KEGG数据库)、蛋白相互作用(PPI)、Network分析筛选出了一条显著改变的通路。这条通路同时包含了30个差异蛋白，其中β-抑制蛋白1(β-arrestin1)的差异最显著(图2-图3)。基于该通路图，推测：NK1R通过影响β-arrestin1的表达调节色素的合成。

发明人在预实验中发现：免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)结果显示在静息状态下，NK1R和β-arrestin1存在相互作用，用NK1R的配体—SP刺激细胞后，NK1R和β-arrestin1相互作用解离(图4)。结合上述前期的研究结果和国内外研究进展，发明人推测：NK1R通过影响β-arrestin1的表达，进而影响酪氨酸酶TYR的活性，最终促进皮肤色素的合成。

为了验证这一假说，本发明拟从正常人包皮环切术的包皮中提取人黑素细胞，结合NK1R^+/-小鼠，运用分子生物学、生物化学、蛋白质组学等技术，揭示NK1R通过β-arrestin1影响色素合成的新机制，为了解色素障碍性皮肤病的发病机制提供新的思路，为合理有效治疗该病提供新的生物学靶点，为进一步研究NK1R在该病中的功能提供线索，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1：采用定量蛋白质组学技术筛选与NK1R调控黑素合成相关的蛋白

发明人采用TMT(Tandem Mass Tag，Thermo Scientific)结合LC-MS(液相色谱-质谱联用)的定量蛋白质组学技术，对三组细胞的蛋白质样品(空白对照组Control、NK1R激动剂组SP和NK1R抑制剂组L-733060)进行了高通量的系统分析，依据质谱(MS)的定量结果和数据统计分析，在总共鉴定到的6211个蛋白质中，筛选到了与NK1R调控黑素合成相关的、有显著差异的蛋白共74个。如图1所示，图中733-CON指L-733060给药组和Control空白对照组相比，SP-CON指SP给药组和Control空白对照组相比。

其中，空白对照组Control、NK1R激动剂组SP和NK1R抑制剂组L-733060具体实验过程如下：

(1)细胞培养

分别取处于指数生长期状态良好的人原代黑素细胞及B16F10细胞，消化，计数，将细胞接种于6孔板中，接种浓度约1×10⁵个/ml，接种量为2ml/孔，置37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；更换新鲜培养基后，分别加入SP或L-733060，培养72小时；PBS洗2遍，收集细胞于doff管中

(2)细胞样本提取

样品加入裂解液(2％SDS，7M尿素，1x Protease Inhibitor Cocktail)，超声3min(细菌超声5min)，冰上裂解30min，4℃、15000rpm离心15min，取上清

(3)蛋白酶解

蛋白采用500mM TEAB(triethylammonium bicarbonate)重溶。使用BCA蛋白试剂盒测定上清中的蛋白浓度，随后将各个样品100μg转移到新试管中，用8M urea调至100μL定容。加入11μL 1M DTT并在37℃下温育1小时，然后将样品加到10K超滤管(Millipore)14000g离心10min后，加入120uL 55mM碘乙酰胺，在室温下避光温育20min。在超滤管中用100mM TEAB连续离心三次置换Urea体系后，用1：50的Trypsin(Promega)酶解过夜。

(4)TMT标记

肽段混合物采用TMT-6Plex标记定量试剂盒，遵照制造商说明书进行标记。标记肽段样品混合后冻干。

(5)高PH反相分离

肽段混合物在bufferA(bufferA:20mM甲酸铵水溶液，氨水调节至pH10.0)重新溶解后用Ultimate 3000系统(ThermoFisher scientific，MA，USA)连接反向柱(XBridgeC18column，4.6mm x 250mm，5μm，(Waters Corporation，MA，USA)进行高pH分离，分离使用线性梯度，40min内5％B至45％B(B：80％CAN中加入20mM甲酸铵，氨水调节至pH 10.0)。柱子在初始条件下平衡15min，柱流速维持在1mL/min，柱温维持在30℃。收集到24个fraction，拼接为12个fraction。各个fraction在真空浓缩仪中干燥待用。

(6)低PH nano-HPLC-MS/MS分析

各fraction加入30μl solvent C(C:0.1％甲酸水溶液；D:0.1％甲酸ACN溶液)制成悬浮液后用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。实验在Easy-nLC 1000system(Thermo FisherScientific，MA，USA)上进行，系统连接装有在线nano电喷雾离子源的Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)。10μl肽段样品以10μl/min流量上样到捕集柱(ThermoScientificAcclaim PepMap C18，100μm x 2cm)，随后在分析柱(Acclaim PepMap C18，75μm x15cm)中以线性梯度分离：120min内3％D至32％D。柱子在初始条件下平衡10min。柱流量控制在300nL/min，电喷雾电压2kV。

Q-exactive质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。在35K质量分辨率下获得全扫描谱图(m/z 350-1550)，随后在17.5K分辨率下进行后续HCDMS/MS扫描。动态排除时间20秒。

(7)搜库

串联质谱图通过Mascot Distiller version 2.6提取，解析并去除同位素。所有MS/MS图谱通过Mascot(Matrix Science，London，UK；version 2.5.1)分析搜库，Mascot对Uniprot ProteomeMouse 201612database数据库搜库，设置trypsin酶解。Mascot搜库参数为碎片离子质量容许误差：0.050Da，母离子质量容许误差：10.0PPM，固定修饰：Carbamidomethyl(C)及TMT 6Plex(lysine及n端标记)，可变修饰：Asparagine及glutamine脱酰胺化，methionine氧化。

(8)蛋白定性质控

Scaffold(version Scaffold_4.7.2，Proteome Software Inc.，Portland，OR)用于分析基于MS/MS的肽段及蛋白定性。肽段得分满足Scaffold Local FDR算法低于1.0％FDR。蛋白组装要求定性到至少两条独有肽段。当蛋白含有同源肽段时基于奥卡姆剃刀法进行蛋白分组组装。

(9)定量数据分析

Scaffold Q+(version Scaffold_4.7.2，Proteome Software Inc.，Portland，OR)用于定量肽段及蛋白。通过对强度迭代(同时考虑样品及谱图)进行归一化，具体可参照StatisticalAnalysisofRelative Labeled Mass Spectrometry Data from ComplexSamples Using ANOVA(Oberg，AnnL.et al.，Journal ofproteome research 7.1(2008):225–233).采用中位数进行平均。匹配多个蛋白的谱图及缺少参数的谱图数据经过log变换和修正，通过一个自适应强度加权算法定量。定量检验使用Benjamini-Hochberg法校正的Mann-Whitney检验。

实施例2：对与NK1R调控黑素合成相关的、有显著差异的蛋白进行通路分析

在通路分析中，我们通过KEGG Pathway(基于KEGG数据库)、蛋白相互作用(PPI)、Network分析筛选出了一条显著改变的通路。这条通路同时包含了30个差异蛋白和1个转录因子，其中β-抑制蛋白1(β-arrestin1)和肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α)的差异最显著。结果如图2-图3所示。

实施例3：SP对NK1R与β-arrestin1相互作用的影响

分离提取人原代黑素细胞，设立空白对照组Control和NK1R激动剂组(SP)，结果显示，Control组中免疫沉淀结果显示NK1R和β-arrestin1蛋白可以共沉淀下来，而SP组则未检测到二者之间的相互作用，提示NK1R激活后能够导致β-arrestin1与NK1R的相互作用解离。

实施例4：β-arrestin1对HNF4α表达水平、酪氨酸酶活性、黑色素含量的影响

首先，发明人通过Westernblot法首次证实在人原代黑素细胞和人皮肤样本中存在转录因子HNF4α(见图5A)。然后，为了明确在色素合成过程中β-arrestin1对HNF4α表达水平的影响，在人原代黑素细胞中，发明人分别构建了β-arrestin1敲除和过表达稳转细胞株，Western blot结果显示，β-arrestin1过表达后能显著抑制HNF4α的表达，同时上调酪氨酸酶活性，增加细胞内黑素含量；β-arrestin1敲除后上述结果相反。这些结果，提示β-arrestin1能够通过抑制HNF4α的表达阻碍细胞内色素的合成(见图5B～图5D)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.β-arrestin1在制备预防或治疗色素减少性皮肤病的药物中的应用，其特征在于，β-arrestin1通过抑制HNF4α的表达，同时增加酪氨酸酶活性，增加细胞内黑素含量。

2.抑制β-arrestin1活性的物质在制备预防或治疗色素增加性皮肤病的药物方面的应用，其特征在于，抑制β-arrestin1后增加HNF4α的表达，同时抑制酪氨酸酶活性，减少细胞内黑素含量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制β-arrestin1活性，以能够抑制β-arrestin1活性的物质作为有效成分制备药物。

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