CN107344964B - 靶向akap3的亲和肽p333 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽，序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的多肽是AKAP3抗肿瘤CTL表位肽，较好地诱导特异性CTL应答，提升IFN‑γ的表达量，从而增强肿瘤预防和治疗的效果，可制为一种新型的肿瘤治疗性疫苗甚至食物、保健品。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种多肽。
背景技术
A型激酶锚定蛋白(A-kinaseanchorproteins,AKAPs)是结合蛋白激酶A(PKA)亚基的一组结构不同的蛋白质。大量的证据表明AKAPs在cAMP介导的信号传导中起着重要的作用。AKAP3是一个癌睾抗原。研究表明，AKAP3是精子特有的基因，主要在精子形成过程中减数分裂后表达，在精子前体细胞的形态变化和调节精子功能中起重要作用。在正常组织中，AKAP3表达仅存在于睾丸中。AKAP3的mRNA在各种肿瘤细胞系中广泛表达。研究发现，AKAP3在卵巢癌中高表达，并且AKAP3的表达和肿瘤的组织学分级有关，也与肿瘤的临床分期有关。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种靶向AKAP3的亲和肽或AKAP3来源的抗肿瘤CTL表位肽P333及其应用。
一方面，本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本发明提供了所述多肽的制备方法，该多肽可通过固相合成制得，如采用标准Fmoc方案制备。
另一方面，本发明提供了含所述多肽的食物、保健品或药物组合物，药物组合物可包括多肽及其药学上可接受的载体或赋形剂，其形式可为疫苗。
再一方面，本发明提供了所述多肽用于制备AKAP3表达阳性肿瘤的预防性或治疗性多肽疫苗的用途。
本发明的有益效果为：
本发明的多肽是AKAP3抗肿瘤CTL(细胞毒性T淋巴细胞)表位肽，较好地诱导特异性CTL应答，提升IFN-γ的表达量，从而增强肿瘤预防和治疗的效果，可制为一种新型的肿瘤治疗性疫苗甚至食物、保健品。
附图说明
图1表征ELISPOT法检测表位肽体外特异性CTL分泌IFN-γ的能力；
图2表征LDH法检测表位肽体外特异性CTL细胞毒性；
图3表征ELISPOT法检测表位肽体内特异性CTL分泌IFN-γ的能力；
图4表征LDH法检测表位肽体内特异性CTL细胞毒性；
图5表征ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ的分泌量；
图6为转基因小鼠体重变化图。
各图中所涉*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001分别代表实验组与PBS组的显著性差异；▲P<0.05，▲▲P<0.01和▲▲▲P<0.001分别代表实验组与HBcAg18–27或者Th表位组的显著性差异。
具体实施方式
本发明的候选肽P333，其序列为LIDSFLRNL(Leu-Ile-Asp-Ser-Phe-Leu-Arg-Asn-Leu)，如SEQ ID NO.1所示，采用标准Fmoc方案进行固相合成，经质谱检测其分子量为：1091.7[M+H]，基本同理论值1090.3。下面鉴定该候选肽(有时亦称表位肽)的活性，所用实验方法、试剂均为常规选择，参见文献：Shi RR,Liu J,Zou Z,Qi YM,Zhai MX,Zhai WJ,GaoYF:The immunogenicity of a novel cytotoxic T lymphocyte epitope from tumorantigen PL2L60 could be enhanced by 4-chlorophenylalanine substitution atposition 1.Cancer immunology,immunotherapy:CII 2013,62(11):1723-1732。如无特别说明，所涉名词、缩写均为本领域常规含义。
1.T2A2细胞亲和力实验
①收集T2A2细胞，用无血清IMDM洗3次，调整细胞浓度至1×106/mL，铺于24孔板中，1mL/孔。实验组加入2.5μg/mL的β2微球蛋白，50μM的候选肽P333；设置阳性组、阴性组、背景对照组。于37℃、5％CO2培养箱中共孵育18h。
②收集孵育后的细胞，用冰PBA洗3次，加入0.5mL 1:100稀释的单克隆抗体BB7.2，4℃避光孵育30min。
③冷PBA洗3次，加入50μL稀释度为1:50的FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃避光孵育40min。冷PBA洗涤1次，1mL PBA重悬，上流式细胞仪进行检测。同时，设置已被鉴定的HBcAg18-27作为结合力和稳定性实验的阳性肽，PBS作为阴性对照，未加肽刺激的单纯T2A2细胞作为背景对照。
结果用荧光系数(FI)表示：荧光系数(FI)＝(表位肽平均荧光强度－背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。结果分析：如果FI>1.5：候选肽与HLA-A*0201具有强亲合力；1.5>FI>0.5：中等亲合力；FI<0.5：弱亲合力。
经分析，本肽的FI＝2.86。
2.肽/MHC复合物稳定性分析
收集T2A2细胞，用无血清IMDM洗3次，调整细胞浓度至1×106/mL，铺于24孔板中，1mL/孔。分别加入50μM的候选肽，设置阳性组、阴性组、背景组和调零组，每孔加入2.5μg/mL的β2微球蛋白，于37℃、5％CO2培养箱中共孵育18h。
孵育完成后，以冷PBA洗涤3次以洗净未结合的肽，加入10μg/mL BrefeldinA(布雷菲德菌素A)孵育1h。以0h、2h、4h、6h为时间点，37℃、5％CO2共孵育。冷PBA洗涤2次，加500μL稀释度为1:100的单克隆抗体BB7.2，4℃避光孵育30min。冷PBA洗涤2次，加50μL稀释度为1:50的FITC-羊抗鼠IgG，4℃避光孵育40min。冷PBA洗涤后，PBA重悬细胞，于流式细胞仪检测，结果以DC50表示。
经检测，DC50>6h。
3.体外免疫活性检测
细胞毒T淋巴细胞体外诱导
①40mL离心管中加入适量肝素钠溶液，抽取HLA-A2阳性健康志愿者外周血20ml，无菌pH＝7.2的PBS将抗凝血进行稀释。
②将4mL的淋巴细胞分裂液贴壁缓缓加入无菌的离心管，随后加入经PBS稀释过的抗凝血，注意不要打破界面。2000rpm，离心20min。
③离心结束后，离心管中细胞从上至下分为四层；弃去第一层血浆层，吸取第二层环状乳白色的淋巴细胞层，置于另一无菌离心管中，随后加入5倍体积的PBS洗涤，2000rpm，15min。
④弃上清，收集沉淀。用含10％胎牛血清的IMDM培养基调整细胞浓度为1×106/mL，置于24孔板中培养。
⑤设定PBS组、HBV组、实验组，第2天HBV组、实验组分别加入相对应的多肽和β2-M(两者终浓度均设为10μg/ml)，PBS组加入相对应的PBS，第3天加入50U/mL的重组人源IL-2(rh IL-2)，观察培养液状态，进行半量换液，补加rh IL-2。每7天进行一轮重复刺激，刺激过程：24孔板进行1000rpm，10min离心，去除上清，加入新鲜的含10％胎牛血清的IMDM培养基，同时补加上述量相对应的多肽、rh IL-2和β2-M，第2轮刺激的第3天加入CD3抗体。
⑥完成3轮刺激后，继续培养2-3天，收集细胞即作为效应CTL。
免疫活性检测
1)ELISPOT(Enzyme-linked Immunospot Assay酶联免疫斑点实验)法检测分泌IFN-γ的T细胞数
a.首先进行预包被板的活化：
取出所需ELISPOT板条，每孔加200μL无血清的IMDM培养基进行封闭，静置10min后将培养基弃去；
b.细胞铺板：
诱导的CTL作为效应细胞，荷肽的T2A2作为刺激细胞，细胞浓度均调整为2×106个/mL；实验孔每孔加50μL效应细胞和50μL刺激细胞；
阴性对照孔每孔加100μL无血清的IMDM培养基；
阳性对照孔每孔加50μL的效应细胞和10μL PHA再补加40μL无血清的IMDM培养基培养。
铺板完毕放于培养箱中，37℃、5％CO2孵育18h；
c.细胞裂解：
孵育结束后，倾尽孔中培养基，每孔加入200μL无菌的去离子水，4℃裂解细胞10min；倾尽孔内液体，加入200μL 1×Washing Buffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕后，在吸水纸上拍干；
d.加入检测抗体孵育：
加入100μL生物素标记的抗体，37℃孵育1h；孵育完成后，倾尽孔内液体，加入200μL 1×Washing Buffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕后，在吸水纸上拍干；
e.加入酶联亲和素孵育：
加入100μL酶联亲和素，37℃孵育1h；孵育完成后，倾尽孔内液体，每孔加入200μL1×Washing Buffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕后，在吸水纸上拍干；
f.显色：
加入100μL现配的AEC显色液，室温25℃避光静置30min，进行显色；显色完成后，倾尽孔内液体并打开孔板底座，去离子水洗涤，终止显色。置于通风处，室温静置干燥；用ELISPOT图像分析仪计数96孔板中每孔的斑点数，结果比较如图1所示。
2)LDH(Lactate Dehydrogenase乳酸盐脱氢酶)法检测细胞毒性实验
①靶细胞、效应细胞的准备
本实验中将SW620作为靶细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，每孔加入5000个/50μL，加入不同数量和体积的效应细胞(前面体外诱导制备)，使实验组形成不同的效靶比(分别为12.5:1、25:1、50:1)，并补加无血清的IMDM培养基至总体积100μL，每组设置3个复孔。
同时设立以下对照：
靶细胞自发释放组
靶细胞最大释放组
效应细胞自发释放组
背景对照组
总体积校正对照组，各对照组也设3个复孔，每孔总体积100μL。
②LDH实验步骤：
细胞培养板96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养4h。孵育结束前45min，加入10μL 10×裂解液添加在靶细胞最大释放孔和体积校正孔中。培养结束后，离心培养板1000rpm，10min；取出96孔板，每孔轻轻吸取50μL上清置于另一96孔板对应的孔中，全部转移结束后，每孔迅速加入50μL乳酸脱氢酶底物混合液，室温避光孵育30min；孵育结束后，每孔添加50μL终止液；酶标仪上以490nm检测吸收OD值，计算杀伤率。
杀伤率＝(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释)×100％。
结果比较如图2所示。
4.AKAP3的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠体内免疫活性检测
效应CTL的体内诱导
随机选取6～8周龄HLA-A2.1/Kb转基因小鼠，每组5只，雌雄随机分配。
实验共设置PBS组、Th表位组、实验组。每组注射小鼠体内的剂量如下：
PBS组：PBS：弗氏不完全佐剂(IFA)＝1:1
Th组：PBS：Th表位：弗氏不完全佐剂(IFA)＝1:1:2
实验组：实验组：Th表位：弗氏不完全佐剂(IFA)＝1:1:2
第1次免疫注射记为第0天，按照上面所给各个组分进行皮下免疫注射，在第5d、第10d时进行第2次和第3次加强免疫；同时每次免疫注射前，对HLA-A2.1/Kb转基因小鼠进行观察，记录体重，结果如图6所示。
制备效应细胞：
①将免疫注射后的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠于第11d脱颈处死，置于75％酒精中，浸泡处理10min消毒后，无菌开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织放于200目不锈钢网筛中；
②培养皿中加入少量pH＝7.2的PBS，并将200目钢网置于其上，用20mL医用注射器内芯进行研磨，尽量研磨干净。PBS冲洗，移去筛网，培养皿中得脾细胞悬液(约10mL)，转移至无菌离心管中；
③1000rpm、10min水平离心，弃上清，收集细胞；每管加入5mL红细胞裂解液，轻轻吹打重悬细胞，4℃孵育15min裂解红细胞；1000rpm、10min水平离心弃上清，收集细胞。PBS洗涤2次；
④将脾细胞重悬于10mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。计数后的脾细胞悬液置于6孔板中培养，每孔5mL细胞悬液；次日每孔加入250U重组鼠源IL-2、β2-M以及与相对应的多肽；在37℃、5％CO2培养箱中培养5d，收获后作为效应细胞，进行ELISPOT和LDH检测。ELISPOT和LDH检测方法同前面体外免疫实验所用方法，ELISPOT法检测结果如图3所示，LDH法检测结果如图4所示。
HLA-A2.1/Kb转基因小鼠血清中IFN-γ酶联免疫分析(ELISA)
在转基因小鼠脱颈处死之前，用眼球取血的方法取各组免疫小鼠静脉血，室温静置2-4h后，3000rpm离心10分钟取上层血清，标记好后-80℃保存。ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ抗体水平，结果比较如图5所示。
序列表
<110> 漯河医学高等专科学校
<120>靶向AKAP3的亲和肽P333
<160> 1
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213>人工合成
<400> 1
Leu Ile Asp Ser Phe Leu Arg Asn Leu
1 5
Claims (1)
1.多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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