CN107200760A

CN107200760A - 一种高纯度红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的制备方法

Info

Publication number: CN107200760A
Application number: CN201610223491.5A
Authority: CN
Inventors: 刘向前; 戴玲; 邹亲朋; 潘烨
Original assignee: Changsha Broad Ocean Bio Science and Technique Co Ltd
Current assignee: Changsha Broad Ocean Bio Science and Technique Co Ltd
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2017-09-26

Abstract

本发明涉及一种高纯度红镰霉素‑6‑O‑β‑龙胆二糖苷的制备方法，尤其是通过闪式提取从决明子中制备红镰霉素‑6‑O‑β‑龙胆二糖苷的工艺方法。所述制备方法以决明子为原料，包括提取、精制、干燥等步骤，其特征在于所述的制备方法包括以极性有机溶剂为溶媒、在10～60℃进行闪式提取，提取液经硅胶柱层析、反相色谱、冷冻干燥等工艺。相比已报道红镰霉素‑6‑O‑β‑龙胆二糖苷制备方法，本发明制备工艺不仅温度低，有效成分不易破坏，而且时间短，提取率高，产品纯度高，且可用于大规模工业化生产。

Description

一种高纯度红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的制备方法

技术领域

本发明涉及一种从决明子中制备获得纯度大于98％的红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的制备方法，尤其是通过闪式提取从决明子中制备红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的工艺方法。

背景技术

决明子(Semen Cassiae)是豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，为临床上常用中药，具有清肝明目、润肠通便的功效，常用于治疗目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结等。现代医学研究表明决明子还具有增强机体免疫力、抗衰老等多方面作用。决明子无论在药用、保健等方面都具有广泛的研究、利用和开发前景。

决明子主要含有蒽醌类和萘并吡喃酮类等化学成分，具有多种药理活性，如保肝、降糖、降脂、抗突变、抗雌激素样作用等.红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷为决明子中主要萘骈吡喃酮类成分，具有降血脂、保肝、抗突变、抗雌激素等作用，为决明子主要药效成分之一。

姜艳艳等在对决明子化学对照品红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的稳定性研究表明，红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷对照品在60℃以下，相对湿度90％，加热8h后仍有85.0％以上剩余，但是随着温度增高，湿度增大，红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷稳定性逐渐降低。表明其在较低温度环境及含水较少的溶液中，红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷稳定性较好，

红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的分离制备方法主要有：刘斌等(中国专利CN201110001317.3，2014年公开)采用20％～50％乙醇加热回流提取得决明子提取物浸膏，浸膏用甲醇回流提取得甲醇提取物；甲醇提取物采用硅胶干柱色谱法分离得到红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗品，粗品采用硅胶干柱色谱法、C₁₈反相色谱柱纯化得到红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷黄色粉末，其主要工艺步骤中用含水乙醇加热回流提取，需要较高温度且湿度较大，容易破坏红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的结构，且在制备过程中用的试剂量很大，不利于大规模推广应用。目前，温度低、时间短、工艺简便的制备方法用于大规模(克级以上)制备98％含量红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的工作尚未见报道。

发明内容

本发明以决明子为原料，包括原料粉碎、提取、分离、精制、干燥等步骤，其特征在于所述的制备方法包括以极性有机溶剂为溶媒、在10～60℃进行闪式提取，提取液经硅胶柱层析、反相色谱、冷冻干燥等工艺。本发明所述的红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷制备方法不仅温度低，有效成分不易破坏，而且时间短，提取率高，产品纯度高，且可用于大规模工业化生产。

本发明的目的是开发出一种工艺简单、提取率高且纯度在98％以上的红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：

1.一种高纯度红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的制备方法，尤其是通过闪式提取从决明子中制备红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的工艺方法。所述方法以决明子为原料，包括提取、精制、干燥等步骤，其特征在于所述的制备方法包括以下具体步骤：

(1)取决明子，加入按药材质量计5～20倍溶剂，闪式提取1～3次，过滤，合并提取液，回收溶剂，得决明子提取物。

(2)取步骤(1)所得决明子提取物，与硅胶以1∶1质量比拌样，洗脱剂氯仿-甲醇，干法上样，洗脱3～5倍柱体积后，挖出上样层，继续用甲醇洗脱硅胶柱，通过TLC追踪检测，直至无红链霉素-6-O-β-龙胆二糖苷。回收洗脱液，得到红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物。

(3)将步骤(2)红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物用体积浓度30％～80％甲醇水溶液溶解，配置成浓度为50～150mg/mL的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；采用柱长10～50cm、直径1～10cm的高效液相制备色谱柱进行分离，六通阀或泵进样，进样体积为1～50mL，以体积浓度为40％～70％的甲醇-水为洗脱体系，流速控制在10～400mL/min，在线紫外检测，收集含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的洗脱液，减压浓缩干燥得黄色粉末I；

(4)黄色粉末I以体积浓度为35％～60％甲醇水溶液的洗脱体系进行第二次高效液相制备，其他条件同步骤(3)，收集纯度大于98％的含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的馏分；将上述馏分直接干燥即可得到纯度大于98％的红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷对照品，其为黄色粉末。

步骤(1)所述的提取溶剂为甲醇，乙醇，甲醇水溶液或乙醇水溶液。

步骤(4)中所述的干燥方法为真空干燥、微波干燥或冷冻干燥中的一种或多种。

步骤(4)中所述的干燥方法优选冷冻干燥。

2.纯度检查

仪器：LC-10AT型高效液相色谱仪，SPD-10A型紫外可见检测器，CBM-10A型色谱工作站，色谱柱PromosilC₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-四氢呋喃-水(18∶3∶79)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测时间为25min。

3.结构鉴定

红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷为黄色粉末(甲醇)，分子式：C₂₇H₃₂O₁₅，分子量：596。

¹H-NMR(DMSO，400MHz)：δ7.20(1H，s，H-10)，6.94(1H，s，H-9)，6.80(1H，s，H-7)，6.20(1H，s，H-3)，5.13(1H，br，s，5-OH)，5.06(1H，d，J＝7.6Hz，H-1’)，4.19(1H，d，J＝7.6Hz，H-1”)，5.13～3.21(16H，m，糖基质子)，3.87(3H，s，8-OCH₃)，2.40(3H，s，2-CH₃)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，100MHz)∶δ183.7(C-4)，168.8(C-2)，161.9(C-5)，161.1(C-6)，157.6(C-8)，152.4(C-10a)，140.3(C-9a)，107.7(C-5a)，106.7(C-10)，103.6(C-7 or C-4a)，101.1(C-3 or C-1’)，100.7(C-1”)，99.7(C-9)，76.8(C-3’)，76.6(C-3”)，75.5(C-5’)，76.3(C-5”)，73.5(C-2’ or C-2”)，70.0(C-4’)，69.6(C-4”)，68.6(C-6’)，61.0(C-6”)，55.4(8-OCH₃），20.1(2-CH₃)。以上数据与KITANAKA S等的文献《tudies on the constituents of the seeds of Cassia obtusifolia L.The structureof two naphthopyrone glycosides》中数据一致。

以本发明从决明子中分离制备红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷化学对照品具有如下优点和进步：

(1)本发明用甲醇或乙醇为提取溶剂，以闪式提取方法提取，保证了低温低湿度的操作环境，使红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷保持稳定不被破坏，从而可以提高红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的提取率。

(2)本发明通过柱分离对目标对照品进行初步富集，以制备型高效液相为主要精制手段，使红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷得到高效分离的同时避免了大量使用有毒挥发性流动相及开口柱。

(3)本发明所用的高效液相制备方法为快速制备方法，单针分离时间在10～30分钟之间，非常适合大批量化学对照品的制备；同时加上制备溶剂的回收再利用，可实现批量制备的低成本。

(4)本发明采用紫外检测器在线检测，红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的分离情况可直接检测，直接选择性收集高纯度样品，从而实现纯度保证下的高回收率。

(5)本发明采用真空干燥、微波干燥或冷冻干燥，保证了红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的低温环境，大大提高了其提取率.

总之，本发明实现了温度低、时间短、工艺步骤简单、纯度高、提取率高，并且可大规模生产。

附图说明

图1为红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的HPLC分析图谱(278nm)

具体实施方式

现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

(1)取决明子500g，加入6L甲醇，闪式提取2次，过滤，合并提取液，回收甲醇，得决明子提取物85g。

(2)取85g决明子提取物，与硅胶以1∶1质量比拌样，洗脱剂氯仿-甲醇，干法上样，洗脱4倍柱体积后，挖出上样层，继续用甲醇洗脱硅胶柱，通过TLC追踪检测，直至无红链霉素龙胆二糖苷。回收洗脱液，得到红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物15g。

(3)将15g红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物用体积浓度39％甲醇水溶液溶解，配置成浓度为150mg/mL的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；采用柱长35cm、直径8cm的高效液相制备色谱柱进行分离，六通阀进样，进样体积为50mL，以体积浓度为40％的甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在155mL/min，在线紫外检测，收集含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的洗脱液，减压浓缩干燥得黄色粉末I3.6g。

(4)将3.6g黄色粉末I以体积浓度为42％甲醇水溶液的洗脱体系进行第二次高效液相制备，其他条件同步骤(3)，收集纯度大于98％的含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的馏分；将上述馏分冷冻干燥即可得到纯度大于98％的红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷对照品2.25g，得率为0.45％，其为黄色粉末。

实施例2

(1)取决明子100g，加入1000mL50％甲醇，闪式提取3次，过滤，合并提取液，回收甲醇，得决明子提取物16g。

(2)取16g决明子提取物，与硅胶以1∶1质量比拌样，洗脱剂氯仿-甲醇，干法上样，洗脱3倍柱体积后，挖出上样层，继续用甲醇洗脱硅胶柱，通过TLC追踪检测，直至无红链霉素龙胆二糖苷。低温减压回收洗脱液，得到红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物3.1g。

(3)将3.1g红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物用体积浓度35％甲醇水溶液溶解，配置成浓度为120mg/mL的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；采用柱长15cm、直径6cm的高效液相制备色谱柱进行分离，六通阀或泵进样，进样体积为12.5mL，以体积浓度为23％的甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在150mL/min，在线紫外检测，收集含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的洗脱液，减压浓缩干燥得黄色粉末I0.72g。

(4)黄色粉末I以体积浓度为35％～60％甲醇水溶液的洗脱体系进行第二次高效液相制备，其他条件同步骤(3)，收集纯度大于98％的含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的馏分；将上述馏分低温真空干燥即可得到纯度大于98％的红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷对照品0.405g，得率为0.405％，其为黄色粉末。

实施例3

(1)取决明子300g，加入4.5L乙醇，闪式提取3次，过滤，合并提取液，回收乙醇，得决明子提取物49g。

(2)取决明子提取物49g，与硅胶以1∶1质量比拌样，洗脱剂氯仿-甲醇，干法上样，洗脱4倍柱体积后，挖出上样层，继续用甲醇洗脱硅胶柱，通过TLC追踪检测，直至无红链霉素龙胆二糖苷。低温减压回收洗脱液，得到红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物9.2g。

(3)将9.2g红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷粗提物用体积浓度27％的甲醇水溶液溶解，配置成浓度为115mg/mL的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；采用柱长30cm、直径8cm的高效液相制备色谱柱进行分离，六通阀或泵进样，进样体积为40mL，以体积浓度为40％的甲醇-水为洗脱体系，流速控制在218mL/min，在线紫外检测，收集含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的洗脱液，减压浓缩干燥得黄色粉末I2.28g。

(4)将2.28g黄色粉末I以体积浓度为45％甲醇水溶液的洗脱体系进行第二次高效液相制备，其他条件同步骤(3)，收集纯度大于98％的含有红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷的馏分；将上述馏分冷冻干燥即可得到纯度大于98％的红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷对照品1.31g，得率为0.437％，其为黄色粉末。

以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例和实验例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

Claims

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的提取溶剂为甲醇，乙醇，甲醇水溶液或乙醇水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的干燥方法为真空干燥、微波干燥或冷冻干燥中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的干燥方法优选冷冻干燥。