CN107338320A - 一种结直肠癌 slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒 - Google Patents
一种结直肠癌 slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107338320A CN107338320A CN201710743631.6A CN201710743631A CN107338320A CN 107338320 A CN107338320 A CN 107338320A CN 201710743631 A CN201710743631 A CN 201710743631A CN 107338320 A CN107338320 A CN 107338320A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- colorectal cancer
- sequence
- base sequence
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 101150087759 SLFN11 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 8
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 claims description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 101000864269 Homo sapiens Schlafen family member 11 Proteins 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 102100029918 Schlafen family member 11 Human genes 0.000 description 7
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 4
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 3
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 1
- 102100036279 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008051 Hereditary Nonpolyposis Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010051922 Hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000931098 Homo sapiens DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005027 Lynch syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 241000212335 Perideridia gairdneri Species 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 239000000686 essence Substances 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 125000005909 ethyl alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 238000011248 postoperative chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- 229940079827 sodium hydrogen sulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒，包括M‑forward、M‑reverse引物对及U‑forward、U‑reverse引物对；M‑forward的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，M‑forward的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，U‑forward的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，U‑reverse的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。本发明所述的引物组能够实现对处理后甲基化DNA链进行扩增进而得到扩增片段，进而能够判定该位点是否存在甲基化，对确定不同病人的特定治疗方案，采取更加精准的医疗手段起到重要的临床意义。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，尤其是涉及一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒。
背景技术
结直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60％。发病多在40岁以后，男女之比为2:1。大肠癌的治疗以手术切除癌肿为首选，辅之以放射治疗、化疗药物治疗及中医药治疗等；最近不少学者对早期大肠癌采用经内镜下切除治疗，也取得较好疗效。大肠癌根治术后，仍有50％的病例复发和转移，因此术前、术后化疗有可能提高根治术后5年生存率。抗癌药物首选氟脲嘧啶，其次为丝裂霉素和阿霉素。
DNA损伤修复和检查点控制缺陷可能导致基因突变和染色体不稳定，促进肿瘤发生。家族性腺瘤息肉病和林奇综合症，这是由基因突变引起的DNA错配修复系统，占所有CRC不到5％。DNA损伤修复基因的异常甲基化变化是CRC发展的一个重要机制。
SLFN基因产物已被证明参与细胞生物过程包括增殖、分化和免疫功能。SLFN11通过使得同源重组修复的中间产物RPA-ssDNA的不稳定，抑制同源重组修复和细胞周期检验点的持续激活，进而使得肿瘤细胞对基于诱导DNA损伤的化疗药物十分敏感，促进肿瘤细胞的死亡。由于SLFN11在不同肿瘤细胞中的表达量有很大差异，因此对不同病人肿瘤中SLFN11的表达量进行前期检测将对确定不同病人的特定治疗方案，采取更加精准的医疗手段起到重要的临床意义。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒，以解决现有的技术难以实现对结直肠癌SLFN11基因甲基化预后的检测的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测引物组，包括M-forward、M-reverse引物对及U-forward、U-reverse引物对；M-forward的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，M-forward的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，U-forward的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，U-reverse的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase，DNMT)催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的5号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因表达及基因组的稳定性中起着重要的作用。甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
相对于现有技术，本发明所述的引物组具有以下优势：
本发明所述的引物组能够实现对处理后甲基化DNA链进行扩增进而得到扩增片段，进而能够判定该位点是否存在甲基化，对确定不同病人的特定治疗方案，采取更加精准的医疗手段起到重要的临床意义。
上述引物组在制备用于检测结直肠癌SLFN11基因甲基化状态的试剂中的应用。
一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测试剂盒，包含以下任意一种或多种：
1)SEQ ID No：1～SEQ ID No：4；
2)SEQ ID No：1～SEQ ID No：4所示序列中每条序列的互补链；
3)与SEQ ID No：1～SEQ ID No：4所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
使用上述引物组或试剂盒进行PCR时，其特征在于：
反应体系如下：
反应流程如下：
使用上述引物组或试剂盒检测对顺铂敏感性的方法，包括如下步骤：
S1：从样品中提取DNA；
S2：对步骤S1中的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
S3：MSP反应即使用权利要求1提供的引物对S2中得到的DNA进行扩增；
S4：将MSP反应产物进行凝胶电泳检测，查看电泳结果。
进一步的，MSP反应的反应体系及反应流程如下：
反应体系：
反应流程：
步骤S4中当检测得到扩增片段说明SLFN11基因位点存在甲基化，即对顺铂不敏感；反之，步骤S4中当检测不到扩增片段说明被检测的SLFN11基因位点不存在甲基化，对顺铂敏感。
上述结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测引物组具有益之处本结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测试剂盒及检测对顺铂敏感性的方法也一应具有，在此不一一赘述。
附图说明
图1为电泳结果示意图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。其中：
M-forward、M-reverse、U-forward、U-reverse均由我公司设计并交由苏州金唯智生物科技有限公司采用现有方法合成；当然M-forward、M-reverse、U-forward、U-reverse也可采用其他现有方法合成。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测引物组，包括M-forward、M-reverse引物对及U-forward、U-reverse引物对；M-forward的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，M-forward的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，U-forward的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，U-reverse的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
使用上述引物组检测对顺铂敏感性的方法，包括如下步骤：
S1：从样品中提取DNA。采用常规现有方法即可。
本实例中从样品中提取DNA具体为(1)取保存于-70℃癌组织的组织，用手术刀片将组织切下，确定组织量，不多于25mg；
(2)将25mg组织切成小块，放入1.5ml离心管中，加入180μL BuferATL；
(3)加入20μL proteinase K，震荡混匀，56℃孵育直到组织完全裂解；
(4)短暂离心5s；
(5)加入200μL Bufer AL，震荡混匀15s，70℃孵育10min，短暂离心5s；
(6)加入200μL无水乙醇，震荡混匀15s，短暂离心5s；
(7)将上述液体转入QIAamp Mini spin column，8000rpm离心1min，弃废液；
(8)加入500μL Buffer AW1，8000rpm离心1min，弃废液；
(9)加入500μL Buffer AW2，14000rpm离心3min，弃废液；
(10)全速离心1min；
(11)将QIAamp Mini spin column放入新的1.5ml离心管中，室温放置1min晾干，加入200μL Buffer AE，室温放置1min，8000rpm离心1min；
(12)重复步骤(11)，检测DNA浓度。
上述短暂离心的速度为：8000rpm，全速离心的速度为：12000rpm。
S2：对步骤S1中的DNA进行亚硫酸氢盐处理。采用常规现有方法即可。
本实例对步骤S1中的DNA进行亚硫酸氢盐处理具体为(1)解冻亚硫酸氢盐反应所需的DNA；加入800μL RNase-free的水溶解所需的亚硫酸氢盐，充分震荡混匀，直到完全溶解；亚硫酸氢盐优选为亚硫酸氢钠(本实例中亚硫酸氢钠浓度为3.6mol/L)。
(2)按表1配制反应液，加到200μL PCR管中；
表1
| Component | Volume per reaction(μL) |
| DNA solution(1ng–2μg) | Variable*(maximum 20μL) |
| RNase-free water | Variable* |
| Bisulfite Mix(dissolved),see step 1 | 85 |
| DNA Protect Buffer | 35 |
| Total volume | 140 |
其中DNA solution(1ng–2μg)Variable*(maximum 20μL)是指DNA solution的添加量可变，但是最多为20μL，且里面DNA的含量在1ng–2μg；
(3)盖上管盖，亚硫酸氢盐充分反应，室温放置；
(4)使用PCR仪进行亚硫酸氢盐DNA的转换，按表2设置程序；
表2
(5)将PCR管放置在PCR仪上，进行上述反应；
(6)反应完成后，短暂离心5s，转入到新的1.5ml离心管中；
(7)加入560μL包含10μg/ml carrier RNA的Buffer BL到每个样本中。震荡混匀，离心5s；
(8)将上述液体转入到EpiTect spin column中；
(9)全速离心1min，弃废液；
(10)加入500μL Buffer BW，全速离心1min，弃废液；
(11)加入500μLL Buffer BD，室温下放置15min；
(12)全速离心1min，弃废液；
(13)加入500μL Buffer BW，全速离心1min，弃废液；
(14)重复步骤(13)1次；
(15)全速离心1min；
(16)将spin column放入新的1.5ml离心管中，开盖56℃孵育5min；
(17)将spin column放入新的1.5ml离心管中，加入20μL Buffer EB,12000rpm离心1min。
本实例中全速离心速度为：12000rpm；短暂离心速度为：8000rpm
S3：MSP反应即使用权利要求1提供的引物对S2中得到的DNA进行扩增。
(1)选择基因：SLFN11。
(2)SLFN11的引物序列如表3所示。
表3
(3)MSP反应体系及流程
反应体系如表4所示：
表4
其中each primer 1μL(10uM)即SEQ ID No：1～SEQ ID No：4分别加入1μL(10uM)。each dATP，dCTP，dGTP and dTTP 2μL(2.5mM)即dATP，dCTP，dGTP and dTTP分别加入2μL(2.5mM)。
反应流程如表5所示：
表5
S4：将MSP反应产物进行凝胶电泳检测，查看电泳结果。
电泳结果如图1所示，当出现M时说明：SLFN11存在甲基化，相应的基体对顺铂不敏感；
当出现U时说明：SLFN11为非甲基化，相应的基体对顺铂敏感。既M为SLFN11基因甲基化，U为SLFN11基因未甲基化。若SLFN11基因甲基化，则M处显示条带，患者对顺铂不敏感；若SLFN11基因没有发生，则M处不显示条带，患者对顺铂敏感。
采用本申请提供的引物检测的灵敏度81.7％，特异性69.3％，检测准确度达99％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津艾至恩医疗科技有限公司
<120> 一种结直肠癌 SLFN11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒
<130> AZEYL1702
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attattagta gcgtgacggt tatc 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacaaatat acaaattaaa ccgcg 25
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatattatta gtagtgtgat ggttatt 27
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atacaacaaa tatacaaatt aaaccaca 28
Claims (7)
1.一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测引物组，其特征在于：包括M-forward、M-reverse引物对及U-forward、U-reverse引物对；M-forward的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，M-forward的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，U-forward的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，U-reverse的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
2.权利要求1的引物组在制备用于检测结直肠癌SLFN11基因甲基化状态的试剂中的应用。
3.一种结直肠癌SLFN11基因甲基化预后检测试剂盒，其特征在于：
包含以下任意一种或多种：
1)权利要求1的引物组；
2)SEQ ID No：1～SEQ ID No：4所示序列中每条序列的互补链；
3)与SEQ ID No：1～SEQ ID No：4所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
4.使用权利要求1所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒进行PCR时，反应体系如下：
反应流程如下：
5.使用权利要求1的引物组或权利要求3所述的试剂盒检测对顺铂敏感性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：从样品中提取DNA；
S2：对步骤S1中的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
S3：MSP反应即使用权利要求1所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒对S2中得到的DNA进行扩增；
S4：将MSP反应产物进行凝胶电泳检测，查看电泳结果。
6.根据权利要求5所述的检测对顺铂敏感性的方法，其特征在于：MSP反应采用权利要求4中的反应体系及反应流程。
7.根据权利要求5所述的检测对顺铂敏感性的方法，其特征在于：
步骤S4中当检测得到扩增片段说明SLFN11基因位点存在甲基化，即对顺铂不敏感；反之，步骤S4中当检测不到扩增片段说明被检测的SLFN11基因位点不存在甲基化，对顺铂敏感。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710743631.6A CN107338320A (zh) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | 一种结直肠癌 slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710743631.6A CN107338320A (zh) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | 一种结直肠癌 slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107338320A true CN107338320A (zh) | 2017-11-10 |
Family
ID=60214120
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710743631.6A Pending CN107338320A (zh) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | 一种结直肠癌 slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107338320A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102686744A (zh) * | 2009-11-05 | 2012-09-19 | 基因特力株式会社 | 用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法 |
| WO2013012781A2 (en) * | 2011-07-15 | 2013-01-24 | The Johns Hopkins University | Genome-wide methylation analysis and use to identify genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence |
| CN102936597A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-02-20 | 温州医学院 | 一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物 |
| US20130137584A1 (en) * | 2010-02-01 | 2013-05-30 | The Regents Of The University Of California | Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies |
| CN104878121A (zh) * | 2015-06-29 | 2015-09-02 | 黄文林 | 一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒 |
| CN105624273A (zh) * | 2014-11-04 | 2016-06-01 | 香港中文大学深圳研究院 | 结直肠癌的检测引物、方法及试剂盒 |
-
2017
- 2017-08-25 CN CN201710743631.6A patent/CN107338320A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102686744A (zh) * | 2009-11-05 | 2012-09-19 | 基因特力株式会社 | 用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法 |
| US20130137584A1 (en) * | 2010-02-01 | 2013-05-30 | The Regents Of The University Of California | Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies |
| WO2013012781A2 (en) * | 2011-07-15 | 2013-01-24 | The Johns Hopkins University | Genome-wide methylation analysis and use to identify genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence |
| CN102936597A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-02-20 | 温州医学院 | 一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物 |
| CN105624273A (zh) * | 2014-11-04 | 2016-06-01 | 香港中文大学深圳研究院 | 结直肠癌的检测引物、方法及试剂盒 |
| CN104878121A (zh) * | 2015-06-29 | 2015-09-02 | 黄文林 | 一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TAO HE ET AL: "Methylation of SLFN11 is a marker of poor prognosis and cisplatin resistance in colorectal cancer", 《EPIGENOMICS》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101912731B1 (ko) | 조기 대장암 검출을 위한 혈장 마이크로rna | |
| CN105624274B (zh) | 肿瘤靶向药物相关基因突变高通量检测方法、引物及试剂 | |
| CN101831490A (zh) | 一种利用pax1和cdh1基因甲基化检测宫颈癌的方法和试剂盒 | |
| Gleeson et al. | Kinase genotype analysis of gastric gastrointestinal stromal tumor cytology samples using targeted next-generation sequencing | |
| CN107400710A (zh) | 一种用于met基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒 | |
| CN102776286B (zh) | 用于检测ros1基因融合突变的引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN105177141B (zh) | 在外周血游离dna中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的试剂盒及其引物对组 | |
| CN112410424A (zh) | 一种nk/t细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒及建库方法 | |
| EP3814534A1 (en) | Methods and compositions for improved multiplex genotyping and sequencing | |
| JP7622093B2 (ja) | 腫瘍検出試薬及びキット | |
| CN107513578A (zh) | 一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法 | |
| Zhuo et al. | LINE-1 hypomethylation in normal colon mucosa is associated with poor survival in Chinese patients with sporadic colon cancer | |
| CN107586842A (zh) | 一种用于肾透明细胞癌诊治的生物标志物 | |
| CN113122636A (zh) | 检测dna甲基化的试剂及用途 | |
| CN106148497A (zh) | Braf基因突变检测试剂盒及其应用 | |
| CN110387418A (zh) | 一种结直肠癌诊断试剂盒 | |
| CN105603117B (zh) | miR-3613用于区分肺鳞癌转移与非转移的miRNA标志物 | |
| CN116970705B (zh) | 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用 | |
| CN107338320A (zh) | 一种结直肠癌 slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒 | |
| CN106119361B (zh) | 用于胃癌早期诊断及预后评估的ndrg4基因甲基化检测的试剂盒及其应用 | |
| CN105063052B (zh) | 急性髓系白血病miRNA标记物 | |
| CN107267626A (zh) | 一种基于dna甲基化检测肝癌的试剂盒及应用 | |
| CN104774966B (zh) | 肺腺癌miRNA标记物 | |
| CN105255869B (zh) | ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒 | |
| Chen et al. | Hypermethylation of the pl5INK4B gene in acute leukemia and myelodysplastic syndromes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171110 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |