CN107198685B - 一种治疗肾细胞癌的药物组合物及应用 - Google Patents
一种治疗肾细胞癌的药物组合物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种治疗肾细胞癌的药物组合物及应用。本发明首次公开了汉黄芩素与舒尼替尼共同作为药效成分的组合物在治疗肾细胞癌药物中的应用。实验结果证实，异常快速DNA复制以及细胞增殖是肿瘤的重要特征之一，抑制DNA复制可诱导肿瘤细胞凋亡。汉黄芩素与舒尼替尼组合物与上述两种药物单独使用相比，抑制肾细胞癌细胞DNA复制和增殖以及诱发细胞凋亡的活性更高，且二者具有相互促进增效的作用。同时研究发现，汉黄芩素与舒尼替尼组合物共同使用，能够有效克服肾细胞癌细胞对舒尼替尼的药物耐药性。汉黄芩素与舒尼替尼组合物在肾细胞癌治疗中的应用前景广泛，也为肾细胞癌的治疗提供了更多的药物选择。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗肾细胞癌的药物组合物及应用，属于药物开发技术领域。
背景技术
随着人们生活方式和生活环境的改变，癌症的发病率和死亡率均呈上升趋势，已成为继冠心病之后，人类致死率第二高的病症，也是世界性的热点健康问题。肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占所有恶性肿瘤的3％，且近年来其发病率呈上升趋势。据世界癌症中心资料显示，2015年美国预测新发的肾癌患者人数为61,560，肿瘤特异性死亡患者数目也高达14,080，位居死亡率前列。我国肾癌的患病人数也逐年增加，，肾癌新发和死亡病例分别为668000例和234000例，分别位居发病率和死亡率的第15位和17位，成为泌尿男生殖系第二位肿瘤。
肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)起源于肾实质肾小管上皮细胞，发病率高，大约90％的肾脏癌为RCC。RCC对于传统的放疗、化疗并不敏感。随着诊治水平的提高及临床药物的革新，尤其随着分子遗传学的发展，越来越多的分子信号通路被发现在RCC中行使着重要的功能。在此基础上，各国批准了越来越多的靶向药物如靶向抑制多酪氨酸激酶的抑制剂药物如舒尼替尼等用于治疗晚期转移性RCC。肾癌的诊治近年来取得了一定疗效与这些分子靶向治疗药物的使用密不可分。因为患者通过免疫治疗获益极其有限，因此对于RCC尤其是中晚期转移性RCC，靶向药物治疗已成为各大指南推荐的治疗策略，也成为晚期肾癌的一线治疗手段。然而，由于肿瘤是一种高度异质性疾病，随着分子靶向药物的应用，靶向药物的耐药性问题逐渐暴露出来，如接受舒尼替尼治疗的患者尽管在初期疗效显著，但大多在5～10个月内产生耐药，很少有患者完全缓解，这严重影响了RCC治疗的疗效，增加了临床上治疗肾细胞癌的难度。此外，靶向药物也存在一定副作用以及价格昂贵等不足，这些都成为靶向治疗的瓶颈。所以增加靶向药物敏感性，降低使用剂量，克服耐药性，开发新疗法成为肾癌治疗的重点研究方向。
中药在恶性肿瘤的治疗中表现出一定效果，并且毒副作用较小。从有效抗肿瘤传统中药中分离得到活性天然化合物具有多靶点的整体调节特点，使其具有潜在改善或逆转耐药优势，也是抗肿瘤新药研发的重要手段之一。唇形科(Labiatase)植物黄芩是我国一味常用中药。汉黄芩素是黄芩及同属相应植物根中提取的黄酮类化合物，是黄芩药物有效成分之一。研究已表明汉黄芩素具有抗炎、抗氧化，抗病毒等多方面的生物活性。
此外，汉黄芩素在胃癌中可以通过增加细胞内活性氧的含量，诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤周围新生血管生成以及逆转化疗药物的耐药等多种方式发挥抗肿瘤的功能。尽管如此，有关汉黄芩素在制备治疗肾细胞癌药物中的应用以及分子机制方面，尤其是汉黄芩素在增加肾细胞癌靶向药物敏感性，逆转肾细胞癌靶向药物耐药中的作用等问题，尚无研究。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种治疗肾细胞癌的药物组合物及应用。
本发明的技术方案如下：
舒尼替尼和汉黄芩素组合物在制备治疗肾细胞癌药物中的应用。
一种治疗肾细胞癌的药物组合物，包括：舒尼替尼和汉黄芩素。
汉黄芩素与舒尼替尼药物组合可有效抑制肾细胞癌细胞增殖，诱导DNA复制障碍，诱导肾细胞癌细胞凋亡。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼与汉黄芩素的摩尔比为1∶(1～10)。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:(1～8)。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:(4～8)。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼和汉黄芩素的质量占所述药物组合物的1～99.5％。
上述药物组合物，还包括药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的某些实施方式，所述药物组合物中，汉舒尼替尼与黄芩素的摩尔比为1:1～10，例如1:1～9、1:1～8、1:1～7、1:1～6、1:1～5、1:1～4、1:1～3、1:1～2、1:2～10、1:2～9、1:2～8、1:2～7、1:2～6、1:2～5、1:2～4、1:2～3、1:3～10、1:3～9、1:3～8、1:3～7、1:3～6、1:3～5、1:3～4、1∶4～10、1:4～9、1:4～8、1:4～7、1:4～6、1:4～5、1:5～10、1∶5～9、1∶5～8、1∶5～7、1:5～6、1:6～10、1:6～9、1:6～8、1:6～7、1:7～10、1:7～9、1:7～8、1:8～10、1∶8～9、和1:9～10；优选1:6～10，更优选1:8～10。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药盒，所述药盒包含所述汉黄芩素和舒尼替尼。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼与汉黄芩素的摩尔比为1:(1～10)。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:(1～8)。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:(4～8)。
根据本发明优选的，所述舒尼替尼和汉黄芩素的质量占所述药物组合物的1～99.5％。
根据本发明的某些实施方式，所述的舒尼替尼和汉黄芩素的质量占所述药物组合物或药盒质量的1～99.5％，例如1～99％、1～90％、1～80％、1～70％、1～60％、1～50％、1～40％、1～30％、1～20％、1～10％、10～99.5％、10～99％、10～90％、10～80％、10～70％、10～60％、10～50％、10～40％、10～30％、10～20％、20～99.5％、20～99％、20～90％、20～80％、20～70％、20～60％、20～50％、20～40％、20～30％、30～99.5％、30～99％、30～90％、30～80％、30～70％、30～60％、30～50％、30～40％、40～99.5％、40～99％、40～90％、40～80％、40～70％、40～60％、40～50％、50～99.5％、50～99％、50～90％、50～80％、50～70％、50～60％、60～99.5％、60～99％、60～90％、60～80％、60～70％、70～99.5％、70～99％、70～90％、70～80％、80～99.5％、80～99％、80～90％、90～99.5％、或90～99％。
根据本申请的某些实施方式，所述的舒尼替尼和汉黄芩素的质量占所述药物组合物或药盒质量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％。
除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。
汉黄芩素(wogonin)，又名5,7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮。常温下为黄色针状结晶物，不溶于水，易溶于有机溶剂，例如乙醇、丙酮等。汉黄芩素是从黄芩的根中提取的黄酮类化合物，具有抗炎、降血脂、抗血栓形成等作用。
肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，包括肾细胞癌、肾母细胞瘤及肾盂癌等。
肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，又称为肾腺癌，是肾癌最常见的病理类型，约占肾癌的80％～85％。RCC是起源于肾实质肾小管上皮细胞的恶性肿瘤。RCC对于传统的放疗、化疗并不敏感。
靶向药物舒尼替尼治疗肾细胞癌可显著提高患者无进展生存期和总生存期，是晚期肾细胞癌的标准一线用药。但临床应用中发现该药物具有较高的不良反应发生率，甚至部分患者因毒性不可耐受而影响疗效或停药。此外该药物使用5～10个月后患者易出现耐药性，严重影响治疗效果。
中药治疗肿瘤具有改善病情、延长缓解期、副作用小，远期疗效好且费用低廉等特点，彰显出了独特的优势。
肾细胞癌研究中，经常使用人肾细胞癌细胞株786-O和OS-RC-2细胞来分析基因或药物对肾细胞癌细胞肿瘤特性的影响。
术语“赋形剂”表示指的是通常用于制备颗粒和/或固体口服剂型/和或液体注射剂型制剂的制药技术的不具有任何药理学作用的可药用成分。赋形剂可以起到载体、稀释剂、或溶解改性剂、吸收促进剂、稳定剂或制备的助剂以及其它的作用。在制备药物组合物中有用的赋形剂通常是安全、无毒并且是医学使用以及药物使用中可接受的。在本说明书中使用的"赋形剂"或"药学上可接受的赋形剂"包括一种和多种这样的赋形剂。
药物组合物和药盒
术语“药物组合物”表示含有治疗有效量的一种或多种所述化合物及其药学上可接受的互变异构体、溶剂合物、水合物或盐，与其他药学上可接受的载体的混合物。将所述化合物制备成药物组合物的目的是为了更方便地向对象给药。
本申请中术语“药盒”或“试剂盒”可互换使用。本申请公开了包含治疗有效量的所述治疗剂或药物组合物的药盒。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含一种或多种其他的治疗剂。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含使用说明书。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含用于相应给药方式的装置，例如但不限于针头。
术语“耐药性”是指生物或细胞(在本文中具体涉及肿瘤细胞和肿瘤患者)对于药物作用的耐受性。例如，在肿瘤细胞对药物产生耐药性后，药物的治疗作用就明显下降，需加大剂量才能保证药效不减。
本发明中汉黄芩素可将其制备成药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、口服剂、冲剂、注射剂、脂质体、靶向给药注射剂丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂等。所述药物组合物可制成干粉形式，并且在给药前与无菌水或缓冲液混合以制成溶液形式。所述缓冲液的pH通常为3～11，优选5～9，更优选7～8。
术语“给药”、“给予”或“施予”是指将一定剂量的化合物或药物组合物通过合适的给药方式给予对象。
所述“给药方式”包括但不限于口服给药、静脉内给药、呼吸道内给药、舌下给药、局部给药、肌肉内给药、眼内给药、透皮吸收、胃肠外给药、腹膜内给药、阴道给药、颊部给药、经直肠给药等本领域已知的任何给药方式。本领域技术人员应该了解对象的给药方式取决于多个因素，所述因素包括疾病的位置、对象的年龄、疾病的严重程度、以及药物组合物的成分等。
在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。
除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。
有益效果
本发明首次公开了汉黄芩素与舒尼替尼共同作为药效成分的组合物在治疗肾细胞癌药物中的应用。实验结果证实，异常快速DNA复制以及细胞增殖是肿瘤的重要特征之一，抑制DNA复制可诱导肿瘤细胞凋亡。汉黄芩素与舒尼替尼组合物与上述两种药物单独使用相比，抑制肾细胞癌细胞DNA复制和增殖以及诱发细胞凋亡的活性更高，且二者具有相互促进增效的作用。同时研究发现，汉黄芩素与舒尼替尼组合物共同使用，能够有效克服肾细胞癌细胞对舒尼替尼的药物耐药性。汉黄芩素与舒尼替尼组合物在肾细胞癌治疗中的应用前景广泛，也为肾细胞癌的治疗提供了更多的药物选择。
附图说明
图1、MTT实验的汉黄芩素与舒尼替尼组合物对肾细胞癌的生长抑制活性的柱状图；
图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验设定5个重复孔，使用T检验；*表示p≦0.05；**表示p≦0.01；
图2、Tunel实验的汉黄芩素与舒尼替尼组合物诱导肾细胞癌细胞凋亡活性的柱状图；
图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验设定5个随机视野，每个视野细胞总数不少于200个，使用T检验；*表示相比空白对照组，p≦0.05；**表示相比空白对照组，p≦0.01；
图3、EdU实验的汉黄芩素与舒尼替尼组合物抑制肾细胞癌细胞DNA复制效率的柱状图；
图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验设定5个随机视野，每个视野细胞总数不少于200个，使用T检验；*表示相比空白对照组，p≦0.05；**表示相比空白对照组，p≦0.01；
图4、MTT实验的汉黄芩素与舒尼替尼组合物可有效抑制舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞的增殖的柱状图；
图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验设定5个重复孔，使用T检验；*表示相比空白对照组，p≦0.05；**表示相比空白对照组，p≦0.01；
图5、Tunel实验的汉黄芩素与舒尼替尼组合物可显著诱导舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞凋亡的柱状图；
图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验设定5个随机视野，每个视野细胞总数不少于200个，使用T检验；*表示相比空白对照组，p≦0.05；**表示相比空白对照组，p≦0.01；和
图6、EdU实验的汉黄芩素与舒尼替尼组合物可有效抑制舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞的DNA复制效率的柱状图；
图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验设定5个随机视野，每个视野细胞总数不少于200个，使用T检验；*表示相比空白对照组，p≦0.05；**表示相比空白对照组，p≦0.01。
具体实施方式
以下结合具体实例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围并不局限于这些实例。
实施例1：汉黄芩素与舒尼替尼组合物对肾细胞癌的生长抑制活性更高
本实施例表明汉黄芩素与舒尼替尼组合物对肾细胞癌的生长抑制活性更高。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-O和OS-RC-2细胞。
试验分组与给药终浓度如下：
空白对照组：等体积的赋形剂二甲基亚风(DMSO)
汉黄芩素低剂量组：20μmol/L汉黄芩素
汉黄芩素高剂量组：40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼低剂量组：5μmol/L舒尼替尼
舒尼替尼高剂量组：10μmol/L舒尼替尼
组合物A组:10μmol/L汉黄芩素+5μmol/L舒尼替尼
组合物B组：20μmol/L汉黄芩素+5μmol/L舒尼替尼
组合物C组：20μmol/L汉黄芩素+10μmol/L舒尼替尼
汉黄芩素购自上海源叶生物科技有限公司(产品号ZCX-00023510-005)，将其溶于DMSO中配制成0.1M(mol/L)的母液并于-20℃贮藏。舒尼替尼购自美国selleck生物科技有限公司(产品号S7781)，将其溶于DMSO中配制成0.05M(mol/L)的母液并于-20℃贮藏。MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(产品号C0009)。人肾透明细胞腺癌细胞786-O(产品号TCHu186)和OS-RC-2(产品号TCHu 40)细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，细胞培养均使用RPMI-1640培养基(美国Gibco公司，产品号11875127)添加10％(V/V)胎牛血清(美国Gibco公司，(产品号1099141)，并加入100U/ml的青霉素和100mg/ml链霉素。所有的细胞均以37℃、CO2分压为5％(体积百分数)的条件培养。
噻唑蓝(MTT)实验：将处于对数生长期的786-O和OS-RC-2细胞以10×104/ml细胞浓度接种入96孔细胞培养板内，每孔100μL，设5复孔，置于37℃，5％CO2孵箱内培养24小时左右，再分别加入含各组药物的RPMI-1640完全培养基。孵育48小时后，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT工作液。摇匀后将培养板放回37℃，5％CO2培养箱中继续培养4-6小时后，将含MTT工作液的上清小心移除，每孔加入100μL二甲基亚砜溶液，将培养板放入37℃，5％CO2培养箱中孵育,待紫色结晶全部溶解且溶液透明度均一后(约20分钟)，于多功能酶标仪570nm波长处测定吸光度值(OD)，以OD值计算细胞存活率。
细胞存活率＝(试验组细胞OD值-空白组细胞OD值)/(对照组细胞OD值-空白组细胞OD值)×100％。
结果见图1所示，汉黄芩素与舒尼替尼均能够抑制肾细胞癌细胞的生长。20μM汉黄芩素处理786-O细胞48小时后，与未加入药物处理786-O细胞相比，细胞活力减少了约15％；40μM汉黄芩素处理786-O细胞48小时后，细胞活力减少了约55％；5μM舒尼替尼处理48小时后，细胞活力减少了约21％；10μM舒尼替尼处理48小时后，细胞活力减少了约51％；组合物A组处理48小时后，细胞活力减少了约66％，药物联合指数CI＝0.576；组合物B组处理48小时后，细胞活力减少了约89％，药物联合指数CI＝0.431；组合物C组处理48小时后，细胞活力减少了约97％，药物联合指数CI＝0.329。与786-O细胞类似，汉黄芩素与舒尼替尼处理也可导致OS-RC-2细胞的活力有明显下降。与未加入药物处理OS-RC-2细胞相比，20μM汉黄芩素处理OS-RC-2细胞48小时后，细胞活力减少了约10％；40μM汉黄芩素处理OS-RC-2细胞48小时后，细胞活力减少了约28％；5μM舒尼替尼处理48小时后，细胞活力减少了约17％；10μM舒尼替尼处理48小时后，细胞活力减少了约55％；组合物A组处理48小时后，细胞活力减少了约64％，药物联合指数CI＝0.540；组合物B组处理48小时后，细胞活力减少了约88％，药物联合指数CI＝0.348；组合物C组处理48小时后，细胞活力减少了约95％，药物联合指数CI＝0.403。
这些结果表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以更有效的抑制肾癌细胞的生长。并且抑制效果呈现浓度依赖性。
实施例2：汉黄芩素与舒尼替尼组合物能够更有效的诱导肾细胞癌细胞凋亡
本实施例表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以更有效的诱导肾细胞癌细胞凋亡。在本实施例中，所用肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-O细胞与OS-RC-2细胞。
试验分组与给药终浓度如下：
空白对照组：等体积的赋形剂二甲基亚风(DMSO)
汉黄芩素组：40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼组：10μmol/L舒尼替尼
组合物A组：10μmol/L汉黄芩素+5μmol/L舒尼替尼
组合物B组：20μmol/L汉黄芩素+5μmol/L舒尼替尼
组合物C组：20μmol/L汉黄芩素+10μmol/L舒尼替尼
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)购自碧云天生物技术有限公司(产品号C1089)。
TUNEL法检测细胞凋亡：细胞培养同实施例1。选取对数生长期786-O和OS-RC-2细胞，分别加入各组药物处理48小时，PBS洗一遍，加入免疫染色固定液室温固定20分钟。弃固定液，PBS洗2次，加入0.5％TritonX 100的PBS室温处理30分钟。弃上清，PBS洗2次，将20μl新鲜配制的TUNEL染色液滴加到细胞爬片上，37℃避光孵育60分钟，加入含DAPI的抗淬灭剂，使用荧光显微镜观察拍照。
结果如图2所示，未处理786-O细胞凋亡比例仅为约2％，40μM汉黄芩素处理48小时后凋亡细胞比例上升至约33％；10μM舒尼替尼处理48小时后凋亡细胞比例上升至约43％；组合物A组处理48小时后，786-O细胞凋亡比例约为56％；组合物B组处理48小时后，细胞凋亡比例约为79％；组合物C组处理48小时后，细胞凋亡比例约为91％。
与786-O细胞类似，未处理OS-RC-2细胞凋亡比例仅为约3％，40μM汉黄芩素处理48小时后OS-RC-2凋亡细胞比例上升至18％；10μM舒尼替尼处理48小时后凋亡细胞比例上升至46％；组合物A组处理48小时后，OS-RC-2细胞凋亡比例约为50％；组合物B组处理48小时后，细胞凋亡比例约为71％；组合物C组处理48小时后，细胞凋亡比例约为88％。
这些结果表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以更有效的诱导肾细胞癌细胞的凋亡，且诱导效果呈现浓度依赖性。
实施例3：汉黄芩素与舒尼替尼组合物抑制肾细胞癌细胞DNA复制的活性更高
本实施例表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以更有效的抑制肾细胞癌细胞DNA复制。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-O和OS-RC-2细胞。
试验分组与给药终浓度如下：
空白对照组：等体积的赋形剂二甲基亚风(DMSO)
汉黄芩素组：40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼组：10μmol/L舒尼替尼
组合物A组：10μmol/L汉黄芩素+5μmol/L舒尼替尼
组合物B组：20μmol/L汉黄芩素+5μmol/L舒尼替尼
组合物C组：20μmol/L汉黄芩素+10μmol/L舒尼替尼
细胞免疫染色固定液购自碧云天生物技术有限公司(产品号P0098)，EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司(产品号C10310-1)。抗淬灭剂购自Invitrogen公司(产品号P36931)。
EdU细胞增殖检测：细胞培养同实施例1。选取对数生长期的OS-RC-2细胞和786-O细胞，分别加入各组药物，处理24小时后，加入EdU后放置在37℃、5％CO2培养箱中培养20分钟，PBS清洗一遍。使用细胞免疫染色固定液4℃固定过夜，进行EdU染色。加入含DAPI的抗淬灭剂，荧光显微镜拍照。
结果如图3所示，汉黄芩素与舒尼替尼处理均能显著降低肾细胞癌细胞EdU掺入阳性细胞的比例。如未使用药物处理786-O细胞EdU掺入比例约为38％，40μM汉黄芩素处理24小时后，786-O细胞EdU掺入比例降低至约18％；10μM舒尼替尼处理24小时后，786-O细胞EdU掺入比例降低至约13％。组合物A组处理24小时后，EdU掺入比例降低至约12％；组合物B组处理24小时后，EdU掺入比例减少至约6％；组合物C组处理24小时后，EdU掺入比例减少至约1.6％。
与之类似，未处理OS-RC-2细胞EdU掺入比例约为45％，40μM汉黄芩素处理24小时后，OS-RC-2细胞EdU掺入比例降低至约31％；10μM舒尼替尼处理24小时后，OS-RC-2细胞EdU掺入比例降低至约27％。组合物A组处理24小时后，EdU掺入比例降低至约22％；组合物B组处理24小时后，细胞活力降低至约7.5％；组合物C组处理24小时后，EdU掺入比例减少至约3％。
这些结果表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以更有效的抑制肾细胞癌细胞的DNA复制能力，且抑制效果呈现浓度依赖性。
实施例4：汉黄芩素与舒尼替尼组合物可有效抑制舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞
的增殖
本实施例表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以有效的抑制舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞的增殖。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-O和OS-RC-2细胞。
试验分组与给药终浓度如下：
空白对照组：等体积的赋形剂二甲基亚风(DMSO)
汉黄芩素低剂量组：20μmol/L汉黄芩素
汉黄芩素高剂量组：40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼低剂量组：5μmol/L舒尼替尼
舒尼替尼高剂量组：10μmol/L舒尼替尼
组合药物组：10μmol/L舒尼替尼+40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼耐药肾癌细胞株的建立：选取对数生长期的OS-RC-2细胞和786-O细胞，细胞培养基使用含10μmol/L舒尼替尼的RPMI-1640培养基(美国Gibco公司，产品号11875127)添加10％(V/V)胎牛血清(美国Gibco公司，(产品号1099141)，并加入100U/ml的青霉素和100mg/ml链霉素，以37℃、CO2分压为5％(体积百分数)的条件培养传代10次以上，获得的细胞为舒尼替尼耐药细胞株。
噻唑蓝(MTT)实验同实施例1。
结果见图4所示，5μmol/L舒尼替尼低剂量处理组786-O舒尼替尼耐药细胞活力与空白对照组相比无显著差异，10μmol/L舒尼替尼高剂量处理组786-O舒尼替尼耐药细胞活力与空白对照组相比仅仅下降了10％，表明舒尼替尼耐药786-O细胞对舒尼替尼处理并不敏感；与之相比，20μM汉黄芩素处理48小时后，786-O细胞活力减少了约13％；40μM汉黄芩素处理48小时后，786-O细胞活力减少了约37％；组合药物组处理48小时后，细胞活力减少了约72％，药物联合指数CI＝0.671。与786-O细胞类似，舒尼替尼低剂量处理组OS-RC-2舒尼替尼耐药细胞活力与空白对照组相比无显著差异，舒尼替尼高剂量处理组OS-RC-2舒尼替尼耐药细胞活力与空白对照组相比仅仅下降了11％，表明舒尼替尼耐药OS-RC-2细胞对舒尼替尼处理并不敏感；与之相比，20μM汉黄芩素处理48小时后，OS-RC-2细胞活力减少了约8％；40μM汉黄芩素处理48小时后，OS-RC-2细胞活力减少了约26％；组合药物组处理48小时后，细胞活力减少了约64％，药物联合指数CI＝0.63。
这些结果表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以有效克服肾细胞癌细胞对舒尼替尼的耐药性。
实施例5：汉黄芩素与舒尼替尼组合物可有效诱导舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞
的凋亡
本实施例表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以有效的诱导舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞的凋亡。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-O和OS-RC-2细胞。
试验分组与给药终浓度如下：
空白对照组：等体积的赋形剂二甲基亚风(DMSO)
汉黄芩素组：40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼组：10μmol/L舒尼替尼
组合药物组：10μmol/L舒尼替尼+40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼耐药肾癌细胞株的建立：同实施例4。
TUNEL法检测细胞凋亡：同实施例2。选取对数生长期舒尼替尼耐药786-O和OS-RC-2细胞，分别加入各组药物处理48小时后进行TUNEL法检测细胞凋亡。
结果如图5所示，舒尼替尼处理组786-O舒尼替尼耐药细胞凋亡比例与空白对照组相比无显著差异，40μM汉黄芩素处理48小时后凋亡细胞比例上升至约31％；组合药物组处理48小时后，786-O舒尼替尼耐药细胞凋亡比例上升至约67％。
与786-O细胞类似，舒尼替尼处理组OS-RC-2舒尼替尼耐药细胞活力与空白对照组相比无显著差异，40μM汉黄芩素处理48小时后OS-RC-2舒尼替尼耐药细胞凋亡比例上升至26％；组合药物组处理48小时后，OS-RC-2舒尼替尼耐药细胞凋亡比例上升至约53％。
这些结果表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以有效的逆转舒尼替尼耐药肾细胞癌细胞对舒尼替尼的抗凋亡活性。
实施例6：汉黄芩素与舒尼替尼组合物可有效抑制舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞
的DNA复制。
本实施例表明汉黄芩素与舒尼替尼组合物可有效抑制舒尼替尼耐药性肾细胞癌细胞的DNA复制。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-O和OS-RC-2细胞。
试验分组与给药终浓度如下：
空白对照组：等体积的赋形剂二甲基亚风(DMSO)
汉黄芩素组：40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼组：10μmol/L舒尼替尼
组合药物组：10μmol/L舒尼替尼+40μmol/L汉黄芩素
舒尼替尼耐药肾癌细胞株的建立：同实施例4。
EdU检测细胞增殖：同实施例3。
选取对数生长期的786-O和OS-RC-2舒尼替尼耐药细胞，分别加入各组药物，处理24小时后，进行EdU检测。
结果如图6所示，舒尼替尼处理组786-O舒尼替尼耐药细胞EdU掺入阳性比例与空白对照组相比无显著差异，40μM汉黄芩素处理24小时后，786-O舒尼替尼耐药细胞EdU掺入比例降低至约22％；组合药物组处理24小时后，EdU掺入比例降低至约13％；
与之类似，舒尼替尼处理组OS-RC-2舒尼替尼耐药细胞EdU掺入阳性比例与空白对照组相比无显著差异，40μM汉黄芩素处理24小时后，OS-RC-2细胞EdU掺入比例降低至约33％；组合药物组处理24小时后，EdU掺入比例降低至约21％。
这些结果表明汉黄芩素与舒尼替尼协同可以有效的抑制舒尼替尼耐药肾细胞癌细胞的DNA复制能力。
以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。
Claims (10)
1.舒尼替尼和汉黄芩素在制备治疗肾细胞癌药物组合物中的应用，所述舒尼替尼与汉黄芩素的摩尔比为1:（1～10）；
所述肾细胞癌细胞对舒尼替尼有耐药性。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:(1～8)。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:(4～8)。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述舒尼替尼和汉黄芩素的质量占所述药物组合物的1～99.5%。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，还包括药学上可接受的赋形剂。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述汉舒尼替尼与黄芩素的摩尔比为1:2～5。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述汉舒尼替尼与黄芩素的摩尔比为1:2～7。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述汉舒尼替尼与黄芩素的摩尔比为1:3～6。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:6～10。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述舒尼替尼和汉黄芩素的摩尔比为1:8～10。
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