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CN107206334B - 用于产生液滴的设备和方法 - Google Patents

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CN107206334B CN201580075107.5A CN201580075107A CN107206334B CN 107206334 B CN107206334 B CN 107206334B CN 201580075107 A CN201580075107 A CN 201580075107A CN 107206334 B CN107206334 B CN 107206334B
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Abstract

本发明涉及一种用于在第二流体中生产一个或多个第一流体的液滴的装置，其中第二流体与第一流体不混溶。所述装置包括旋转元件和驱动装置。旋转元件具有流体腔室、流体通道和过渡区域。过渡区域具有第一变宽区域和第二变宽区域。驱动装置被设计为旋转旋转元件，使得将第一流体离心供应至流体腔室，并且由于第二变宽区域，产生离心‑流体动力引导的压力和提升力，使液滴在第一流体中分离，从而产生嵌入第二流体中的第一流体的液滴。

Description

用于产生液滴的设备和方法
本发明涉及用于在第二流体中产生第一流体的液滴的设备和方法，具体地，涉及用于在离心微流体中产生液滴的设备和方法。
在旋转系统中，离心微流体处理的流体在毫微微升(femtoliter)至毫升的范围内。这种系统主要为用于或代替离心转子的聚合物一次性使用盒(cartridge)，用于实现实验室流程的自动化。标准实验室流程，如在微流体盒中的移液、离心、混合或等分操作，可以在这里实施。为此，盒包含用于引导流体的通道和用于收集流体的腔室。盒经受的旋转频率的预定序列，即所谓的频率协议，使得盒中的流体可以通过离心力流动。
离心微流体主要应用于实验室分析和移动诊断。这样的盒可被实施为离心微流盘，其为在特殊处理装置中使用的“磁盘实验室(Lab-on-a-disk)”和“实验室磁盘(LabDisk)”和“CD实验室(Lab-on-CD)”等已知的术语。不同的格式，如微流体离心管，例如，已知的术语“实验室管(LabTube)”，可用于现有标准实验室装置的转子。
在离心微流盒中进行的基本操作为将流体体积等分成不同的子体积，即所谓的等分试样。处理该流程的鲁棒性(robustness)和易用性，对于在可能的产物中使用这种基本操作至关重要。此外，所述基本操作是单片实现的，使得无需额外部件或材料而造成因材料成本或额外的安装连接技术(组装)显著增加盒的成本。
不同的应用，如数字PCR(聚合酶链式反应)、单细胞方法、通过荧光噬菌体计数细菌和在微米范围内制造颗粒，需要产生大量的等分试样。需要产生数百达至超过百万等分量的数量。
对许多应用来说，产生小尺寸(几微升至皮升或者毫微微升)的等分试样是重要的。当为了进行理想的实验而产生一定量的等分试样时，这是特别重要的，但受限于初始体积，例如，在数字PCR中。通常，试剂的成本高，样品材料的纯化昂贵或少量的探针材料成为了这种应用的限制。
因此，需要一种用于离心微流体系统的基本操作，其特别可以等分体积以形成许多(数百达至百万)小体积(几微升至毫微微升)的等分试样。在压力驱动的微流体和离心微流体平台上产生液滴的多种技术是已知的。
众所周知，在油中产生水溶液的液滴的压力驱动方法利用微通道系统以使油中的水溶液乳化。因此，水相流过通道进入灌装有油的腔室。它取代了油，并逐步流到高地(plateau)。这个高地被多个壁划分成通道。水相通过这些通道流入高地后面。从那里，该相流至下游腔室，并通过在至腔室的边缘处液滴分离而产生乳化液。例如，在[6]、[9]至[20]和[22]中描述了这种方法。
[8]描述了一种通过变化的腔室高度在流体中的气泡的压力驱动产生和输送的方法。这种方法允许使用微通道系统在液相中产生气相的气泡。这里的气相通过通道进入灌装有水相的腔室。腔室具有斜面，使得其平坦端位于通道的口部并且具有与通道相同的高度。通过压力驱动，气相流至通道的口部，其中气泡被推入第二相。由膨胀(expanding)腔室产生的，由膨胀腔室高度和毛细力驱动的，具有限定尺寸的气泡从流体舌部分离并且沿流动方向移动至腔室中。
[1]和[2]描述了一种用于在流体中通过变化的腔室高度压力驱动产生和输送流体液滴的方法。该方法允许使用微通道系统在第二液相中产生第一液相的液滴。因此，第一相流过通道进入灌装有第二相的腔室。腔室具有斜面，使得其平坦端位于通道的口部并且具有与通道相同的高度。通过泵浦驱动，第一相流至通道的口部，其中流体舌部被推入第二相。由膨胀腔室产生的，由膨胀腔室高度和毛细力驱动的，具有限定尺寸的液滴从流体舌部分离并且沿流动方向移动至腔室中。
[23]描述了一种类似的方法。描述了一种压力操作系统，即非离心系统，其包括用于产生液滴的装置。核心部件为产生液滴的膨胀部。在首次灌装油之后，例如，第二相，如水，通过毛细力在膨胀部被乳化。液滴的大小主要由膨胀部的几何形状来决定。此外，描述了通过圆形布置实现并行化操作。
[3]和[7]公开了一种在空气中离心产生液滴的方法。该方法允许使用微通道系统在空气中产生液滴，然后在水溶液中收集液滴。因此，由离心力驱动的第一液相流过通道进入毛细管，该毛细管末端有一自由悬浮在空气中的微型喷嘴。在毛细管的末端，从一定的频率开始，液滴分离，其在短距离内飞过环境空气，然后撞击收集器中流体的表面。在那里，液滴通过生化反应被(部分)硬化并被收集。因此，收集器被实施为使得，在静止状态下，其相对于地面垂直，并且当施加离心力时仅被带动至水平位置。
[5]描述了一种在旋转盘上离心产生成品流体体积的方法。该方法允许使用微通道和微孔系统产生成品流体体积。将第一流体引入至旋转盘上的微流体系统的入口腔室。由于离心力作用，该流体移动至具有大量填充有第一流体的小孔的腔室。第二不混溶流体用于置换孔壁中的第一流体的上清液。这中断了孔中的第一流体的流体体积彼此之间的直接接触。
[4]和[21]描述了用于产生两种互不溶相的混合物的设备和方法。提供了一种用于产生液滴的离心微流体盘，其中液滴产生基于涂层流动原理。水相的液滴通过从相邻通道的油流窜动(pinging off)而从第一通道分离。在相邻通道通向第一通道之后，第一通道膨胀并且产生的液滴到达第一通道的膨胀部分。
本发明的目的在于提供一种替代设备和替代方法，其允许离心产生嵌入在不同流体中的流体的一个或数个液滴。
该目的通过根据权利要求1的设备和根据权利要求13的方法来实现。
实施例提供了一种用于在与第一流体不混溶的第二流体中产生一个或数个第一流体的液滴的设备，包括：
旋转体，该旋转体包括流体结构，该流体结构包括：流体腔室，该流体腔室配置为包括第二流体，流体通道，该流体通道通向流体腔室并配置为使第一流体沿流动方向流动至流体腔室，以及流体通道通向流体腔室的过渡区域，其中该过渡区域包括第一膨胀或拓宽区域，其中用于第一流体流动的流动横截面在垂直于流动方向的至少第一方向上膨胀，以及第二膨胀区域，其中用于第一流体流动的流动横截面在垂直于流动方向和第一方向的第二方向上膨胀，其中第二膨胀区域被布置在第一膨胀区域的下游；以及
驱动设备，该驱动设备配置为向旋转体提供旋转，将第一流体离心供应至流体腔室，并且由于第二膨胀区域引起离心流体动力引导的压力、提升力和毛细力，使液滴在第一流体中分离，从而产生嵌入第二流体中的第一流体的液滴。
实施例提供了一种用于通过使用相应的设备在与第一流体不混溶的第二流体中产生一个或数个第一流体的液滴的方法，包括：
将第二流体注入流体腔室中；
旋转旋转体以通过流体通道将第一流体离心供应至流体腔室，并且在第二膨胀区域中控制作用在第一流体上的离心产生的压力、提升力和毛细力，使得引起第一流体的液滴分离，从而产生嵌入第二流体中的第一流体的液滴。
本发明的实施例是基于以下认识：通过使用对应的过渡区域，可以以最小的处理复杂性和减小的空间需求在离心系统中产生液滴，因为实际上产生液滴仅需要一个通过过渡区域通向流体腔室的流体通道。因此，能够以巧妙的方式利用离心式微流体系统的优点，以便以最小的处理复杂度在第二流体中快速产生第一流体的液滴。本发明人已经认识到，这可以在离心系统中通过在流动方向上使用包括两个对应的前后相接的膨胀区域的过渡区域来实现。因此，可以产生具有非常小的死体积和具有非常高体积分数的整体体积的液滴。
以下将参照附图详细说明本发明的实施例，其中：
图1示意性示出了流体结构，其中流体通道通向流体腔室于径向外部部分；
图2示意性示出了流体结构，其中流体通道通向流体腔室于径向内部部分；
图3a至3c示出了用于论述过渡区域的示意图；
图4示出了在过渡区域的液滴产生的示意图；
图5a至5c示出了不同的液滴尺寸与流体通道和过渡区域的不同参数的关系图；
图6为用于产生液滴的设备的示意图；
图7为产生的乳化液的示意图；
图8为结合不同操作的用于产生液滴的流体结构的示意图；
图9a和9b为用于并行产生数个液滴的流体结构的示意图；
图10a和10b为用于并行产生具有不同特征的数个液滴的流体结构的示意图；
图11为流体结构的替代实施例的示意图；以及
图12和13为用于论述用于产生一个或数个液滴的设备的实施例的示意性侧视图。
在对本发明实施例进行更详细的论述之前，应当指出的是，本发明的实施例可以特别用于离心微流体领域，其中处理的流体在毫微微升至毫升的范围内。相应地，流体结构可以包括针对处理相应流体体积的在微米范围内的适当尺寸。具体地，本发明的实施例可以应用于离心微流体系统，例如为人熟知的术语“磁盘实验室(Lab-on-a-Disk)”。
当使用术语“径向”时，这里所指的是相对于旋转中心的径向，旋转体可围绕该旋转中心旋转。在离心场中，远离旋转中心的径向方向径向减小，朝向旋转中心的径向方向径向上升。流体通道的起点比其端部更靠近旋转中心，因而为径向减小，而流体通道的起点比其端部更远离旋转中心，为径向上升。包括径向上升部分的通道因而包括径向上升或径向向内指向的方向分量。显然，这样的通道无需沿径向线精确通过，而是可以与径向线成一定角度或弯曲。
当谈及流体通道时，意味着一种结构，其流体入口至流体出口的长度尺寸大于限定流动截面的尺寸，例如，大于限定流动截面的尺寸5倍或10倍。因此，流体通道可以包括从流体入口至流体出口经过流体通道的流动阻力。相反，这里所说的流体腔室为可以具有如此尺寸设计的腔室：即在其内部没有相关流动阻力。
本文所用术语“流体”或“液相”，还包括含有固体组分的流体，如悬浮液或生物样品，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
首先，参照图12和13，描述了可以采用本发明的离心微流体系统的实例。
图12示出了具有旋转体形式的流体模块10的设备，其包括基底12和顶盖14。在顶视图中，基底12和顶盖14可以为圆形，且具有中心开口，旋转体10可以通过该中心开口利用常规固定机构16施加到驱动设备20的旋转件18。旋转件18被支撑为能够在驱动设备20的静止件22上旋转。驱动设备20，例如，可以为包括可调节转速的常规离心机，或者也可以为CD或DVD驱动器。可以设置有控制机构24，并将其配置为控制驱动设备20，以使旋转体10以不同旋转频率进行一次旋转或多次旋转。对于本领域技术人员显而易见的是，控制机构24可以示例性地由相应的编程计算装置或专用集成电路来实现。此外，控制机构24可以配置为响应于用户的手动输入来控制驱动设备20，以引起旋转体所需的旋转。在任何情况下，控制机构24可以配置为控制驱动设备20，以使旋转体旋转，从而实现本发明的实施例，这将在本文中描述。仅具有单一旋转方向的常规离心机可以被用作驱动设备20。
旋转体10包括所需的流体结构。所需的流体结构可以由在顶盖14、基底12中的腔体和通道或基底12和顶盖14形成。在实施例中，例如，流体结构可以形成在基底12中，其中注入开口和排出开口形成在顶盖14中。在实施例中，结构化基底(包括注入开口和排出开口)被布置在顶部且在顶盖的底部。
在图13所示的替代实施例中，流体模块32被插入到转子30中，并与转子30一起形成旋转体10。流体模块32可以分别包括基底和顶盖，其中可以依次形成相应的流体结构。由转子30和流体模块32依次形成的旋转体10可以通过由控制机构24控制的驱动设备20转动。
在图12和图13中，流体模块或旋转体可围绕旋转的旋转中心标记为R。
在本发明的实施例中，包括流体结构的流体模块或旋转体可由任何合适的材料形成，例如塑料，如PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PC(聚碳酸酯)、PVC(聚氯乙烯)或PDMS(聚二甲基硅氧烷)、玻璃等。旋转体10可以被认为是离心微流体平台。在优选实施例中，流体模块或旋转体可以由热塑性塑料形成，例如PP(聚丙烯)、PC、COP(环烯烃聚合物)、COC(环烯烃共聚物)或PS(聚苯乙烯)等。
下面将参照附图，对可形成在相应的流体模块32或相应的旋转体10中的流体结构的实施例进行描述。
如图1和图2所示，流体结构包括流体腔室50、流体通道52和过渡区域54。旋转体以及其流体结构可围绕旋转中心R旋转。流体腔室50配置为接收流体，在此所述流体也被称为第二流体。例如，第二流体可以为油。流体通道52配置为通过由旋转体旋转引起的静水离心压力将流体供应到过渡区域54，从而将流体供应到流体腔室50，在此所述流体也被称为第一流体。例如，第一流体可以为水溶液。但是，本发明不限于这种流体，也可以使用其它流体来实施，只要第一流体和第二流体是不混溶的，优选为具有不同密度的第一流体和第二流体。
流体通道52和流体腔室50之间的过渡区域54被成形为使得，由基体旋转引起和静水离心压力产生的，通过流体通道朝向流体腔室方向的不混溶于第二流体中的第一流体的流动，以形成嵌入第二流体中的第一流体的液滴。这里，仅第一流体显著流动。图1和图2所示的本发明的实施例不包含另外的通道，其中流体腔室50和流体通道52可通风。
在图1所示的实施例中，流体通道52于径向外部区域通向流体腔室50a。该实施例配置为第一流体的密度小于第二流体的密度的情况，这意味着乳化相(emulsified phase)比其周围的相更轻。由于旋转引起的离心场，在本实施例中，流体腔室50中产生的第一流体的较轻液滴径向向内上升，从而离开过渡区域。因此，可以利用离心场的浮力来使较轻的液滴从产生该液滴的位置移出并将第二流体保持在该位置。
离心产生液滴的一个特别的优点是，在连续介质(即第二流体，如油)比第一流体(如水)密度更大的实施例中，连续介质通过离心力保持膨胀。当试图产生在尽可能少的连续相中包含尽可能多的液滴的乳化液时，这是特别有利的。这里现有技术提供的比例为96％的液滴体积和4％的连续相体积。利用本发明的实施例，可以显著地提高该比例，即例如97.2％的液滴体积和2.8％的连续相体积。这对应节省30％的连续相，并允许原位产生凝胶乳化液。
在图2所示的实施例中，流体通道52于径向内部区域通向流体腔室。该实施例配置为第一流体的密度大于第二流体的密度的情况，即乳化相(emulsified phase)比其周围的相更重。由于旋转引起的离心场，在本实施例中，流体腔室50中产生的第一流体的较重液滴被径向向外驱动，并离开过渡区域。
与图1和图2所示的其中旋转中心高于流体结构的实施例相反，旋转中心也可被布置在流体结构的下方，这将形成通向流体腔室的径向外端的直通道，以及通向流体腔室的径向内端的角通道。
因此，第一流体可以通过旋转体旋转以可控的方式乳化形成第二流体。这意味着第一流体的一液滴可以嵌入第二流体中，或者第一流体的多个液滴可以嵌入第二流体中，其中液滴的数量可以由旋转的持续时间决定。在本发明的实施例中，通过流体通道供应的第一流体的总体积可以被分为大量的嵌入第二流体中的液滴。
下面将参照图3a至3c对过渡区域的实施例进行更详细的论述。因此，图3a和图3为各种过渡区域54的示意性顶视图，图3c示出了各种过渡区域54的示意性纵向剖面图(其中所述纵向剖面可应用于图3a和3b所示的两种结构)。在图3a至3c中流动方向示出为从左到右并由箭头55表示。
过渡区域54包括第一膨胀区域54a，其中用于第一流体的流动的流动横截面在垂直于流动方向55的第一方向上膨胀。例如，第一方向可以对应于流体通道的宽度方向。换句话说，第一膨胀区域54a中的流体通道在第一维度上膨胀。这种膨胀可以是突变的，即阶梯式的，参见图3a，或可以是至少部分连续的，参见图3b中的膨胀部58。从图3a和3b中可以看出，优选地，流动横截面在彼此相对的第一方向上膨胀，即相对于流体通道52(纵向)的虚构中心线56向左和向右膨胀。相互相对的第一方向的膨胀可以是对称的。
过渡区域54还包括第二膨胀区域54b，第二膨胀区域54b布置在第一膨胀区域54a的下游，并且其中第一流体流动的流动横截面在垂直于第一方向和流动方向的第二方向上膨胀。例如，第二方向可以为流体通道52的高度方向。换句话说，在第二膨胀区域中，通道在第二维度上膨胀。在第二膨胀区域中的膨胀部限定边缘61(参见图3c)，其优选通过在第一膨胀区域中的膨胀部获得的结构的整体宽度上延伸。
如图3a和3b所示的距离A，过渡区域可以包括恒定横截面的一部分，其中第一流体的流动经过在第一膨胀区域54a和第二膨胀区域54b之间恒定的流动横截面。该区域可以被称为梯台(terrace)，因为在该区域中，与第二膨胀区域后的腔室底板相比，腔室底板增加。
图3c中的示意性纵向剖面图I、II和III示出了第二膨胀区域54b中的膨胀部的实施例。图I示出为阶梯式膨胀部60，图II示出为连续膨胀部52，图III示出为阶梯式膨胀部60。此外，在图III所示的实施例中，在第二方向上第一膨胀区域54a中设置有膨胀部64。
通常，在第一膨胀区域54a中，流动横截面沿第一方向(或第一相反方向)膨胀，其中同时可以在不同方向上进行膨胀，例如在第二方向，其中在另一方向上的膨胀通常小于在第一方向上的膨胀。通常，在第二膨胀区域54b中，流动横截面在第二方向上膨胀，其中同时也可以在不同的方向上进行膨胀。这意味着这包括流体通道以不同于垂直角度的角度通向流体腔室的情况。
换言之，流体通道52于位置X处通向流体腔室50，即在表示为梯台的流体腔室的区域50a中。在口部区域，通道在第一维度上突变膨胀，如图3a，或连续膨胀，如图3b。如图3c所示，流体腔室的区域50a包括恒定的高度。因此，区域50a为第一流体的流动提供了恒定的流动横截面。从流动方向上的位置Y开始，流体腔室50的高度在边缘61处增加，从而在第二方向上进行膨胀，由此形成腔室的第二区域50b。如图3c所示，这种增加可以是突变的或连续的。第二膨胀区域54b由此实现。显然，图3a至3c仅示出了流体通道和流体腔室50中与过渡区域相关的部分。
换句话说，流体通道52与流体腔室50相接。流体通道52至少在一维度上突变或连续地膨胀。流体通道52可以在第二维度上同时突变或连续地膨胀。优选地，流体通道52在第二维度上不会同时膨胀。当流体通道同时在第二维度上膨胀时，优选地，与同时在第一维度上的膨胀相比，其膨胀程度较小。流体腔室50从供给流体通道52的端部朝向另一侧膨胀。这种膨胀可以是突变的或连续的。膨胀开始于从流体通道52至流体腔室50的过渡部距离A之后。优选地，膨胀在垂直于流体通道在至流体腔室的口部处的先前膨胀的方向上进行。优选地，这里意味着其它方向也是可能的。
发明人认识到，与[6]、[9]至[20]和[22]中的基于压力的系统所描述的结构相当的流体结构可以有利地用于离心系统或离心平台。
为了产生液滴，流体腔室50和流体通道52灌装有第二液相，即第二流体。这可以例如是由围绕旋转中心R旋转的流体结构引起的离心力的影响所引起的。随后，通过流体通道52注入与第一相不混溶的第一(大部分)液相。
第一液相朝向流体腔室50的流动是由于基底(即旋转体)的旋转引起的，例如由于静水离心压力。旋转可以以恒定的转速进行。通过上述相的第二不混溶物质中的第一液相的流动导致液滴在第二维度的膨胀部(即第二膨胀区域54b的膨胀部)中分离。因此，所产生的液滴的体积基本上取决于膨胀部的几何形状和表面张力，以及与其连接的毛细力。液滴尺寸在很大程度上与第一相的流速无关。因此，基本上只有第一液相是流动的，而第二液相基本上是静止的。流体腔室50和所有其它结构，例如流体通道50，均可以具有压力补偿。
因此产生的液滴的直径大于过渡部的最小通道尺寸。在实施例中，作用在过渡部的流体上的由旋转体旋转产生的旋转场，可以相当于地球的重力加速度的至少两倍。
图4示出了使用如图3b和图3c中的I所示的流体结构在第二次膨胀部产生液滴的五个阶段。对应的流体结构如图4右侧所示。所示的参数A对应为梯台长度(即等横截面区域的长度)，参数B对应为流体通道宽度，参数C对应为流体通道深度。此外，图4中示出沿通道(沿线q1)和垂直于通道(沿线q2)的相应横截面。
在该过程开始时，流体结构灌装有第二流体67，例如油。在阶段1中，第一流体66通过流体通道52离心供给。在阶段2中，第一流体66到达第一膨胀部58并沿宽度方向扩展。在阶段3中，第一流体66到达第二膨胀部50并且还在高度方向上膨胀。该扩展在阶段4中继续，直到在阶段5中，液滴70在离心场中分离。
图5a至5c示出了不同参数对液滴尺寸的影响，其中水相作为第一流体，油作为第二流体。图5a示出了流体通道深度C的变化对液滴尺寸的影响。图5b示出了梯台长度A的变化对液滴尺寸的影响。图5c示出了旋转频率的变化对液滴尺寸的影响。
发明人发现，用于产生中等尺寸液滴的良好方法如下：A＝75μm-125μm，特别为100μm；B＝70μm-110μm，特别为90μm；C＝45μm-75μm，特别为60μm。第一膨胀部的角度为45°，但可以变化。第二膨胀部的角度为90°，但可以减小。流体腔室(即液滴收集腔室)的深度为200μm。
发明人发现，第一膨胀区域的膨胀部至少为相当于通道宽度的1.1倍。本发明人还发现，在第二膨胀区域中，膨胀部也至少为1.1倍。
如图5a所示，液滴尺寸随通道深度C而线性增加。图5a所示获得的液滴尺寸，其梯台长度A为100μm，通道宽度B为90μm。
如图5b所示，随梯台长度A的变化，曲线的三个子区域将被区分开。如果梯台比通道宽度短得多，则梯台长度与液滴直径无关。随梯台长度的增加，液滴直径随梯台长度A的增加而增加(根据理论的2/3次幂)。当梯台相对于通道深度C变得很长时，液滴在梯台上已经分离，液滴直径保持大致相同。在一定程度上，卫星液滴形成为具有直径约150μm的液滴，梯台长度为500μm。得到的结果如图5b所示，其恒定通道宽度B为90μm，恒定通道深度C为60μm。
图5c示出了通道宽度B为90μm，通道深度C为60μm，梯台长度A为100μm的恒定结构的压力变化时的液滴尺寸。相对于在流体通道口部处进入流体腔室的油相的水相过压已经改变，这种变化是通过改变旋转频率来实现的。如图5c所示，测量区域中的液滴尺寸不依赖于旋转频率，从而不依赖于压力。
图6示意性地示出了用于执行相应方法的设备的实施例，其中所述设备被示出为处于以下状态：通过流体通道52供应的第一流体72的多个液滴70在设置于流体腔室50中的第二流体74中产生。流体通道52的入口区域可以流体连接至入口腔室100。图6还示出了过渡区域54的放大顶视图102和放大纵向剖面图104。可以将包括相应流体结构的流体模块插入到转子中，例如，如图6中示意性所示的盒106。
本发明的流体结构的实施例允许液滴的离心微流体产生而无需手动操作。在图7的图A至图F中，示出了产生不同尺寸的液滴的流体腔室的显微图像(顶视图)。这些液滴是用不同尺寸的流体结构产生的。更准确地说，液滴是用具有不同横截面的流体通道产生的，其中横截面(尺寸)大小如下：A<B<C<D<E<F。所有的液滴都可以在不到一分钟的时间内仅通过两个移液步骤产生，而不受旋转频率的限制，这对于当前使用的基于注射泵的系统来说是一个显著的优点。
本发明的实施例还基于以下知识：离心微流体平台上的液滴产生可以容易地与在相同的离心微流体平台上的其它操作相结合。例如，可以通过使用本文所述的液滴生成技术以最小的处理工作和低污染风险来实现DNA提取，以及后续的DNA纯化，以及后续的用于DNA扩增的组分混合，以及后续的等分成许多小液滴，以及后续的对等分试样进行数字DNA扩增。
因此，本发明的实施例特别适用于在生物化学验证反应的环境中通过在N个分区中分离分析物的方法。在这样的方法中，将分析物稀释至至少一个分区和最多N-1个分区不包括任何分析物的程度。通过计数灌装有分析物的分区，可以基于其泊松分布计算分析物的浓度。这里，分离分析物(第一流体)可以根据本文所述的液滴产生技术来执行。
例如，本发明人首次通过利用本文所述的液滴产生方法成功地执行数字液滴RPA(RPA＝重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification))。这里，商购的RPA混合物已加入稀释的商购DNA靶分子，并在油中分离成许多不同的液滴(反应体积)。与图7所示的液滴一样，这是用两个移液步骤进行的，并且不受旋转频率的限制。商业试剂的成分没有变化。随后，将微流体结构中的液滴置于恒温，以便进行酶反应(RPA)。读取荧光强度也通过商购的荧光扫描仪在微流体结构中进行。
在另一实施例中，流体结构可以集成在大致与其中一个显微镜载玻片(大约25×75平方毫米)尺寸匹配的流体模块中。通过将流体模块插入离心机(例如，台式离心机)中，可以在其滑动尺寸的范围内产生液滴。
在另一实施例中，流体结构可以集成在微量滴定板上的流体模块中，例如，96孔板。通过将流体模块插入离心机中，可以在板的各个孔中产生液滴。在另一实施例中，流体模块的流体结构集成在用于微量滴定板的插入物上。通过将流体模块插入离心机中，在板的各个孔中产生液滴。产生液滴之后，可以将插入物再次从微量滴定板移除，并且液滴可用于后续的应用，例如，PCR。
因此，在实施例中，液滴可以包括适合于检测DNA的生化反应混合物，例如PCR混合物或不同的等温扩增混合物，例如RPA(重组酶聚合酶扩增)，RCA(滚动扩增)，LAMP(环介导等温扩增)或用于非等温DNA检测的不同混合物。此外，一些液滴可以包括待验证的DNA分子。形成有流体结构的完整流体模块可以具有标准化的尺寸。产生液滴之后，可以将整个流体模块置于不同的温度，例如，用常规装置，即所谓的载玻片循环仪(slide cyclers)，以便进行DNA验证反应(例如PCR、RPA、RCA、LAMP)。这种验证反应可以被验证，例如，通过荧光染料，其可以通过光学系统在反应后或反应过程中被读取。由于标准化的尺寸，这可以被执行，例如，在一个所谓的载玻片扫描仪(slide scanners)。为此，系统的一部分可以以透明的方式设计。此外，在整个过程中，可以选择控制流体模块的温度，例如，以防止酶在低温下过早活化。这里，等温扩增方法是指在恒温下进行的扩增方法。
实施例提供了一种设备，其中液滴产生结构在离心微流体平台上与离心微流体结构连接，离心微流体结构允许在生化反应混合物加入DNA之前进行DNA提取和/或纯化，其允许基于DNA的验证，例如，PCR或其它，例如，等温或非等温扩增方法。例如，可以使用数字PCR或数字PPR。相应流体结构的实例如图8所示。入口130通过离心微流体平台上的通道130连接至用于DNA提取和/或纯化134的结构134。在上游或下游，系统可以通过通道136连接至用于自动化操作步骤的其它结构138(例如，预扩增或双液滴生成，例如，插入式预扩增)。这些结构138或用于DNA提取和/或纯化的结构134通过流体通道52连接至用于液滴产生的过渡部55和流体腔室50。通过这种方式，液滴产生可以通过通道以及入口连接至其它流体操作，其允许例如自动DNA提取、DNA纯化、DNA预扩增以及后续的数字PCR(和数字等温验证方法)。
在替代实施例中，代替DNA，可以验证和检测其它核酸，例如，RNA(核糖核酸)。
参照图9和10，在下文中，将论述通过并联连接几个产生结构来增加液滴产生速率的实施例，使得可以同时产生几个液滴。
图9a示出了流体结构，其中多个流体通道152中的每一个通过相应的过渡区域154通向流体腔室154。流体通道152通过分配器结构160流体连接至公共供应通道162。代替一个供应通道，可以设置多个供应通道，其中流体通道的第一子集可以通过第一分配器通道连接至第一供应通道，并且流体通道的第二子集可以通过第二分配器通道连接至第二供应通道。流体通道通向流体腔室于其径向内部部分，使得流体结构适于具有比第二流体较大的密度的第一流体。过渡区域154具有相同的结构，使得可以并行产生相同尺寸的液滴。
图9b示出了相似的流体结构，然而，其中流体通道通向流体腔室于其径向外部部分，使得流体结构适于具有比第二流体较低的密度的第一流体。
通过这种方式，实施例提供围绕旋转中心R可旋转的流体模块，其中供应通道162耦合至分配器通道160，数个流体通道152从该分配器通道160分支，其通过数个过渡部154通向流体腔室150。流体腔室150和流体通道152之间的过渡部154再次被设计为使得由流体模块的旋转和由此产生的静水压力引起的与第二流体不混溶的第一流体在流体腔室的方向上通过通道的流动产生嵌入于第二流体的第一流体的液滴。这里，仅第一相以显著的方式流动。
图10a和10b示出了类似于图9a和9b的流体结构。然而，在图10a和10b中，过渡部的尺寸不同，使得产生不同尺寸的液滴。这在图10a和10b中示出，过渡部以不同阴影表示，其中仅仅示例性地，对两个过渡部用附图标记154a和154j标示。因此，在另一实施例中，可以并行生产不同尺寸的液滴。因此，本发明的实施例提供了一种围绕旋转中心R旋转的流体模块，其中供应通道162耦合至分配器通道160，数个流体通道152从该分配器通道160分支。流体通道152通过具有不同尺寸的数个结构相似的过渡部154a、154j通向流体腔室150。流体腔室和流体通道之间的过渡部154a、154j被设计为使得由流体模块的旋转和由此产生的静水压力引起的与第二流体不混溶的第一流体在流体腔室的方向上通过通道的流动产生嵌入于第二流体的不同尺寸的第一流体的液滴。这里，仅第一相以显著的方式流动。通过这种方式，可以产生具有不同大小但限定尺寸的液滴，例如，在具有旋转频率的盒中。
通常，在用于产生液滴的本发明的实施例中，仅需要一个流体通道，其通过过渡区域通向流体腔室。在另一实施例中，一个或数个通道可以在过渡部前或在过渡部中合并流体。这允许在产生液滴之前立即混合化学物质。另外，这允许特定的各向异性液滴的产生，例如，产生Janus颗粒等。图11示出了在液滴产生之前用于合并至少两个通道的合适的流体结构。在左边的流体结构中，两个通道52和52a通向公共过渡部54，该公共过渡部54产生运动至腔室50的液滴。与通道52和52a合并的一个或数个其它的通道示出如虚线表示的可选通道52b。在右边的流体结构中，另一通道52c通向产生液滴的过渡部54前的主通道52。一个或数个其它的通道52d、52e还可以如虚线所示通向主通道52。这里，通向通道52c、52d、52e可以在相同位置和/或不同位置通向主通道52。
在另一实施例中，可以产生嵌入第二相的第一相的液滴，并在其内部包括与第一相不混溶的第三相。例如，它们可以为悬浮液的液滴，例如，细胞或玻璃粉(beads)。此外，例如，它们可以为乳化液的液滴。至少一个相可以在稍后的步骤中(部分地)被固化。除此之外，这还允许产生Janus颗粒，例如，用于医疗产品的封装。
在另一实施例中，可以产生其中包括细菌的液滴。可以通过验证反应(例如，荧光噬菌体)验证这些细菌，并且可以通过合适的检测方法(例如，荧光测量)检测这些细菌。这允许对活细菌进行绝对定量，例如，用于诊断败血症。
在另一实施例中，液滴可以包括用于进行免疫验证反应(免疫测定)的组分，以便可以验证抗原或抗体。如果液滴的数量适于使得全部或者没有液滴不包括相应的抗原或抗体，则可以进行抗原或抗体的数字验证(例如，数字ELISA(酶联免疫吸附测定))，对抗原或抗体进行绝对定量。
发明人发现，如上所述的用于液滴产生的已知系统具有许多缺点。
例如，用于产生液滴的等分压力驱动微流体系统需要一建立合适压力的外部系统。这将导致许多缺点。压力驱动微流体系统的运行所必需的产生压力的装置是没有标准装置的，因此每个应用都需要昂贵的专用系统。根据配置，这些系统的操作是复杂的，例如，必须确保用于产生液滴的系统和盒之间的密封连接。这个问题的技术解决方案是可行的，但增加了专业化程度和成本。用于建立压力的系统中的压力变化只能以高成本来最小化，并且在系统运行期间造成困难。压力驱动系统中等分的基本操作只能与其它基本操作相结合，费用高昂。一种可行的单片系统自动化，例如，DNA提取，DNA纯化和数字PCR，只能以压力驱动的方式实现，难度很大，操作起来非常复杂，这使得标准情况下的应用变得非常困难。总而言之，压力驱动系统是昂贵的，由于脉动而受到压力变化的影响，其特征在于复杂的集成。
用于等分的常规离心微流体系统也具有许多缺点。产生的液滴通过环境空气飞进收集容器，受到许多缺点的限制。该系统只能有限程度地应用于其它流体，因为液滴的(部分)固化对于系统的运行是必需的。在与环境空气接触过程中不能排除环境和/或液滴的污染。这些系统中等分的基本操作只能与其它基本操作相结合，费用高昂。一种可行的单片系统自动化，例如，DNA提取，DNA纯化和数字PCR，难以实现，操作起来非常复杂，这使得标准情况下的应用变得非常困难。此外，使用这种方法，很难产生特别小的液滴。
在用于等分的基于微孔的微流体系统中，在孔中产生等分试样受旋转盘的限制，具有多个缺点。在下游进行必要的等分处理是非常困难的，例如，用于产生医疗产品的Janus颗粒。孔的空间要求相对较高，因为它们不能三维布置，并且孔之间的刚性壁具有比紧密堆积的液滴之间的距离更大的特定宽度。
发明人进一步发现，在[4]和[21]描述的方法中，液滴分离的基本物理原理在很大程度上取决于油和待乳化相的流速。由于流速不能在流程开始和结束时精确控制，因此在流程开始和结束时会导致不均匀的液滴。由于进一步产生液滴需要油相的连续流动，所以需要大量的油来产生乳化液。此外，与本发明的实施例仅需要一个通道相比，这种传统系统需要至少三个通道来产生液滴，这导致盘上的空间要求增加。此外，这种方法要适应其它液滴体积需要涉及对结构的完全重新设计。在本文所述的系统中，基本上仅需适应调整单个通道的直径。
本发明的方法可以大部分地或完全地消除现有技术的上述缺点。
根据本发明，离心产生的驱动力可用于液滴分离。两种不混溶流体之间的密度差可用于产生乳化液。此外，本发明方法的优点在于，产生液滴的离心场可以同时用于将产生的液滴从产生位置移出，并将周围的相保持在液滴产生的位置。例如，可以通过离心产生的提升力将液滴从流体通道的孔口驱动至流体腔室中。可以使用人造的提升力将流体通道的孔口处的第二流体保持在流体腔室中，从而可以实现乳化液中的高水/油比。实施例仅需要一个通道通向腔室以产生相应的液滴。
此外，与当前最广为使用的产生液滴的方法相反，本发明无需外部压力源，降低了误差可能性和成本。与现有技术相反，本发明可以使用标准实验室装置(例如，台式离心机)进行操作。此外，可以容易地开发和构建用于特定应用领域的相应装置。通过本发明的方法，与现有技术相比，可以显著简化流程，例如，仅需要标准实验室装置中一个移液步骤和的一个操作。可以降低污染风险。实施例可以包括仅一个至多个移液步骤。通过使用本发明的方法，后续的等分操作可以容易地实现自动化。与现有技术相比，本发明方法简化了等分操作和其它处理步骤的结合，例如，DNA提取和纯化。此外，与现有技术相比，可以减少使用周围相的量。与现有技术相比，本发明的方法能够分别等分和乳化完整的样品体积而无任何死体积。此外，还允许对等分样品体积进行扩展下游操作。此外，所产生的液滴可以通过快速离心再次分离，并且结合到总体积中。这对于某些应用是必要的，例如，测序或预扩增，并且在压力驱动系统中实施非常复杂，例如，添加化学品。
本发明方法使用几乎无源的系统，其唯一的自由度(旋转频率)可用于控制更多的上游流程。与压力驱动系统相比，本发明不存在启动问题，即可以从开始到结束产生均匀的液滴。此外，本发明方法允许通过频率协议简单地调节流量。
本发明的实施例允许从两个液相离心产生嵌入式流体(liquid-in-liquid)液滴，其中基本上仅一个相流动。实施例仅需要一个通向流体腔室的流体通道，用于产生每个液滴，其中可以提供数个通道以并行产生数个液滴。实施例允许对旋转体上的靶分子进行数字验证(例如，DNA扩增)。实施例提供了一种基底，其包括连接至流体通道的腔室，其中从流体通道至腔室的过渡部配置为使得在将第二液相(例如，油)灌装腔室之后，由于基体的旋转(由于静水离心压力)而引起的与第一液相不能混合的第二液相(例如，水)的流动，产生液滴(其中在液滴产生过程中基本上仅两相中的一相流动)。产生的液滴的直径可以大于过渡部的最小通道尺寸。
因此，本发明的实施例提供了用于在离心操作的微流体盒内产生液滴的微流体结构。在相应的液滴产生过程中，基本上仅待分离的流体流动。液滴分离和液滴体积主要由毛细力、提升力、表面张力和过渡区域的几何形状(喷嘴几何形状)决定。所产生液滴的体积几乎与流速和压力无关。
尽管本文中某些方面描述了设备以及设备功能的内容，但是显然，这些方面还提供了相应方法的描述。同样地，显然，在描述方法内容的某些方面也涉及相应设计的设备的描述，以便提供与该方法对应的功能。
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[22]US 6 387 301 B1
[23]US 2013/0078164 A1

Claims (14)

1.一种用于离心微流体领域中在与第一流体不混溶的第二流体中产生一个或数个第一流体的液滴的设备，包括：
旋转体(10)，所述旋转体(10)包括流体结构，所述流体结构包括：
流体腔室(50、150)，所述流体腔室(50、150)配置为包括第二流体；
流体通道(52、152)，所述流体通道(52、152)通向所述流体腔室(50、150)并配置为使第一流体沿流动方向流动至所述流体腔室(50、150)；以及
所述流体通道(52、152)通向所述流体腔室(50、150)的过渡区域(54、154、154a、154j)，其中所述过渡区域(54、154、154a、154j)包括第一膨胀区域(54a)，其中用于第一流体流动的流动横截面在垂直于流动方向的至少第一方向上膨胀；以及第二膨胀区域(54b)，其中用于第一流体流动的流动横截面在垂直于所述流动方向和所述第一方向的第二方向上膨胀，其中所述第二膨胀区域(54b)被布置在所述第一膨胀区域(54a)的下游；以及
驱动设备(22)，所述驱动设备配置为向所述旋转体(10)提供旋转，将所述第一流体离心供应至所述流体腔室(50、150)，并且由于所述第二膨胀区域(54g)引起离心流体动力引导的压力、提升力和毛细力，使液滴在所述第一流体中分离，从而产生嵌入所述第二流体中的所述第一流体的液滴；
所述设备配置用于在具有第二密度的第二流体中产生具有第一密度的第一流体的液滴，其中a)所述第一密度大于所述第二密度，并且所述流体通道(52、152)于径向内部区域通向所述流体腔室(50、150)，或者b)所述第二密度大于所述第一密度，其中所述流体通道(52、152)于径向外部区域通向所述流体腔室(50、150)。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，在所述第一膨胀区域(54a)中，所述流动横截面在两个相对的第一方向上膨胀。
3.根据权利要求1所述的设备，其中，在所述第二膨胀区域(54a)中，所述流动横截面在第二方向上进一步膨胀。
4.根据权利要求1所述的设备，其中，在所述第一膨胀区域(54a)和所述第二膨胀区域(54b)之间布置有用于所述第一流体流动的恒流横截面。
5.根据权利要求1所述的设备，其中，所述流体结构包括一个或数个另外的流体通道(52a-52e)，所述另外的流体通道(52a-52e)通向所述流体通道(52)于所述过渡区域(54)的上游或于所述过渡区域(54)。
6.根据权利要求1所述的设备，其中，所述流体结构包括多个流体通道(152)，每个流体通道在相应的过渡区域(154、154a、154j)中通向所述流体腔室(50、150)，使得通过所述旋转体的旋转，能够在所述第二流体中并行产生数个液滴。
7.根据权利要求6所述的设备，其中，所述流体结构包括分配器结构(160)，所述分配器结构(160)将所述多个流体通道(152)流体连接至一个供应通道(162)或数个供应通道。
8.根据权利要求6所述的设备，其中，所述多个流体通道(152)的过渡区域(154a、154j)至少部分被设计为不相同，以在所述第二流体中产生不同尺寸的液滴。
9.根据权利要求1所述的设备，其中，所述流体结构还包括处理结构(134、138)，所述处理结构(134、138)允许在所述第一流体通过所述流体通道(52)供应至所述流体腔室(50)之前对所述第一流体中的样品进行处理。
10.根据权利要求9所述的设备，其中所述处理结构(134、138)包括用于分析物浓缩和/或纯化的结构和/或用于生物样品预扩增的结构。
11.一种用于离心微流体领域中在与第一流体不混溶的第二流体中产生一个或数个第一流体的液滴的方法，该方法采用一种用于在与第一流体不混溶的第二流体中产生一个或数个第一流体的液滴的设备，所述设备包括：
旋转体(10)，所述旋转体(10)包括流体结构，所述流体结构包括：
流体腔室(50、150)，所述流体腔室(50、150)配置为包括第二流体：
流体通道(52、152)，所述流体通道(52、152)通向流体腔室(50、150)并配置为使第一流体沿流动方向流动至流体腔室(50、150)；以及
所述流体通道(52、152)通向所述流体腔室(50、150)的过渡区域(54、154、154a、154j)，其中所述过渡区域(54、154、154a、154j)包括第一膨胀区域(54a)，其中用于第一流体流动的流动横截面在垂直于流动方向的至少第一方向上膨胀；以及第二膨胀区域(54b)，其中用于第一流体流动的流动横截面在垂直于所述流动方向和所述第一方向的第二方向上膨胀，其中所述第二膨胀区域(54b)被布置在所述第一膨胀区域(54a)的下游；以及
驱动设备(22)，所述驱动设备配置为向所述旋转体(10)提供旋转，将所述第一流体离心供应至所述流体腔室(50、150)，并且由于所述第二膨胀区域(54g)引起离心流体动力引导的压力、提升力和毛细力，使液滴在所述第一流体中分离，从而产生嵌入所述第二流体中的所述第一流体的液滴；
所述方法包括：
将所述第二流体注入所述流体腔室(50、150)中；
旋转所述旋转体(10)以通过所述流体通道(52、152)将所述第一流体离心供应至所述流体腔室(50、150)，并且在所述第二膨胀区域中控制作用在所述第一流体上的离心产生的压力、提升力和毛细力，使得引起所述第一流体的液滴分离，从而产生嵌入所述第二流体中的所述第一流体的液滴；
其中，在产生液滴之后，由于所述第一流体和所述第二流体的密度不同，液滴通过旋转而移出所述过渡区域(54、154、154a、154j)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，使用于径向外部区域通向所述流体腔室(50、150)的流体通道(52、152)，并且其中使用具有比所述第一流体密度更高的第二流体，并且其中通过作用在所述第二流体上的离心力将所述第二流体保持在所述过渡区域(54、154、154a、154j)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一流体包括适于检测DNA或RNA的生化反应混合物。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括进行生化反应混合物的DNA验证反应或RNA验证反应并读取反应结果。
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