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CN107345245A - IL‑1β在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用 - Google Patents

IL‑1β在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用 Download PDF

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CN107345245A
CN107345245A CN201710443459.2A CN201710443459A CN107345245A CN 107345245 A CN107345245 A CN 107345245A CN 201710443459 A CN201710443459 A CN 201710443459A CN 107345245 A CN107345245 A CN 107345245A
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CN
China
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human recombinant
fgf21 protein
recombinant fgf21
expression level
interleukin
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Pending
Application number
CN201710443459.2A
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苏兴利
赵玉峰
魏兰兰
陈镝
闫爱丽
梁向艳
赵妍妍
谢荣
刘英光
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Xian Medical University
Original Assignee
Xian Medical University
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Publication date
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

本发明公开的白细胞介素‑1β(IL‑1β)在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用,以诱导分化的脂肪细胞为对象,采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT‑PCR)检测经不同浓度的人重组FGF21蛋白处理后脂肪细胞内白细胞介素‑1β基因表达水平的升高程度,进而确定人重组FGF21蛋白的活性。本发明发现白细胞介素‑1β基因表达水平与所用人重组FGF21蛋白浓度之间存在良好的量效关系,从而确定脂肪细胞内白细胞介素‑1β基因表达水平成为人重组FGF21蛋白活性检测的新指标,该方法操作过程简单,对环境的要求低,有很好的实用价值。

Description

IL-1β在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用
技术领域
本发明属于白细胞介素应用技术领域,具体涉及一种IL-1β在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。
背景技术
2型糖尿病严重威胁人类健康,其新药研制一直是科研和开发领域的热点,尤其以蛋白类药物开发更为引人注目。在众多的候选蛋白中,成纤维细胞生长因子21(FGF21)是一个研发热点。研究发现,人重组FGF21蛋白可降低肥胖和2型糖尿病患者的血脂、减轻体重、降低血糖、显著减轻2型糖尿病及其并发症。在药物研发中,建立一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物的关键,因此,建立一个客观评价人重组FGF21蛋白治疗糖尿病效果的检测体系也是FGF21研发中的一个重要环节。
目前,普遍采用的FGF21活性检测方法是细胞葡萄糖摄取测定:该方法通过葡萄糖的类似物2-脱氧葡萄糖来测定,2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖,6-磷酸-2-脱氧葡萄糖无法进入后续代谢步骤,因而会在细胞中聚集,直接成比例地反映细胞的葡萄糖摄入水平。该方法检测过程中一是使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖,对于实验防护和环境保护要求较高;另外,检测方法中使用荧光检测方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平,该方法价格昂贵,不利于高通量筛选使用,同时该检测还受到己糖激酶活性的影响,在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。因此,研发新的FGF21功能检测的体系不仅可弥补葡萄糖摄取测定的不足,而且有望获得更为简便可靠的检测方法,这对于客观评价人重组FGF21蛋白效果具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种IL-1β在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用,为判断人重组FGF21蛋白活性提供了新的思路,解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。
本发明所采用的技术方案是,IL-1β在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。
本发明的特征在于,
IL-1β的基因表达水平与人重组FGF21蛋白的添加浓度的关系为:IL-1β基因表达水平由于人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而增大。
IL-1β的基因表达水平通过定量PCR方法检测。
定量PCR方法检测过程中,IL-1β的引物序列为:
上游引物:5’-AAA TAC CTG TGG CCT TGG GC-3’;
下游引物:5’-CTT GGG ATC CAC ACT CTC CAG-3’。
本发明的另一个技术方案,用于判断人重组FGF21蛋白活性的IL-1β,IL-1β基因表达水平被人重组FGF21蛋白浓度上调,且呈剂量依赖性升高。
本发明的特征还在于,
IL-1β为脂肪细胞内的IL-1β。
本发明的有益效果是:本发明通过不同浓度的人重组FGF21蛋白处理脂肪细胞,采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测脂肪细胞内的白细胞介素-1β(IL-1β)的基因表达水平,从而确定脂肪细胞白细胞介素-1β基因表达水平成为人重组FGF21蛋白活性检测的新指标,操作过程简单,对环境的要求低,有很好的实用价值。
附图说明
图1是本发明细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片,A-脂肪细胞光镜图,B-脂肪细胞的油红O染色图;
图2是本发明定量PCR方法中白细胞介素-1β和beta-actin基因的扩增曲线图;
图3是本发明定量PCR方法中PCR产物的溶解曲线;
图4是本发明人重组FGF21蛋白处理细胞12h后对白细胞介素-1β基因表达的影响柱状图;
图5是本发明人重组FGF21蛋白浓度与白细胞介素-1β基因表达水平的量效关系图。
具体实施方式
本发明脂肪细胞内白细胞介素-1β(IL-1β)基因表达水平在人重组FGF21蛋白活性检测的应用,下面结合附图和具体实施方式对本发明应用进行详细说明。
一、细胞培养和处理
小鼠前体脂肪细胞种植于12孔培养板中,在温度37℃孵箱内培养,所用培养液为普通培养液即DMEM培养液,其中加入体积分数10%的新生牛血清,每2天更换新鲜培养液;当细胞生长至接触抑制2天后,更换到诱导培养液,诱导培养液为DMEM培养液,其中加入体积分数10%的新生牛血清、0.3IU/ml胰岛素、20μmol/L地塞米松和20μmol/L罗格列酮,处理2天后;更换到胰岛素培养液,胰岛素培养液为DMEM培养液,其中加入体积分数为10%的新生牛血清和0.3IU/ml胰岛素,继续培养2天后;更换到普通培养液中继续培养,细胞经诱导后可见细胞内脂滴沉积,向脂肪细胞转化,每2天更换新鲜培养液,6天后细胞用于人重组FGF21处理。如图1所示,细胞经诱导分化后全部出现脂滴沉积,转变为成熟的脂肪细胞的显微图片。
在脂肪细胞培养液中分别加入不同浓度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml共8组人重组FGF21蛋白,处理12小时后,脂肪细胞用于RNA提取。
二、脂肪细胞RNA提取和反转录
将12孔板中的培养液去除干净,每孔加入350μL裂解液RL,用细胞研磨棒研磨裂解,再将所有溶液转移至过滤柱CS中以12000rpm的速度离心2min,收集滤液;再向滤液中加入350μL 70%乙醇,混匀并转入吸附柱CR3中以12000rpm的速度离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中;向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1,以12000rpm的速度离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中;向吸附柱CR3中加入80μLDNaseI工作液,室温放置15min;向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1,以12000rpm的速度离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中;向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW,室温静置2min,以12000rpm的速度离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中;重复向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW,室温静置2min,以12000rpm的速度离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3置于室温放置5min以彻底晾干残余的漂洗液;将吸附柱CR3转入RNase-Free离心管中,加入50μL Rnase-Free ddH2O,室温放置2min,以12000rpm的速度离心2min,得到RNA溶液。
酶标仪检测RNA浓度与纯度,琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。在八连管中依次加入2μL 5x gDNA Eraser Buffer,再分别加入1μL gDNA Eraser,再分别加入1μg Total RNA,最后用RNase Free dH2O补足至10μL,混匀,室温反应5min。在各管中分别依次以下试剂,4μL5x PrimeScript Buffer2,4μL RNase Free dH2O,1μL PrimeScript RT Enzyme Mix I,1μL RT Primer Mix,总反应体系为20μL,混匀。反应条件为37℃、反应时间15min,85℃、反应时间5s。反应完成后将cDNA存于温度4℃下备用,长期保存时转入-20℃。
三、白细胞介素-1β基因表达水平的检测
白细胞介素-1β基因表达水平采用定量PCR方法检测,以beta-actin基因的表达作为参考基因。在八连管中依次加入6μL dH2O,2μL模板cDNA,2μL白细胞介素-1β引物,10μLSYBR Premix Ex TaqII(2x),总反应体系为20μL,混匀。
反应条件是:第一步是94℃、5min,第二步是94℃、30s,56℃、30s,72℃、1min依次循环进行40次,第三步是加温溶解扩增产物,获得溶解曲线。
白细胞介素-1β引物序列是:
上游引物:5’-AAA TAC CTG TGG CCT TGG GC-3’;
下游引物:5’-CTT GGG ATC CAC ACT CTC CAG-3’。
Beta-actin的引物序列是:
上游引物:5’-CGT TGG CAT CCA CGA AAC TA-3’;
下游引物:5’-GGT GCT GGG AGG TAC AGG G-3’。
以beta-actin基因表达为参考,对实验结果进行表达水平分析:如图2所示,随着扩增次数的增加,白细胞介素-1β和beta-actin基因的拷贝数在一定扩增次数后呈指数增加,最后到达平台期;如图3所示,获得的溶解曲线表现单峰,说明扩增产物的特异性强;如图4所示,人重组FGF21(美国Peprotech公司产品,浓度100ng/ml)处理细胞12小时可显著增加脂肪细胞内白细胞介素-1β的表达(**表示统计学分析P<0.01,N=6);如图5所示,白细胞介素-1β表达随人重组FGF21(美国Peprotech公司产品,处理细胞12小时)浓度的增加而增加,表现为良好的量效关系。
四、扩增特异性的鉴定
把定量PCR扩增产物进行DNA测序,白细胞介素-1β测序结果如下:
“aaa tac ctg tgg cct tgg gcc tca aag gaa aga atc tat acc tgt cct gtgtaa tga aag acg gca cac cca ccc tgc agc tgg aga gtg tgg atc cca ag”,扩增片段大小为101bp,与美国国家生物技术信息中心报道的白细胞介素-1β的mRNA(序号:NM_008361.4)的碱基序列完全一致。
根据以上实验结果发现,白细胞介素-1β基因表达水平被人重组FGF21蛋白浓度上调,且呈剂量依赖性升高,脂肪细胞内的白细胞介素-1β的基因表达水平能成为人重组FGF21活性检测的新指标。

Claims (6)

1.IL-1β在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述IL-1β的基因表达水平与人重组FGF21蛋白的添加浓度的关系为:IL-1β基因表达水平由于人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而增大。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述IL-1β的基因表达水平通过定量PCR方法检测。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述定量PCR方法检测过程中,IL-1β的引物序列为:
上游引物:5’-AAA TAC CTG TGG CCT TGG GC-3’;
下游引物:5’-CTT GGG ATC CAC ACT CTC CAG-3’。
5.用于判断人重组FGF21蛋白活性的IL-1β,其特征在于,所述的IL-1β基因表达水平被人重组FGF21蛋白浓度上调,且呈剂量依赖性升高。
6.根据权利要求5所述的用于判断人重组FGF21蛋白活性的IL-1β,其特征在于,所述的IL-1β为脂肪细胞内的IL-1β。
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Non-Patent Citations (4)

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