CN1073155C

CN1073155C - 2－酮－l－古洛糖酸的生产方法

Info

Publication number: CN1073155C
Application number: CN95192699A
Authority: CN
Inventors: 丹羽峰雄; 齐藤善正; 石井芳则; 吉田胜; 林宽美
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-02-25
Filing date: 1995-02-24
Publication date: 2001-10-17
Anticipated expiration: 2015-02-24
Also published as: EP0758679A4; CN1146780A; WO1995023220A1; US5888786A; CA2183632A1; KR970701262A; EP0758679A1; US5834263A; CN1332249A

Abstract

能由D-山梨糖醇高产L-山梨糖、且无2-酮-L-古洛糖酸降解活性或活性很低，除这些性质外，宿主微生物还无L-艾杜糖产出活性或活性很低。这种微生物可由同时含有编码L-山梨糖脱氢酶的DNA及编码L-山梨糖醛酮脱氨酶的DNA的表达载体转化而成为具有从D-山梨糖醇高产2KLGA能力的转化体，及该转化体在含有D-山梨糖醇的培养基上培养而生产2KLGA的生产方法。根据本发明。在生产L-抗坏血酸时使用的2KLGA，通过一次培养就能简便，大量地高效生产。

Description

2-酮-L-古洛糖酸的生产方法

技术领域

本发明是涉及通过基因工程技术简便、有效地生产L-抗坏血酸前体-2-酮-L-古洛糖酸(此后也称为2KLGA)的方法。

本发明还涉及有效生产2-酮-L-古洛糖酸所运用的一系列表达体系。

发明背景

2-酮-L-古洛糖酸是合成L-抗坏血酸的一个关键性中间体。在工业生产中，2-酮-L-古洛糖酸是根据Reichstein’s方法由D-山梨糖醇氧化而化学合成的。已经知道包括葡萄糖酸杆菌属在内的多种微生物都能通过酶促氧化反应将D-山梨糖醇转化为2-酮-L-古洛糖酸。并且葡萄糖酸杆菌属的微生物，通过采用接合转移及转座子的基因工程技术加以改良。然而这类微生物的2-酮-L-古洛糖酸的产量很低，所以一直无法在工业生产中运用它们。

有鉴于此，寻找到一个高效、简便的方法来生产2-酮-L-古洛糖酸是人们迫切的愿望。

众所周知，在微生物产生诸如2-酮-L-古洛糖酸等二级代谢产物时，仅在质粒中插入能对某物质进行生物合成的一个基因(组)并培养用该质粒重组转染的微生物细胞体，并不一定就能增加所欲获得产物的产量，相反却有可能导致产量的下降[Thomas,D.I.et al.,J.Gen.alicrol.,137,pp.2331-2337(1991)]。

发明内容

本发明的目的是提供含有编码L-山梨糖脱氢酶(此后称为SDH)及编码L-山梨糖醛酮脱氢酶双方DNA的表达载体，用所述的表达载体转化的可由D-山梨糖醇高产2KLGA的转化体，以及通过培养该转化体高效、简便生产2-酮-L-古洛糖酸的生产方法。

为了达到上述提及的目标，发明者进行了大量深入的研究，并获得了具备上述优化性质的表达载体，并进一步发现2-酮-L-古洛糖酸可以通过一系列培养体系由D-山梨糖醇高效制备。这些过程包括将上述表达载体导入高效L-山梨糖且2-酮-L-古洛糖酸降解活性低的微生物宿主体中，或将其导入除上述提及特性外同时具有L-艾杜糖酸产出活性较低的微生物宿主中，本发明的全部过程即如此。

因此，本发明涉及含有编码山梨糖脱氢酶DNA(此后称为SDH基因)及编码山梨糖醛酸DNA(此后称为SNDH基因)的表达载体。

本发明还涉及由D-山梨糖醇高效生产L-山梨糖及无或低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性的微生物，或除具备上述特性同时又无或仅具备低的L-艾杜糖酸产出活性的微生物。该微生物是在将上述表达载体导入时非常有用的宿主。本发明的表达载体不仅包括具备SDH基因和SNDH基因的载体，也包括具有各自基因的一组载体。

本发明也涉及已导入了上述表达载体的微生物转化体，它能由D-山梨糖醇高产2KLGA。

另外，本发明涉及生产2KLGA的生产方法，包括在含D-山梨糖醇的培养基中培养上述转化体并由此获得2KLGA为特征的方法。

此外本发明涉及通过遗传重组方法由D-山梨糖醇高效、简易地生产2KLGA所用的表达载体、宿主、质粒及转化方法。

附图的简要说明图1是质粒pUC18SD180的限制酶切图谱图2是质粒pUC19SD5的限制酶切图谱图3是质粒pF2、pF3及pF4的限制酶切图谱图4显示穿梭载体pFG5B的构建图5显示穿梭载体pFG14A的构建图6显示穿梭载体pFG15A的构建图7是质粒pSD5-RIBg的酶切图谱图8显示表达载体pSDH145的构建图9显示表达载体pSDH155的构建图10显示表达载体pSD33的构建图11显示表达载体pSD34的构建图12显示表达载体pSDH155-NC的构建图13显示表达载体pSDH155-NN的构建图14显示表达载体pSDH165-NN的构建图15显示表达载体pSDH-tufB1的构建

发明的详细说明(1)表达载体

本发明的表达载体同时含有编码SDH基因的DNA及编码SNDH基因的DNA。

本发明的表达载体是整合有处于表达状态的SDH基因及SNDH基因的DNA分子，并包含能在宿主微生物体中自主复制或能够整合进入宿主微生物基因组中的任何载体。

优选的表达载体是可由D-山梨糖醇高产L-山梨糖，且无2-酮-L-古洛糖酸降解活性或活性低的宿主微生物，以及除了具备上述特性，还无L-艾杜糖酸产出活性或活性低的宿主微生物，使其成为具有由D-山梨糖醇高产2KLGA为特性的微生物，并使其成为适合转化的表达载体。

这种表达载体的典型例证以下列载体为佳，它至少含有在由D-山梨糖醇高效产出L-山梨糖的微生物体中有很高启动子活性的启动子、SDH基因、SNDH基因、自主复制单元及可选择的终止子区域等成分，而且这些成分能在该微生物中稳定存在。最优的选择是它们属于葡萄糖酸杆菌属或醋酸杆菌属的微生物-这些微生物能够由D-山梨糖醇高效产出L-山梨糖，无2KLGA的降解活性或活性很低，并且这些微生物除了具备上述特性外，还无L-艾杜糖酸产出活性或活性很低，使之成为可由D-山梨糖醇高效产出2-酮-L-古洛糖酸的微生物。并成为适合转化的表达载体。

如同表达载体一样，穿梭载体除了带有能在宿主微生物体中稳定的正常表达的自主复制单元外，还带有能在诸如大肠杆菌等微生物体内中自主复制单元并适合于克隆该表达载体，这一点是有益处的。穿梭载体若带有诸如抗生素抗性基因等标记基因是优选的。

本发明中优选的穿梭载体实例为由pHSG298和pF3及pFG15A和pFG15B组合而成的pFG14A和pFG14B，以及由pHSG298和pF4组合而成的pFG15B。

本发明所使用的标记基因的典型实例为药物抗性基因，包括卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、湿霉素抗性基因、营养缺陷基因及诸如LacZ类酶基因。

本发明中的表达载体所用启动子并无特别限定，只要求它能在宿主微生物体中具有能表达SNDH和/或SDH基因的启动子活性。在可由D-山梨糖醇高产L-山梨糖的宿主微生物体内转录表达SNDH和/或SDH基因的高活力启动子是最优选择。作为该类启动子之一，其中一个带有SNDH基因并有启动子活性部分的启动子来做例证。该特例中SNDH基因的启动子区域是来自氧化葡糖杆菌T-100，此基因是序列表中SQID No.5核苷酸1-1040序列，它的一部分同时具有启动子活性。启动子的实例还包括源自大肠杆菌的启动子，例如tufB、λPL、trp、tac、lac UV5、lap、lac、ompA、phoA、recA和rrnB启动子，其中tufB、λPL、trp和tac启动子是较优选择。-35处及-10处区域的序列应适当地选择以便于构建质粒。自主复制单元是宿主细胞以外的能够复制DNA序列的DNA化合物，包括源自天然质粒，人工修饰质粒(例如由天然质粒制备的DNA片段)及合成质粒。

本发明中所选用自主复制单元可按照作为宿主的微生物加以适当地选择。优选源自宿主是同样的微生物中质粒的自主复制单元。例如，当宿主属于葡萄糖酸杆菌属微生物时，源自葡萄糖酸杆菌属的质粒即为优化选择。

含有此类自主复制单元的质粒大小为1-100kb，最好为1-10kb，而优选带有可用的限制性酶识别位点。

在此可用的限制性酶识别位点是指对某种限制酶的切割位点加以限定，并且即使被限制酶切割或在该位点处插入DNA序列，也不会导致复制单元的活性丧失。如上所述，在该位点能够自由地操作以切割位点或插入选择的DNA片段将很有益处。此类质粒的实例有源自葡萄糖酸杆菌IAM 12138的pF3质粒及源自葡萄糖酸杆菌T-100的pF4质粒。

作为适合于克隆的微生物自主复制单元并无特别限定，只要是源自基因工程领域中基因克隆通用的微生物中质粒的复制单元即可。优选实例为下列质粒中的自主复制单元，它们包括源自大肠杆菌的pBR322、pUC18、pHSG 396、pACYC 184及pACYC 177等质粒和源自大肠杆菌的人工修饰质粒(例如通过适当限制酶切割后质粒pBR 322中的DNA片段)，以及源自酵母的酵母2μ质粒。

本发明中SDH及SNDH基因在表达载体中的状态并无特别限定，只要SDH及SNDH基因能够表达即可。

例如，本发明的表达载体，SDH基因和SNDH基因的转录与翻译可以由不同的表达系统所控制的状态包含该基因，两种基因也可以由同一套表达系统控制的状态包含该基因。

前一种状态的表达载体的例证是该载体在构建时每一种基因的转录在不同的启动子控制之下，而后一种状态的表达质体的例证是该载体在构建时SDH基因及SNDH基因的转录处于一个启动子控制之下连续进行。

本发明的表达载体可能带有多个SDH基因和/或SNDH基因。

本发明中所用编码SDH的DNA及编码SNDH的DNA，只要其编码的酶具有SDH活性或SNDH活性，无论哪种都可以。例如胞质或膜结合SDH及SNDH，辅酶依赖或辅酶不依赖SDH和SNDH。优化的选择是编码源自微生物体的酶的基因及编码其变异体的基因。实例包括葡萄糖酸杆菌及醋酸杆菌属微生物，确切地是指氧化葡糖杆菌T-100(FERM BP-4188)。

源自氧化葡糖杆菌T-100的膜结合的SDH酶具备如下特征：(1)催化L-山梨糖转化为L-山梨糖醛酮；(2)分子量为58,000道尔顿(SDS-PAGE)；(3)N末端氨基酸序列为

Thr-Ser-Gly-Phe-Asp-Tyr-Ile-Val-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-

该SDH基因较优选的序列是编码后述序列表中SQ:ID No.1中所述氨基酸序列的蛋白质的DNA序列，且最优选的DNA序列是序列表中SQ:ID No.3中所述的核苷酸序列。

源自氧化葡糖杆菌T-100的胞质SNDH酶具备如下特性：(1)催化L-山梨糖醛酮转化为2-酮-L-古洛糖酸；(2)分子量为50,000道尔顿(SDS-PAGE法)；(3)N末端氨基酸序列为

Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Lau(Xaa指未鉴别的氨基酸)。

该SNDH基因较优选序列的是编码后述序列表中SQ:ID No.2中所述氨基酸序列的蛋白质的DNA序列，最优选的DNA序列是序列表中SQ:ID No.4所述的核苷酸序列。

本发明中合适的表达载体的实例，具体地是pSDH 145和pSDH 155(FERM BP-4522)等。

本发明的表达载体通过常规方法加以制备(例如以限制性酶消化，T₄ DNA连接酶连接)，必要时可使用合适的DNA片段及上述表达系统，编码SDH及SNDH的DNA使其适当地自主复制进行环形连接而制备。(2)宿主微生物

本发明中用来作为宿主的微生物能够由D-山梨糖醇高产L-山梨糖，而无或仅有低的2KLGA降解活性。

较优的选择是它不仅具有上述特性，还无或仅有低的L-艾杜糖酸产出活性。

在本发明中重要的是宿主能高效转化D-山梨糖醇为L-山梨糖：具备低的L-山梨糖代谢活性，或者即便发生代谢，L-山梨糖代谢成为L-山梨糖至2-酮-L-古洛糖酸代谢途径之外的其他产物的活性应极低；且具低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性。

优选的微生物能在高浓度D-山梨糖醇中生长，优选的山梨糖醇浓度不少于5％，更优的山梨糖醇浓度不少于15％，并能将D-山梨糖醇以近于100％的效率转化为L-山梨糖。这些微生物的实例包括葡萄糖酸杆菌或醋酸杆菌属的微生物，例如氧化葡糖杆菌G 624(FERM BP-4415)和氧化葡糖杆菌NB 6939。(3)转化体

本发明中转化体可通过导入上述表达载体进入宿主细胞来制备。本发明的转化体也通过将SDH基因及SNDH基因导入不同的表达载体中，并使它们整合进宿主微生物细胞内的方法制备。

制备转化体的方法并无特别限定，可根据宿主微生物加以适当的决定。例如，当使用葡萄糖酸杆菌或醋酸杆菌属微生物作为宿主时，电穿孔的方法优先使用[Dower,W.J.,Miller,J.F.and Ragsdale,C.W.,Nucleic Acid Res.Vol.16,p.6127(1988)]，因为常规使用的转化方法只有较低的转化率。电穿孔方法可依照基因工程领域中常规方法执行，或根据转化的宿主微生物加以适当的修饰来进行。

本发明还涉及适合上述电穿孔的感受态细胞的生产方法。

适合上述电穿孔方法的感受态细胞可由培养葡萄糖酸杆菌或醋酸杆菌属的宿主微生物来制备，这些宿主细胞可由D-山梨糖醇高产L-山梨糖，无或仅有低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性，或该宿主微生物除了具备上述特征外，在含有甘露醇的培养基中它无或仅有低的L-艾杜糖酸产出活性。

这样获得的转化体具备以D-山梨糖醇为原料高产2KLGA的能力。

本发明中宿主是否得到正确的转化可由转化体具有的选择标记来检验这些标记包括抗生素抗性基因如卡那霉素抗性基因，酶基因如营养缺陷型基因或LacZ基因，或者根据转化体所具有的SDH活性和SNDH活性来检验。(4)2KLGA的生产过程

本发明中2KLGA是由在含D-山梨糖醇的培养基中培养带表达载体的上述转化体而获得的，由获得的培养物收获2KLGA。

尽管培养基的优化组成根据宿主的不同有所改变，它通常含有D-山梨糖醇并可以含有诸如D-甘露醇、D-葡萄糖、D-果糖、L-山梨糖和甘油等碳源。它的优化选择还包括无机及有机氮源(例如：硫酸铵、氯化铵、酪蛋白水解物、酵母浸出物、多聚蛋白胨、细胞培养用胰化蛋白胨、牛肉膏及玉米浆)。如果需要，其它营养物质如无机盐(例如：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化镁、硫酸镁、碳酸钙及氯化钙)，维生素(例如维生素B1)以及抗生素(例如：氨苄青霉素、四环素以及氯霉素等)可加至培养基中。

例如：当使用葡萄糖酸杆菌属微生物为宿主时，可使用含D-山梨糖醇、酵母浸出物及碳酸钙的培养基。

培养基D-山梨糖醇的浓度通常为1-30％优化选择为5-20％。

转化体的培养条件根据所用宿主微生物决定，以高产2-酮-L-古洛糖酸。例如使用葡萄糖酸杆菌属微生物时，pH通常为5.5-8.5，优化选择为7-7.5，培养温度通常为18-40℃，优化选择为20-30℃，培养时间为20-170小时。

这样生产的2KLGA通常在培养物的溶液部分。这样2KLGA可以通过过滤的方法或离心培养物来获得培养物滤液，所得滤液通过常规纯化方法加以提纯，例如以适当的吸附剂进行柱层析及晶体沉淀。

商业可购质粒、限制酶、T4DNA连接酶及其他物质等在下面实例中所用到，均按照其说明书的指示使用。DNA克隆、转化体的培养及由培养物回收2KLGA为本领域的技术人员所熟知或可由公开的出版物查知。

本发明所使用的氧化葡糖杆菌T-100(FERM BP-4188)氧化葡糖杆菌G 624(FERM BP-4155)、氧化葡糖杆菌GA-1(G624-pSDH 155)(FERM BP-4522)以及氧化葡糖杆菌N 952(NB6939-pSDH 155)保藏在日本通商产业省技术院生命科学与人体技术研究所。

根据本发明，用以生产抗坏血酸的2KLGA可以通过一步培养操作简便地大批量生产。

以下本发明采取实例进行具体说明，但本发明不限定于此。

实施例1

从氧化葡糖杆菌T-100中纯化SDH(1)微生物

氧化葡糖杆菌T-100选做高产2-酮-L-古洛糖酸的突变株，它通过亚硝基胍(NTG)诱发突变由野生型氧化葡糖杆菌G716衍生而来。(2)氧化葡糖杆菌T-100的培养

单个克隆的氧化葡糖杆菌T-100转移至盛有6个单独的培养基(每个100m1)的500ml三角烧瓶中，培养基中包括2.5％葡萄糖、1.0％多聚蛋白胨、0.5％酵母浸出物(Difco Labs.,USA)及20％CaCO₃ ^-。该培养物置旋转振荡器(250rpm)上在30℃中培养18小时。该培养物(共600ml)接种至盛有20升发酵液的30升大瓶中，该发酵液包括有5％D-山梨糖醇、0.5％甘油、0.5％酵母浸出物及1.0％CaCO₃。30℃、通气量20升/分、300rpm振荡条件下培养42小时。培养的肉汤(20升)在4℃以6000rpm离心10分钟。以冷盐水洗细胞一次后再以相同条件再离心。细胞存放于-20℃中以备用。(3)制备膜部分

由(2)所得细胞(17.7g，湿重)以50ml的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)悬浮，超声波破碎，4℃以8,000rpm离心10分钟后收集上清。同时，所得沉淀以40ml的10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)悬浮，以超声波破碎再按上述同样条件离心。合并上清在4℃下超速离心32,000rpm 60分钟。所得沉淀以磷酸缓冲液(50ml)洗一次，再按上述方法超速离心得到膜蛋白粗提物(膜部分)。(4)由膜部分溶解SDH酶

(3)中所得膜部分在50ml 10mM磷酸缓冲液中悬浮(pH 7.0)。向悬浮液中加入0.75ml 20％ Triton X-100(Nacalai Tesque,Japan)及1.8gL-山梨糖，在冰中搅动混合物3.5小时。所得悬浮液在4℃中32,000rpm超速离心60分钟后得到上清(约48ml)，这称为可溶性SDH部分。(5)离子交换层析

(4)中所得可溶性部分(16ml)经过TSKgel DEAE-5PW(7.5mm内径×75mm,Toso Co.Ltd.Japan)离子交换层析柱，该柱以包括0.3％ Triton x-100,200mM L-山梨糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡。随后用平衡缓冲液在0-0.5M线性梯度的NaCl洗脱。根据T.SUGISAWA等(Agric.Biol.Chem.,Vol.55,303-370,1991)方法，用L-山梨糖为底物，0.28M磷酸缓冲液(pH7.0)中0.1mM 2,6-二氯酚靛酚(DCIP)作电子受体来测定酶活性。一个酶单位定义为每分钟能催化1μmol DCIP还原的酶量。DCIP的还原由分光光度计(Model UV-160,Shimadzu,Japan)检测600nm处光吸收值下降决定。收集活性部分，以10mM磷酸缓冲液稀释3倍，继续上样至以10mM磷酸缓冲液平衡物的DEAE-TOYOPEARL 650M柱(7.0mm内径×17mm,Toso Co.Ltd.Japan)。以含0.2M NaCl的磷酸缓冲液洗脱。洗脱液将用于进一步纯化步骤中。(6)凝胶过滤层析

浓缩活性级分的一部分(300μl)上样至Superose 12HR10/30凝胶过滤层析柱中(10mm内径×30cm,Pharmacia,Sweden)，该柱以包括0.3％ Triton X-100,200mM L-山梨糖及0.2M NaCl的10mM磷酸缓冲液平衡，以同样缓冲液洗脱。每一级分(0.4ml)都在有SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,12.5％胶)分析及按照实例1(5)所述方法测酶活。根据SDS-PAGE分析表明，SDH酶与58kd蛋白质相关，推测58KD蛋白质是所要SDH酶分子。

实施例2

SDH酶的氨基酸序列分析

浓缩的活性级分(15μl)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(12.5％胶)，分离后的蛋白质印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。以丽春红S染色后显示有58kd蛋白质在膜上，该处被切下用蒸馏水清洗。该膜片以470A型蛋白质自动测序仪(Applied Biosystem Inc.,USA)测定N末端氨基酸顺序。

为了测定内部氨基酸序列，在膜片表面以无色杆菌蛋白酶I(WakoChemicai,Japan)裂解该蛋白。用含量8％的乙腈50mM Tris-HCl(pH9.0)把所得裂解物从膜中溶解出来，用Cosmosil 5C4-300(4.6mm内径×50mm,Nacalai Tesque,Japan)作反相层析柱，以0.05％三氟乙酸中含有8％至83％的乙酸腈作线性梯度洗脱(75分钟)。分离出两类肽(肽1及肽2)，以470A型蛋白质自动测序仪测定氨基酸序列。结果在表Ⅰ中示出。

表ⅠN末端序列：TSGFDYIVVGGGSA肽 1: MTTGPHTWDLLTEPQK肽 2: LMMLSGVGPA

实施例3DNA探针的制备(1)DNA寡聚体的合成

表2中所列寡核苷酸均是由392型DNA合成仪(AppliedBiosystem Inc.,USA)通过磷酰亚胺Phospho amidite方法合成。合成的寡核苷酸用28％氨水处理后使之从CPG多聚物载体上释放(CPG：可控多孔玻璃)，随后60℃加热9小时以除去所有保护基团。反应混合物中的溶剂在真空中蒸发，残留物以200μl TE[10mMTris-HCl(pH7.4)-1mM EDTA]。所得溶液以乙醚洗一次后用乙醇沉淀。所得寡核苷酸无需进一步纯化即可作为聚合酶链式反应的引物。

表 2编码NH₂-末端序列的寡核苷酸(正向引物)

5’＞ACC(TA)(GC)CGGCTT(TC)GA(TC)ATCTCA)GT＜3’编码内部序列的寡核苷酸(反向引物)

5’＞TCCCA(ATCG)GT(AG)TG(ATCG)GG(ATCG)CG＜3’

(2)染色体DNA的制备

单克隆的氧化葡糖杆菌T-100在培养基中(100ml)37℃培养24小时，该培养基含有2％葡萄糖，1％多聚蛋白胨(polypeptone)和0.5％酵母浸出物。离心收集细胞(4,600rpm,10分钟)后悬浮在TE缓冲液里(2.5ml)悬浮液的一部分(2.0ml)用20ml的STE缓冲液[20％蔗糖-50mM Tris-HCl(pH8)-1mM EDTA]稀释，再与5ml溶菌酶(5mg/ml)混合后，置37℃温育30分钟。再加入N-月桂酰肌氨酸钠(Sarcosil)溶液[1％N-月桂酰肌氨酸钠(Lauroylsarcosilate)-100mM EDTA(pH9.0)](50ml)及蛋白酶K(40mg)，把该混合物在50℃温育1.5小时。在75ml上述混合物中溶入氯化铯(93.8g)及6ml溴化乙锭(5mg/ml)，该氯化铯溶液置20℃中，50,000rpm离心14小时。分离含有染色体DNA，以生理盐水饱和的异丙醇清洗两次，再以TE缓冲液(2L)透析4小时。透析液用苯酚(20ml)抽提后，以TE缓冲液(2L)透析两次后即得到染色体DNA溶液(14ml,91.5μg/ml)。(3)聚合酶链式反应

取180ng氧化葡糖杆菌T-100染色体DNA及2.5皮摩尔表2所列各种引物，用Hybaid热反应仪HB-TR1型(PCR仪)(Hybaid Limited,UK)进行聚合酶链式反应。反应混合物[200μm dNTPs和2.5单位Taq DNA聚合酶在PCR缓冲液中(Perkin Elmer-Cetus,USA)]进行50个循环的聚合酶链式反应，每个循环包括：95℃中0.5分钟变性，42℃中1分钟退火及72℃中2分钟的聚合。由聚合酶链式反应获得单一片段。假定其编码部分SDH基因的DNA片段(180 bp)通过1.5％琼脂糖电泳回收，以DNA聚合酶Klenow片段(Takara Shuzo,Japan)将之填平成为平末端DNA。所得DNA以及SmalⅠ预处理的pUC18由T₄ DNA连接酶(Takara Shuzo,Japan)进行连接反应。连接混合物按照SHIGESADA等(Saibo-kogaku,2,616-626,1983)方法转化大肠杆菌JM 109(Nippon Gene,Japan)。由某一转化体，获得所欲得的质粒pUC18SD180(见图Ⅰ)，并通过限制性酶切作图加以鉴定。(4)制备³²P-标记的探针

插入DNA片段(约200bp)可通过用Bam HⅠ及EcoRⅠ(NipponGene,Japan)消化pUC18SD180得到。该长度约为200bp的DNA片段由0.5％琼脂糖电泳纯化。所得纯化DNA参照附带操作说明用缺刻转移试剂盒³²P进行标记。³²P标记DNA的比活约为3.7×10⁷cpm/μg。

实施例4从氧化葡糖杆菌T-100DNA文库中分离SDH基因(1)制备染色体DNA文库

以MboⅠ(Nippon Gene,Japan)部分消化实例3(2)中制备的基因组DNA，所得片段通过蔗糖梯度离心分离得到长度为8-22kbp的片段，此后它们将克隆至Lambda噬菌体载体EMBL-3(Clonetech)的BamHⅠ位点。将该Lambda噬菌体载体导入大肠杆菌NM 538(Clonetech)构建葡萄糖酸杆菌T-100染色体DNA程序库。(2)噬菌斑杂交

由大肠杆菌NM538(Clonetech)菌株所作平板制备Lambda噬菌斑及这些噬菌斑固定于硝酸纤维素滤膜等方法完全参照MolecularCloning Vol.1,Chapter 2,page 108,1989,USA上描述的方法进行。含有Lambda DNA的滤膜在杂交缓冲液(50％甲醛，1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％ficollc(菲可)-5×SSPE(见《分子克隆》)、0.1％SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA)中置42℃温育4小时，在同样的缓冲液中再加32P-标记的探针(约200bp，约1×10⁷cpm/ml)在42℃温育杂交18小时，随后换成含0.05％SDS的2×SSC(见《分子克隆》)缓冲液42℃温育以除去多余的探针。滤膜在-80℃向X-光胶片HR-H(Fuji Film,Japan)曝光18小时。第一轮筛选Lambda噬菌体文库结果显示72,000个噬菌斑中约有30个阳性噬菌体。(3)Southern印迹

把一个阳性噬菌斑DNA用EcoRⅠ及SalⅠ(Nippon Gene,Japan)酶切消化，并在0.8％琼脂糖上进行电泳。胶中分离的DNA片段通过电印迹方法转移至硝酸纤维素滤膜上。大约长度为6kbp的片段能够与32P标记的探针杂交。它被克隆进入质粒pUC19(Nippon Gene,Japan)的EcoRⅠ位点与SalⅠ位点之间得到质粒pUC19SD5(图2)。

实施例5SDH基因的DNA序列分析(1)构建DNA测序质粒

构建质粒pSD5RRV

以EcoRV(Toyobo,Japan)消化pUC19SD5质粒。由1.5％琼脂糖凝胶电泳分离所得3条带中分离能与³²P-标记探针杂交的1.1 kbpDNA片段，并将其克隆进入pUC18的SmalⅠ位点得到质粒pSD5RRV。(2)构建pSD5RVS

以EcoRV及Eco47 Ⅲ(Toyobo,Japan)消化pUC19SD5质粒。其中大片段(约5,700bp)分离后由T4 DNA连接酶(Takara Shuzo,Japan)自体连接得到质粒pSD5RVS.(3)DNA序列分析

用370A DNA测序仪(Applied Biosystems,USA)并参照指示的方法运用双脱氧链终止法对模板DNA(pSD5RRV和pSD5RVS)进行DNA序列分析。在第一次测序时用M₁₃测序引物，通用引物以及反向引物(New England Biolabs,USA)。根据第一次测序所确定的DNA序列，用下列合成的引物作进一步序列分析。合成引物如表3所示：表3：引物1(12聚体)：5’＞CTG TGT TCT CGC＜3’

引物2(15聚体)：5’＞TCG GTT TCG CGA AGA＜3’

引物3(16聚体)：5’＞CGT CTT CAA CGG AAC G＜3’

引物4(16聚体)：5’＞GGA GTG ACG TCC GTT C＜3’

引物5(16聚体)：5’＞GAG ATG TTC TCC CAG C＜3’

根据上述序列分析，发现了由1596碱基对组成的开放阅读框架(ORF)。由该开放阅读框架起始密码子处起始的核苷酸序列所编码的氨基酸序列与实例2中得到的SDH氨基酸序列相符，由该开放阅读框架编码的蛋白质其理论上的分子量为58kd，与SDH通过SDS-PAGE测得表现分子量58kd也完全符合。故此认为开放阅读框架为SDH基因。

SDH基因的核苷酸序列在后面提及的序列表Sequence No.3中示出，由核苷酸序列所推断出来的氨基酸序列在Sequence No.1中示出。

实施例6在大肠杆菌中表达SDH基因(1)培养转化(转染)的大肠杆菌

由pUC19SD5(E.coli JM 109-pUC19SD5)转化的大肠杆菌JM109单个克隆接种至盛有100ml培养基500ml三角烧瓶中，该培养基中包括1％细菌培养用胰化蛋白胨(Difco Labs,USA),0.5％酵母浸出物、0.5％氯化钠和0.1％葡萄糖(pH 7.2)把它们置30℃培养18小时。部分培养的肉汤(每个3ml)分别转至两个培养基(100ml)，培养基中含有1％细胞培养用胰化蛋白胨、0.5％酵母浸出物、0.5％氯化钠、1％甘油、0.3％KH₂PO₄、0.8％Na₂PO₄·12H₂O(pH6.8)、1％L-山梨糖及100μg/ml氨苄青霉素，盛在500ml三角烧瓶。所得混合物在25℃培养3天。培养的肉汤(共200ml)在4℃下6,000rpm离心10分钟收集。细胞用盐水洗二次，用相同的溶液使之悬浮，在冰浴中超声振荡破碎2分钟，间隙时间为30秒。所得细胞裂解液在-20℃贮存直至做酶活实验。(2)SDH活性测定

SDH表达活性通过运用高效液相色谱(HPLC)检测它的反应产物L-山梨糖醛酮的产量测定的。反应混合物包括1％L-山梨糖、1mM甲基硫苯乙肼、0.1M磷酸缓冲液(pH8.0)及超声裂解细胞液，它们在30℃振荡温育5小时。用6N硫酸调pH值至2以终止反应。反应混合物在4℃中6,000rpm离心10分钟，部分上清直接用^#3011柱(4.6mm内径×300mm,Hitachi,Japan)由高效液相色谱进行分析。流动相是过柱后标记方法所用的包括有0.02M盐酸苯甲脒及0.25M硫酸钾的1M硼酸缓冲液，流速为0.8ml/分钟。过柱后标记反应于80℃中在Tefron管中(0.5mm内径×10m)进行。检测标记化合物是监测荧光(激发光315nm，发射光405nm)。如下表4所示、含有质粒pUC19SD5的超声破碎细胞具备转化L-山梨糖为L-山梨糖醛酮的活性。但细胞裂解液在100℃处理时或无该质粒的细胞中则无此活性。这些结果表明重组质粒pUC19SD5含有编码L-山梨糖脱氢酶的基因，该基因能在大肠杆菌JM 109中表达。

表4

菌株处理 L-山梨糖醛酮(μg/ml)

JM 109(pUC19SD5) 超声 2,310

JM 109(pUC19SD5) 超声，煮沸 24

JM 109 超声 31

本底 - 33

实施例7

从葡萄糖酸杆菌T-100提纯SNDH(1)酶粗提液的制备

由实例1(2)中取得的细胞(湿重量为10g)用40ml 10mM磷酸缓冲液(pH7.0)悬浮，用超声破碎，4℃中8,000rpm离心10分钟。其上清在4℃中32,000rpm超速离心60分钟。所得上清即为进一步测定所用的SNDH酶粗提液。(2)离子交换层析

把SNDH酶粗提液上样到由10mM磷酸缓冲液(pH7.0)预平衡的QAE-TOYOPEARL 550 C柱中(1.6cm内径×30cm,Toso Co.Ltd.,Japan)。该柱用相同缓冲液清洗后用同一缓冲液在0-0.4M氯化钠线性梯度下洗脱。酶活测定方法依据SUGISAWA等(Agric.Biol.Chem.55,665-670,1991)方法，测定50mM磷酸缓冲液中13.7μM L-山梨糖醛酸及0.73μM NAD反应所得NADH的产量，这是通过340nm光吸来测定的。活性部分(约15ml)合并后以磷酸缓冲液稀释5倍备后面提纯步骤使用。(3)兰琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)层析

由(2)所得酶液(约75ml)上样至由磷酸缓冲液预平衡的兰琼脂糖凝胶柱(1.0cm内径×10cm,Pharmacia,Sweden)。该柱用相同缓冲液清洗后以相同缓冲液在0-0.6M NaCl线性梯度下洗脱。相应的部分收集液在有十二烷基磺酸钠条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析及实例7(2)中的酶活分析。结果发现SDS-PAGE中分子量为50kd的蛋白质有酶的活性，暗示该50kd蛋白质是所期望的SNDH分子。

实施例8SNDH氨基酸序列分析

实施例7(3)中所得活性部分(75μl)进行SDS-PAGE并将分离的蛋白质印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。把膜上含有被考马斯亮兰染色的50kd蛋白部分截下，并用蒸馏水清洗。用470A型蛋白质测序仪(Applied Biosystems Inc.,USA)对膜片上蛋白质进行N-末端氨基酸序列分析。下面为示出的结果，Xaa表示未确定的氨基酸。N-末端氨基酸序列：

Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu-

实施例9SNDH基因的DNA序列分析(1)构建核苷酸序列分析质粒

由实施例4(3)中所得质粒pUC19SD5(图2)以SalⅠ(NipponGene,Japan)及EcoRV(Toyobo,Japan)消化后在0.8％琼脂糖中进行凝胶电泳。在分离的DNA片段中，长度约为600bp及4,300bp的片段从凝胶中分离出来。把前者插入pUC18的SmalⅠ位点构建成为pSD6RRV。后者由DNA聚合酶的Klenow片段(Takara Shuzo,Japan)填平得到SalⅠ位点的平末端，随后自身连接得到环状质粒pSD5RIRV。该质粒用EcoRⅠ及MluⅠ消化后分离得到约3,400bp的片段。填平后采用如上同样方式环化得到质粒pSD5MRV.(2)核苷酸序列分析

运用370ADNA测序仪(Applied Biosystems.USA)采用双脱氧链终止法对模板DNA(对pSD5MRV,pSD6RRV及SDH进行核苷酸序列分析对所用pSD5RRV)的核苷酸进行确定。第一次测序中用M₁₃测序引物，通用引物及反向引物(New England Biolabs,USA)。根据第一次测序结果，合成下一个引物，作进一步序列分析。所用合成引物如下：

引物1(15聚体)：5’＞TGATGGAGAATGGCG＜3’

引物2(15聚体)：5’＞GTAATCAGACCGACG＜3’

引物3(15聚体)：5’＞TTCATTCTCGCATCC＜3’

引物4(15聚体)：5’＞GATCTCACCTTTCGC＜3’

引物5(15聚体)：5’＞CACGGATGTGAAGCC＜3’

引物6(15聚体)：5’＞GATCCTGTGTGAGCG＜3’

引物7(15聚体)：5’＞GCGATGTCATCACGG＜3’

根据上述分析，在SNDH基因5’端上游发现包括1497bp的开放阅读框架(ORF)。从开放阅读框架起始密码子(ATG)开始的核苷酸序列编码的氨基酸序列与实例8中所得SNDH的N-末端氨基酸序列一致，且开放阅读框架所编码蛋白质的理论分子量53kd亦与SDS-PAGE所确定的SNDH分子量50kd很一致。所以推断这个开放阅读框架是SNDH基因，SNDH基因的核苷酸序列在后面提及的序列表中Sequence No.4示出，由核苷酸序列推断的氨基酸序列在Sequence No.2中示出。

实施例10在大肠杆菌中表达SNDH基因

(1)转化大肠杆菌的培养

以实施例6中同样的方式得到大肠杆菌JM 109-pUC19SD5细胞裂解液，贮存于-20℃直至进行酶活实验。

(2)SNDH酶活性测定

SNDH表达活性是通过运用高效液相色谱的方法来检测其反应产物2-酮-L-古洛糖酸的数量来测定的。反应混合物包括1％L-山梨糖醛酮，0.5mM NAD,0.1M磷酸缓冲液(pH8.0)及细胞超声裂解液，它们共同在30℃振荡温育5小时。用6N硫酸将反应混合物pH调至2停止其反应。把该混合物在4℃中6,000rpm离心10分钟，部分上清由高效液相色谱进行分析(Capcellpak NH₂柱；4.6mm内径×250mm,Shiseido,Japan)。移动相用含有30％乙腈的20mM磷酸钠缓冲液(pH3.0)，流速为1.2ml每分钟。检测时是测量210nm紫外光吸收。

结果表明，含有由质粒pUC19SD5转化的大肠杆菌JM 109-pUC19SD5的细胞超声裂解液能产生5690μg/ml 2KLGA，证明它有将L-山梨糖醛酮转化为2KLGA的能力。而转化体的宿主大肠杆菌JM 109本身由L-山梨糖醛酮转化为2KLGA的活性则为转化体的二分之一(2170μg/ml)。因此可确定重组质粒pUC19SD5有编码SNDH的基因，并且在实例9中发现的SDH基因其上游5’端包括1497bp的开放阅读框架为SNDH基因。

实施例11宿主的选择(1)高产山梨糖细菌的选择

可由D-山梨糖醇高产L-山梨糖的生产细菌由水果中分离得到。少量分离的原材料加至组分为马铃薯右旋糖(2.4％)，乙醇(0.5％)，蛋白胨(0.3％)酵母浸出物(0.5％)和醋酸(0.03％)的增强培养基中，在30℃静置培养5天。用含有D-山梨糖醇(5％)、酵母浸出物(0.5％)、碳酸钙(0.25％)及琼脂(1.5％)的平板培养基分离纯化细菌，挑选在30℃培养5天时形成的克隆。在平板上生长的细菌接种至盛有种子培养基(6ml)的试管中，该培养基含有葡萄糖(2.5％)，酵母浸出物(0.5％)，多种蛋白胨(1.0％)及碳酸钙(0.5％)，将试管中培养物在30℃振荡培养18小时。培养物的一部分(0.5μl)接种至盛有15ml培养基的100ml容量的三角烧瓶中，该培养基含有D-山梨糖醇(5％)，酵母浸出物(0.5％)，碳酸钙(2％)，培养物在旋转振荡器(250rpm)中30℃培养4天。所得到L-山梨糖由高效液相色谱测定(OAKC柱；7.8mm内径×300mm,Merck，流动相0.05N硫酸，流速为0.4ml/分，由示差折光检测器检测)，从而选择高产L-山梨糖的菌株。所选择的菌株仍通过上述培养基筛选，只是D-山梨糖醇的浓度分别为10％、15％和20％，选出5个菌株即使在很高的D-山梨糖醇浓度下仍能高产L-山梨糖。在这五个菌株之中，G624-(FERM BP-4415)具有最高的糖抗性并能由D-山梨糖醇转化为L-山梨糖(表5)。表 5细胞株 L-山梨糖产量(g/l)

培养基中 100g/l 150g/l 200g/l

D-山梨糖醇 (10％) (15％) (20％)G575 96 149 4G613 98 145 2G617 98 147 2G624 97 154 200G625 102 98 4(2)2KLGA低降解活性菌的选择

用超声破碎的细胞体系来检测高产L-山梨糖的G624菌株降解2KLGA活性。将G624接种至盛有培养基(6ml)的试管中，该培养基含有葡萄糖(2.5％)，多聚蛋白胨(1.0％)，酵母浸出物(0.5％)，碳酸钙(0.5％)，它们在试管振荡器中30℃培养18小时进行种子培养。把种子培养液(3ml)接种至盛有100ml培养基的500ml三角烧瓶中，该培养基含有D-山梨糖醇(5％)，酵母浸出物(0.5％)，碳酸钙(2.0％)，在旋转振荡器中30℃培养48小时。所得培养物在4℃中500rpm离心10分钟以除去碳酸钙。上清在4℃中6,000rpm离心10分钟以收集细胞。用生理盐水清洗后在相同条件下离心分离，重复两次后细胞再以生理盐水悬浮并调整体积至2.5ml。

在冰浴中超声破碎处理细胞6分钟，每次间隙为30秒，从而制备超声破碎细胞。这些超声破碎的细胞加至测试液(1.0ml)中，测试液含有2％2KLGA,2mM NADPH和0.2M磷酸缓冲液(pH 7.0)，将混合物在30℃振荡3至5小时。以6N硫酸将pH值调至2终止反应。反应混合物在4℃中6,000rpm离心10分钟。根据实施例10(2)中所述高效液相色谱测定上清中2KLGA及L-艾杜糖酸含量。在没有加入NADPH且反应时间为0时所得结果如表6所示。很清楚G624无降解2KLGA活性。

表6 G624降解2KLGA(1％2KLGA)加入NADPH(mM) 反应时间(小时) 2KLGA L-艾杜糖酸

(mg/ml) (mg/ml)

0 0 9.30 0.00

3 9.00 0.00

5 9.21 0.00

1 0 9.00 0.00

3 9.23 0.00

5 9.37 0.00(3)高产山梨糖且具低2KLGA降解活性的G624菌株的鉴定

G624的细菌学特征根据《伯杰氏细菌学分类手册》[The Williams& Wilkins Company(1989)]。结果表明G624是革兰氏阴性短杆菌，G+C含量为57.4％，氧化酶阴性，催化酶阳性，好氧并能利用乙醇，属于醋酸杆菌科且菌体内的类异戊二烯醌仅有泛醌10。因此，G624属于葡萄糖酸杆菌属。用氧化葡糖杆菌IFO 3287和IFO 3293作为模式菌种，用微平板培养物作PNA-DNA杂交，根据DNA的同源性判定G624为氧化葡糖杆菌。(4)选择性标记的选择

由琼脂稀释方法检测选定宿主G624对不同抗生素的敏感性，主要考虑在转化过程中作为选择标记时可能用到的药物抗性基因。其结果在表7中示出。表7 琼脂稀释法测定的MIC

抗生素 MIC(μg/ml)

氯霉素 500

庆大霉素 10-50

湿霉素 50-100

卡那霉素 10

四环素 10-50

氨苄青霉素 500

SY培养基：D-山梨糖醇 5.0％

酵母浸出物 0.5％

CaCO3 0.25％

琼脂 1.0％

根据上述结果发现G624对卡那霉素敏感，因而决定该宿主细胞能利用卡那霉素抗性作为选择标记。

实施例12构建穿梭载体

选用大肠杆菌作为适当的微生物以大量生产穿梭载体及克隆表达载体，因此构建了同时在氧化葡糖杆菌及大肠杆菌中都能表达的穿梭载体。(1)制备葡萄糖酸杆菌的质粒

由模式菌种及天然生长菌种分离的葡萄糖酸杆菌中制备质粒，以获得葡萄糖酸杆菌的自身复制单位。

模式菌种IFO 3287,IAM 12138及天然生长分离的氧化葡糖杆菌T-100(FERM BP-4188)分别接种至10支盛6ml MB培养基[D-甘露醇(2.5％)，多聚蛋白胨(0.3％)及酵母浸出物(0.5％)，pH6.0]，在试管振荡器中30℃培养18小时得到种子培养物。在十个三角烧瓶中分别加入100ml MB培养基，并接种了3ml种子培养物，随后在30℃培养6小时。这十支培养物(1升)在4℃中6,000rpm离心10分钟，所得细胞在30ml P1溶液(100μg/ml RNase A,10mMEDTA,50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)中悬浮。再加入P2溶液(30ml,1％SDS,0.2N NaOH溶液)及P3溶液(30ml,3M醋酸钾溶液，pH5.5)，混合物在4℃中13,000rpm离心30分钟。其上清在相同条件下再次离心，上清吸附至由QBT溶液预平衡(15％乙醇，0.15％Triton X-100,750mM NaCl,50mM MOPS缓冲液，pH7.0)的Quagen柱Tip 100(Quagen)，用10ml QC溶液(15％乙醇，1.0M NaCl,50mM MOPS缓冲液，pH7.0)清洗二次，再以10ml QF溶液(15％乙醇，1.25M NaCl,50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5)洗脱。洗脱液中加入0.7倍体积的异丙醇，混合物在4℃中1,000rpm离心30分钟。沉淀物用70％乙醇清洗并在真空中干燥得到DNA。所得DNA用150μl TE缓冲液(1mM EDTA,10mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)溶解，用入Hind Ⅲ分子量标记(BehringerMannheim AG)作为指示，将这些DNA溶液在0.8％琼脂糖上100V电泳30分钟，由溴化乙铵染色可见在2kb-5kb之间有单条带出现，将它由凝胶上切下置透析管中在100V电压下泳动30分钟，然后再倒转电流方向泳动30秒，将管内容物转至eppendorf管中。用水饱和酚抽提两次，水相用丁醇清洗以脱水并重复清洗与脱水直至溶液浓缩至500μl。加入3M醋酸钠(50μl)和乙醇(1ml)，混合物在-20℃中过夜。于4℃中，14,000rpm离心30分钟。沉淀用70％乙醇清洗后在真空中干燥。所得沉淀溶于TE缓冲液得到质粒溶液。由葡萄糖酸杆菌IFO 3287所得大小为2.6kb质粒称为pF2,IFM 12138所得大小为3.7kb质粒称为pF3，天然分离葡萄糖酸杆菌T-100中所得大小为4.4kb质粒称为pF4(见图3)。(2)构建大肠杆菌和葡萄糖酸杆菌穿梭载体

作为含有在大肠杆菌中起作用的复制起点的药物抗性质粒，选用具有抗性基因及多克隆位点lacZ基因的pHSG 298(Takara Shuzo)。

穿梭载体按如下操作制备。pHSG 298用限制性酶AccⅠ(NipponGene,Japan)消化，由磷性磷酸酶处理后与pF2的AccⅠ消化产物通过T₄ DNA连接酶连接之后成为重组质粒。它命名为pFG5B(见图4)。pHSG 298由限制性酶Hind Ⅲ(NIppon Gene,Japan)，由碱性磷酸酶处理后，用T₄ DNA连接使之分别与pF3和pF4的Hind Ⅲ酶切片段相连接。重组的质粒分别都带有一个卡那霉素抗性基因，分别称为pFG14A和pFG15A(见图5和图6)。这些重组质粒用转化的方法导入大肠杆菌JM 109中，根据卡那霉素的抗性及有关LacZ所产生的颜色，选出含有重组质粒的菌株。

实施例13转化葡萄糖酸杆菌(1)感受态菌的制备及转化

氧化葡糖杆菌G624(FERM BP-415)接种至盛有100μl培养基的500μl三角烧瓶中，该培养基含有葡萄糖(2.5％)，多聚蛋白胨(0.3％)和酵母浸出物(0.5％)，它们在25℃培养20小时。当确证培养物在570nm处光吸收值处于0.6至1.2之间，即可于4℃中6,000rpm离心10分钟收集细胞。根据电穿孔[Dower W.J.Miller,J.F.and Ragsdale,C.W.,Nucleic Acid Res.,Vol.16,p,6127(1988)]转化大肠杆菌的方法转化细胞。以10％甘油清洗上述离心细胞并再于4℃中6,000rpm离心10分钟后可得到感受态细胞，随后在显微镜下制成10¹⁰ cells/ml的细胞悬液。作为转化时所用质粒，根据实例12-(1)中方法分离并纯化获得实例12-(2)中所得的穿梭载体pFG14A，并用TE缓冲液制成4mg/ml的DNA溶液。穿梭载体(1μl)加到感受态细胞悬液(160μl)中，混匀后该转化溶液置Gene Pulser(BioRad)的样品槽中。然后进行电穿孔。所用样品槽其宽度为0.1cm，电阻200Ω，电压1.8千伏，电容为25μF。随后在转化溶液中加入MB(1ml)培养使细胞悬浮，所有溶液转移至15ml Corning管中，在30℃旋转(80rpm)水浴箱中温育2小时。将悬浮液铺在含有卡那霉素(100μg/ml)的MB琼脂平板上并计数生长的克隆。结果发现在上述生长条件下，葡萄糖酸杆菌几乎无转化。

对氧化葡糖杆菌G624的培养条件及电穿孔条件的各方面都加以研究。最终发现若以D-甘露醇为培养基中碳源可获得高转化率。在上述条件下电穿孔是最有效的转化方法。也就是说，以D-甘露醇代替葡萄糖后再进行电穿孔，样品槽的宽度为0.1cm，电阻200Ω，电压1.8千伏，电容为25μF，结果如表8所示能够高效率得到G624-pFG14A。

表 8

培养基类型转化体数目(cells/μg DNA)

葡萄糖培养基 0

甘露醇培养基 1500

运用穿梭载体pFG5B和pFG15A，按照上述同样方式转化氧化葡糖杆菌G624可得到转化体G624-pFG5B和G624-pFG15A。由这些结果可确切知道葡萄糖酸杆菌的pF2质粒中AccⅠ切割位点及葡萄糖酸杆菌的pF3和pF4质粒中HindⅢ切割位点所处位置与各自的自身复制单元无关。(2)宿主内穿梭载体的稳定性

宿主内穿梭载体的稳定性通过如下的方法检测。

培养肉汤在无卡那霉素的MB培养基中传代培养两次，每一所得肉汤铺在无卡那霉素的MB琼脂平板上，随后30℃培养两天。出现的克隆在有卡那霉素(50μg/ml)的MB琼脂平板及无卡那霉素的平板上复印来检测其稳定性。根据下列公式计算稳定性。结果由表9示出。

表9 宿主内穿梭载体稳定性穿梭载体传代培养稳定性(％)pFG5B 1 100

2 100pFG14A 1 100

2 100pFG15A 1 100

2 100

导入三种pFG穿梭载体的转化细胞株其山梨糖的产出量与宿主一样，质粒对产出量无任何影响。

实施例14构建带有SDH及SNDH基因的表达载体(1)构建pSD5-RIBg

为使带有SDH基因及SNDH基因的DNA片段能整合进入穿梭载体，由pUC19SD5删除其SalⅠ位点及BglⅡ位点之间约2kb的片段以减小上述片段的大小。

具体地说，用SalⅠ(Nippon Gene,Japan)和BglⅡ(Pharmacia)消化pUC19SD5后得到约7,000kb和2,000b的DNA片段，将它们通过0.8％琼脂糖电泳分离。分离得到约7,000b片段用DNA聚合酶Ⅰ填平后通过T₄ DNA连接酶发生自身连接得到质粒pSD5-RIBg(见图7)。(2)构建表达载体

pSD5-RIBg用限制酶EcoRⅠ(Nippon Gene,Japan)酶和PstⅠ(Nippon Gene,Japan)消化得到含有SDH基因及SNDH基因的长约4.4kb DNA片段。该片段与实例12中构建穿梭载体pFG 14A的EcoRⅠ及PstⅠ双酶切所得片段用T4 DNA连接酶进行连接后得到含有SDH及SNDH基因的新表达载体pSDH 145(见图8)。同样方法，穿梭载体pFG 15A也被连接以构建表达载体pSDH 155(见图9)。实施例15

氧化葡糖杆菌T-100衍生质粒pSD5-RIBg的DNA序列分析。

为确定SNDH基因5’上游区域(包括启动子)及3’下游区域(包括终止子)的DNA序列，按照实例5及实例9同样的方法对pUC 19SD5(图2)进行DNA序列分析。结果在序列表SQ:ID No.5中示出。启动子区域在核苷酸1-1040之间，SNDH及SDH基因在核苷酸1041-4132之间，终止子包括在4133及其以后核苷酸之间。

实施例16由表达载体转化氧化葡糖杆菌G624(1)制备转化细胞株

以制备实例13(1)的相同方法用实例14得到的表达载体pSDH 145及pSDH 155转化氧化葡糖杆菌G624，得到转化细胞株G34(G624-pSDG 145)和GA-1(G624-pSDH 155)(FERM BP-4522)。(2)宿主内表达载体的稳定性

表达载体pSDH 145及pSDH 155是否如同穿梭载体pFG 14A及pFG 15A那样可在宿主氧化葡糖杆菌G624中稳定存在，根据实施例13(2)描述的方法进行检测。结果由表10示出。

表10 宿主内表达载体的稳定性表达载体传代培养稳定性(％)pSDH 145 1 98

2 93pSDH 155 1 100

2 100(3)转化细胞株的2KLGA产量

把转化细胞株GA-1接种至盛有6ml培养基的试管中，该培养基含有葡萄糖(2.5％)，多聚蛋白胨(1.0％)，酵母浸出物(0.5％)，碳酸钙(0.5％)和卡那霉素(50μg/ml)，它们在试管振荡器内30℃培养18小时以得到种子培养物。将其0.3ml接种至盛有10ml培养基的100ml三角烧瓶中，该培养基包括有：D-山梨糖醇(5％)，酵母浸出物(0.5％)和碳酸钙(2.0％)。烧瓶在旋转振荡器(250rpm)中30℃培养5天。所得培养物在4℃中6,000rpm离心10分钟，上清通过实施例10(2)中高效液相色谱分析法测量2KLGA的产量。能够高产2KLGA并用以克隆SDH基因和SNDH基因的氧化葡糖杆菌T-100在上述的相同条件下培养，然后测量其2KLGA的产量。结果如表11中所示。表 11

细胞株 2KLGA产量(mg/ml) L-艾杜糖酸产量(mg/ml)

GA-1 17 12

T-100 9 7

设计的转化体细胞株GA-1是由D-山梨糖醇生产2KLGA，很明显GA-1可以表达SDH基因及SNDH基因。并且由宿主G624的山梨糖醇脱氢酶从D-山梨糖醇转化所得L-山梨糖可通过SDH基因及SNDH基因的氧化作用生成2KLGA。

即使与氧化葡糖杆菌T-100这样具有改良的2KLGA产出潜能的突变细胞株并由天然生长细胞株中分离的可由D-山梨糖醇产出2KLGA的细胞株相比。GA-1明显显示出2KLGA产出量的增大。

根据实施例10(2)中描述的分析2KLGA的高效液相色谱方法，在分析2KLGA的同时也检测L-艾社糖酸是否有产出。表11中示出GA-1能产生相当数量的L-艾杜糖酸。产生艾杜糖酸的途径还不能确定，但认为如阻断艾杜糖酸产生的途径则会使2KLGA的产量增加。

实施例17制备低艾杜糖酸产出的宿主(1)制备低艾杜糖酸产出的转化细胞株

以亚硝基胍(NTG)处理转化细胞株GA-1来诱导得到可产出2KLGA的细胞株氧化葡糖杆菌IA 1069，它的L-艾杜糖酸产出能力大大下降。

根据实施例16(3)中描述的方法培养IA 1069细胞并通过高效液相色谱分析培养物中2KLGA和L-艾杜糖酸含量，结果见表12。

表12

细胞株 2KLGA产量(mg/ml) L-艾杜糖酸产量(mg/ml)

IA 1069 32 0(2)从低艾杜糖酸产出的转化细胞株中除去表达载体

用新生霉素处理IA 1069能够除去表达载体pSDH 155而不影响其由D-山梨糖醇产生L-山梨糖能力及低艾杜糖酸产出活性。

根据实施例16(3)中记载的方法培养的IA 1069的种子培养物1ml接种至盛有20ml MB培养基并添加新生霉素0.5μg/ml的100ml三角烧瓶中，在旋转振荡器(250rpm)内30℃培养24小时，随后在同一培养基中五次传代培养。所得培养物在无卡那霉素的MB琼脂平板上以30℃温育生长2天生长的克隆变制至无卡那霉素的MB琼脂平板及含卡那霉素(50μg/ml)的MB琼脂平板上：这样可以选择缺失表达载体pSDH 155的细胞株，在五次传代培养后，可发现约50％的表达载体pSDH 155丢失。将上述方法用来筛选表达载体pSDH 155缺失细胞株以得到单细胞。根据实例12(1)中描述的方法，由琼脂糖凝胶电泳证实pSDH 155被完全除去。根据实施例11(1)中描述方法研究了所得表达载体pSDH 155缺失细胞株NB 6939由D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的活性，结果发现它的高产山梨糖水平与氧化葡糖杆菌G624相当。

实施例18以表达载体转化氧化葡糖杆菌NB 6939及转化细胞株的2KLGA生产

以实施例13(1)中同样方式，用表达载体pSDH 145和pSDH 155去转化实施例17中所得氧化葡糖杆菌NB 6939后得到转化细胞株N 943(NB 6939-pSDH 145)和N952(NB 6939-pSDH 155)(FERM BP-4580)、转化细胞株N 943和N 952的种子培养物(0.3ml)接种至盛有10ml培养基的100ml烧瓶中，该培养基含有D-山梨糖醇(5％)。酵母浸出物(0.5％)及碳酸钙(2.0％)，按照实施例16(3)同样方式在旋转振荡器(250rpm)内30℃培养7天。

所得培养物在4℃中6,000rpm离心10分钟，上清通过高效液相色谱检测2KLGA和L-艾杜糖酸的产出。结果在表13中示出，同时还列出GA-1培养物的检测结果。

表13

细胞株 2KLGA产量(mg/ml) L-艾杜糖酸产量(mg/ml)

GA-1 20 16

N943 37 0

N952 38 0结果清楚显示在高产L-山梨糖、低2KLGA降解活性及低艾杜糖酸产出活性的宿主中导入表达载体能明显提高由D-山梨糖醇产生2KLGA的活性。

实施例19以带大肠杆菌启动子的表达载体转化氧化葡糖杆菌NB 6939及转化细胞株的2KLGA生产(1)构建插入启动子的表达载体

表达载体pSDH 155包括氧化葡糖杆菌T-100染色体DNA中SNDH基因翻译起始密码子(ATG)上游的1040bp在内的核苷酸序列(SQ:IDNo.5)，以及在SNDH基因启动子序列处插入的强启动子序列-这个序列能提高SNDH基因及SDH基因的表达。通过将CCATAG序列(SQ:IDNo.5中核苷酸1017-1022)修饰成为NcoⅠ位点(CCATGG)，并利用这个NcoⅠ切割位点及SQ:ID No.5中1-6处核苷酸序列的ZcoRⅠ切割位点可将启动子序列进行交换。

将NcoⅠ切割位点引入表达载体pSDH 155中SNDH基因的上游除去存在于SDH下游的NcoⅠ切割位点及来自穿梭载体pFG 15A的lac启动子以构建可插入启动子的表达载体。ⅰ)DNA序列的交换可运用SNDH基因上游的SspⅠ切割位点(SQ:IDNo.5中核苷酸1031-1036)及MluⅠ切割位点(SQ:ID No.5中核苷酸870-875)并引入NcoⅠ切割位点。以EcoRⅠ及PstⅠ切割pSD5-RIBg(图7)，通过0.8％琼脂糖电泳回收得到长度约4.6kb的片段，它包括启动子，SDH基因及SNDH基因。同时也以EcoRⅠ及PstⅠ消化大肠杆菌pBR322启动子，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳得到长度约3.6kbDNA片段，它包括四环素抗性基因及复制起点。这两个DNA片段由T4DNA连接酶进行连接后得到包括有一个SspⅠ切割位点的大肠杆菌表达载体pSD33(图10)。ⅱ)通过聚合酶链式反应(PCR)，可制备插有NcoⅠ切割位点的MluⅠ-SspⅠ DNA片段(SQ:ID No.5核苷酸序列870-1036)。具体地说，以pSD5-RⅠBg作为模板，以引物P5[5’CGG TGC GTT ACG CGTCAG GAAG 3’，序列中包括MluⅠ切割位点(下划线)]及P6[5’TCA TGAGAA ATA TTC CTA CTG ACC ATG GTG CTG CC 3’。序列中包括SspⅠ切割位点(5’端下划线)及NcoⅠ切割位点(3’端下划线)]进行聚合酶链式反应。PCR产物由快速旋转柱G-25(Behringer MannheimAG)纯化，再以SspⅠ及MluⅠ消化，由2％琼脂糖凝胶电泳得到包括161bp并有NcoⅠ切割位点的MluⅠ-SspⅠ DNA片段。同时以MluⅠ及SspⅠ消化pSD33得到长度约为8.0kb DNA片段，该片段及上述161bpMluⅠ-SspⅠ DNA片段通过T4 DNA连接酶连接后可得到一个包括NcoⅠ切割位点的大肠杆菌表达载体pSD34(图11)。ⅲ)pSD34由EcoRⅠ及PstⅠ消化之后可分离得到长度为4.6kb的DNA片段，它包括含有NcoⅠ切割位点的SNDH基因上游序列，SNDH基因及SDH基因。用它去置换表达载体pSDH 155中相应位点将得到在SNDH基因上游整合有NcoⅠ切割位点的表达载体pSDH 155-NC(图12)。ⅳ)因为表达载体pSDH 155-NC除了在SNDH基因上游有一个NcoⅠ切割位点以外，在SDH基因下游还有另外一个NcoⅠ切割位点，所以下面除去这个位于SDH基因下游的NcoⅠ切割位点(见图13)。首先，用NcoⅠ切割pSDH 155，用DNA聚合酶的Klenow片段填平其末端，再用T4 DNA连接酶使之环化得到无NcoⅠ切割位点的表达载体pSDH 155-NK。该载体用EcoRⅠ及SacⅠ消化后分离得到删除了SNDH基因上游，SNDH基因及部分SDH基因且其长度约为8.2kb DNA片段。同时以EcoRⅠ及SacⅠ消化表达载体pSDH 155-NC后分离得到包括有(含有NcoⅠ切割位点的)SNDH基因上游，SNDH基因及部分SDH基因的长度约为3.4kb DNA片段，这两个DNA片段由T₄ DNA连接酶连接后构建成为只在SNDH基因上游有一个NcoⅠ切割位点的表达载体pSDH 155-NN。(见图13)。ⅴ)因为表达载体pSDH 155-NN带有源自大肠杆菌质粒pHSG 298的lac启动子，因此下面将其除去lac启动子(图14)。具体地说，穿梭载体pFG 15A用Pvu Ⅱ部分消化得到仅有一个Pvu Ⅱ切割位点被消化的约7.0kb的DNA片段。这个DNA片段和EcoRⅠ接头(5’CCG GAA TTCCGG 3’)用T₄DNA连接酶连接，随后加热使酶失活。连接后的DNA用EcoRⅠ消化分离得到约6.8kb DNA片段，随后再用T₄DNA连接酶使之自身连接得到无lac启动子的穿梭载体pFG 16A。

这个pFG 16A用EcoRⅠ及PstⅠ切割分离出约6.8kb的DNA片段。同时用EcoRⅠ及PstⅠ消化pSDH 155-NN分离出长约4.6kb并包括含有NcoⅠ切割位点的SNDH基因上游序列，SNDH基因及SDH基因。这两个DNA片段用T₄DNA连接酶连接后得到可插入启动子的目标表达载体pSDH 165-NN(见图14)。(2)制备构建大肠杆菌启动子的DNA寡聚物

每一个大肠杆菌启动子在设计时都使之在启动子上游-35处有EcoRⅠ切割位点。并在启动子下游-10处有NcoⅠ切割位点。构成启动子的DNA寡聚物在-35处及-10处的中间分开。用DNA合成仪392型(Applied Siosystems)合成四条DNA寡聚物，它们分别包括-35区域，1-10区域及它们的互补寡聚物。构成每一个启动子的DNA寡聚物在表14中示出。

表14合成大肠杆菌启动子的DNA寡聚物1．tufB启动子

名称	大小	序列(5′→3′)
名称	大小	序列(5′→3′)	TUFB1TUFB2TUFB3TUFB4	(30)(33)(29)(26)	AAT TCG CAA TTT TTT AGT TGC ATG AAC TCGAGA CAT GCG AGT TCA TGC AAC TAA AAA ATT GCGCAT GTC TCC ATA GAA TGC GCG CTA CTT GCCAT GGC AAG TAG CGC GCA TTC TAT GG

2．trp启动子

名称	大小	序列(5′→3′)
名称	大小	序列(5′→3′)	P29P30P31P32	(30)(33)(29)(26)	AAT TCT GAA ATG AGC TGT TGA CAA TTA ATCGTT CGA TGA TTA ATT GTC AAC AGC TCA TTT CAGATC GAA CTA GTT AAC TAG TAC GCA AGT TCCAT GGA ACT TGC GTA CTA GTT AAC TA

3．λPL启动子

名称	大小	序列(5′→3′)
名称	大小	序列(5′→3′)	LAMBDA PL1LAMBDA PL2LAMBDA PL3LAMBDA PL4	(30)(33)(29)(26)	AAT TCT CTC TGG CGG TGT TGA CAT AAA TACGCC AGT GGT ATT TAT GTC AAC ACC GCC AGA GAGCAC TGG CGG TGA TAC TGA GCA CAT CAG CCCAT GGG CTG ATG TGC TCA GTA TCA CC

4．lac UV-5启动子

名称	大小	序列(5′→3′)
名称	大小	序列(5′→3′)	LAC UV5-1LAC UV5-2LAC UV5-3TAC4	(30)(35)(30)(25)	AAT TCG GCA CCC CAG GCT TTA CAC TTT ATGAGC CGG AAG CAT AAA GTG TAA AGC CTG GGG TGC CGCTT CCG GCT CGT ATA ATG TGT GGA ATT GTCCAT GGA CAA TTC CAC ACA TTA TAC G

5．lpp启动子

名称	大小	序列(5＇→3＇)
名称	大小	序列(5＇→3＇)	LPP1LPP2LPP3LPP4	(30)(33)(29)(26)	AAT TCA TCA AAA AAA TAT TCT CAA CAT AAAAAA GTT TTT TAT GTT GAG AAT ATT TTT TTG ATGAAA CTT TGT GTA ATA CTT GTA ACG CTA CCCAT GGG TAG CGT TAC AAG TAT TAC AC

6．tac启动子

名称	大小	序列(5′→3′)
名称	大小	序列(5′→3′)	P29TAC2TAC3TAC4	(30)(33)(28)(25)	AAT TCT GAA ATG AGC TGT TGA CAA TTA ATCAGC CGA TGA TTA ATT GTC AAC AGC TCA TTT CAGATC GGC TCG TAT AAT GTG TGG AAT TGT CCAT GGA CAA TTC CAC ACA TTA TAC G

(3)构建整合有大肠杆菌启动子序列的表达载体

整合有tufB启动子的表达载体pSDH-tufB1按如下方法构建(图15)。

DNA寡聚物TUFB2及TUFB3(每种1μl，约40pmol),10倍浓度的磷酸缓冲液[2μl,660mM Tris-HCl(pH7.5)100mMMgCl₂,150mM DTT],10mM ATP(2μl)，蒸馏水(12μl)以及T₄多核苷酸激酶(2μl,20单位)组成的混合物在37℃温育1小时后加热至65℃并保持30分钟以灭活酶。把DNA寡聚物TUFB1和TUFB4(每种1μl，约40pmol,5倍浓度的T₄ DNA连接酶缓冲液[8μl,250mM Tris-HCl(pH 7.6),50mM MgCl₂,5mM DTT,25％PEG-6000],10mM ATP(2μl)以及蒸馏水(4μl)加入到20μl反应混合物中(20μl)。将该混合物在70℃加热5分钟后冷却至4℃并保持30分钟。所得到的反应混合物加入T₄DNA连接酶(2μl,600单位，Takara Shuzo)及10mM ATP(4μl)，反应混合物在16℃放置2小时，随后在65℃加热30分钟使酶失活。以EcoRⅠ及NcoⅠ消化pSDH 165-NN并收集长度约为10.4kb的DNA片段。将寡聚物的连接混合物(1μl),10倍浓度的T₄ DNA连接酶缓冲液(2μl)，蒸馏水(10μl),10mM ATP(2μl)及T₄ DNA连接酶(2μl,600单位)加至所得(5μl,200ng)DNA片段中，使其在16℃发生2小时连接反应，最终得到目标表达载体pSDH-tufB1(见图15)。

带有trp启动子序列的pSDH-trp6表达载体，带有λPL启动子序列的pSDH-PL1表述载体，带有lac UV5启动子序列的pSDH-lac UV5-2表达载体，带有lpp启动子序列的pSDH-lppl表达载体以及带有tac启动子序列的pSDH-tac8表达载体部分别按照上述pSDH-tufB1的构建方法，分别运用表14中DNA寡聚物p29、p30、p31、p32,表14中DNA寡聚物LAMBDA PLl,LAMBDA PL2,LAMBDA PL3,LAMBDA PL4，表14中DNA寡聚物LAC UV5-1,LAC UV5-2,LAC UV5-3,LAC UV5-4，以及表14中DNA寡聚物LPP1,LPP2,LPP3,LPP4，表14中DNA寡聚物P29,TAC2,TAC3,TAC4等来制备。(4)用带有大肠杆菌启动子的表达载体转化氧化葡糖杆菌NB 6939及转化细胞株的2KLGA生产

按照实施例13(1)中同样的方法，由实施例17中得到的具有低L-艾杜糖酸产出活性的宿主用实施例17(3)中制备的带有大肠杆菌启动子的表达载体进行转化可得到转化细胞株NB 6939-pSDH-tufB1,NB 6939-pSDH-trp6,NB 6939-pSDH-PL1,NB 6939-pSDH-lac UV5-2,NB 6939-pSDH-lpp1,NB 6939-pSDH-tac 8。

按照实施例16(3)中描述的方法培养NB 6939-pSDH-tufB1,NB 6939-pSDH-trp6,NB 6939-pSDH-PLl，并得到它们的种子培养物。将0.3ml的种子培养物接种至盛有10ml培养基的100ml三角烧瓶中，该培养基含有10％D-山梨糖醇，1.0％玉米浆及2.0％碳酸钙，它们在旋转振荡器(250rpm)中在32℃培养5天。培养物在4℃中6,000rpm离心10分钟，上清进行高效液相色谱分析2KLGA的产量。这些结果在表15中示出。同时还有N952(NB 6939-pSDH 155)及NB 6939-pSDH 165-NN培养物的分析结果。

表 15

细胞株 2KLGA的产量(mg/ml)

N952 52

NB 6939-pSDH 165-NN 42

NB 6939-pSDH-tufB1 75

NB 6939-pSDH-trp6 73

NB 6939-pSDH-PL1 73

按照实施例16(3)中描述的方法培养NB 6939-pSDH-rufB1,NB 6939-pSDH-lac UV5-2,NB 6939-pSDH-lpp1及NB 6939-pSDH-tac 8并得到它们的培养物。将3ml的种子培养物接种至盛有10ml培养基的100ml三角烧瓶中，该培养基含有10％D-山梨糖醇，1.5％玉米浆0.15％MgSO₄及2.0％碳酸钙，它们在旋转振荡器内(250rpm)32℃培养5天。培养物在4℃中6,000rpm离心10分钟，上清用高效液相色谱分析2KLGA的产量。结果在表16中示出。同时还有N952(NB 6939-pSDH 155)及NB 6939-pSDH 165-NN培养物的分析结果。

表 16

细胞株 2KLGA的产量(mg/ml)

N952 73

NB 6939-pSDH 165-NN 56

NB 6939-pSDH-tufB1 91

NB 6939-pSDH-lac UV5-2 61

NB 6939-pSDH-lpp 1 33

NB 6939-pSDH-tac 8 85

序列表序列号：1序列长度：530序列类型：氨基酸拓扑学特点：线性分子类型：肽原材料：

生物：氧化葡糖杆菌

细胞株：T-100序列特征

鉴定方法：E序列：Thr Ser Gly Phe Asp Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly1 5 10 15Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg Val

20 25 30Cys Leu Ile Glu Ala Gly Arg Arg Asp Thr His Pro Leu Ile His

35 40 45Met Pro Val Gly Phe Ala Lys Met Thr Thr Gly Pro His Thr Trp

50 55 60Asp Leu Leu Thr Glu Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Gln Ile

65 70 75Pro Tyr Val Gln Gly Arg Ile Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn

80 85 90Ala Glu Val Phe Thr Arg Gly His Pro Ser Asp Phe Asp Arg Trp

95 100 105Ala Ala Glu Gly Ala Asp Gly Trp Ser Phe Arg Asp Val Gln Lys

110 115 120Tyr Phe lle Arg Ser Glu Gly Asn Ala Val Phe Ser Gly Thr Trp

125 130 135His Gly Thr Asn Gly Pro Leu Gly Val Ser Asn Leu Ala Glu Pro

140 145 150Asn Pro Thr Ser Arg Ala Phe Val Gln Ser Cys Gln Glu Met Gly

155 160 165Leu Pro Tyr Asn Pro Asp Phe Asn Gly Ala Ser Gln Glu Gly Ala

170 175 180Gly Ile Tyr Gln Met Thr Ile Arg Asn Asn Arg Arg Cys Ser Thr

185 190 195Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Gly Arg Lys Asn Leu Thr

200 205 210Val Val Thr Arg Ala Leu Val Leu Lys Ile Val Phe Asn Gly Thr

215 220 225Arg Ala Thr Gly Val Gln Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Leu Asn Thr

230 235 240Ala Glu Ala Ser Gln Glu lle Val Val Thr Ala Gly Ala Ile Gly

245 250 255Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala His

260 265 270Leu Arg Glu Asn Gly Ile Pro Val Val Gln Asp Leu Pro Gly Val

275 280 285Gly Glu Asn Leu Gln Asp His Phe Gly Val Asp Ile Val Ala Glu

290 295 300Leu Lys Thr Asp Glu Ser Phe Asp Lys Tyr Arg Lys Leu His Trp

305 310 315Met Leu Trp Ala Gly Leu Glu Tyr Thr Met Phe Arg Ser Gly Pro

320 325 330Val Ala Ser Asn Val Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Ser Asp

335 340 345Pro Ser Ser Gly Val Pro Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Glu

350 355 360Ala Gly Ala Glu Ala Gly Val Thr Ser Val Pro Lys Gly Ala Ser

365 370 375Gly Ile Thr Leu Asn Ser Tyr Val Leu Arg Pro Lys Ser Arg Gly

380 385 390Thr Val Arg Leu Arg Ser Ala Asp Pro Arg Val Asn Pro Met Val

395 400 405Asp Pro Asn Phe Leu Gly Asp Pro Ala Asp Leu Glu Thr Ser Ala

410 415 420Glu Gly Val Arg Leu Ser Tyr Glu Met Phe Ser Gln Pro Ser Leu

425 430 435Glu Lys His Ile Arg Lys Thr Cys Phe Phe Ser Gly Lys Gln Pro

440 445 450Thr Met Gln Met Tyr Arg Asp Tyr Ala Arg Glu His Gly Arg Thr

455 460 465Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg Asp Asp Met

470 475 480Ser Val Val Asp Pro Arg Leu Lys Val His Gly Leu Glu Gly Ile

485 490 495Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Leu Gly Ser Asn

500 505 510Thr Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Ser Glu Arg Ala Ala Asp Phe

515 520 525Ile Gln Gly Asn Ala

530序列号：2序列长度：497序列类型：氨基酸拓扑学特点：线性分子类型：肽原材料：

生物：氧化葡糖杆菌

细胞株：T-100序列特征：

鉴定方法：E序列：Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu1 5 10 15Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe

20 25 30Phe Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile

35 40 45Pro Arg Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala

50 55 60Arg Arg Ala Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala

65 70 75Asp Arg Ala Ala Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu

80 85 90Arg Arg Asp Asp Ile Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys

95 100 105Pro Ile Ser Gln Ala Lys Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys

110 115 120Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr

125 130 135Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu Phe Gly Met Val Leu Arg Glu

140 145 150Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr Pro Trp Asn Phe Pro Phe

155 160 165Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile Leu Ala Ser Gly Cys

170 175 180Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser Ala Thr Thr Leu

185 190 195Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro Lys Gly Val

200 205 210Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln Ala Met

215 220 225Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser Thr

230 235 240Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu

245 250 255Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val

260 265 270Phe Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe

275 280 285Gly Ile Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg

290 295 300Leu Ile Val Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val

305 310 315Val Pro Lys Met Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro

320 325 330Glu Thr Gln Ile Gly Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr

335 340 345Ile Leu Asp Tyr Ile Ala Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu

350 355 360Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile

365 370 375Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala

380 385 390Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu Ala Ser Phe His Phe Asp

395 400 405Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn Asp Thr Val Tyr Gly

410 415 420Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp Lys Ala Leu Ala

425 430 435Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val Asn Thr Ile

440 445 450Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys Gln Ser

455 460 465Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr Thr

470 475 480Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp

485 490 495Ile Ser序列号：3序列长度：1596序列类型：核酸链型：双链拓扑学特点：线性分子类型：基因组DNA原材料：

生物：氧化葡糖杆菌

细胞株：T-100序列特点：

名称/关键字：CDS

位置：4..1593

鉴定方法：E序列ATGACGAGCG GTTTTGATTA CATCGTTGTC GGTGGCGGTT CGGCTGGCTG TGTTCTCGCA 60GCCCGCCTTT CCGAAAATCC TTCCGTCCGT GTCTGTCTCA TCGAGGCGGG CCGGCGGGAC 120ACGCATCCCC TGATCCACAT GCCGGTCGGT TTCGCGAAGA TGACCACGGG GCCGCATACC 180TGGGATCTTC TGACGGAGCC GCAGAAACAT GCGAACAACC GCCAGATCCC CTATGTGCAG 240GGCCGGATTC TGGGCGGCGG ATCGTCCATC AACGCGGAAG TCTTCACGCG GGGACACCCT 300TCCGACTTCG ACCGCTGGGC GGCGGAAGGT GCGGATGGCT GGAGCTTCCG GGATGTCCAG 360AAGTACTTCA TCCGTTCCGA AGGCAATGCC GTGTTTTCGG GCACCTGGCA TGGCACGAAC 420GGGCCGCTCG GGGTGTCCAA CCTCGCGGAG CCGAACCCGA CCAGCCGTGC CTTCGTGCAG 480AGCTGTCAGG AAATGGGGCT GCCCTACAAC CCTGACTTCA ACGGCGCATC GCAGGAAGGC 540GCAGGCATCT ATCAGATGAC GATCCGCAAC AACCGGCGCT GCTCGACGGC TGTGGGGTAT 600CTGCGTCCGG CTCTGGGGCG GAAGAACCTG ACGGTTGTGA CGCGGGCGCT GGTCCTGAAG 660ATCGTCTTCA ACGGAACGCG GGCGACGGGC GTGCAGTATA TCGCCAACGG CACCCTGAAT 720ACCGCCGAAG CGAGCCAGGA AATCGTTGTG ACGGCCGGAG CGATCGGAAC GCCGAAGCTG 780ATGATGCTGT CGGGCGTCGG GCCTGCCGCG CATCTTCGCG AAAATGGTAT CCCGGTCGTG 840CAGGATCTGC CGGGCGTGGG CGAGAACCTT CAGGATCATT TCGGTGTGGA TATCGTAGCC 900GAGCTCAAGA CGGATGAGAG CTTCGACAAG TACCGGAAAC TGCACTGGAT GCTGTGGGCA 960GGTCTTGAAT ATACCATGTT CAGATCCGGT CCCGTTGCAT CCAACGTGGT TGAGGGCGGC 1020GCGTTCTGGT ACTCGGACCC GTCATCGGGT GTTCCTGATC TCCAGTTCCA TTTTCTTGCG 1080GAGGCTGGGG CTGAGGCTGG AGTGACGTCC GTTCCCAAGG GAGCGTCCGG GATTACGCTG 1140AACAGCTATG TGCTGCGTCC GAAGTCTCGT GGAACTGTCC GGCTGCGTTC GGCAGATCCA 1200AGGGTCAATC CGATGGTCGA TCCCAATTTC CTTGGAGACC CGGCCGACCT TGAGACGTCT 1260GCGGAAGGTG TGCGCCTGAG CTACGAGATG TTCTCCCAGC CGTCTTTGGA GAAGCACATC 1320CGGAAAACCT GTTTCTTTAG CGGTAAACAG CCGACGATGC AGATGTATCG GGACTATGCG 1380CGGGAACATG GCCGGACGTC CTATCATCCG ACATGCACCT GCAAGATGGG TCGTGATGAC 1440ATGTCCGTCG TCGATCCGCG TCTGAAGGTT CATGGCCTTG AGGGCATCAG GATCTGTGAC 1500AGTTCGGTTA TGCCGTCGCT GCTCGGTTCC AACACCAATG CTGCGACGAT CATGATCAGT 1560GAGCGGGCAG CGGATTTCAT TCAGGGGAAC GCCTGA 1596序列号：4序列长度：1497序列类型：核酸链型：双链拓扑学特点：线性分子类型：基因组DNA原材料：

生物：氧化葡糖杆菌

细胞株：T-100序列特点：

名称/关键字：CDS

位置：4..1494

鉴定方法：E序列ATGAATGTTG TCTCAAAGAC TGTATCTTTA CCGTTAAAGC CGCGTGAGTT CGGATTCTTT 60ATTGATGGAG AATGGCGCGC AGGTAAGGAT TTCTTCGATC GTTCCTCGCC GGCTCATGAT 120GTTCCCGTCA CCCGTATTCC ACGCTGCACC CGTGAAGACC TTGATGAGGC AGTCGCTGCT 180GCACGTCGTG CTTTCGAGAA CGGAAGCTGG GCGGGTCTGG CAGCCGCGGA TCGTGCGGCG 240GTTCTTCTGA AAGCCGCGGG CCTTCTGCGC GAGCGCCGTG ATGACATCGC TTACTGGGAA 300GTTCTCGAAA ACGGGAAGCC CATCAGCCAG GCGAAAGGTG AGATCGATCA CTGTATCGCC 360TGTTTCGAGA TGGCGGCCGG CGCTGCGCGG ATGCTGCATG GTGATACGTT CAACAATCTG 420GGCGAGGGGC TGTTTGGCAT GGTCCTGCGG GAGCCCATCG GTGTCGTCGG TCTGATTACG 480CCGTGGAACT TCCCGTTCAT GATCCTGTGT GAGCGGGCGC CTTTCATTCT CGCATCCGGC 540TGCACGCTGG TCGTCAAGCC TGCCGAAGTC ACGAGTGCCA CGACCCTTCT TCTGGCAGAA 600ATCCTTGCCG ATGCCGGGCT GCCGAAGGGT GTCTTCAATG TCGTGACAGG CACGGGGCGC 660ACGGTCGGTC AGGCCATGAC CGAGCATCAG GATATCGACA TGCTGTCCTT CACGGGCTCC 720ACGGGCGTCG GCAAGTCCTG TATCCACGCG GCGGCTGACA GCAACCTGAA GAAACTTGGC 780CTCGAACTGG GCGGCAAGAA CCCGATTGTC GTGTTCGCTG ACAGCAACCT TGAGGATGCG 840GCCGACGCGG TAGCCTTCGG GATCAGCTTT AATACCGGGC AGTGCTGTGT GTCGTCGAGC 900CGCCTGATCG TAGAGCGGTC CGTGGCGGAG AAGTTCGAGC GCCTCGTCGT GCCAAAAATG 960GAGAAGATCC GCGTTGGTGA TCCGTTTGAT CCCGAAACGC AGATTGGCGC CATCACGACG 1020GAAGCGCAGA ACAAGACCAT TCTGGACTAT ATCGCGAAAG GCAAGGCCGA GGGCGCCAAG 1080CTGCTCTGTG GTGGCGGGAT CGTCGATTTC GGCAAGGGAC AGTATATCCA GCCCACGCTT 1140TTCACGGATG TGAAGCCCTC GATGGGCATC GCGCGTGACG AGATTTTTGG GCCGGTTCTG 1200GCGTCCTTCC ACTTCGATAC CGTCGATGAG GCGATCGCGA TTGCCAATGA CACGGTTTAC 1260GGCTTGGCCG CATCGGTCTG GAGCAAGGAT ATCGACAAGG CGCTTGCCGT GACCCGTCGT 1320GTTCGTGCCG GCCGCTTCTG GGTGAACACC ATCATGAGCG GTGGTCCCGA GACGCCGCTG 1380GGTGGTTTCA AGCAGTCGGG CTGGGGCCGT GAGGCCGGTC TGTACGGCGT TGAGGAATAT 1440ACGCAGATCA AATCTGTCCA TATCGAAACT GGCAAACGTT CGCACTGGAT TTCGTAA 1497序列号：5序列长度：4624序列类型：核酸链型：双链拓扑学特点：线性分子类型：基因组DNA原材料：

生物：氧化葡糖杆菌

细胞株：T-100序列GAATTCAGGG GGGTGAGATG TATGTTTGTA AGAAAAACTG CGCCTTAATT CTTGCAGACCAGGCGGCATA TCGTTTCGAT ATTAAAGGAA ATTCTTTCTT CAAGCGCTTC GGGGGCTGTAAAATCCCGCT CGAAGATTAC CGATCCCGTG AAGCGGTTTG TGAAATAATA ATAATTGATCGAGGCGATCG TGATGTTCAG CTGGGCTGCG TCAATGCCAT CGCGGAAGAC GTTTTCCCGAACCCCCCGAT CCAGAAGAGA CTGGATGCGG CGGACGAATT TCTGACTGAT CGTCTTCAGT 300GTGGGCGAGT TCCGGATATG GGCGGCCTGA CAGAGGTTCT CGCTGTTCAC AAGGGTGATG 360AACTCCGGAT TGGCGATATA GTATTCCCAT GTGAAACGGA CGAGCGTTTC GGAGTGCTGT 420CCTGGGGGGC AGGTTCTCCA GATCCAGTCT GGTCTCTTCC TCCCGAATGT TGAGGTATTT 480CCGCTCCAGG ACGGTGCGGA AGAGCCCGTC CTTACTTTTG AAGTAGTGGT AGAGCATCCT 540CTTGTTGGCC TTGGCATCGA GGGCGATCGT ATCGACCCGC GCGCCTTCAA GCCCGTTTCG 600GGCAAACTCC TTCTTCGCCG CTTCGAGAAT GCGTAATTTC GTGGCCTCAG CGTCCCTGAC 660ACGCTTTTTC GTAGAGGAGG ACGCTCTGCT TTTCTCAAGG GGCATCAGGG GTTTGTTCCG 720CTCTCAGTAG GGGCGCTCTT TCTGGGGGAA ACCGCCCCAA AAGAAAAGCG GATCATAAAA 780TCACACTTAA AGTACGAAAA AATATCAACG TAACGTGATT TCATGCTGGC GTACCCCTGC 840GATATGTGTA AGTAACTACA CGGTGCGTTA 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2580TGGCTGTGTT CTCGCAGCCC GCCTTTCCGA AAATCCTTCC GTCCGTGTCT GTCTCATCGA 2640GGCGGGCCGG CGGGACACGC ATCCCCTGAT CCACATGCCG GTCGGTTTCG CGAAGATGAC 2700CACGGGGCCG CATACCTGGG ATCTTCTGAC GGAGCCGCAG AAACATGCGA ACAACCGCCA 2760GATCCCCTAT GTGCAGGGCC GGATTCTGGG CGGCGGATCG TCCATCAACG CGGAAGTCTT 2820CACGCGGGGA CACCCTTCCG ACTTCGACCG CTGGGCGGCG GAAGGTGCGG ATGGCTGGAG 2880CTTCCGGGAT GTCCAGAAGT ACTTCATCCG TTCCGAAGGC AATGCCGTGT TTTCGGGCAC 2940CTGGCATGGC ACGAACGGGC CGCTCGGGGT GTCCAACCTC GCGGAGCCGA ACCCGACCAG 3000CCGTGCCTTC GTGCAGAGCT GTCAGGAAAT GGGGCTGCCC TACAACCCTG ACTTCAACGG 3060CGCATCGCAG GAAGGCGCAG GCATCTATCA GATGACGATC CGCAACAACC GGCGCTGCTC 3120GACGGCTGTG GGGTATCTGC GTCCGGCTCT GGGGCGGAAG AACCTGACGG TTGTGACGCG 3180GGCGCTGGTC CTGAAGATCG TCTTCAACGG AACGCGGGCG ACGGGCGTGC AGTATATCGC 3240CAACGGCACC CTGAATACCG CCGAAGCGAG CCAGGAAATC GTTGTGACGG CCGGAGCGAT 3300CGGAACGCCG AAGCTGATGA TGCTGTCGGG CGTCGGGCCT GCCGCGCATC TTCGCGAAAA 3360TGGTATCCCG GTCGTGCAGG ATCTGCCGGG CGTGGGCGAG AACCTTCAGG ATCATTTCGG 3420TGTGGATATC 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AAGATGACGA AAGTCAGGAC AGCGACCGAG GCTGTGAGCC 4320TCATCAGGGA CGGAGCCATG GTTGCCGTCA ATTCGTCCTC GGGGCTTCTG TGTCCCGACG 4380CGGTTCTTGA AGCACTGGGA CAGCGTTTCG AGGCTACAAA ATCTCCATCT AAACTGACGA 4440CCATCCATCC GATTGCCGCA GGCGACATGT TCGGGACCAA GGGCGTGGAC CATCTTGCCC 4500GTCCGGGCAT GATTACGAAG ATCATTGGCG GCTCCTATCC TTCCGGGCCG AGCAATGCCG 4560AGCCACCGCT GATCTGGCAG CGCATCCAGG CAGAAGATCC GACCTGCAGG CATGCAAGCT 4620TGGC 4624

Claims

1．一种表达载体，包括编码L-山梨糖脱氢酶的DNA及编码L-山梨糖醛酮脱氢酶的DNA。

2．权利要求1中的表达载体，其中编码L-山梨糖脱氢酶的DNA及编码L-山梨糖醛酮脱氢酶的DNA的构建是使得转录可由一个启动子下相继发生，或者每一个DNA的转录在不同的启动子控制下发生。

3．权利要求1或2中的表达载体，其中启动子是L-山梨糖醛酮脱氢酶基因的启动子区域或其中有启动子活性的部分。

4．权利要求1或2中的表达载体，其中启动子源自大肠杆菌。

5．权利要求1或2中的表达载体，其中启动子为大肠杆菌启动子tufB,λPL,trp或tac。

6．权利要求1的表达载体，其适用于转化能由D-山梨糖醇高产L-山梨糖的、没有或仅有低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性的宿主微生物。

7．权利要求1的表达载体，其适用于转化能由D-山梨糖醇高产L-山梨糖的、没有或仅有低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性，没有或仅有低的L-艾杜糖酸产出活性的宿主微生物。

8．权利要求1的表达载体，其中编码L-山梨糖脱氢酶的DNA及编码L-山梨糖醛酮脱氢酶的DNA是编码源自氧化葡糖杆菌T-100的所述酶类的DNA。

9．权利要求1的表达载体，其中编码L-山梨糖脱氢酶的DNA及编码L-山梨糖醛酮脱氢酶的DNA所编码的酶分别具有序列表中SQ:IDNo.1及SQ:ID No.2描述的氨基酸序列。

10．权利要求1的表达载体，其中编码L-山梨糖脱氢酶的DNA及编码L-山梨糖醛酮的DNA分别具有序列表中SQ:ID No.3及SQ:IDNo.4中的核苷酸序列。

11．一种用权利要求1的表达载体转化宿主细胞而得到的可由D-山梨糖醇生产2-酮-L-古洛糖酸的转化体，其中宿主微生物可以由D-山梨糖高产L-山梨糖，并且没有或仅有低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性。

12．一种用含有编码L-山梨糖脱氢酶的DNA的表达载体和含有编码L-山梨糖醛酮脱氢酶的DNA的表达载体转化宿主细胞而得到的转化体，该转化体可由D-山梨糖醇生产2-酮-L-古洛糖酸，其中宿主微生物可以由D-山梨糖醇高产L-山梨糖，并且没有或仅有低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性。

13．一种用权利要求1的表达载体转化宿主细胞而得到的可由D-山梨糖醇生产2-酮-L-古洛糖酸的转化体，其中宿主微生物可以由D-山梨糖高产L-山梨糖，并且没有或仅有低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性以及没有或仅有低的艾杜酸生产活性。

14．一种用含有编码L-山梨糖脱氢酶的DNA的表达载体和含有编码L-山梨糖醛酮脱氢酶的DNA的表达载体转化宿主细胞而得到的转化体，该转化体可由D-山梨糖醇生产2-酮-L-古洛糖酸，其中宿主微生物可以由D-山梨糖醇高产L-山梨糖，并且没有或仅有低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性以及没有或仅有低的L-艾杜酸生产活性。

15．生产2-酮-L-古洛糖酸的方法，包括在含有D-山梨糖醇的培养基中培养权利要求11至14中任一项的转化体，并由得到的培养物获得2-酮-L-古洛糖酸。