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CN107206379A - 改进的小滴测序装置和方法 - Google Patents

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CN107206379A
CN107206379A CN201680006117.8A CN201680006117A CN107206379A CN 107206379 A CN107206379 A CN 107206379A CN 201680006117 A CN201680006117 A CN 201680006117A CN 107206379 A CN107206379 A CN 107206379A
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aqueous medium
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analyte
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CN201680006117.8A
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巴纳比·巴姆福思
卡梅伦·亚历山大·弗雷林
托马斯·亨利·艾萨克
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Base4 Innovation Ltd
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Abstract

提供用于对多核苷酸分析物进行测序的装置，并且所述装置包括；●第一区域，在其中通过逐步消化与颗粒连接的分析物的分子产生单个核苷酸流，所述颗粒位于所述第一区域中并且暴露于流动的水性介质；●第二区域，在其中从所述水性介质和所述核苷酸流产生相应的水性小滴流，并且其中所述至少一些小滴含有单个核苷酸，和●第三区域，在其中储存和/或询问每个小滴以揭示所述小滴中可能含有的单个核苷酸特有的性质；其特征在于，所述第一区域包括微流体通道，所述水性介质通过所述微流体通道流动，并且位置在其壁中包括中空的基座，能够向所述基座中施加抽吸，并且所述颗粒能够紧密匹配在所述基座中。

Description

改进的小滴测序装置和方法
本发明涉及用于对多核苷酸(如例如源自天然来源的遗传物质的RNA和DNA片段或其合成的类似物)进行测序的改进的装置和方法。
遗传物质的下一代测序已经对生物科学整体上和特别地对医学产生显著的影响，原因在于测序的单位成本降低，与越来越快的测序仪投放市场一致。在我们之前的申请WO2014/053853和WO 2014/053854中，我们描述了新的测序方法和相关装置，其涉及逐步消化多核苷酸分析物以产生单个-核碱基核苷酸(下文为‘单个核苷酸’)流，优选通过焦磷酸解产生的其有序的流，其每一个可以逐个被捕获到微滴流中的相应小滴中。之后，可以化学和/或酶操作每个小滴以揭示其最初包含的特定单个核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶操作包括涉及使用一种或多种两组分寡核苷酸探针类型的方法，所述两组分寡核苷酸探针类型中的每个适于能够选择性捕获构成分析物的单个核苷酸类型中的一种；例如在天然存在的DNA的情形中，对应于核碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤的四种类型中的一种。通常，在每个这样的探针类型中，两种寡核苷酸组分中的一种包含不同的和特征性荧光团，并且在探针的未使用状态，这些荧光团发荧光的能力由于位于附近的猝灭剂的存在或通过自猝灭保持不存在。之后，一旦特定探针捕获其相应的单个核苷酸，其变得容易受外切核酸酶降解影响，由此引起荧光团与所述猝灭剂分离和/或彼此分离，并且由此使它们能够在其特征波长自由发荧光。通过这种方式，每个小滴中最初存在的单个核苷酸的性质可以从光谱分析推断。
J.Biotech.102(2003)，第1-14页，US2008/0194012和Lab on a Chip(2012)，第906-915页教导了用于各种不同目的的珠子的真空固定。
我们现在开发了用于这种类型的测序方法的装置的改进的版本，其允许初始多核苷酸消化步骤容易地且可靠地进行，并且以能够利用数千个小滴产生位点多重地工作的方式进行。该改进涉及首先将要分析的多核苷酸(下文为分析物)固定在颗粒的表面，并且之后将所述颗粒固定在所述装置内的位置，在所述位置，通过跨越它施加负压力梯度发生消化。我们了解，US6471917之前已经描述了将小的固体珠子置于有组织的阵列中的系统和技术，但就我们所知，这样的技术尚未应用于在流动中持有单个分子或单个分子测序应用。
因此，根据本发明的第一方面，提供对多核苷酸分析物进行测序的装置，所述装置包括：
●第一区域，在其中通过逐步消化与颗粒连接的分析物的分子产生单个核苷酸流，所述颗粒位于所述第一区域中并且暴露于流动的水性介质；
●第二区域，在其中从所述水性介质和所述核苷酸流产生相应的水性小滴流，并且其中至少一些小滴含有单个核苷酸，和
●第三区域，在其中储存和/或询问每个小滴以揭示所述小滴中可能含有的单个核苷酸特有的性质；
其特征在于，所述第一区域包括微流体通道，所述水性介质通过所述微流体通道流动，并且位置在其壁中包括中空的基座，可以向所述基座中施加抽吸，并且所述颗粒可以紧密匹配在所述基座中。
本发明的装置涉及这样的区域，其中通过使用酶逐步消化多核苷酸分析物产生单个核苷酸流，优选有序的单个核苷酸流。在一个实施方案中，该逐步消化包括使用外切核酸酶的外切核酸酶降解。在另一个实施方案中，其包括使用磷酸酶的磷酸解。在另一个实施方案中，消化包括使用聚合酶焦磷酸解。根据选择的特定消化模式，分析物可以是单链的、双链的或部分双链的多核苷酸，并且可以具有原理上可能不限的核苷酸链长度；例如多至并且包括基因组片段中发现的数百万的核苷酸或核苷酸对。在一个实施方案中，分析物因此将是至少50个，优选至少150个核苷酸或核苷酸对长度；适当地，其将大于500，大于1000，并且在一些情况下，为5000+个核苷酸对长度。分析物本身适当地包含天然来源(例如源自植物、动物、细菌或病毒的遗传物质)的RNA或DNA，尽管该方法同等适用于部分或整体合成的RNA或DNA或实际上由包含天然不常遇到的核苷酸碱基的核苷酸整体或部分制成的其他核酸(即具有除了腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核碱基的核苷酸)的测序。这样的核碱基的实例包括4-乙酰基胞苷，5-(羧基羟基甲基)尿苷，2-O-甲基胞苷，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷，5-羧基甲基氨基-甲基尿苷，二氢尿苷，2-O-甲基假尿苷，2-O-甲基鸟苷，肌苷，N6-异戊基腺苷，1-甲基腺苷，1-甲基假尿苷，1-甲基鸟苷，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟苷，2-甲基腺苷，2-甲基鸟苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，N6-甲基腺苷，7-甲基鸟苷，5-甲基氨基甲基尿苷，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷，5-甲氧基尿苷，5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷，5-甲氧基羰基甲基尿苷，2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷，尿苷-5-氧基乙酸-甲酯，尿苷-5-氧基乙酸，wybutoxosine，wybutosine，假尿苷，queuosine，2-硫代胞苷，5-甲基-2-硫代尿苷，2-硫代尿苷，4-硫代尿苷，5-甲基尿苷，2-O-甲基-5-甲基尿苷和2-O-甲基尿苷。在外切核酸酶降解、磷酸解和焦磷酸解的情形下，产生的单个核苷酸分别是核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸，其具体形式取决于分析物是DNA还是RNA。
在所述装置的一个版本中，将分析物以3’-5’方向逐步焦磷酸解，产生单个核苷酸三磷酸流，其顺序与分析物序列的顺序对应。焦磷酸解本身通常在20至90℃的范围内的温度在反应介质(包括聚合酶)的存在下进行。其还适当地进行，从而单个核苷酸由流动的水性介质连续从颗粒周围焦磷酸解的区域移除。该移除在产生小滴的出口处或与其紧邻处发生。在一个实施方案中，将该介质缓冲，并且还包含维持焦磷酸解反应所需的那些其他成分(聚合酶，焦磷酸根阴离子，镁阳离子等)。在另一个实施方案中，其另外含有以下各项的一种或多种：(a)下文指定的探针类型(或具有等价功能的探针)；(b)引起探针结合并捕获相关单个核苷酸所需的各种化学品和酶(例如聚合酶和/或连接酶)和(3)引起使用的探针的随后的外切核酸酶降解发生所需的酶。备选地，这些成分中的一些或全部可以一起或分阶段引入到流动的水性介质中或在第三区域上游的一些其他点处的小滴中(根据情况而定)。这样随后将这些成分直接引入到小滴可以例如通过使用注射器注射或通过小滴合并实现。
优选地，设计装置，使得焦磷酸解的速率尽可能快，并且在一个实施方案中，该速率落在1至50个单个核苷酸/秒的范围内。关于如所用的焦磷酸解反应以逐步降解多核苷酸的其他信息可以例如在J.Biol.Chem.244(1969)第3019-3028页中找到。
在本发明的装置中，将进行消化的分析物分子适当地与颗粒提前连接。在一个实施方案中，该颗粒包含珠子；例如微珠，其由惰性材料如玻璃、二氧化硅、氧化铝，金属或不可降解的聚合物制成。在另一实施方案中，珠子由磁性材料制成，使得其通过磁性被引入到装置中并递送到希望的位置。
优选地，颗粒还包含外表面，所述外表面特异性适于与分析物物理或化学结合。存在很多分析物可以这样结合的方式，理论上可以使用其中任一种。例如，一种方式涉及用官能化的硅烷如环氧硅烷、氨基烃基硅烷或巯基硅烷引发玻璃珠的表面。这样产生的反应性位点随后可以用已经相应修饰以包括末端胺、琥珀酰基或巯基的分析物衍生物处理。在一个实施方案中，化学连接可以通过与衔接子寡核苷酸连接或通过生物素-链霉亲和素缀合发生。
在另一实施方案中，这样引发的颗粒将仅具有一个反应性位点，从而分析物的仅一个分子可以与其连接。如果分析物是小的多核苷酸片段，则这是重要的，原因在于，要不然多重分子倾向于成为被连接的，这是不希望的。如果片段大，则这是次要的考虑，因为空间效应将起作用以妨碍这种现象发生。适当地，颗粒的最大直径将在1至5微米的范围内。
装置中使用的第一区域适当地为微流体尺度的，并且包括至少一个可以放置颗粒并且通过施加负压力梯度保持固定的位置。在一个实施方案中，第一区域包括微流体通道，如微米尺寸的室或一件微流体管道，并且所述位置在室或管道的壁中包括中空的基座，例如锥台基座(frustoconical seating)，颗粒可以紧密匹配在所述中空的基座中。以此排列方式，基座的中空内部与可以施加以真空抽吸的第二通道的入口连接。一旦颗粒就位，随后可以通过，例如，施加连续的抽吸或通过排空中空的基座的内部并在静态真空下将其密封来维持负压力梯度。在该装置类型中，中空的基座适当地位于紧接第二区域的上游处。
水性介质从第一区域以含有彼此在空间上临时性分离并且以与分析物的核苷酸序列对应的顺序排列的单个核苷酸的液体流的形式流出。之后，在第二区域中，通过使水性介质从合适的尺寸和几何形状的产生小滴的头部流向包含不混溶溶剂(如矿物油或烃油，例如硅油)的流动的载体介质，该水性流随后转变为对应的水性小滴流，适当地微滴流，它们中的至少一些含有单个核苷酸。备选地，并且在优选的实施方案中，颗粒可以固定在打印机喷嘴或类似组件的第一区域上游，在此情况下，任选地，涉及的载体介质可以被分散或使其不流动。为了避免给定微滴含有多于一个单个核苷酸的风险，优选的是在焦磷酸解步骤释放单个核苷酸和/或调整水性介质通过第一区域的流动，使得每个通过喷嘴产生的填充的(filled)微滴由1至20个优选2至10个空的微滴分开。之后，填充的和未填充的微滴流(任选地在溶剂中)，以微滴维持离散状态并且不具有彼此合并的机会的速率和方式打印在第三区域上或使其沿流动路径(适当地是微流体流动路径)流到第三区域。适当地，使用的微滴直径小于100微米，优选小于50微米，更优选小于20微米并且甚至更优选小于15微米。所有中最优选的是，其直径在2至20微米的范围内。在一个实施方案中，微滴从第二区域到第三区域的流速在50至3000小滴/秒的范围内，优选100至2000小滴/秒的范围内。
与第二区域流体连通的第三区域适于接收和储存小滴。在一个实施方案中，该第三区域包含表面，如金属或塑料片或载玻片的表面，其相对于第二区域(例如打印机喷嘴)的外出点(egress point)可移动，实际上使得每个小滴以与喷墨打印机相似的可重复方式打印在表面上的指定点。在该设计的一个实施方案中，接收表面以离散的小滴接收位置(如孔或小滴结合位点)的阵列形成样式，每个小滴可以被递送和固定到所述小滴接收位置。在另一实施方案中，表面用与小滴不混溶的液体层预覆盖，其帮助防止相邻的小滴经历迁移和合并。在本设计的优选的版本中，该液体层包含可UV光固化的单体，使得一旦所有小滴接收位置被填满，液体可以被固化并且小滴可以被永久包封在半透明的固体聚合物基质中。
之后依次在每个小滴接收位置询问样式化的表面，以揭示每个小滴可能含有的单个核苷酸特有的性质。尽管可以使该询问与装置分开，例如任选地在另一专门的装置如分光光度计内，其优选使用作为第三区域的整体部分的询问工具进行。
由询问工具检测的性质理论上可能是直接或间接使其显示的单个核苷酸的任意特征性性质。例如，在一个实施方案中，每个单个核苷单磷酸、二磷酸或三磷酸的性质，酌情通过利用电磁辐射询问每个小滴并且研究经历拉曼散射的光来确定。在该实施方案中，源自单个核苷酸的拉曼散射优选通过在小滴内包括能够被刺激以经历等离子共振的金属(如金或银)的胶体来增强。在另一优选的实施方案中，测量由小滴中存在的荧光团产生的荧光射线。在这两种实施方案中，询问工具适当地包含聚焦的入射光源，例如激光束；光检测器或类似装置，其调节至核苷酸的振动模式或荧光团的荧光模式的特征波长或波长包络(wavelength envelope)；移除相对于彼此(例如机械台)的表面上的入射光源、光检测器和小滴的工具和用于引导和聚焦入射光和荧光束的相关光学器件。
两种装置类型还可以进一步包含与其整体的微处理器，用于分析由询问工具产生的数据，所述数据是分析物的序列特有的。如果非常需要，该责任可以备选地使用独立的计算机远程进行。
该装置特别用于产生和询问这样的小滴，在所述小滴中，它们含有的单个核苷酸之前已经由仅在它们已经被使用并且经历随后的外切核酸酶降解后能实质上发荧光的探针选择性捕获。概括地，这通过保证装置能够处理在一些点含有对构成分析物的多种单个核苷酸的一种有选择性的至少一个探针类型的分子和酶的小滴，从而允许使用例如聚合酶和/或连接酶将单个核苷酸结合入其相应探针来实现。每个小滴还将在一些点包含3’-5’外切核酸酶或表现出等价活性的聚合酶；焦磷酸酶，缓冲液，表面活性剂和生物化学领域常见的其他成分。在一个实施方案中，将这些探针、酶、外切核酸酶和其他成分中的一些、全部或任何排列引入第一区域中的最初的水性介质或包含在最初的水性介质进料自身内。另外，在产生每个小滴时或之后，将这些探针、酶、外切核酸酶和其他成分中的一些、全部或任何排列引入水性介质。在该情形中，这些物质可以通过例如直接注射或通过将它们首先放置在包含次级小滴流的次级小滴中并之后将来自该流的小滴逐个与初级流中的相应小滴合并而被引入到小滴中。
关于探针本身，可以有利地使用的一种类型是基于各种捕获系统的那些，并且其使用模式在我们的专利申请WO 2014/053853，WO 2014/053854，WO 2014/167323，和WO2014/167324中教导；它们的内容通过参考结合于本文。简言之，这些探针中的一个亚型，在其未使用状态，特征为包含单链核苷酸区，其末端各自连接两个不同的双链寡核苷酸区。优选地，至少一个所述寡核苷酸区包含呈现特征性荧光的多个荧光团和任选的猝灭剂。荧光团在寡核苷酸区上排列，使得它们显现的荧光基本上小于当相同数量的荧光团结合在相应数量的单个核苷酸时的荧光。优选地，处于其未使用状态的探针完全不显现或基本上不显现荧光。这些探针这样起作用：通过使用聚合酶和任选地连接酶捕获其相应的单个核苷酸以产生使用过的探针，随后该使用过的探针容易被外切核酸酶降解，导致产生多个携带荧光团的单个核苷酸，所述荧光团随后能够完全发荧光。在另一优选的亚类中，这些探针由两种组分组成；互补的i-和j-型寡核苷酸，其中之一或二者可以被标记，其可以在它们的靶标单个核苷酸的存在下一起杂交成基本上双链的寡核苷酸，所述基本上双链的寡核苷酸也可以由外切核酸酶消化，如上文解释的。
在另一优选的亚类(在我们的待审申请PCT/GB2015/052119中公开并且通过参考结合于本文)中，探针包含：(a)第一单链寡核苷酸，将其用处于不可检测状态的特征性荧光团标记，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与第一寡核苷酸上的互补区杂交。在该特别亚类的情况下，可以将使用的探针用具有双链核酸外切降解活性的酶消化，得到处于可检测状态的可检测元件和单链的第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸至少部分与第一寡核苷酸序列互补。结果，可以引起第四寡核苷酸与另一标记的第一寡核苷酸反应，再次产生基本上双链的寡核苷酸产物，其对应于使用的探针。通过循环重复该步骤和外切核酸酶降解步骤，可以引起能够发荧光的自由荧光团的数量级联并显著增加。该类型中最优选的项包括其中第二和第三寡核苷酸包含共有第四寡核苷酸的单个寡核苷酸区的那些探针，其在捕获其互补靶标单个核苷酸后，产生抗外切核酸酶降解的单链闭环寡核苷酸，并且其可以用作模板用于一系列第一寡核苷酸的杂交和随后的外切核酸酶降解。
从以上显而易见的是，在一个实施方案中，优选设计本发明的装置从而以用于在包含单个核苷酸的小滴中产生荧光的特定方法使用。因此，根据本发明的第二方面，进一步提供对多核苷酸分析物进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将与颗粒连接的分析物分子逐步焦磷酸解产生单个核苷酸三磷酸流，所述颗粒暴露于流动的水性介质；
(b)从所述水性介质和所述单个核苷酸流产生小滴流，其中至少一些小滴含有单个核苷酸；和
(c)储存和/或询问每个小滴并且检测所述小滴中可能含有的单个核苷酸特有的性质；
其特征在于步骤(a)还包括将所述颗粒固定在微流体通道中紧密匹配的中空的基座中的亚步骤，能够向所述中空的基座中施加抽吸。
在该方法的一个实施方案中，水性介质在给定点还包含对捕获构成分析物的核苷酸类型中的一种有选择性的至少一个单个-核苷酸探针，并且所述探针能够仅在它们已经捕获了单个核苷酸并且经历随后的外切核酸酶降解后实质上发荧光。优选这些探针是上述类型的成员。在另一实施方案中，探针包含在最初流动的水性介质内或在每个小滴产生后随后直接引入每个小滴中。另外，方法还包括步骤(d)，其包括检测由每个小滴发出的荧光射线并由其组装序列数据。
在另一实施方案中，方法包括下述在前步骤：将分析物分子连接于多个颗粒的表面；选择使用的颗粒和通过抽吸的方式将选择的颗粒连接到其位置。这里的颗粒适当地包括具有反应性表面的珠子。
现在通过下图1和2说明本发明所述的装置，图1和2示例性说明本发明所述的测序装置，其中产生并询问包含单个核苷酸和检测核苷酸的寡核苷酸探针系统的水滴。
向直径为十微米的微流体管1提供侧通道2，可以向所述侧通道2施加真空抽吸。2与1在接合点相交，所述接合点包含具有两微米内径的环状横截面的锥台孔口3。之前将直径为四微米的球形玻璃珠4引入1并且就位在3中，使得当使水性介质5的流从3上游的引入点流过1时，其外表面的大部分突出进入水性介质5的流中。通过链霉亲和素缀合连接于4的是包含1000个核碱基的DNA双链片段的分析物。5包含在37℃缓冲的(pH 7.5)反应介质，包含Bst大片段DNA聚合酶和2毫摩尔/升浓度的焦磷酸钠和氯化镁中的每一种。将珠子的温度维持在37℃，并且在这些条件下，聚合酶逐步在3’到5’方向上消化分析物，由此释放单个核苷酸(脱氧核糖核苷酸三磷酸)流，其随后通过介质的流动被携带到4的下游。5的下游部分中的单个核苷酸的顺序因此对应于其在分析物中的最初序列。5的下游部分从小滴头6出现，进入第一室7中，在那里其与一个或多个轻硅油8流接触。选择这些流在接触点的速度以避免湍流混合，并且产生基本上水性的球状小滴9，其悬浮在油中，各自具有约八微米的直径。然后9的流以1000小滴/秒的速度沿相同直径的第二微流体管向前进入第二室10，同时使用第二小滴头12将五微米水性球状小滴11的第二流进料至所述第二室10中。小滴11包含检测核苷酸的寡核苷酸探针系统，如下文概述的那种，并且使其以顺序的方式与9合并，形成直径约为九微米的放大的水性小滴13。随后将这样产生的小滴13的流递送到打印机组件14(提供有小滴打印机头14a)，在这里每个小滴依次被打印到载玻片15上，所述载玻片15可沿平面的限定了其面的两个轴移动，并且用对于含有单个小滴的孔16的二维阵列形成样式。
然后将小滴在载玻片上温育，之后用包含一个或多个激光器17和检测器18(调节到适当波长用于激发和检测来自用于探针系统的荧光染料的荧光)的检测系统询问。然后在高于确定的阈值的给定波长的荧光检测表明在小滴内存在给定类型的单个核苷酸碱基。因此，随着依次询问小滴，可以有效读出最初多核苷酸分析物中的核苷酸碱基的序列。
现在详细描述可以用于上述系统的寡核苷酸探针系统的实例。
制备单链第一寡核苷酸1，其具有以下核苷酸序列：
5′TCGTGCCTCATCGAACATGACGAGGXXQXXGGTTTGTGGT3′
其中A，C，G，和T表示携带DNA的相关特征性核苷酸碱基的核苷酸；X表示使用常规胺连接化学用Atto 655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)，并且Q表示用BHQ-2猝灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸。其进一步包含对捕获脱氧胸苷三磷酸核苷酸(dTTPs)具有选择性的捕获区(A核苷酸)。
还制备另一单链寡核苷酸2，其包含：(1)第二寡核苷酸区，其具有以单个碱基错配与第一寡核苷酸的3’末端互补的序列；(2)第三寡核苷酸区，其具有与第一寡核苷酸的5’末端互补的序列，和(3)76个碱基对的单链接头区。其具有以下核苷酸序列：
5′PCATGTTCGATGAGGCACGATAGATGTACGCTTTGACATACGCTTTGACAATACTTGAGCAGTCGGCAGATATAGGATGTTGCAAGCTCCGTGAGTCCCACAAACCAAAAACCTCG3′
其中另外的P表示5’磷酸基团。
然后制备包含探针系统的反应混合物，其具有与源自以下配方相对应的组成：
56uL 5x缓冲液pH 7.5
28uL寡核苷酸1，100nM
28uL寡核苷酸2，10nM
2.8uL dNTPs(包括dTTP)的混合物，10nM
0.4U Phusion II热启动聚合酶(外切核酸酶)
1.6U Bst大片段聚合酶
20U大肠杆菌(E.coli)连接酶
4U热稳定性无机焦磷酸酶
加水到280uL
其中5x缓冲液包含以下混合物：
200uL Trizma盐酸盐，1M，pH 7.5
13.75uL水性MgCl2，1M
2.5uL二硫苏糖醇，1M
50uL Triton X-100表面活性剂(10％)
20uL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，100uM
166.67uL KCl
加水至1mL
在存在单个dTTP核苷酸的情况下，将所述核苷酸结合在寡核苷酸2中的一个的3’末端并且发生寡核苷酸2的连接，形成闭环的使用的探针。通过在37℃温育50分钟进行该过程。然后将反应介质在70℃另外温育50分钟，激活Phusion II聚合酶。寡核苷酸1中的一个在此温度可以与成环的寡核苷酸2退火，并且该双链形式由聚合酶消化，释放其荧光团成为可检测状态。然后另一寡核苷酸1能够与成环的探针退火，使得该过程以连续的循环重复，并且导致荧光强度随时间增长。
还制备其他组的类似寡核苷酸探针，它们具有不同的捕获位点、序列和荧光团，它们与第一探针组组合，从而实现四种核苷酸碱基的捕获、检测和区分。
序列表
<110> 贝斯4创新有限公司
<120> 具有珠定位器的小滴测序仪
<130> P62385WO
<150> GB1501012.7
<151> 2015-01-21
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸1
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> 用Atto 655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> 用Atto 655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 用BHQ-2猝灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 用Atto 655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> 用Atto 655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)
<400> 1
tcgtgcctca tcgaacatga cgaggttttt ggtttgtggt 40
<210> 2
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 连接于胞嘧啶的5'磷酸基团
<400> 2
catgttcgat gaggcacgat agatgtacgc tttgacatac gctttgacaa tacttgagca 60
gtcggcagat ataggatgtt gcaagctccg tgagtcccac aaaccaaaaa cctcg 115

Claims (15)

1.用于对多核苷酸分析物进行测序的装置，所述装置包括；
·第一区域，在其中通过逐步消化与颗粒连接的分析物的分子产生单个核苷酸流，所述颗粒位于所述第一区域中并且暴露于流动的水性介质；
·第二区域，在其中从所述水性介质和所述核苷酸流产生相应水性小滴流，并且其中所述至少一些小滴含有单个核苷酸，和
·第三区域，在其中储存和/或询问每个小滴以揭示所述小滴中可能含有的单个核苷酸特有的性质；
其特征在于，所述第一区域包括微流体通道，所述水性介质通过所述微流体通道流动，并且位置在其壁中包括中空的基座，能够向所述基座中施加抽吸，并且所述颗粒能够紧密匹配在所述基座中。
2.权利要求1所述的装置，其特征在于所述中空的基座紧接地位于所述第二区域的上游。
3.权利要求1或权利要求2所述的装置，其特征在于所述颗粒包含珠子，所述珠子具有所述分析物分子能够物理或化学与其结合的表面。
4.任一前述权利要求所述的装置，其特征在于所述消化方法选自外切核酸酶降解、磷酸解或焦磷酸解。
5.任一前述权利要求所述的装置，其特征在于所述第三区域包括激光器和光检测器以检测拉曼散射光。
6.任一前述权利要求所述的装置，其特征是能够处理水性介质，所述水性介质在第二或第三区域中的至少一个中含有对构成所述分析物的核碱基类型中的一种有选择性的至少一种单个-核苷酸探针；所述一种或多种探针能够仅在其已经捕获单个核苷酸并且随后经历外切核酸酶降解后才实质上发荧光。
7.权利要求6所述的装置，其特征是还包括在产生每个小滴之前、之时或之后将所述一种或多种探针引入所述水性介质的工具。
8.任一前述权利要求所述的装置，其特征在于所述第三区域包括打印机喷嘴，所述打印机喷嘴适于将每个小滴打印在包含小滴接收位置的阵列的表面。
9.任一前述权利要求所述的装置，其特征在于所述第三区域包括询问工具，所述询问工具用于检测由每个小滴发出的荧光射线。
10.对多核苷酸分析物进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将与颗粒连接的分析物分子逐步焦磷酸解产生单个核苷酸三磷酸流，所述颗粒暴露于流动的水性介质；
(b)从所述水性介质和所述单个核苷酸流产生小滴流，其中至少一些小滴含有单个核苷酸；
(c)储存和/或询问每个小滴并且检测所述小滴中可能含有的单个核苷酸特有的性质；
其特征在于步骤(a)还包括将所述颗粒固定在微流体通道中紧密匹配的中空的基座中的亚步骤，能够向所述中空的基座中施加抽吸。
11.权利要求10所述的方法，其特征在于所述水性介质在给定点含有对捕获构成所述分析物的核苷酸三磷酸类型中的一种有选择性的至少一种单个-核苷酸探针；所述一种或多种探针能够仅在它们已经捕获单个核苷酸并且经历随后的外切核酸酶降解后实质上发荧光。
12.权利要求11所述的方法，其特征在于所述一种或多种探针包含：(a)第一单链寡核苷酸，将其用处于不可检测状态的特征性荧光团标记，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与所述第一寡核苷酸上的互补区域杂交。
13.权利要求12所述的方法，其特征在于所述第二和第三寡核苷酸是单个寡核苷酸的寡核苷酸区域，使得添加靶标单个核苷酸产生对外切核酸酶降解有抗性的单链封闭环。
14.权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于所述一种或多种探针包含在最初的流动的水性介质内或在每个小滴产生后随后直接引入每个小滴中。
15.权利要求10至14中任一项所述的方法，其特征在于所述颗粒包含珠子，所述珠子具有在其上连接所述分析物分子的反应性表面。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110769936A (zh) * 2017-06-21 2020-02-07 贝斯4创新公司 微流体分析设备

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3115109A1 (en) * 2015-07-06 2017-01-11 Base4 Innovation Limited Droplet sequencing device
EP3507381B1 (en) * 2016-09-02 2020-10-21 Base4 Innovation Limited Single nucleotide detection method and associated probes
IL271537B2 (en) 2017-06-21 2024-11-01 Base4 Innovation Ltd Microdroplet manipulation device
EP4450646A3 (en) * 2017-06-21 2025-01-08 Lightcast Discovery Ltd Method for investigating molecules such as nucleic acids

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1136330A (zh) * 1993-09-27 1996-11-20 阿奇发展公司 有效进行核酸测序的方法和组合物
CN1556861A (zh) * 2001-09-24 2004-12-22 ض� 通过分子解构的拉曼监测实施的核酸测序
CN1702177A (zh) * 2004-05-04 2005-11-30 埃佩多夫阵列技术股份有限公司 用于高灵敏度地检测多种多核苷酸序列的微阵列支持物的制备方法和用途
CN101128601A (zh) * 2003-01-29 2008-02-20 454公司 核酸扩增和测序的方法
CN101434988A (zh) * 2007-11-16 2009-05-20 深圳华因康基因科技有限公司 一种高通量寡核苷酸测序方法
EP2175014A1 (en) * 2007-08-01 2010-04-14 National University Corporation Tokyo University of Agriculture and Technology Microfluidicdevice for trapping single cell
CN101918590A (zh) * 2007-12-10 2010-12-15 高晓莲 核酸测序
WO2014167324A1 (en) * 2013-04-09 2014-10-16 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
WO2014199113A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 Base4 Innovation Ltd Droplet storage method

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE346287T1 (de) * 1999-07-16 2006-12-15 Univ Texas Verfahren und vorrichtung zur zuführung von proben zu einer chemischen sensormatrix
US9354156B2 (en) * 2007-02-08 2016-05-31 Emd Millipore Corporation Microfluidic particle analysis method, device and system
GB201217772D0 (en) * 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
GB201217770D0 (en) * 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Biological probes and the use thereof
GB201300957D0 (en) * 2013-01-18 2013-03-06 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
GB201306444D0 (en) * 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1136330A (zh) * 1993-09-27 1996-11-20 阿奇发展公司 有效进行核酸测序的方法和组合物
CN1556861A (zh) * 2001-09-24 2004-12-22 ض� 通过分子解构的拉曼监测实施的核酸测序
CN101128601A (zh) * 2003-01-29 2008-02-20 454公司 核酸扩增和测序的方法
CN1702177A (zh) * 2004-05-04 2005-11-30 埃佩多夫阵列技术股份有限公司 用于高灵敏度地检测多种多核苷酸序列的微阵列支持物的制备方法和用途
EP2175014A1 (en) * 2007-08-01 2010-04-14 National University Corporation Tokyo University of Agriculture and Technology Microfluidicdevice for trapping single cell
CN101434988A (zh) * 2007-11-16 2009-05-20 深圳华因康基因科技有限公司 一种高通量寡核苷酸测序方法
CN101918590A (zh) * 2007-12-10 2010-12-15 高晓莲 核酸测序
WO2014167324A1 (en) * 2013-04-09 2014-10-16 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
WO2014199113A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 Base4 Innovation Ltd Droplet storage method

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110769936A (zh) * 2017-06-21 2020-02-07 贝斯4创新公司 微流体分析设备
CN110769936B (zh) * 2017-06-21 2022-07-08 光投发现有限公司 微流体分析设备

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Publication number Publication date
GB201501012D0 (en) 2015-03-04
WO2016116757A1 (en) 2016-07-28
EP3247498A1 (en) 2017-11-29
JP2018505670A (ja) 2018-03-01
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