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CN107367564A - 利用高效液相色谱快速高效的n‑糖定性与定量分析方法 - Google Patents

利用高效液相色谱快速高效的n‑糖定性与定量分析方法 Download PDF

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CN107367564A CN201710522447.9A CN201710522447A CN107367564A CN 107367564 A CN107367564 A CN 107367564A CN 201710522447 A CN201710522447 A CN 201710522447A CN 107367564 A CN107367564 A CN 107367564A
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刘欣
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Huazhong University of Science and Technology
Ezhou Industrial Technology Research Institute of Huazhong University of Science and Technology
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Huazhong University of Science and Technology
Ezhou Industrial Technology Research Institute of Huazhong University of Science and Technology
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Abstract

本发明一种利用高效液相色谱快速高效的N‑糖定性与定量分析方法，属于糖组学分析领域。本发明提供一种高效液相色谱快速高效的N‑糖定性与定量分析方法，利用微波辅助的手段加快N‑糖的去糖基化反应，并结合衍生试剂AQC来标记直接通过酶切获得的葡糖胺，从而达到高效和高灵敏度的N‑糖的定性和定量分析。

Description

利用高效液相色谱快速高效的N-糖定性与定量分析方法
技术领域
本发明属于糖组学分析领域，具体涉及一种利用高效液相色谱快速高效的N-糖定性与定量分析方法。
背景技术
蛋白质的N-糖基化在许多重要的生物过程中起重要作用，如细胞信号传导，受精，增殖和分化。蛋白质N-聚糖的改变与许多疾病包括癌症，糖尿病和心力衰竭的发病机制相关。因此，对于获得相关生物过程的进一步理解以及发现新的诊断糖代谢标志物和治疗药物靶标，N-聚糖的稳定鉴定和准确定量是非常必要的。
现有技术中，N-糖分析步骤一般分为：去糖基化，提取糖，糖标记，纯化，糖分析，传统的N-糖分析方法采用PNGase F过夜酶切去糖基化，然后需要对释放的糖链进行纯化，再通过还原胺化进行标记N-糖链的还原端，接着对衍生后混合物进行进一步纯化后再进行高效液相色谱分析，此过程往往需要数天的时间，耗时较长并且灵敏度不是很理想。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种高效液相色谱快速高效的N-糖定性与定量分析方法，利用微波辅助的手段加快N-糖的去糖基化反应，并结合衍生试剂AQC来标记直接通过酶切获得的葡糖胺，从而达到高效和高灵敏度的N-糖的定性和定量分析。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：
一种利用高效液相色谱快速高效的N-糖定性与定量分析方法，利用微波辅助的手段加快N-糖的去糖基化反应，并结合衍生试剂AQC来标记直接通过酶切获得的葡糖胺，实现对N-糖的定性和定量分析，具体包括如下步骤：
(1)样品变性：10μg样品加入20μL的pH 8.5的碳酸氢铵缓冲液(其中含0.48μL的变性缓冲液)，沸水浴10min变性，冷却至室温后加入2.4μL 10％NP-40来抑制变性剂5min。
(2)微波辅助酶切：加入1μL的外切糖苷酶PNGse F微波辅助酶切20min，为防止样品沸腾，采用样品浮在盛有500mL水的烧杯中，于微波炉700W功率反应。
(3)AQC衍生葡糖胺：步骤(2)反应完成后冷却至室温，然后直接加入20μL150mMAQC乙腈溶液和20μL pH 8.5的碳酸氢铵缓冲液，震荡混匀，40℃水浴20min，反应完成后，作HILIC SPE纯化后HPLC分析。
相对现有技术，本发明具有的优点为：
1、不同于常用的还原胺化标记反应，本发明的微波辅助酶切结合氨基标记反应可以直接在水相环境下反应，省去了标记前的纯化过程从而达到减少样品损失的效果，并且反应的条件较温和，反应时间也较短，大大地提高了分析效率和检测灵敏度。
2、采用微波辅助快速酶切，AQC直接标记葡糖胺型N-糖，使整体反应在50min内完成，并且分析灵敏度增强了10倍左右。
3、稳定的定性与定量分析，通过对此技术的重复性与重现性进行探究，在高效和高灵敏度的基础上获得了较好的N-糖定性与定量分析。
4、通过优化后的此技术，对人血清中N-糖进行快速高效的分析，实现了对癌症血清中糖标记物的筛选和癌症的初步诊断。
5、微波辅助酶切能够在20分钟内达到传统方法过夜酶切的效果，并且在短时间内，被酶切下来的N-糖的还原端会以葡糖胺的形式较稳定地存在于弱碱性的环境中，为后续标记氨基的衍生反应提供了前提。
6、微波辅助酶切20min与37℃传统方法的酶切实验对比，本方法对PNGase F的酶活性没造成影响。
附图说明
图1为酶切反应的使用酶量和微波辐射时间探究图。
图2为AQC衍生反应的条件优化图。
图3为传统方法与本发明灵敏度对比结果图。
图4为本方法的定量、重复性与重现性探究图。
图5为本发明在癌症N-糖标记物筛选方面的应用图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种利用高效液相色谱快速高效的N-糖定性与定量分析方法，具体包括如下步骤：
(1)10μg糖蛋白RNase B，fetuin或者10μL的人血清加入pH 8.5的碳酸氢铵缓冲和变性缓冲液，总体积为20μL，其中变性缓冲液为0.48μL。沸水浴10min变性，冷却至室温后加入2.4μL 10％NP-40来抑制变性剂5min。
(2)加入1μL的外切糖苷酶PNGse F，微波辅助酶切20min，为防止样品沸腾，采用样品浮在盛有500mL水的烧杯中于微波炉中700W功率反应。
(3)反应完成后冷却至室温，然后直接加入20μL150mM AQC乙腈溶液和20μL pH8.5的碳酸氢铵缓冲液，震荡混匀，40℃水浴20min，反应完成后，作HILIC SPE纯化后HPLC分析。
(4)HPLC分析。
实施例2
选取糖蛋白RNase B进行条件优化，fetuin做进一步验证，利用蛋白质SDS-PAGE来探究PNGase F酶切过程中微波时间，酶与底物摩尔比的影响，并与能完全酶切的传统过夜酶切进行对比，得出最适合的酶与底物的摩尔比和微波辐射时间。具体步骤如下：
(1)10μg RNase B采用实施例1的方式变性后；
(2)控制微波辐射时间为20min，分别加入1:10000，1:5000，1:2500，1:1000的酶与底物的摩尔比进行试验，同时与能完全酶切的传统过夜酶切进行对比；
(3)选用步骤(2)中优化后的酶与底物的摩尔比1:1000，在复杂的糖蛋白fetuin作验证试验，结果发现并没有得到预期的结果，故增大酶与底物的摩尔比继续进行实验探究。
试验如下：保持微波辐射时间为20min，分别加入1:1000，1:200，1:100，的酶与底物的摩尔比进行试验，同时与能完全酶切的传统过夜酶切进行对比。
由附图1可知，PNGase F酶与底物的摩尔比为1:100，微波辐射时间20min,能对不同类型的N-糖进行完全释放。
实施例3
采用优化后的微波辅助酶切条件完成RNase B酶切后，加入20μL的AQC溶液和20μL的酶切反应缓冲液，水浴反应。
通过对影响AQC标记反应因素，反应缓冲液的不同种类(磷酸钠缓冲液，碳酸氢铵缓冲液，硼酸钠缓冲液)及浓度(10，20，50，80，100)mM，衍生试剂的浓度(30，50，100，150，200)mM，反应的pH(7.5，8.0，8.5，9.0)，温度(25，40，50，60，70)℃和反应时间(5，10，20，40，60)min进行探究与优化。优化实验采用单一因素分析方法，即选取一种因素做梯度分析，保持其他的因素相同。确定一种因素的条件后，类似地进行其他因素分析。
由附图2得到此反应的最优的反应条件为：在pH为8.5浓度为50mM的碳酸氢铵缓冲溶液中，与浓度为150mM的AQC乙腈溶液40℃下反应20min。
实施例4
由优化后的方法与传统的方法处理后做HPLC N-糖分析，具体步骤如下：
(1)10μg糖蛋白RNase B，fetuin或者10μL的人血清加入pH 8.5的碳酸氢铵缓冲和变性缓冲液，总体积为20μL，其中变性缓冲液为0.48μL。沸水浴10min变性，冷却至室温后加入2.4μL 10％NP-40来抑制变性剂5min。
(2)加入1μL的外切糖苷酶PNGase F，微波辅助酶切20min，为防止样品沸腾，采用样品浮在盛有500mL水的烧杯中于微波炉中700W功率反应。
(3)反应完成后冷却至室温，然后直接加入20μL150mM AQC乙腈溶液和20μL pH8.5的碳酸氢铵缓冲液，震荡混匀，40℃水浴20min，反应完成后，作HILIC SPE纯化后HPLC分析。
(4)HPLC分析(上样量2μg，流动相A为pH＝4.4的甲酸铵，B相为乙腈，柱温40℃，二元洗脱梯度如下：0-5min 68％B,5-65min 68％-43％B,65-75min 43％-95％B，流速为1.0mL/min，AQC荧光激发波长245nm，发射波长395nm；传统方法的2-AA荧光激发波长360nm，发射波长419nm)。
由附图3可知，采用微波辅助快速酶切，AQC直接标记葡糖胺型N-糖，使分析灵敏度增强了10倍左右。
实施例5
10μg糖蛋白RNase B利用上述提出的方法处理后，分别上样0.4-4.0线性梯度做HPLC荧光分析，并通过所得的荧光峰面积进行线性分析。同时，不同的实验人员连续五次进行此实验，进行重复性和重现性分析。
由下表、附图4可知，开发的此方法具有好的重复性和重现性，并且荧光峰迁移时间相对标准偏差小于0.1，荧光峰面积相对偏差为1.1％-8.7％。
实施例6
10μL人血清(正常血清和分期的肺癌患者血清)利用上述提出的方法处理后，上样2μL进行HPLC荧光分析，并将所得的荧光峰面积归一处理，然后通过独立样本T检验和PCA以及ROC曲线分析相对峰含量的变化对比，从而筛选出癌症N-糖标记物。
由附图5可知，通过此技术，对人血清中N-糖进行快速高效的分析，实现了对癌症血清中糖标记物的筛选和癌症的初步诊断。

Claims (2)

1.一种利用高效液相色谱快速高效的N-糖定性与定量分析方法，其特征在于：该方法利用微波辅助的手段加快N-糖的去糖基化反应，并结合衍生试剂AQC来标记直接通过酶切获得的葡糖胺，实现对N-糖的定性和定量分析，具体包括如下步骤：
(1)10μg样品加入pH 8.5的碳酸氢铵缓冲和变性缓冲液中，沸水浴10min变性，冷却至室温后加入2.4μL 10％NP-40抑制变性剂5min；
所述碳酸氢铵缓冲和变性缓冲液的总体积为20μL，其中变性缓冲液为0.48μL；
(2)加入1μL的外切糖苷酶PNGse F，微波辅助酶切20min，微波炉中700W功率反应；
(3)步骤(2)反应完成后冷却至室温，直接加入20μL AQC乙腈溶液和20μL pH 8.5的碳酸氢铵缓冲液，震荡混匀，40℃水浴20min，反应完成后，作HILIC SPE纯化后HPLC分析；
所述乙腈溶液浓度为150mM。
2.如权利要求1所述的一种利用高效液相色谱快速高效的N-糖定性与定量分析方法，其特征在于：步骤(1)中的样品为糖蛋白RNase B、胎球蛋白、人血清中的任一种。
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