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CN107148419A - Zeste增强子同源物2抑制剂 - Google Patents

Zeste增强子同源物2抑制剂 Download PDF

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CN107148419A
CN107148419A CN201580058856.7A CN201580058856A CN107148419A CN 107148419 A CN107148419 A CN 107148419A CN 201580058856 A CN201580058856 A CN 201580058856A CN 107148419 A CN107148419 A CN 107148419A
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CN
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methyl
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dimethyl
oxo
propyl group
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Application number
CN201580058856.7A
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S.D.奈特
K.A.纽兰德
X.田
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GlaxoSmithKline Intellectual Property No 2 Ltd
Original Assignee
GlaxoSmithKline Intellectual Property No 2 Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及新的式(I)化合物，其为Zeste增强子同源物2(EZH2)的抑制剂，含有它们的药物组合物，它们的制备方法以及它们在治疗癌症的疗法中的用途。

Description

ZESTE增强子同源物2抑制剂
技术领域
本发明涉及化合物，其抑制Zeste增强子同源物2(EZH2)并且因此用于在癌细胞中抑制增殖和/或诱导细胞凋亡。
背景技术
表观遗传修饰在许多细胞过程(包括细胞增殖、分化和细胞存活)的调节中起着重要作用。总体表观遗传修饰在癌症中是常见的，且包括导致致癌基因、肿瘤抑制基因和信号通路的异常活化或失活的DNA和/或组蛋白甲基化的总体变化、非编码RNA的失调以及核小体重构。但是，不像癌症中出现的基因突变，这些表观遗传变化可通过选择性抑制所参与的酶而被逆转。已知参与组蛋白或DNA甲基化的多个甲基化酶在癌症中失调。因此，特定甲基化酶的选择性抑制剂将有用于治疗增殖性疾病，例如癌症。
EZH2(人EZH2基因：Cardoso，C，等人；European J of Human Genetics，第8卷，第3期，174-180页，2000)为多梳抑制复合物2(Polycomb Repressor Complex 2，PRC2)的催化亚单位，其功能是通过将组蛋白H3的赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)来使靶基因沉默。组蛋白H3是参与真核细胞染色质结构的五种主要组蛋白之一。以主要球状结构域和长的N末端尾为特征的组蛋白涉及核小体结构，即'串珠'结构。虽然组蛋白被高度地翻译后修饰，但组蛋白H3是五种组蛋白中被最广泛修饰的。单独的术语“组蛋白H3”是有意模糊的，因为它没有区分序列变体或修饰状态。组蛋白H3是表观遗传学(epigenetics)新领域中的重要蛋白，其中其序列变体和可变的修饰状态被认为在基因的动力学和长期调节中发挥着作用。
已经在许多实体瘤(包括前列腺、乳腺、皮肤、膀胱、肝、胰腺、头和颈的肿瘤)中观测到了增加的EZH2表达并且所述增加的EZH2表达与癌症进攻性、转移性和不良预后有关(Varambally等人，2002；Kleer等人，2003；Breuer等人，2004；Bachmann等人，2005；Weikert等人，2005；Sudo等人，2005；Bachmann等人，2006)。例如，在具有高EZH2水平的乳腺癌患者中，存在在前列腺切除术后表达高水平EZH2的肿瘤复发、转移增加、无疾病生存期缩短和死亡增加的风险(Varambally等人，2002；Kleer等人，2003)。最近，在UTX(ubiquitouslytranscribed tetratricopeptide repeats X，泛转录的三十四肽重复X)(即H3K27去甲基化酶，其与EZH2的功能相反)中的失活突变已经在多个实体瘤和血液肿瘤类型(包括肾肿瘤、成胶质细胞瘤、食管肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、小细胞肺肿瘤、膀胱肿瘤、多发性骨髓瘤和慢性髓样白血病肿瘤)中得以证实，且低UTX水平与乳腺癌中低存活有关，意味着UTX功能的丧失导致H3K27me3的增加和靶基因的抑制(Wang等人，2010)。总而言之，这些数据表明，在许多肿瘤类型中，增加的H3K27me3水平导致癌症的恶化，并且EZH2活性的抑制可提供治疗益处。
许多研究报道，通过siRNA或shRNA直接敲除EZH2或通过SAH水解酶抑制剂3-去氮腺嘌呤A(deazaneplanocin A，DZNep)的治疗间接消耗EZH2均降低癌细胞系在体外的增殖与侵入并降低体内肿瘤生长(Gonzalez等人，2008，GBM 2009)。虽然不知道异常EZH2活性导致癌症进展的确切机理，但是许多EZH2靶基因是肿瘤抑制剂，意味着肿瘤抑制剂功能的丧失是关键机理。此外，EZH2在永生化或原代上皮细胞中的过表达促进无贴壁依赖性生长和侵入且需要EZH2催化活性(Kleer等人，2003；Cao等人，2008)。
因此，有力的证据显示，EZH2活性的抑制降低了细胞增殖和侵入。因此，抑制EZH2活性的化合物将可用于治疗癌症。
发明概述
本发明涉及式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
X和Y各自独立地为CH、C或N；其中
当X为N，Y为CH时，为单键；
当Y为N，X为CH时，为单键；
当X和Y各为CH时，为单键；和
当X为C，Y为C时，为双键；
Z为CH或N；
R1和R2各自独立地为(C1-C4)烷基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为(C1-C3)烷基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基、嘧啶基、噁唑基甲基、和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
条件是所述化合物不是N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-((4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺、5-((4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基-N-((6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)噻吩-3-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)环己基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(4-(乙基(甲基)氨基)环己基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或各个这些化合物的立体异构体或其混合物。
本发明的另一方面涉及在实体瘤的癌细胞中诱导细胞凋亡；治疗实体肿瘤的方法。
本发明的另一方面涉及包含式(I)化合物和药学上可接受的赋形剂的药物制剂。
在另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，在制备用于治疗由EZH2介导的病症(例如通过诱导癌细胞中的细胞凋亡)的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐在治疗由EZH2介导的疾病中的用途。本发明还提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性治疗物质在治疗由EZH2介导的疾病中的用途。
在另一方面，本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗。
在另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗由EZH2介导的病症。
在另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗细胞增殖疾病。
在另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症，包括治疗实体瘤，例如脑癌(神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、威尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、胃癌、膀胱癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、肾脏癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨细胞肿瘤和甲状腺癌。
在另一方面，提供了共同给药本发明的式(I)化合物与其他活性成分的方法。
在另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐和至少一种抗肿瘤药的组合，其用于治疗由EZH2介导的病症。
在另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐和至少一种抗肿瘤药的组合，其用于治疗细胞增殖疾病。
在另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐和至少一种抗肿瘤药的组合，其用于治疗癌症，包括治疗实体瘤，例如脑癌(神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、威尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、胃癌、膀胱癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、肾脏癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨细胞肿瘤和甲状腺癌。
发明详述
本发明涉及如上定义的式(I)化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中X和Y各自独立地为CH或N，其中X和Y中至少一个为CH，和为单键。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中X为N，Y为CH，和为单键。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中Y为N，X为CH，和为单键。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中X和Y各为CH，和为单键。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中X和Y各为C，和为双键。
在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中X为CH或C和Y为CH，C或N，其中当Y为N，X为CH时，为单键，当X和Y各为CH时，为单键，且当X为C，Y为C时，为双键。
在具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中Z为CH。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中Z为N。
在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基。在具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R1和R2各为甲基。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R3和R4各为氢。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R3和R4一起表示-CH2CH2-；
在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基。在具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R5为甲基。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R6为乙基。
在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7为卤代(C1-C4)烷基。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7为-N((C1-C4)烷基)2。在具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7为二甲基氨基。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7为羟基。
在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7为-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中Z为N，和R7为-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基。在具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中Z为N，和R7为-C(＝N-CN)NHCH3。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7选自：2-氟丙基、2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟乙基、2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基、羟基、二甲基氨基、嘧啶-2-基、噁唑-2-基甲基和-C(＝N-CN)NHCH3。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7选自：2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基、羟基、二甲基氨基、嘧啶-2-基和噁唑-2-基甲基。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7选自：2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟丙基和2,2,2-三氟乙基。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7为2-氟-2-甲基丙基。还在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中R7为2,2-二氟丙基。
在具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中当R7为-N((C1-C4)烷基)2时，以下条件中至少一个必须满足：
(i)Z为N；
(ii)R3和R4一起表示-CH2CH2-；或
(iii)X和Y各为C，和为双键。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中当R7为-N((C1-C4)烷基)2时，Z为N。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中当R7为-N((C1-C4)烷基)2时，R3和R4一起表示-CH2CH2-。在另一具体实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中当R7为-N((C1-C4)烷基)2时，X和Y各为C，和为双键。
在另一实施方案中，本发明还涉及式(Ia)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7根据式(I)定义，条件是所述化合物不是N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-((4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺、5-((4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基-N-((6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)噻吩-3-甲酰胺或N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(4-(乙基(甲基)氨基)环己基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或各个这些化合物的立体异构体或其混合物。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Ia)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ia)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ia)化合物，其中：
Z为CH或N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，本发明还涉及式(Ib)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7根据式(I)定义，条件是所述化合物不为N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或这些化合物的立体异构体或其混合物。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Ib)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Ib)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ib)化合物，其中：
Z为CH或N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ib)化合物，其中：
Z为CH；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7为-N((C1-C4)烷基)2；
或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，本发明还涉及式(Ib2)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7根据式(I)定义，条件是所述化合物不为N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或这些化合物的立体异构体或其混合物。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Ib2)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Ib2)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ib2)化合物，其中：
Z为CH或N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ib2)化合物，其中：
Z为CH；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7为-N((C1-C4)烷基)2；
或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，本发明还涉及式(Ic)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7根据式(I)定义，条件是所述化合物不为N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)环己基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或其立体异构体或混合物。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Ic)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ic)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，本发明还涉及式(Ic2)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7根据式(I)定义，条件是所述化合物不为N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)环己基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或其立体异构体或混合物。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Ic2)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Ic2)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，本发明还涉及式(Id)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7根据式(I)定义。
在具体实施方案中，本发明涉及式(Id)化合物，其中：
Z为N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
或其药学上可接受的盐。
在另一具体实施方案中，本发明涉及式(Id)化合物，其中：
Z为CH或N；
R1和R2各自独立地为甲基、乙基、正丙基或正丁基；
R3和R4各为氢；
R5和R6各自独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基；
或其药学上可接受的盐。
本发明的具体化合物包括：
5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
(S)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羟基哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮；
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(1-(2-氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮；
N'-氰基-4-(1-(5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)-N-甲基哌啶-1-甲脒；
5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；和
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
或其药学上可接受的盐。
典型地，但不是绝对地，本发明的盐是药学上可接受的盐。含有碱性胺官能团或其他碱性官能团的所公开的化合物的盐可通过本领域已知的任何合适的方法制备，包括用无机酸处理游离碱，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，或用有机酸处理游离碱，所述有机酸诸如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖基酸诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羟基酸诸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸诸如天冬氨酸或谷氨酸、芳族酸诸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸诸如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。药学上可接受的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐(propiolate)、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、扁桃酸盐和磺酸盐诸如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1磺酸盐和萘-2磺酸盐。
含有羧酸官能团或其他酸性官能团的所公开的化合物的盐可通过与合适的碱反应制备。所述药学上可接受的盐可用提供药学上可接受的阳离子的碱制得，所述盐包括碱金属盐(尤其是钠盐和钾盐)、碱土金属盐(尤其是钙盐和镁盐)、铝盐和铵盐，以及所述药学上可接受的盐可从生理学可接受的有机碱制得，所述有机碱诸如三甲基胺、三乙基胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己基胺、N,N’-二苄基乙二胺、2-羟基乙基胺、双-(2-羟基乙基)胺、三-(2-羟基乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、去氢枞胺(dehydroabietylamine)、N,N’-去氢枞胺、二葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、三甲基吡啶、奎宁、喹啉，和碱性氨基酸诸如赖氨酸和精氨酸。
不是药学上可接受的其他盐可用于制备本发明化合物，并且这些应被视为本发明的另一方面。这些盐诸如草酸盐或三氟乙酸盐，尽管它们本身不是药学上可接受的，但是可用于制备在获得本发明化合物和它们的药学上可接受的盐时用作中间体的盐。
式(I)化合物或其盐可按立体异构形式存在(例如，其含有一个或多个不对称碳原子)。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)和这些异构体的混合物包括在本发明范围内。同样地，应理解式(I)的化合物或盐可按不同于该式中所示的互变异构形式存在，并且这些也包括在本发明范围内。应理解，本发明包括上文定义的具体组的所有组合和亚类。本发明的范围包括立体异构体的混合物以及纯化的对映异构体或对映异构体/非对映异构体富集的混合物。应理解，本发明包括上文定义的具体组的所有组合和亚类。
本发明还包括同位素标记的化合物，其除以下事实外与式(I)所述的那些化合物相同：一个或多个原子被原子质量或质量数不同于天然常见的原子质量或质量数的原子代替。可引入本发明化合物及其药学上可接受的盐中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯和碘的同位素，诸如2H、3H、11C、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I和125I。
含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的本发明的化合物和所述化合物的药学上可接受的盐在本发明范围内。同位素标记的本发明的化合物，例如引入了放射性同位素诸如3H或14C的那些化合物，用于药物和/或底物组织分布测定。氚代的即3H和碳-14即14C同位素由于其易于制备及可检测性而是特别优选的。11C和18F同位素特别用于PET(正电子发射断层扫描术)，以及125I同位素特别用于SPECT(单光子发射计算机断层扫描)，所有这些都用于脑成像。此外，用较重的同位素诸如氘即2H取代可提供某些导致更大的代谢稳定性的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量需求减小，由此在一些情况中是优选的。通常可通过进行下文的方案和/或实施例中披露的操作，通过用容易获得的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂来制备同位素标记的式(I)化合物和本发明的以下化合物。
本发明还提供了药物组合物(也称为药物制剂)，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和一或多种赋形剂(在制药领域也称为载体和/或稀释剂)。所述赋形剂在与该制剂的其他成分相容且对其接受者(即，患者)无毒方面是可接受的。
合适的药学上可接受的赋形剂将根据所选具体的剂型而变化。此外，可根据在组合物中所起的具体功能来选择合适的药学上可接受的赋形剂。例如，可根据促进制备均一剂型的能力来选择某些药学上可接受的赋形剂。可根据促进制备稳定的剂型的能力来选择某些药学上可接受的赋形剂。可根据在给药至患者后促进本发明化合物从身体的一个器官或部分携带或运输至身体的另一器官或部分的能力来选择某些药学上可接受的赋形剂。某些药学上可接受的赋形剂可根据其提高患者顺应性的能力进行选择。
合适的药学上可接受的赋形剂包括下列赋形剂类型：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粒化剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、增甜剂、矫味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。本领域技术人员将理解，某些药学上可接受的赋形剂可以以多于一种功能和以替代性功能来使用，取决于所述赋形剂在制剂中存在多少和在制剂中存在何种其它成分。
具有本领域的知识和技术的技术人员能够选择出以适当量用于本发明的合适的药学上可接受的赋形剂。此外，有许多本领域技术人员可用的资源，这些资源描述了药学上可接受的赋形剂且其可用于选择合适的药学上可接受的赋形剂。实例包括Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company)，The Handbook of Pharmaceutical Additives(Gower Publishing Limited)，和The Handbook of Pharmaceutical Excipients(the American Pharmaceutical Association and thePharmaceutical Press)。
本发明的药物组合物使用本领域技术熟练人员已知的技术和方法制备。通常用于本领域的一些方法描述在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCompany)中。
药物组合物可为每个剂量单位含有预定量的活性成分的单位剂量形式。所述单位可含有治疗有效剂量的式(I)化合物或其盐，或一定比例的治疗有效剂量的式(I)化合物或其盐，从而在给定的时间可给予多个单位剂量形式以达到期望的治疗有效剂量。优选的单位剂量制剂是本申请上文所述的含有活性成分的每日剂量或亚剂量或其适当的比例的那些。此外，所述药物组合物可通过药学领域熟知的任何方法制备。
药物组合物可适应于通过任何适当的途径给药，例如，经口服(包括口腔或舌下)、直肠、鼻、局部(包括口腔、舌下或经皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径给药。所述组合物可通过药学领域已知的任何方法制备，例如，通过使活性成分与一种或多种赋形剂结合。
当适应于口服给药时，药物组合物可为离散单位诸如片剂或胶囊剂、粉末或颗粒、于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、可食用泡沫或搅打剂(whip)，或水包油型液体乳液或油包水型乳液。本发明的化合物或其盐或本发明的药物组合物也可被掺入到糖果、薄片剂(wafer)和/或条型(tongue tape)制剂中，用于作为“快速溶解”的药物给药。
例如，就以片剂或胶囊剂形式进行的口服给药而言，可将活性药物组分与口服的无毒的药学上可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等混合。粉末剂或颗粒剂如下制备：将化合物研磨至合适的微细尺寸，然后与经类似研磨的药物载体如可食用的碳水化合物(如淀粉或甘露醇)混合。也可存在矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
胶囊剂如下制备：如上所述制备粉末混合物，然后填充到成形的明胶或非明胶壳中。可将助流剂和润滑剂如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加到粉末混合物中，然后进行填充操作。也可加入崩解剂或增溶剂如琼脂、碳酸钙或碳酸钠以改善胶囊剂被摄入时的药物利用度。
此外，当期望或需要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺到混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然胶和合成胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
片剂如下配制：例如制备粉末混合物，制粒或预压片，加入润滑剂和崩解剂，然后压制成片剂。粉末混合物如下制备：将经合适研磨的化合物与上述稀释剂或基质以及任选的粘合剂(如羧甲基纤维素、海藻酸盐、凝胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶液延迟剂(solutionretardant)(如石蜡)、吸收促进剂(如季胺盐)和/或吸收剂(如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合。粉末混合物可如下制粒：润湿粘合剂如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶液、纤维素溶液或聚合物溶液，然后挤压过筛。作为可选择的制粒方法，粉末混合物可通过压片机来处理，导致不完全成形的预压片破裂成颗粒。可通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油的方式来对颗粒进行润滑以防止与片剂成形模粘连。然后将经润滑的混合物压制成片剂。本发明的化合物或盐也可与自由流动的惰性载体组合，并在不经历制粒或预压片步骤的情况下直接压制成片剂。可提供透明的或不透明的保护性包衣，所述包衣由以下包衣层构成：由虫胶形成的隔离包衣层、由糖或聚合物形成的包衣层和由蜡形成的光亮包衣层。可将染料加到这些包衣中以区分不同的剂量。
口服流体如溶液剂、糖浆剂和酏剂可按剂量单位形式来制备，从而使给定的量含有预定量的活性成分物。糖浆剂可通过将本发明的化合物或其盐溶于经合适矫味的水溶液中来制备，而酏剂通过使用无毒的含醇媒介物来制备。悬浮剂可通过将本发明的化合物或其盐分散在无毒的媒介物中来制备。也可加入增溶剂和乳化剂(如乙氧基化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐剂、矫味添加剂(如薄荷油、天然甜味剂、糖精或其它人造甜味剂)等。
当适当时，可对用于口服给药的剂量单位制剂进行微囊化。也可例如通过将颗粒物质包衣或包埋到聚合物、蜡等中来制备制剂以延长或维持释放。
在本发明中，对于递送药物组合物而言，片剂和胶囊剂是优选的。
根据本发明的另一方面，提供了制备药物组合物的方法，其包括将式(I)化合物或其盐与至少一种赋形剂混合(或掺合)。
本发明还提供了在哺乳动物，尤其是人中的治疗方法。本发明的化合物和组合物用于治疗细胞增殖性疾病。可通过本文提供的方法和组合物得到治疗的疾病包括，但不限于，癌症(下文进一步讨论)、自身免疫性疾病、真菌病症、关节炎、移植排斥、炎性肠病、医疗程序(medical procedure)后诱导的增殖，所述医疗程序包括，但不限于，手术、血管成形术等。应理解，在一些情况下，细胞可能并不在高增殖或低增殖状态(异常状态)但仍需要进行治疗。例如，在伤口愈合过程中，尽管细胞可能是“正常”增殖的，但仍可能需要增殖强化。因此，在一个实施方案中，本发明包括施用至患有或即将患有任一这些疾病或病症的细胞或个体。
本文提供的组合物和方法尤其被认为是用于治疗癌症，包括肿瘤，例如前列腺癌、乳腺癌、脑癌、皮肤癌、宫颈癌、睾丸癌等。它们尤其用于治疗转移性或恶性肿瘤。更具体地，可通过本发明的组合物和方法得到治疗的癌症包括，但不限于以下肿瘤类型，例如星形细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、喉癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌和甲状腺癌和肉瘤。更具体地，这些化合物可用于治疗：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管癌(鳞状上皮细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠道：食道(鳞状上皮细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤(vipoma))、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道：肾(腺癌、威尔姆斯肿瘤(Wilm's tumor)(肾胚细胞瘤)、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状上皮细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝：肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞性腺瘤、血管瘤；胆道：胆囊癌、壶腹癌、胆管癌；骨：成骨性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣(osteocartilaginous exostose))、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤(chondromyxofibroma)、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：头骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤(meningiosarcoma)、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈病变(pre-tumor cervical dysplasia))、卵巢(卵巢癌(浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌(unclassified carcinoma))、颗膜细胞瘤(granulosa-thecal cell tumor)、塞-莱细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状上皮细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状上皮细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管癌)；血液方面：血液(髓细胞性白血病(急性和慢性)、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome))、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(恶性淋巴瘤)；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌、卡波西肉瘤、发育不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；和肾上腺：神经母细胞瘤。因此，本文所述术语“癌细胞”包括患有任一上述病症或相关病症的细胞。
本发明化合物可与其他治疗剂，尤其是可提高化合物活性及体内处置时间的药剂组合或共同给药。本发明的组合疗法包括施用至少一种本发明化合物并使用至少一种其他治疗方法。在一个实施方案中，本发明的组合疗法包括施用至少一种本发明化合物和手术治疗。在一个实施方案中，本发明的组合疗法包括施用至少一种本发明化合物和放射疗法。在一个实施方案中，本发明的组合疗法包括施用至少一种本发明化合物和至少一种支持疗法药物(例如，至少一种镇吐药)。在一个实施方案中，本发明的组合疗法包括施用至少一种本发明化合物和至少一种其他化疗剂。在一个具体实施方案中，本发明包括施用至少一种本发明化合物和至少一种抗肿瘤药。在另一实施方案中，本发明包括治疗方案，其中本公开的EZH2抑制剂本身并没有活性或并没有显著活性，但是当其与另一疗法组合时(所述另一疗法作为单独疗法时可以是有活性的或无活性的)，该组合提供有用的治疗效果。
本文所用的术语“共同给药”及其衍生词语是指同时给药或以任意单独的方式相继给药本文所述的EZH2抑制化合物和已知用于治疗癌症(包括化疗和放射治疗)的一种或多种其他活性成分。当向有治疗癌症需要的患者给药时，本文所用术语一种或多种活性成分还包括已知的或被证明有有益性质的任意化合物或治疗剂。优选地，如果所述给药不是同时的，那么该化合物以彼此极接近的时间进行给药。此外，所述化合物是否以同一剂型施用并不重要，例如一种化合物可局部给药而另一化合物可口服给药。
通常，在治疗本发明中指定的癌症时，可以共同给药对待治疗的敏感肿瘤具有活性的任何抗肿瘤药物。该药物的实例参考V.T.Devita和S.Hellman(主编)的CancerPrinciples and Practice of Oncology，第6版(2001年2月15日)，Lippincott Williams&Wilkins Publishers。本领域一般技术人员将能够根据药物的具体特征和所涉及癌症辨别药物的何种组合将是有用的。可用于本发明的典型抗肿瘤药物包括，但不限于，抗微管剂例如二萜类化合物和长春花生物碱；铂配位络合物；烷基化剂例如氮芥、氧氮磷杂环己二烯(oxazaphosphorine)、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯；抗生素例如蒽环类、放线菌素和博莱霉素；拓扑异构酶II抑制剂例如表鬼臼毒素；抗代谢剂例如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱；激素和激素类似物；DNA甲基转移酶抑制剂例如阿扎胞苷和地西他滨；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促细胞凋亡剂；以及细胞周期信号转导抑制剂。
通常，对所治疗的易感肿瘤具有活性的任意化学治疗剂可与本发明化合物组合使用，条件是该具体药物与采用本发明化合物的疗法在临床上兼容。用于本发明的典型抗肿瘤剂包括，但不限于：烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、抗有丝分裂药、核苷类似物、拓扑异构酶I和II抑制剂、激素和激素类似物；维甲酸，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；信号转导通路抑制剂，包括细胞生长或生长因子功能的抑制剂、血管生成抑制剂和丝氨酸/苏氨酸或其他激酶抑制剂；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；反义疗法和免疫治疗剂，包括单克隆抗体、疫苗或其他生物制剂。
核苷类似物是指转化成三磷酸脱氧核苷酸并代替胞嘧啶并入到复制的DNA中的化合物。DNA甲基转移酶共价地连接至该修饰的碱基上，导致酶失活以及降低的DNA甲基化。核苷类似物的实例包括阿扎胞苷和地西他滨，它们都用于治疗骨髓增生异常疾病。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂包括伏立诺他，其用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤。HDAC通过组蛋白脱乙酰基作用来修饰染色质。此外，它们具有各种作用底物，包括各种转录因子和信号分子。其他HDAC抑制剂正在研发。
信号转导通路抑制剂是阻断或抑制化学过程的那些抑制剂，所述化学过程引起细胞内变化。如本文所用，这一变化是细胞增殖或分化或存活。用于本发明的信号转导通路抑制剂包括，但不限于，受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、SH2/SH3结构域阻断剂、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷脂酰肌醇-3-OH激酶、肌醇信号传导和Ras癌基因的抑制剂。信号转导通路抑制剂可与上述组合物和方法中的本发明化合物组合使用。
受体激酶血管生成抑制剂也可用于本发明中。涉及VEGFR和TIE-2的血管生成抑制剂在上述针对信号传导抑制剂(两者都是受体酪氨酸激酶)中进行讨论。其他抑制剂可与本发明化合物组合使用。例如，抗VEGF抗体，其不识别VEGFR(受体酪氨酸激酶)，但结合至该配体；整联蛋白(αvβ3)的小分子抑制剂，其抑制血管生成；内皮他丁和血管他丁(非-RTK)也可被证明用于与本发明化合物组合。VEGFR抗体的一个实例是贝伐单抗
生长因子受体的多种抑制剂正在研发且包括配体拮抗剂、抗体、酪氨酸激酶抑制剂、反义寡核苷酸和适体。任意这些生长因子受体抑制剂可与本发明化合物组合用于本文所述的任意组合物和方法/用途中。曲妥珠单抗是生长因子功能的抗-erbB2抗体抑制剂的实例。生长因子功能的抗-erbB2抗体抑制剂的实例是西妥昔单抗(ErbituxTM，C225)。贝伐单抗是直接针对VEGFR的单克隆抗体的实例。表皮生长因子受体的小分子抑制剂的实例包括但不限于拉帕替尼和厄洛替尼甲磺酸伊马替尼是PDGFR抑制剂的一个实例。VEGFR抑制剂的实例包括帕唑帕尼ZD6474、AZD2171、PTK787、舒尼替尼和索拉非尼。
抗微管或抗有丝分裂剂是时相特异性药物(phase specific agent)，其在细胞周期中的M期或有丝分裂期对肿瘤细胞的微管具有活性。抗微管剂的实例包括但不限于二萜类化合物(diterpenoid)和长春花生物碱(vinca alkaloid)。
天然来源的二萜类化合物是时相特异性的抗癌剂，其在细胞周期中的G2/M期起作用。认为二萜类化合物通过与该蛋白结合，使微管的β-微管蛋白亚单位稳定。然后使蛋白的分解受到抑制，有丝分裂停止，接着发生细胞死亡。二萜类化合物的实例包括但不限于紫杉醇及其类似物多西他赛。
紫杉醇，5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4,10-二乙酸酯2-苯甲酸酯13-(2R,3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨酸酯(5β,20-epoxy-1,2α,4,7β,10β,13α-hexa-hydroxytax-11-en-9-one 4,10-diacetate2-benzoate 13-ester with(2R,3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserine)，其是从太平洋紫杉树(Taxus brevifolia)中分离出来的天然二萜产物，且作为可注射的溶液市售。其为萜类紫杉烷家族的成员。其在1971年由Wani等人首次分离出来(J.Am.Chem，Soc.,93：2325,1971)，并通过化学和X-射线结晶学方法表征其结构。其活性的机理之一是关于紫杉醇能结合微管蛋白，进而抑制癌细胞生长。Schiff等,Proc.Natl,Acad,Sci.USA,77：1561-1565(1980)；Schiff等,Nature,277：665-667(1979)；Kumar,J.Biol,Chem,256：10435-10441(1981)。有关一些紫杉醇衍生物的合成和抗癌活性的综述，参见D.G.I.Kingston等,Studies in Oranic Chemistry第26卷,标题为“New trends in Natural Products Chemistry 1986”,Attaur-Rahman,P.W.LeQuesne编辑(Elsevier,Amsterdam,1986)第219-235页。
在美国，已经批准紫杉醇的临床使用，用于治疗难治的卵巢癌(Markman等,YaleJournal of Biology and Medicine,64：583,1991；McGuire等,Ann.Int.,Med.,111：273,1989)和用于治疗乳腺癌(Holmes等,J.Nat.Cancer Inst.,83：1797,1991)。其为治疗皮肤癌(Einzig等,Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.,20：46)和头颈癌(Forastire等,Sem.Oncol.,20：56,1990)的可能的候选药物。该化合物还具有治疗多囊性肾病(Woo等,Nature,368：750,1994)、肺癌和疟疾的潜力。采用紫杉醇治疗患者，导致骨髓抑制(多重细胞谱系(multiplecell lineage),Ignoff,R.J.等,Cancer Chemotherapy Pocket Guide,1998)，这与高于阈浓度(50nM)的给药的持续时间有关(Kearns,C.M.等,Seminars in Oncology,3(6)p.16-23,1995)。
多西他赛(Docetaxel)，5β-20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4-乙酸酯2-苯甲酸酯13-(2R,3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸N-叔丁基酯，三水合物，作为可注射的溶液市售。多西他赛可用于治疗乳腺癌。多西他赛是适量(q.v.)紫杉醇的半合成衍生物，其利用天然前体即从欧洲浆果紫杉树的针叶中提取的10-去乙酰基浆果赤霉素III制备。多西他赛的剂量限制性毒性是嗜中性白细胞减少症。
长春花生物碱(Vinca alkaloids)是来源于长春花属植物的时相特异性的抗肿瘤药物。长春花生物碱通过特异性地结合微管蛋白而在细胞周期的M期(有丝分裂)起作用。因此，被结合的微管蛋白分子不能聚合成微管。认为有丝分裂在中期被停止，随后细胞死亡。长春花生物碱的实例包括但不限于长春碱，长春新碱和长春瑞滨。
长春碱(Vinblastine)，长春碱硫酸盐，以注射液市售。尽管已经表明其有可能作为各种实体瘤的二线治疗，但是其最初表明用于治疗睾丸癌和各种淋巴瘤，包括霍奇金病以及淋巴细胞和组织细胞的淋巴瘤。骨髓抑制是长春碱的剂量限制性副作用。
长春新碱(Vincristine)，长春碱22-氧代-硫酸盐，以注射溶液市售。长春新碱显示用于治疗急性白血病，还发现用于治疗霍奇金和非霍奇金恶性淋巴瘤。脱发和神经作用是长春新碱最常见的副作用，并产生较小程度的骨髓抑制和胃肠粘膜炎作用。
长春瑞滨(Vinorelbine)，3',4'-二脱氢-4'-脱氧-C'-去甲长春碱(norvincaleukoblastine)[R-(R*,R*)-2,3-二羟基丁二酸二酯(1：2)(盐)]，以长春瑞滨酒石酸盐注射溶液市售，是半合成的长春花生物碱。长春瑞滨可作为单独的药物或与其它化学治疗剂(如顺铂)组合，用于治疗各种实体瘤，特别是非小细胞肺癌、晚期乳腺癌和激素难治的前列腺癌。骨髓抑制是长春瑞滨最常见的剂量限制性副作用。
铂配位络合物(Platinum coordination complex)是非时相特异性的抗癌剂，其与DNA相互作用。铂络合物进入肿瘤细胞，进行水合作用，并与DNA形成链内部和之间的交联，导致对肿瘤不利的生物学作用。铂配位络合物的实例包括但不限于顺铂和卡铂。
顺铂，顺式-二氨二氯合铂，以注射溶液市售。顺铂最初用于治疗转移性睾丸癌和卵巢癌以及晚期的膀胱癌。顺铂的主要剂量限制性副作用是肾毒性和耳毒性，所述肾毒性可通过水合和利尿来控制。
卡铂，二氨[1,1-环丁烷-二羧酸根(2-)-O,O']合铂，以注射溶液市售。卡铂最初用于晚期卵巢癌的一线和二线治疗。骨髓抑制是卡铂的剂量限制性毒性。
烷化剂是非时相特异性的抗癌药物和强亲电试剂。通常，烷化剂借助于烷基化作用，通过DNA分子的亲核部分如磷酸基(phosphate)、氨基、巯基、羟基、羧基和咪唑基，与DNA形成共价键。这种烷基化作用破坏核酸功能，导致细胞死亡。烷化剂的实例包括但不限于氮芥(如环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥)、磺酸烷基酯(如白消安、亚硝基脲如卡莫司汀)，以及三氮烯(如达卡巴嗪)。
环磷酰胺(Cyclophosphamide)，2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-氧氮磷杂环己二烯2-氧化物一水合物(2-[bis(2-chloroethyl)amino]tetrahydro-2H-1,3,2-oxazaphosphorine 2-oxide monohydrate)，以注射溶液或片剂市售。环磷酰胺可作为单独的药物或与其它化学治疗剂组合，用于治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。脱发、恶心、呕吐和白细胞减少症是环磷酰胺最常见的剂量限制性副作用。
美法仑(Melphalan)，4-[双(2-氯乙基)氨基]-L-苯基丙氨酸(4-[bis(2-chloroethyl)amino]-L-phenylalanine)，以注射溶液或片剂市售。美法仑可用于多发性骨髓瘤和不可切除的卵巢上皮癌的姑息疗法。骨髓抑制是美法仑最常见的剂量限制性副作用。
苯丁酸氮芥(Chlorambucil)，4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸(4-[bis(2-chloroethyl)amino]benzenebutanoic acid)，以片剂市售。苯丁酸氮芥可用于慢性淋巴细胞性白血病，恶性淋巴瘤(如淋巴肉瘤、巨滤泡性淋巴瘤和霍奇金病)的姑息疗法。骨髓抑制是苯丁酸氮芥最常见的剂量限制性副作用。
白消安(Busulfan)，1,4-丁二醇二甲磺酸酯(1,4-butanedioldimethanesulfonate)，以片剂市售。白消安用于慢性髓细胞性白血病的姑息疗法。骨髓抑制是白消安最常见的剂量限制性副作用。
卡莫司汀(Carmustine)，1,3-[双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(1,3-[bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea)，以单瓶装的冻干产物市售。卡莫司汀可作为单独的药物或与其它药物组合，用于脑瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤的姑息疗法。延迟的骨髓抑制是卡莫司汀最常见的剂量限制性副作用。
达卡巴嗪(Dacarbazine)，5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺(5-(3,3-dimethyl-1-triazeno)-imidazole-4-carboxamide)，以DTIC-单瓶装的产物市售。达卡巴嗪可用于转移性恶性黑素瘤的治疗，并且可与其它药物组合，用于霍奇金病的二线治疗。恶心、呕吐和厌食是达卡巴嗪最常见的剂量限制性副作用。
抗生素类抗癌剂(Antibiotic anti-neoplastics)是非时相特异性的药物，其结合或嵌入DNA中。通常，这种作用导致稳定的DNA复合物或链断裂，破坏核酸的正常功能，导致细胞死亡。抗生素类抗肿瘤药物的实例包括但不限于放线菌素(如放线菌素D)；蒽环类(anthrocyclins)(如柔红霉素和多柔比星)；以及博来霉素。
放线菌素D(Dactinomycin，也称为Actinomycin D)，以注射液形式市售。放线菌素D可用于威尔姆斯肿瘤和横纹肌肉瘤的治疗。恶心、呕吐和厌食是放线菌素D最常见的剂量限制性副作用。
柔红霉素(Daunorubicin)，(8S-顺式-)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧基α-L-来苏-己吡喃糖基)-氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮盐酸盐，以脂质体可注射形式或可注射形式市售。柔红霉素可在急性非淋巴细胞性白血病和晚期HIV相关的卡波西肉瘤的治疗中用于诱导缓解。骨髓抑制是柔红霉素最常见的剂量限制性副作用。
多柔比星(Doxorubicin)，(8S,10S)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃糖基)氧基]-8-乙醇酰基-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮盐酸盐((8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyl)oxy]-8-glycoloyl,7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-1-methoxy-5,12naphthacenedione hydrochloride)，以或ADRIAMYCIN注射溶液市售。多柔比星主要用于急性成淋巴细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病的治疗，但也是治疗某些实体瘤和淋巴瘤的有用组分。骨髓抑制是多柔比星最常见的剂量限制性副作用。
博来霉素(Bleomycin)，是从轮丝链霉菌(streptomyces verticilus)菌株中分离出来的细胞毒素糖肽类抗生素的混合物，以市售。博来霉素可作为单独的药物或与其它药物组合，用于鳞状细胞癌、淋巴瘤和睾丸癌的姑息疗法。肺部和皮肤毒性是博来霉素最常见的剂量限制性副作用。
拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于表鬼臼脂毒素。
表鬼臼脂毒素(Epipodophyllotoxins)是来源于曼德拉草(mandrake)植物的时相特异性的抗肿瘤药物。表鬼臼脂毒素通常通过与拓扑异构酶II和DNA形成三元复合物，导致DNA链断裂来影响处于细胞周期的S和G2期的细胞。链断裂积聚，接着细胞死亡。表鬼臼脂毒素的实例包括但不限于依托泊苷和替尼泊苷。
依托泊苷(Etoposide)，4'-去甲基-表鬼臼脂毒素9[4,6-0-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，以注射溶液或胶囊市售，并且常称之为VP-16。依托泊苷可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗睾丸癌和非小细胞肺癌。骨髓抑制是依托泊苷最常见的副作用。白细胞减少症的发生率(incidence)倾向于比血小板减少症的发生率更严重。
替尼泊苷(Teniposide)，4'-去甲基-表鬼臼脂毒素9[4,6-0-(R)-噻吩亚甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，以注射溶液市售，并且通常称之为VM-26。替尼泊苷可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗儿童急性白血病。骨髓抑制是替尼泊苷最常见的剂量限制性副作用。替尼泊苷可引起白细胞减少症和血小板减少症。
抗代谢肿瘤药物(Antimetabolite neoplasti)是时相特异性的抗肿瘤药物，其作用于细胞周期的S期(DNA合成)，通过抑制DNA的合成，或者通过抑制嘌呤或嘧啶碱基的合成进而限制DNA的合成。因此，S期不能继续下去，接着细胞死亡。抗代谢类抗肿瘤药物的实例包括但不限于氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤，以及吉西他滨(fluorouracil,methotrexate,cytarabine,mecaptopurine,thioguanine,andgemcitabine)。
5-氟尿嘧啶，5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮，以氟尿嘧啶市售。5-氟尿嘧啶的给药导致胸苷酸合成的抑制，并且还掺入到RNA和DNA中。结果通常是细胞死亡。5-氟尿嘧啶可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌和胰腺癌。骨髓抑制和粘膜炎是5-氟尿嘧啶的剂量限制性副作用。其它的氟嘧啶类似物包括5-氟脱氧尿嘧啶核苷(氟尿苷)和5-氟脱氧尿嘧啶核苷一磷酸。
阿糖胞苷(Cytarabine)，4-氨基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2(1H)-嘧啶酮(4-amino-1-β-D-arabinofuranosyl-2(1H)-pyrimidinone)，以CYTOSAR-市售，并且通常称之为Ara-C。认为阿糖胞苷在S-期具有细胞时相特异性，其通过将阿糖胞苷末端掺入到生长的DNA链中而抑制DNA链的延长。阿糖胞苷作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗急性白血病。其它的胞苷类似物包括5-氮杂胞苷和2',2'-二氟脱氧胞苷(吉西他滨)。阿糖胞苷引起白细胞减少症、血小板减少症和粘膜炎。
巯基嘌呤，1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮一水合物(1,7-dihydro-6H-purine-6-thione monohydrate)，以嘌呤市售。巯基嘌呤在S-期通过至今尚未清楚的机理抑制DNA的合成具有细胞时相特异性。巯基嘌呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗急性白血病。预期骨髓抑制和胃肠粘膜炎是高剂量巯基嘌呤的副作用。可使用的巯基嘌呤类似物是硫唑嘌呤。
硫鸟嘌呤(Thioguanine)，2-氨基-1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮(2-amino-1,7-dihydro-6H-purine-6-thione)，以市售。硫鸟嘌呤在S-期通过至今尚未清楚的机理抑制DNA的合成具有细胞时相特异性。硫鸟嘌呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗急性白血病。骨髓抑制，包括白细胞减少症、血小板减少症和贫血是给药硫鸟嘌呤最常见的剂量限制性副作用。然而，还发生胃肠副作用，而且该副作用可能是剂量限制性的。其它的嘌呤类似物包括喷司他丁、赤式羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨。
吉西他滨(Gemcitabine)，2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷一盐酸盐(β-异构体)，以市售。吉西他滨通过阻断细胞通过G1/S边界的发展在S-期具有细胞时相特异性。吉西他滨可与顺铂组合，用于治疗局部的晚期非小细胞肺癌，也可以单独地用于治疗局部的晚期胰腺癌。骨髓抑制(包括白细胞减少症、血小板减少症和贫血)是给药吉西他滨最常见的剂量限制性副作用。
甲氨蝶呤，N-[4[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，以甲氨蝶呤钠市售。甲氨蝶呤在S-期具有细胞时相特异性作用，其通过抑制合成嘌呤核苷酸和胸苷酸所需的脱氢叶酸还原酶来抑制DNA的合成、修复和/或复制。甲氨蝶呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗绒毛膜癌、脑膜白血病、非霍奇金淋巴瘤，以及乳腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌和膀胱癌。预期骨髓抑制(白细胞减少症、血小板减少症和贫血)和粘膜炎是给药甲氨蝶呤的副作用。
喜树碱(Camptothecins)，包括喜树碱和喜树碱衍生物，其可作为拓扑异构酶I抑制剂来使用或开发。认为喜树碱细胞毒素活性与其拓扑异构酶I抑制活性相关。喜树碱的实例包括但不限于伊立替康、托泊替康，以及下述7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基-20-喜树碱的各种旋光体。
盐酸伊立替康(Irinotecan HCl)，(4S)-4,11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶子基哌啶子基)羰基氧基]-1H-吡喃并[3',4',6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮盐酸盐，以注射溶液市售。
伊立替康(Irinotecan)是喜树碱的衍生物，其与其活性代谢物SN-38一起结合在拓扑异构酶I-DNA复合物上。认为由于双链不可修复的(irreparable)断裂，导致出现细胞毒性，所述断裂是由拓扑异构酶I：DNA：伊立替康或SN-38三元复合物与复制酶之间的相互作用引起的。伊立替康可用于治疗结肠或直肠的转移癌。盐酸伊立替康的剂量限制性副作用是骨髓抑制，包括嗜中性白细胞减少症，以及包括腹泻的GI效应。
盐酸托泊替康(Topotecan HCl)，(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3',4',6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮一盐酸盐((S)-10-[(dimethylamino)methyl]-4-ethyl-4,9-dihydroxy-1H-pyrano[3’,4’,6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-3,14-(4H,12H)-dione monohydrochloride)，以注射溶液市售。托泊替康是喜树碱的衍生物，其与拓扑异构酶I-DNA复合物结合，并阻止单链断裂的再连接，所述单链断裂是拓扑异构酶I响应DNA分子的扭转张力(torsional strain)所引起的。托泊替康用于卵巢转移癌和小细胞肺癌的二线治疗。盐酸托泊替康的剂量限制性副作用是骨髓抑制，主要是嗜中性白细胞减少症。
本文提供了治疗或预防自身免疫性和炎性病症和疾病的方法，所述病症和疾病可通过抑制EZH1和/或EZH2而改善，从而，例如，调节甲基化活化和甲基化抑制的靶基因的表达水平或调节信号蛋白的活性。一种方法可以包括向人，例如有此需要的人给药治疗有效量的本文所述药剂。
炎症代表针对创伤的一组血管、细胞和神经系统反应。炎症可以表征为炎性细胞如单核细胞、嗜中性粒细胞和粒细胞进入组织的运动。这通常与减少的内皮屏障功能和水肿进入组织有关。炎症可分为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的初始反应，并且是通过血浆和白细胞从血液向损伤组织的运动增加而实现的。生物化学事件的级联传播和使炎症反应成熟，涉及局部血管系统、免疫系统和损伤组织内的各种细胞。被称为慢性炎症的长期炎症导致存在于炎症部位的细胞类型的逐渐变化，且其特征在于炎症过程中组织的同时破坏和愈合。
当发生作为对感染的免疫应答的一部分或作为对创伤的急性反应时，炎症可以是有益的并且通常是自限性的。然而，炎症在不同条件下可能是有害的。这包括响应于感染因子产生过度炎症，其可导致显著的器官损伤和死亡(例如，在败血症的情况中)。此外，慢性炎症通常是有害的，并且是许多慢性疾病的根源，对组织造成严重的和不可逆的损害。在这种情况下，免疫应答通常针对自身组织(自身免疫)，尽管对外来实体的慢性反应也可能导致对自身组织的旁观者损伤(bystander damage)。
因此，抗炎治疗的目的是减少这种炎症，当存在时抑制自身免疫并允许生理过程或愈合和组织修复进展。
这些药剂可用于治疗身体的任何组织和器官的炎症，包括肌肉骨骼炎症、血管炎症、神经炎症、消化系统炎症、眼部炎症、生殖系统的炎症和其它炎症，如下所示。
肌肉骨骼炎症是指肌肉骨骼系统的任何炎症病症，特别是影响骨骼关节，包括手、手腕、肘部、肩部、颌、脊柱、颈部、髋部、膝盖、脚踝和脚部的关节的那些病症以及影响连接肌肉与骨骼的组织(例如腱)的病症。可用本发明化合物治疗的肌肉骨骼炎症的实例包括关节炎(包括例如，骨关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、急性和慢性感染性关节炎、与痛风和假性关节炎相关的关节炎和幼年特发性关节炎)、肌腱炎、滑膜炎、腱鞘炎、滑囊炎、纤维组织炎(纤维肌痛)、上髁炎、肌炎和骨炎(包括，例如，佩吉特氏病、耻骨骨炎和纤维性骨炎)。
眼部炎症是指眼睛任何结构的炎症，包括眼睑。可以在本发明中治疗的眼部炎症的实例包括眼睑炎、眼睑皮肤松弛症、结膜炎、泪腺炎、角膜炎、干燥性角结膜炎(干眼症)、巩膜炎、倒睫症和葡萄膜炎。
可以在本发明中治疗的神经系统的炎症的实例包括脑炎、格-巴二氏综合征、脑膜炎、神经性肌强直、发作性睡病、多发性硬化、脊髓炎和精神分裂症。
可在本发明中治疗的脉管系统或淋巴系统炎症的实例包括关节硬化、关节炎、静脉炎、血管炎和淋巴管炎。
可在本发明中治疗的消化系统的炎性病症的实例包括胆管炎、胆囊炎、肠炎、小肠结肠炎、胃炎、胃肠炎、回肠炎和直肠炎。
可以在本发明中治疗的生殖系统的炎性病症的实例包括宫颈炎、绒毛膜羊膜炎、子宫内膜炎、附睾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、尿道炎、阴道炎、外阴炎和外阴痛。
所述药剂可用于治疗具有炎性成分的自身免疫病症。这些病症包括急性播散性脱发、贝赫切特病、查加斯病、慢性疲劳综合征、自主神经机能异常、脑脊髓炎、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、化脓性汗腺炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、乳糜泻、克罗恩病、1型糖尿病、巨细胞动脉炎、肺出血肾炎综合征、格雷夫病、格-巴二氏综合征、桥本病、过敏性紫癜、川崎病、红斑狼疮、微观结肠炎、微观多动脉炎、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、眼肌阵挛综合征、视神经炎、Ord’s甲状腺炎、天疱疮、结节性多动脉炎、多肌痛、赖特综合征、干燥综合征、颞动脉炎、韦格纳肉芽肿病、温热自身免疫性溶血性贫血、间质性膀胱炎、莱姆病、硬斑病、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎和白癜风。
所述药剂可用于治疗具有炎性成分的T细胞介导的超敏反应性疾病。这些病症包括接触性超敏反应、接触性皮炎(包括由有毒常春藤引起的)、荨麻疹、皮肤过敏、呼吸道过敏(花粉症、过敏性鼻炎)和麸质敏感性肠病(乳糜泻)。
可在本发明中治疗的其它炎性病症包括例如，阑尾炎、皮炎、皮肌炎、心内膜炎、纤维组织炎、牙龈炎、舌炎、肝炎、化脓性汗腺炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、心肌炎、肾炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽头炎、胸膜炎、肺炎、前列腺炎、肾盂肾炎和口内炎、移植排斥反应(涉及肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺(如胰岛细胞)、骨髓、角膜、小肠、皮肤同种异体移植物、皮肤同种移植物和心脏瓣膜异种移植物、血清病(sewrum sickness)和移植物抗宿主病)、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性呼吸窘迫综合征、Sexary综合征、先天性肾上腺增生、非化脓性甲状腺炎、与癌症相关的高钙血症、天疱疮、大疱性疱疹性皮炎、严重多形红斑、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、季节性或常年性变应性鼻炎、支气管哮喘、接触性皮炎、异位性皮炎、药物超敏反应、变应性结膜炎、角膜炎、眼部带状疱疹、虹膜炎和虹膜睫状体炎、脉络膜视网膜炎、视神经炎、症状性结节病、暴发性或播散性肺结核化疗、成人特发性血小板减少性紫癜、成人继发性血小板减少症、获得性(自身免疫性)溶血性贫血、成人白血病和淋巴瘤、儿童的急性白血病、局限性肠炎、自身免疫性血管炎、多发性硬化、慢性阻塞性肺疾病、实体器官移植排斥、败血症。
优选的治疗包括移植排斥、牛皮癣关节炎、多发性硬化、1型糖尿病、哮喘、系统性红斑狼疮、慢性肺疾病和伴随感染的传染性疾病(例如败血症)的治疗中的任一种。
药物组合物可按照每单位剂量含有预定量的活性成分的单位剂量形式存在。该单位依据所治疗的疾病、给药途径和患者的年龄、体重和状况，可含有，例如，0.5mg-1g，优选1mg-700mg，更优选5mg-100mg的式(I)化合物，或药物组合物可按照每单位剂量含有预定量的活性成分的单位剂量形式存在。优选的单位剂量组合物是含有如上文所述的活性成分的日剂量或亚剂量或其适当分数的那些。此外，该药物组合物可通过药学领域熟知的任意方法制备。
药物组合物可适于任意合适的途径的施用，例如，口服(包括口腔或舌下)、直肠、鼻、局部(包括口腔、舌下或经皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内或真皮内)途径。该组合物可通过药物领域已知的任意方法制备，例如，通过将式(I)化合物与一种或多种载体或赋形剂组合。
适用于口服给药的药物组合物可为离散单位，例如片剂或胶囊；粉剂或颗粒；水性或非水液体中的溶液或混悬液；食用泡沫或搅打剂；水包油的液体乳液或油包水的液体乳液。
胶囊是通过以下制备的：按上述制备粉末混合物并填充到成形的明胶鞘中。可在填充操作前，将助流剂和润滑剂，例如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、固体聚乙二醇加至该粉末混合物中。还可加入崩解剂或增溶剂，例如琼脂、碳酸钙或碳酸钠，使得当该胶囊被摄取时提高药物的可用性。
此外，当需要或必要时，还可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入到该混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶)、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。在这些剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括，但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂是通过如下制备的，例如，制备粉末混合物、制粒或预压(slugging)、添加润滑剂和崩解剂并压制成片。粉末混合物是通过以下制备的，将适当粉碎的化合物与上述稀释剂或碱混合，并任选地，与粘合剂(例如羧甲基纤维素和藻酸盐)、明胶或聚乙烯吡咯烷酮、溶液延迟剂(例如石蜡)、再吸收加速剂(例如季盐)和/或吸收剂(例如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合。用片剂成形模，通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油可将该粉末混合物制粒。然后将该润滑的混合物压制成片。本发明化合物还可与自由流动的惰性载体组合且无需进行制粒或预压步骤而直接压制成片。可提供由虫胶隔离层、糖或聚合材料的包衣和蜡的抛光包衣组成的澄清或不透明的保护包衣。可将染料加至这些包衣以区分不同的剂量。
口服流体(例如溶液、糖浆和酏剂)可以单位剂量形式制备，使得给定量含有预定量的式(I)化合物。糖浆可通过将该化合物溶于适当矫味的水溶液中进行制备，而酏剂通过使用无毒醇媒介物制备。混悬液可通过将该化合物分散于无毒媒介物中进行配制。还可加入增溶剂和乳化剂(例如乙氧基化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐剂、矫味添加剂(例如薄荷油)、天然甜味剂、糖精或其他人造甜味剂等。
当适当时，可对用于口服给药的剂量单位制剂进行微囊化。也可例如通过将颗粒物质包衣或包埋到聚合物、蜡等中来制备制剂以延长或维持释放。
适用于直肠给药的药物组合物可以栓剂或灌肠剂存在。
适用于阴道给药的药物组合物可以阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂存在。
适用于胃肠外给药的药物制剂包括水性和非水无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使得该组合物与预期接受者的血液等渗；和水性和非水无菌混悬液，其可包含悬浮剂和增稠剂。该药物组合物可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密闭的安瓿和小瓶且可储存于冷冻干燥的(冻干的)条件下，其仅需在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和混悬液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
应理解，除了上面特别提及的成分，该药物组合物可根据所探讨的制剂类型包含本领域常用的其他试剂，例如适用于口服给药的那些可包含矫味剂。
本发明化合物的治疗有效量将取决于许多因素，包括，例如，预期接受者的年龄和体重、需要治疗的精确病症和其严重性、该制剂的性质和给药途径且最终由开处方人员慎重决定。但是，治疗贫血的式(I)化合物的有效量的通常范围是每天0.001-100mg/kg接受者体重，适当地范围为每天0.1-10mg/kg体重。对于70kg成年哺乳动物，每天的实际量将适当地为7-700mg且该量可以每日单一剂量给予或以每天若干(例如2、3、4、5或6个)亚剂量给予，使得总的剂量相同。有效量的盐或溶剂合物等可按式(I)化合物本身有效量的比例来确定。预期类似的剂量将适用于治疗上述其他病症。
定义
术语以其被接受的含义使用。以下定义旨在阐明，而非限制所定义的术语。
本文所用术语“烷基”表示具有指定碳原子数的饱和、直链或支链烃部分。术语“(C1-C6)烷基”是指含有1-6个碳原子的烷基。示例性的烷基包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。
当术语“烷基”与其他取代基组合使用时，例如“卤代(C1-C4)烷基”，术语“烷基”旨在涵盖二价直链或支链烃基，其中连接点通过烷基部分。术语“卤代(C1-C4)烷基”旨在表示在含有1-4个碳原子的烷基基团的1个或多个碳原子上具有1个或多个可相同或不同的卤素原子的基团，其可以是直链或支链碳基。在本发明中所用的“卤代(C1-C4)烷基”的实例包括，但不限于，-CF3(三氟甲基)、-CCl3(三氯甲基)、1,1-二氟乙基、2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基和六氟异丙基。
术语“卤素”和“卤”表示氯、氟、溴或碘取代基。“羟基”旨在表示基团-OH。
本文所用术语“任选地”是指随后描述的事件可能发生或不发生，且包括发生的事件和不发生的事件二者。
本文所用术语“治疗”是指在先前患有或确诊的患者或受试者中，减轻具体病症、消除或减少该病症的一种或多种症状、减缓或消除该病症的进展和预防或延迟该病症的复发。
本文所用术语“有效量”是指由例如研究人员或临床医师所探索的将引起组织、系统、动物或人的生物学或医学响应的药物或药剂的量。
术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应受试者相比，引起疾病、障碍或副作用的改进的治疗、治愈或改善，或降低疾病或障碍进展速度的任意量。术语在其范围内还包括提高正常生理功能的有效量。对于在疗法中的用途，治疗有效量的式(I)化合物及其盐可以化学原料施用。此外，所述活性成分可以药物组合物存在。
化合物的制备
缩写
AcOH 乙酸
Boc 叔丁氧基羰基
Boc2O 二碳酸二叔丁酯
CH3CN 乙腈
CH3NO2 硝基甲烷
Cs2CO3 碳酸铯
DCM 二氯甲烷
DIBAL-H 二异丁基氢化铝
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
EDC N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐
ES 电喷射
Et3N 三乙胺
EtOAc 乙酸乙酯
EtOCOCl 氯甲酸乙酯
EtOH 乙醇
h 小时
H2 氢气
HCl 盐酸
H2O 水
H2SO4 硫酸
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
In(OTf)3 三氟甲磺酸铟(III)
K2CO3 碳酸钾
KOAc 乙酸钾
KOtBu 叔丁醇钾
LCMS 液相色谱质谱
LiBH4 硼氢化锂
LiClO4 高氯酸锂
MeOH 甲醇
MgSO4 硫酸镁
min 分钟
MS 质谱
NaBH4 硼氢化钠
NaBH3CN 氰基硼氢化钠
NaBH(OAc)3 三乙酰氧基硼氢化钠
Na2CO3 碳酸钠
NaHCO3 碳酸氢钠
NaHMDS 二(三甲基甲硅烷基)氨基钠
Na2HPO4 磷酸氢二钠
NaNO2 亚硝酸钠
NaOH 氢氧化钠
Na2SO4 硫酸钠
NBS N-溴琥珀酰亚胺
NH4Cl 氯化铵
NH4OAc 醋酸铵
NH4OH 氢氧化铵
NMM N-甲基吗啉
2-NTf2-吡啶 1,1,1-三氟-N-(吡啶-2-基)-N-((三氟甲基)磺酰基)甲磺酰
胺
Pd/C 钯/炭
PdCl2(dppf) [1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)钯(0)
PhH 苯
P2O5 五氧化二磷
POCl3 磷酰氯
pyr 吡啶
RT 室温
SOCl2 亚硫酰氯
TFA 三氟乙酸
Tf2O 三氟甲磺酸酐
THF 四氢呋喃
TiCl4 四氯化钛(IV)
TMSCl 三甲基氯硅烷
Ti(OiPr)4 异丙醇钛(IV)
一般性合成方案
本发明化合物可通过各种方法，包括熟知的标准合成方法制备。示例性的一般性合成方法如下所示，然后具体的本发明化合物在工作实施例中进行制备。本领域技术人员将理解，如果本文所描述的取代基对本文所述的合成方法不相容，则该取代基可用对该反应条件稳定的合适的保护基团进行保护。该保护基团可在反应顺序中合适的点进行脱除以提供所需的中间体或目标化合物。在下文所述的全部方案中，根据合成化学的一般原则，在有必要的位置，使用敏感或反应性基团的保护基团。保护基团根据有机合成的标准方法进行处理(T.W.Green和P.G.M.Wuts，(1991)Protecting Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，其保护基团引入本文作为参考)。使用本领域技术人员熟悉的方法，在该化合物合成的合适的阶段将这些基团脱除。方法及反应条件的选择以及它们的执行顺序应与本发明化合物的制备一致。起始材料是市售可得的或使用本领域技术人员已知的方法从市售可得的起始材料制备的。
式(Id)化合物可根据方案1或类似方法制备。适当取代的噻吩-3-甲酸的酯化提供了相应的酯。用适当取代的任何酸酐(或酰氯)进行铟介导的酰化反应得到5-酰基噻吩。与适当取代的酮进行的McMurray偶联得到四取代的烯烃。用适当取代的三氟甲磺酸酯(或烷基卤化物)进行的烷基化或用适当取代的醛进行的还原胺化提供取代的衍生物。酯的皂化，然后将所得甲酸与适当取代的胺偶联，得到式(Id)化合物。
方案1：式(Id)化合物的合成。
所述式(Ic)化合物可根据方案2或类似方法制备。用相应的Weinreb酰胺形成适当取代的酮是由合适的格氏(或烷基锂)试剂完成的。相应的三氟甲磺酸乙烯酯的形成，然后与适当取代的溴代噻吩进行钯介导的偶联，得到三取代的烯烃。烯烃的还原，然后用适当取代的三氟甲磺酸酯(或烷基卤化物)进行烷基化或用适当取代的醛还原胺化，得到取代的衍生物。酯的皂化，然后将所得羧酸与适当取代的胺偶联，得到式(Ic)化合物。
方案2：式(Ic)化合物的合成。
其中R3和R4一起表示-CH2CH2-的式(I)化合物可根据方案3或类似方法制备。适当取代的噻吩甲醛与硝基甲烷的缩合提供了相应的硝基乙烯基噻吩。硝基乙烯基的还原，然后捕获所得胺，产生相应的氨基甲酸乙酯。将所述氨基甲酸乙酯用POCl3/P2O5处理得到内酰胺。用适当取代的酸酐(或酰氯)进行铟介导的酰化反应，得到5-酰基噻吩。用适当取代的胺进行还原胺化或用适当取代的酮进行McMurray偶联，得到精制的噻吩内酰胺。用适当取代的烷基卤化物进行内酰胺氮的烷基化，然后除去苄基保护基，得到式(I)化合物。
方案3：式(I)化合物的合成。
式(Ic2)化合物可根据方案4或类似方法制备。铱介导的硼酸化，然后与适当取代的三氟甲磺酸酯进行Suzuki偶联，得到相应的偶联烯烃。铱介导的所述烯烃的不对称还原，然后除去Boc-保护基团，得到所述哌啶。用适当取代的三氟甲磺酸酯(或烷基卤化物)进行烷基化或用适当取代的醛进行还原胺化，得到取代的衍生物。酯的皂化，然后将所得羧酸与适当取代的胺偶联，得到式(Ic2)化合物。
方案4：式(Ic2)化合物的合成。
实验
以下指引适用于本文所述的全部实验操作。除非另外提及，否则所有反应是在氮正压下，使用烘干的玻璃器具进行的。所指定的温度是外部的(即浴温度)且是近似的。通过注射器转移对空气和湿度敏感的液体。试剂按原样使用。所用的溶剂是那些供应商标注为“无水”的溶剂。溶液试剂所标注的摩尔浓度是近似的且使用前并未相对相应的标准进行滴定。除非另外提及，否则所有的反应是通过搅拌棒进行搅拌的。除非另外提及，否则加热是使用含有硅油的加热浴进行的。反应是使用配有Biotage微波EXP小瓶(0.2–20mL)和隔垫和瓶盖的Biotage InitiatorTM 2.0仪器，用微波辐射(0–400W，2.45GHz)进行的。基于溶剂和离子电荷所使用的辐射水平(即高、正常、低)是基于供应商的说明。使用干冰/丙酮或干冰/2-丙醇将温度冷却至-70℃以下。用作干燥剂的硫酸镁和硫酸钠是无水级别的且可互换使用。被描述为“真空”或“减压下”除去的溶剂是通过旋转蒸发完成的。
制备型正相硅胶色谱是使用以下进行的：配有RediSep或ISCO Gold硅胶柱(4g-330g)的Teledyne ISCO CombiFlash Companion仪器或配有SF25硅胶柱(4g–300g)的Analogix IF280仪器或配有HP硅胶柱(10g–100g)的Biotage SP1仪器。除非另外提及，否则反相HPLC纯化是使用YMC-pack柱(ODS-A 75x30mm)作为固相进行的。除非另外提及，否则使用25mL/minA(CH3CN-0.1％TFA):B(水-0.1％TFA)的移动相，10-80％梯度A(10min)，在214nM处进行UV检测。
PE Sciex API 150单四极质谱仪(PE Sciex，Thornhill，Ontario，Canada)是阳离子检测模式下，使用电喷雾电离进行操作。该雾化气体产生自零空气发生器(BalstonInc.，Haverhill，MA，USA)并在65psi递送，而所述气帘气(curtain gas)是从Dewar液氮容器中递送的在50psi的高纯氮。施加到电喷雾针上的电压是4.8kV。室口(orifice)设定在25V且质谱仪以0.5扫描/秒的速率进行扫描，其使用0.2amu的步幅质量并收集分布数据。
方法A，LCMS。使用配有hamilton 10uL注射器(其执行向Valco 10通进样阀的注入)的CTC PAL自动采样器(LEAP Technologies，Carrboro，NC)，将样品送入该质谱仪。所述HPLC泵是LC-10ADvp(Shimadzu Scientific Instruments，Columbia，MD)，其以0.3mL/min和线性梯度4.5％A至90％B操作3.2分钟，保持0.4分钟。流动相由容器A中的100％(H2O 0.02％TFA)和容器B中的100％(CH3CN 0.018％TFA)组成。固定相是Aquasil(C18)且柱尺寸为1mm x 40mm。检测是由214nm处的UV、蒸发光散射(ELSD)和MS进行的。
方法B，LCMS。或者，使用具有LC/MS的Agilent 1100分析型HPLC系统并在1mL/min和线性梯度5％A至100％B操作2.2min，保持0.4min。流动相由容器A中的100％(H2O 0.02％TFA)和容器B中的100％(CH3CN0.018％TFA)组成。固定相是具有3.5um颗粒尺寸的Zobax(C8)且柱尺寸为2.1mm x 50mm。检测是由214nm处的UV、蒸发光散射(ELSD)和MS进行的。
方法C，LCMS。或者，使用配有毛细管柱(50×4.6mm，5μm)的MDSSCIEX API 2000。HPLC是在配有柱Zorbax SB-C18(50×4.6mm，1.8μm)的Agilent-1200系列UPLC系统上进行的，其用CH3CN:NH4OAc缓冲液进行洗脱。该反应是在微波(CEM，Discover)中进行的。
1H-NMR谱在400MHz进行记录，其使用Bruker AVANCE 400MHz仪器，配有ACD Spectmanager v.10用于再处理。所指代的多重性为：s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，sxt＝六重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰等和br表示宽信号。除非另外提及，否则所有NMR是在DMSO-d6中进行。
分析型HPLC：产物用以下进行分析，Agilent 1100分析型色谱系统，具有4.5x75mm Zorbax XDB-C18柱(3.5um)，梯度从5％CH3CN(0.1％甲酸)至95％CH3CN(0.1％甲酸)的H2O溶液(0.1％甲酸)以2mL/min进行4min，和保持1min。
中间体
中间体1
a)2-(苄基氧基)-4,6-二甲基烟腈
将2-羟基-4,6-二甲基烟腈(5g，33.7mmol)在甲苯(50mL)中的溶液用苄基氯(4.70mL，40.5mmol)和氧化银(8.60g，37.1mmol)处理，然后在110℃搅拌过夜。将该反应通过过滤并将固体用DCM(2x 100mL)洗涤。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，通过Na2SO4过滤并真空浓缩，得到残余物。将该残余物在真空下，使用20-30％DCM的石油醚溶液，通过二氧化硅填料纯化。将所需级分合并并浓缩，得到2-(苄基氧基)-4,6-二甲基烟腈(9g，35.9mmol，106％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.47-7.56(m，2H)，7.31-7.43(m，3H)，6.72(s，1H)，5.51(s，2H)，2.48(d，J＝3.03Hz，6H)。MS(ES)[M+H]+239.0。
b)2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛
在惰性气氛下，通过注射器向2-(苄基氧基)-4,6-二甲基烟腈(9g，35.9mmol)在DCM(100mL)中的冷却(冰浴)溶液中缓慢加入1M DIBAL-H在甲苯(43.1mL，43.1mmol)中的溶液。将该反应在0℃搅拌20min，此时除去冰浴并将该反应在室温搅拌过夜。LCMS显示约14％的起始原料剩余。加入另一部分的1M DIBAL-H的甲苯溶液(10.76mL，10.76mmol)并将该反应在室温继续搅拌。LCMS指示该反应完成。将该反应冷却(冰浴)并用1N HCl(50mL)淬灭。**注意放热。将该反应搅拌30min直到铝盐自由流动。将该反应用2.5N NaOH(约15mL，约pH7.5)中和。将该两相混合物过滤并将滤液用DCM(100mL，2X)洗涤。分离各层并将水相用DCM(100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，通过Na2SO4过滤并真空浓缩。将该残余物用快速色谱纯化(柱：80克二氧化硅。洗脱液：0-5％EtOAc的庚烷溶液。梯度：15min)。将所需级分合并并真空浓缩，得到2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(3.5g，14.36mmol，40.0％产率)，其为蓬松的白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.58(s，1H)，7.49(d，J＝7.07Hz，2H)，7.31-7.44(m，3H)，6.67(s，1H)，5.54(s，2H)，2.59(s，3H)，2.50(s，3H)。MS(ES)[M+H]+242.1，[M+Na]+264.0。
c)(2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲醇
将2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(3.46g，14.34mmol)在MeOH(100mL)中的混悬液保持在惰性气氛下并在冰浴中冷却至0℃。向该搅拌的混悬液中分两次加入NaBH4(0.651g，17.21mmol)。在加入第一批NaBH4后，将该混悬液倒至溶液中。将该反应在0℃搅拌10min，此时除去冰浴并将该反应在室温搅拌过夜。将该反应溶剂真空除去，然后将剩余的白色固体残余物分配于饱和NaHCO3(60mL)和EtOAc(125mL)之间。将水层用EtOAc(125mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，通过Na2SO4过滤并真空浓缩，得到(2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲醇(3.5g，14.39mmol，100％产率)，其为无色半透明油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.44-7.53(m，2H)，7.30-7.43(m，3H)，6.63(s，1H)，5.46(s，2H)，4.72(s，2H)，2.43(s，3H)，2.35(s，3H)，2.25(br.s.，1H)。MS(ES)[M+H]+244.1。
d)2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶
将(2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲醇(3.5g，14.39mmol)在DCM(70mL)中的混悬液保持在惰性气氛下并在干冰/CH3CN浴冷却至-40℃持续30min。向该冷却溶液中一次性加入2M SOCl2的DCM溶液(10.79mL，21.58mmol)并将该反应在-40℃继续搅拌。1h后，LCMS显示5％起始原料剩余。加入额外的2M SOCl2的DCM溶液(1.439mL，2.88mmol)且该反应继续。20min后，将该反应倾倒至冰水中并将pH用饱和NaHCO3(30mL)调节至7-8。将水层用DCM(125mL，2X)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，通过Na2SO4并真空浓缩。将该残余物用快速色谱纯化(柱：80克二氧化硅。洗脱液：0-10％EtOAc/庚烷。梯度：14min)，得到2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(2.84g，10.74mmol，74.7％产率)，其为无色油。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.48-7.57(m，2H)，7.30-7.45(m，3H)，6.64(s，1H)，5.47(s，2H)，4.74(s，2H)，2.43(s，3H)，2.38(s，3H)。MS(ES)[M+H]+262.1。
中间体2
a)4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
在室温氮气下，向3-溴-4-甲基噻吩(20.0g，113mmol)在THF(100mL)中的搅拌溶液中滴加1.3N异丙基氯化镁氯化锂复合物的THF溶液(90mL，117mmol)。将该反应搅拌过夜。将该反应冷却至-78℃并用氯甲酸甲酯(12mL，155mmol)处理。将该反应温热至室温并搅拌1小时。将该反应用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3洗涤，搅拌30min(形成悬浮于水相中的白色混悬液)，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该产物在44-50℃(油浴50-75℃)真空下(4-2mm Hg)进行短程蒸馏(short path distilled)。将主要且较晚洗脱的级分合并，得到产物4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(13.2g，85mmol，74.8％产率)，其为澄清液体。MS(ES)[M+H]+156.8。
b)4-甲基-5-丙酰基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(5.0g，32.0mmol)在CH3NO2(50mL)中的搅拌溶液中加入LiClO4(4.0g，37.6mmol)、丙酸酐(5.87mL，38.4mmol)和In(OTf)3(0.9g，1.601mmol)。将该反应在50℃搅拌2小时。LCMS显示该反应完全。将该反应用水(100mL)稀释，用DCM(2x50mL)萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并真空蒸发至干。将剩余棕色固体用硅胶色谱纯化(IscoRfGold 120g，0-25％EtOAc的己烷溶液)(装载有DCM)。将纯级分合并并蒸发至干。将剩余的淡黄色固体用己烷研磨，过滤和真空干燥，得到产物4-甲基-5-丙酰基噻吩-3-甲酸甲酯(4.60g，21.67mmol，67.7％产率)，其为白色固体。MS(ES)[M+H]+212.9。
中间体3
5-溴-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(12g，77mmol)在DMF(200mL)中的溶液中加入NBS(14.36g，81mmol)。将该反应在室温搅拌过夜。将该混合物倾倒至水中(1.5L)，搅拌1h并过滤。分离5-溴-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(17.5g，70.7mmol，92％产率)，其为白色固体(在真空烘箱中干燥后熔化，在冷藏库储存后固化)。
中间体4
三氟甲磺酸2-氟-2-甲基丙基酯
向2-氟-2-甲基丙-1-醇(1.3g，14.11mmol)、Et3N(2.361mL，16.94mmol)和DMAP(0.121g，0.988mmol)在DCM(8mL)中的冷却(-20℃)溶液中滴加Tf2O(2.86mL，16.94mmol)。将该反应在0℃搅拌2h。将该反应用DCM稀释，用1M柠檬酸水溶液和饱和NaHCO3洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩，得到2.2g的三氟甲磺酸2-氟-2-甲基丙基酯，其为棕色油。
实施例
实施例1
5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亚丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在冰浴中冷却至0℃的氮气下，通过短冷凝器，用注射器向在1L圆底烧瓶中的锌粉(21g，321mmol)和THF(250mL)的搅拌混悬液中加入TiCl4(17mL，155mmol)(有黄色烟雾的剧烈反应)。将该反应用THF(75mL)冲洗，并将所得黑色浆液加热回流(70℃油浴)2h(反应停止搅拌，但在其加热时恢复)。将4-甲基-5-丙酰基噻吩-3-甲酸甲酯(5.0g，23.56mmol)、4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(15.0g，75mmol)和吡啶(20mL，247mmol)在THF(50mL)中的溶液加入并继续加热2天。将该反应冷却至室温，用饱和NH4Cl水溶液(500mL)淬灭并用EtOAc(200mL)萃取。将上层EtOAc相小心地倾倒至硅藻土垫上并过滤。通过用新鲜的EtOAc搅拌深蓝色水性悬浮液并倾析来重复该方案三次(注意：下层深色水性悬浮液不容易过滤并最终堵塞过滤器)。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。
将上述粗制胺盐酸盐溶于DCM中(250mL)并在0℃冰浴中用Et3N(6.0mL，43.0mmol)和Boc2O(9.57mL，41.2mmol)处理。将该反应温热至室温并搅拌1h。将该反应真空浓缩，溶于EtOAc中并用NaHCO3水溶液洗涤(形成大量白色固体)。将固体过滤掉并用EtOAc冲洗。将含有产物的澄清滤液转移到分液漏斗中。除去较低的NaHCO3相并将EtOAc相用1N HCl、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold120g，0-25％EtOAc的己烷溶液)。将纯级分合并并蒸发至干，得到4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亚丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.08g，14.10mmol，59.9％产率)，其为无色油，其在真空下固化成白色固体。该反应重复两次，总共得到12.17g的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.04(s，1H)，3.86(s，3H)，3.51(br.s.，2H)，3.34(br.s.，2H)，2.44(t，J＝5.8Hz，2H)，2.34(br.s.，2H)，2.24(s，3H)，2.01(t，J＝5.8Hz，2H)，1.48(s，9H)，0.94(t，J＝7.6Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+-Boc 280.0，[M+H]+-异丁烯324.1，M+Na+402.1。
b)5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亚丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(12.1g，31.9mmol)中加入HCl的二噁烷溶液(30mL，120mmol)。搅拌30min后，将该反应蒸发至干，得到粗制的胺盐酸盐，其为白色固体泡沫。
在0℃冰浴中，向2,2-二氟丙-1-醇(16.3g，170mmol)和吡啶(16.3mL，202mmol)在CH3CN(250mL)中的搅拌溶液中滴加Tf2O(28mL，166mmol)。将该反应在0℃搅拌30min，然后加入冰块至上述胺盐酸盐和K2CO3(46.8g，339mmol)在CH3CN(100mL)中的浆液中。将该反应用CH3CN(50mL)漂洗。将该反应温热至室温，加热至50℃并搅拌6h。将该反应真空蒸发至干，溶于DCM中，用水，盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 120g，5-15％EtOAc的己烷溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干，得到5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(10.05g，24.74mmol，78％产率)，其为无色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.03(s，1H)，3.86(s，3H)，2.70(t，J＝12.6Hz，4H)，2.57-2.43(m，4H)，2.32(br.s.，2H)，2.25(s，3H)，2.06(br.s.，2H)，1.67(t，J＝18.8Hz，3H)，0.94(t，J＝7.5Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+358.2。
c)5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(10.0g，28.0mmol)在MeOH(150mL)中的搅拌溶液中加入5N NaOH(20mL，100mmol)。将该反应在70℃搅拌4h。将该反应真空浓缩以除去MeOH并用6NHCl(16.7mL)中和至pH约7。形成胶质，将其用DCM萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发成固体泡沫。
向上述物质中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(5.8g，30.7mmol)、HOAt(3.8g，27.9mmol)、DCM(150mL)和NMM(3.4mL，30.9mmol)。将所有固体块用搅拌棒打碎。向该搅拌混悬液中加入EDC游离碱(5.0g，32.2mmol)。将该反应在室温搅拌3h，然后在40℃用连接的回流冷凝器过夜。将该反应真空浓缩。将该浑浊溶液通过硅藻土垫过滤并用少量的DCM冲洗。将澄清滤液浓缩并用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 220g，0-5％EtOH的EtOAc溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干。将所得固体用10％EtOAc/己烷研磨，过滤，用己烷洗涤和真空干燥，得到5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(11.56g，24.20mmol，87％产率)，其为白色固体。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.48(s，1H)，8.01(t，J＝5.1Hz，1H)，7.78(s，1H)，5.86(s，1H)，4.24(d，J＝5.1Hz，2H)，2.71(t，J＝14.1Hz，2H)，2.61(t，J＝4.7Hz，2H)，2.46(br.s.，2H)，2.38(t，J＝5.6Hz，2H)，2.30-2.21(m，2H)，2.18(s，3H)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，1.93(t，J＝5.3Hz，2H)，1.62(t，J＝19.2Hz，3H)，0.86(t，J＝7.5Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+478.3。
实施例2
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯盐酸盐(160mg，0.507mmol)在CH3CN(5mL)中的溶液中加入Cs2CO3(330mg，1.013mmol)和三氟甲磺酸2-氟-2-甲基丙基酯(454mg，2.026mmol)。将该混合物在50℃加热18h。将该反应混合物冷却至室温，用水淬灭并用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机物干燥(Na2SO4)并浓缩。将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-50％EtOAc/己烷)，得到5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(92mg)，其为无色油。MS(ES)[M+H]+354.3。
b)N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(90mg，0.255mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中加入8N NaOH(0.159mL，1.273mmol)。将该混合物在35℃加热18h。将该混合物用6N HCl(0.212mL，1.273mmol)中和，浓缩。
向该残余物在二甲基亚砜(2.000mL)中的溶液中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(62.4mg，0.331mmol)、NMM(0.140mL，1.273mmol)、EDC(98mg，0.509mmol)和HOAt(69.3mg，0.509mmol)。将该混合物在室温搅拌18h。将该混合物用水(10mL)淬灭。将所得沉淀物通过过滤收集，用水洗涤并真空干燥，得到N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(105mg)，其为灰白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.86(t，J＝7.45Hz，3H)，1.28(s，3H)，1.33(s，3H)，1.93(t，J＝5.31Hz，2H)，2.07(s，3H)，2.11(s,3H)，2.18(s，3H)，2.20-2.32(m，2H)，2.34-2.46(m，6H)，4.23(d，J＝5.05Hz，2H)，5.86(s，1H)，7.78(s，1H)，8.01(t，J＝4.93Hz，1H)。MS(ES)[M+H]+474.3.
实施例3
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺
根据实施例2的一般操作，制备N-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.48(s，1H)，8.01(t，J＝4.93Hz，1H)，7.79(s，1H)，5.86(s，1H)，4.24(d，J＝5.05Hz，2H)，3.33(s，2H)，3.18(q，J＝10.27Hz，2H)，2.69(d，J＝5.05Hz，2H)，2.39(t，J＝5.56Hz，2H)，2.26(d，J＝6.82Hz，2H)，2.18(s，3H)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，1.93(t，J＝5.31Hz，2H)，0.87(t，J＝7.45Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+482.3。
实施例4
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)4-丙酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯
在0℃(冰浴)氮气下，向4-(甲氧基(甲基)氨基甲酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.0g，36.7mmol)在THF(100mL)中的搅拌溶液中滴加2N乙基氯化镁在THF(28mL，56.0mmol)。将该反应在0℃搅拌4h，然后用饱和NH4Cl淬灭，用EtOAc萃取，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空蒸发至干。将该粗产物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold220g，0-40％EtOAc的己烷溶液)。(UV阴性，通过H2SO4的EtOH溶液炭化来显现)。将纯级分合并并蒸发至干，得到4-丙酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(8.10g，33.6mmol，91％产率)，其为无色油。MS(ES)[M+H]+-异丁烯-18 167.9，[M+H]+-异丁烯186.0，M+Na+264.1。
b)(Z)-4-(1-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在-78℃(CO2，丙酮)氮气下，向4-丙酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.9g，28.6mmol)在THF(80mL)中的搅拌溶液中滴加1N NaHMDS的THF溶液(31mL，31.0mmol)。将该反应在-78℃搅拌1h。接下来滴加2-NTf2-吡啶(11.4g，31.8mmol)在THF(50mL)中的，历时5min。将该反应在-78℃搅拌1h，然后在0℃搅拌30min。将该反应用水(150mL)淬灭，用EtOAc(2x 150mL)萃取，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该粗产物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 220g，0-20％EtOAc的己烷溶液)。(UV阴性，通过H2SO4的EtOH溶液炭化来显现)。将纯级分合并并蒸发至干，得到(Z)-4-(1-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(9.15g，24.51mmol，86％产率)，其为无色油。MS(ES)[M+H]+-异丁烯318.1。
c)(Z)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(17.39g，68.5mmol)、5-溴-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(7g，29.8mmol)和KOAc(9.64g，98mmol)在1,4-二噁烷(200mL)中的脱气溶液中加入PdCl2(dppf)-DCM加合物(1.216g，1.489mmol)。将该反应混合物在70℃加热过夜，此时将该混悬液通过二氧化硅短垫过滤。向该滤液中加入(E)-4-(1-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.67g，17.86mmol)、水(60mL)和Na2CO3(7.89g，74.4mmol)。将该溶液脱气并加入Pd(PPh3)4(1.720g，1.489mmol)。将该反应混合物在70℃加热1h。将该反应用EtOAc(200mL)稀释并过滤。分离各层并将有机物用盐水洗涤，用Mg2SO4干燥，过滤并蒸发。将该残余物用快速色谱纯化(8％THF:己烷)，得到(Z)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.2g，15.52mmol，52.1％产率)，其为白色固体。MS(ES)[M+H]+402.2(M+Na)
d)4-甲基-5-(1-(哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向(Z)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.2g，16.34mmol)在EtOH(120mL)中的溶液中加入10％Pd/C(Degussa，12g，11.28mmol)。将该反应在氢气氛下(气球)搅拌24h，此时将该混合物通过硅藻土过滤并蒸发。将该残余物溶于二噁烷(10mL)中并加入3M HCl(10mL)。将该反应混合物加热回流10min，然后蒸发。将该残余物分配于EtOAc(100mL)和1M Na2CO3(50mL)之间。分离各层并将有机物用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发，得到4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.6g，8.78mmol，53.7％产率)，其为无色液体。MS(ES)[M+H]+282.2。
e)(S)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯和(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向2,2-二氟丙-1-醇(3.17g，33.0mmol)和吡啶(2.97mL，36.7mmol)在CH3CN(100mL)中的冷却(0℃)溶液中滴加Tf2O(5.70mL，33.8mmol)。将该反应在0℃搅拌30min。向该冷却浆液中加入4-甲基-5-(1-(哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯盐酸盐(2.6g，7.34mmol)和K2CO3(9.13g，66.0mmol)在CH3CN(20mL)中的冷溶液。将该反应温热至室温，然后在50℃加热过夜。将该反应真空蒸发至干，溶于DCM，用水，盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 120g，5％EtOAc:己烷)，得到5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(2.05g，5.42mmol，73.8％产率)，其为黄色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.00(s，1H)，3.85(s，3H)，2.99(d，J＝11.12Hz，1H)，2.86(d，J＝11.12Hz，1H)，2.53-2.75(m，3H)，2.37(s，3H)，2.04-2.27(m，2H)，1.84-2.01(m，2H)，1.62(t，J＝18.69Hz，4H)，1.30-1.47(m，5H)，0.76(t，J＝7.33Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+360.2。
通过手性HPLC(Chiralcel OD-H，5微米，30mm x 250mm，250nm UV，98:2:0.1正庚烷:2-丙醇:异丙胺)拆分外消旋产物。将该拆分的产物用2-丙醇稀释两次并浓缩，然后在真空烘箱中(50℃)干燥，得到：
S-(-)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(870mg)：>99.8％ee，[α]D＝-9.6°(c＝0.50，MeOH，24℃)和
R-(+)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(860mg)：99.74％ee；[α]D＝+8.8°(c＝0.50，MeOH，24℃)。
f)(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(860mg，2.392mmol)在MeOH(10mL)中的溶液中加入3M NaOH(5mL，400mmol)。将该反应混合物搅拌过夜，此时将其用6M HCl中和并蒸发至干。
向该残余物在DMF(10.00mL)中的混悬液中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(542mg，2.87mmol)，然后加入EDC(550mg，2.87mmol)和HOAt(391mg，2.87mmol)。5min后，加入NMM(0.789mL，7.18mmol)并将该溶液在室温搅拌3h。将该反应混合物倾倒至60mL水中并用EtOAc(2x 50mL)萃取。将合并的有机物用水(30mL)，盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将该残余物从20％CH3CN:水中重结晶，得到(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(780mg，1.626mmol，68.0％产率)，其为白色固体(注意：乙基基团的绝对立体化学是根据关于EZH2抑制的R-异构体的已知偏好指定的)。1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ7.60(s，1H)，6.12(s，1H)，4.45(s，2H)，3.01(d，J＝11.62Hz，1H)，2.89(d，J＝11.12Hz，1H)，2.74(ddd，J＝3.79，7.89，11.05Hz，1H)，2.64(t，J＝14.02Hz，2H)，2.37(s，2H)，2.25(d，J＝5.56Hz，6H)，2.18(dt，J＝2.40，11.56Hz，1H)，2.03-2.11(m，1H)，1.86-2.01(m，2H)，1.60(t，J＝18.69Hz，3H)，1.20-1.49(m，5H)，0.76(t，J＝7.33Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+480.3。
实施例5
(S)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
根据实施例4f的操作，制备(S)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺。1HNMR(400MHz，MeOH-d4)δ7.60(s，1H)，6.13(s，1H)，4.45(s，2H)，3.01(d，J＝11.62Hz，1H)，2.89(d，J＝10.61Hz，1H)，2.74(ddd，J＝3.79，7.89，11.05Hz，1H)，2.65(t，J＝14.15Hz，2H)，2.38(s，3H)，2.25(d，J＝6.06Hz，6H)，2.18(dt，J＝2.53，11.62Hz，1H)，2.07(dt，J＝2.53，11.62Hz，1H)，1.87-2.01(m，2H)，1.60(t，J＝18.82Hz，3H)，1.18-1.48(m，5H)，0.76(t，J＝7.20Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+480.3。
实施例6
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
根据实施例4的操作，制备外消旋N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.62-0.76(m，3H)，1.08-2.97(m，24H)，3.26-3.41(m，2H)，4.17-4.31(m，2H)，5.79-5.94(m，1H)，7.68(s，1H)，7.98(t，J＝4.93Hz，1H)。MS(ES)[M+H]+476.3。
实施例7
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亚丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.63mmol)中加入HCl的二噁烷溶液(20mL，658mmol)。搅拌30min后，将该反应真空蒸发至干，得到脱保护的哌啶盐酸盐，其为白色固体泡沫。
向该白色固体在AcOH(10mL)中的溶液中分批滴加NaNO2(0.46g，6.67mmol)在水(2.5mL)中的，历时2h。将该反应通过LCMS监测。2h后，该反应完成91％(N-亚硝基中间体MS(ES)[M+H]+309.2)。向该反应中分批缓慢加入锌粉(1.5g，22.94mmol)。该反应变得温热至可触摸并在冰浴中冷却。在室温搅拌2h后，将该反应通过硅藻土垫过滤以除去锌并用少量的MeOH(15mL)冲洗。向该滤液中加入37重量％的甲醛水溶液(2.0mL，26.9mmol)。向该搅拌混合物中分批加入NaBH(OAc)3(2.3g，10.85mmol)，历时30min。将该反应在室温搅拌过夜。LCMS显示17％所需的二甲基肼。将该反应混合物真空蒸发至干，溶于DCM中，用1N Na2CO3处理并搅拌30min。将该混悬液通过硅藻土垫过滤并用少量的DCM冲洗。将澄清滤液转移至分液漏斗中。将含有产物的较低有机相除去，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，0-8％EtOH的EtOAc溶液)。(用3至5％EtOH从柱中洗脱该产物)。将含有产物的级分合并并蒸发至干，得到5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(200mg，0.360mmol，13.65％产率)，其为淡黄色油。MS(ES)[M+H]+323.2。
b)N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(200mg，0.620mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中加入1N NaOH(4mL，4.00mmol)。将该反应在70℃加热4h。将该反应真空浓缩以除去MeOH并用1NHCl(4.0mL)中和。形成白色固体混悬液。将该混合物真空蒸发，得到粗制甲酸，其为白色固体。
向上述物质中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(150mg，0.795mmol)、HOAt(84mg，0.62mmol)、DCM(20mL)和NMM(90μL，0.819mmol)。将该固体块用搅拌棒弄碎。向搅拌的混悬液中加入EDC游离碱(130mg，0.837mmol)。将该反应在室温搅拌2h，然后在连有回流冷凝器的情况下在40℃搅拌4h。将该浑浊溶液通过硅藻土垫过滤并用少量的DCM冲洗。将澄清滤液浓缩并用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，2-10％(5％NH4OH/MeOH)的DCM溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干。将该残余物通过硅胶色谱再纯化(IscoRf Gold 40g，15-40％EtOH的EtOAc溶液)。将纯级分合并，真空浓缩，用己烷研磨，过滤，用己烷洗涤和真空干燥，得到N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(144mg，0.325mmol，52.5％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.49(s，1H)，8.02(t，J＝5.1Hz，1H)，7.78(s，1H)，5.86(s，1H)，4.24(d，J＝5.1Hz，2H)，2.61(br.s.，2H)，2.45(br.s.，2H)，2.40(t，J＝5.4Hz，3H)，2.26(br.s.，2H)2.25(s，6H)，2.18(s，3H)，2.11(s，3H)，2.06(s，3H)，1.94(t，J＝5.4Hz，2H)，0.86(t，J＝7.5Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+443.3。
实施例8
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羟基哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)5-(1-(1-(苯甲酰基氧基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亚丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.63mmol)中加入HCl的二噁烷溶液(20mL，658mmol)。将该反应在室温搅拌30min，然后真空蒸发至干，得到胺盐酸盐，其为白色固体泡沫。向上述的THF溶液(20mL)中加入Na2HPO4(2.5g，17.61mmol)。将该反应搅拌并用过氧苯甲酰(1.0g，4.13mmol)分批处理，历时30min。在室温搅拌2h后，LCMS未见任何变化。将该反应在50℃搅拌过夜。LCMS显示大部分为所需产物。将该反应冷却至室温，真空蒸发至干，溶于EtOAc中，用1NNa2CO3，盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 80g，10-40％EtOAc的己烷溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干，得到5-(1-(1-(苯甲酰基氧基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.64g，1.602mmol，60.8％产率)，其为白色泡沫。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.06(s，1H)，8.04-8.01(m，2H)，7.62-7.56(m，1H)，7.50-7.43(m，2H)，3.87(s，3H)，3.61(br.s.，1H)，3.42(br.s.，1H)，3.02(br.s.，1H)，2.85(br.s.，2H)，2.60(br.s.，1H)，2.38(br.s.，4H)，2.30(br.s.，3H)，0.97(t，J＝7.5Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+400.2。
b)N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羟基哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向5-(1-(1-(苯甲酰基氧基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.64g，1.602mmol)在MeOH(25mL)中的搅拌溶液中加入5N NaOH(2.0mL，10.00mmol)。将该反应在70℃加热16h。将该反应真空浓缩以除去MeOH，然后用6N HCl(1.7mL)中和。形成白色固体混悬液。将该混合物真空蒸发，得到粗制去苯甲酰化的甲酸，其为灰白色固体，其被苯甲酸污染。
向上述物质中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(0.604g，3.20mmol)、DCM(40mL)和NMM(0.352mL，3.20mmol)。将该固体块用搅拌棒弄碎。向搅拌的混悬液中加入EDC游离碱(0.547g，3.52mmol)。将该反应在室温搅拌2h，然后在40℃加热4h。LCMS显示所需产物，其为O-苯甲酰化衍生物(注意：反应混合物中存在的苯甲酸导致重新苯甲酰化)和其他杂质。将该浑浊溶液通过硅藻土垫过滤并用少量的DCM冲洗。将澄清滤液浓缩并用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，0-10％EtOH的EtOAc溶液)。将含有O-苯甲酰化产物的级分合并并蒸发至干。将该残余物溶于MeOH(25mL)中并用5N NaOH(1.5mL)处理。将该反应在70℃加热过夜。将该反应用6N HCl(1.3mL)中和并真空蒸发至干。将该残余物溶于DCM中，用NaHCO3水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，10-20％EtOH的EtOAc溶液)，得到N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羟基哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(251mg，0.604mmol，37.7％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.49(br.s.，1H)，8.02(t，J＝5.1Hz，1H)，7.97(s，1H)，7.79(s，1H)，5.87(s，1H)，4.24(d，J＝4.8Hz，2H)，3.16(br.s.，1H)，2.98(br.s.，1H)，2.73-2.66(m，1H)，2.42-2.32(m，1H)，2.31-2.17(m，2H)，2.18(s，3H)，2.11(s，3H)，2.07(br.s.，3H)，2.02(br.s.，1H)，1.92(br.s.，1H)，0.86(t，J＝7.5Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+416.2。
实施例9
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
a)(Z)-4-甲基-2-(2-硝基乙烯基)噻吩
将4-甲基噻吩-2-甲醛(10.0g，79.3mmol)、CH3NO2(100mL)和NH4OAc(1.1g，14.27mmol)的溶液在100℃加热4h。将该反应冷却至室温并真空浓缩。将该残余物溶于EtOAc中，用1N HCl、NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 120g，0-15％EtOAc的己烷溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干，得到(Z)-4-甲基-2-(2-硝基乙烯基)噻吩(9.63g，56.91mmol，71.8％产率)，其为黄色油(在真空下固化)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.10(d，J＝13.4Hz，1H)，7.47(d，J＝13.4Hz，1H)，7.27(s，1H)，7.17(s，1H)，2.31(d，J＝0.8Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+170.0。
b)(2-(4-甲基噻吩-2-基)乙基)氨基甲酸乙酯
在氮气下，向2N LiBH4溶液(120mL，240mmol)中滴加TMSCl(60mL，473mmol)，历时10min。该反应变成白色混悬液。搅拌15min后，缓慢滴加(Z)-4-甲基-2-(2-硝基乙烯基)噻吩(9.60g，56.74mmol)在THF(50mL)中的溶液，历时约20min。观察到剧烈的冒泡。该反应变得微热至可触摸，然后在冰浴中冷却，同时定时加冰。将该反应在室温搅拌4h，然后温热至50℃并搅拌过夜。将该反应在冰浴中冷却并小心地用MeOH(200mL)淬灭。搅拌1h后，将该反应真空浓缩，得到粗制2-氨基乙基-4-甲基噻吩。MS(ES)[M+H]+142.1。
向粗制的2-氨基乙基-4-甲基噻吩在DCM(200mL)和水(100mL)中的冷却(0℃)溶液中缓慢滴加Na2CO3(25g，235.9mmol)和EtOCOCl(0.710mL，7.39mmol)。将所得混合物温热至室温并搅拌1h。将该反应通过硅藻土垫过滤并将澄清滤液转移到分液漏斗中。将较低的有机相除去，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRfGold 120g，10-30％EtOAc的己烷溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干，得到(2-(4-甲基噻吩-2-基)乙基)氨基甲酸乙酯(9.29g，43.55mmol，76.7％产率)，其为无色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.74(s，1H)，6.66(s，1H)，4.80(br.s.，1H)，4.14(q，J＝6.9Hz，2H)，3.46(q，J＝6.3Hz，2H)，2.98(t，J＝6.6Hz，2H)，2.24(d，J＝0.8Hz，3H)，1.26(t，J＝7.1Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+214.1。
c)3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向(2-(4-甲基噻吩-2-基)乙基)氨基甲酸乙酯(9.20g，43.13mmol)中加入POCl3(100mL，107mmol)和P2O5(14g，98.6mmol)。将该混合物加热回流3h(该混合物暂时地形成胶状沉淀物，其最终通过加热溶解)。将该深色反应混合物冷却至室温并真空蒸发至干。将该残余物小心地用冰淬灭，用Na2CO3水溶液碱化，用DCM萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 80g，30-80％EtOAc的己烷溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干，用己烷研磨，过滤和真空干燥，得到3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(2.22g,13.27mmol，30.78％产率)，其为灰白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.72(m，1H)，5.75(br.s.，1H)，3.62(t，J＝6.2Hz，2H)，3.05(t，J＝6.7Hz，2H)，2.50(d，J＝1.3Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+168.0。
d)3-甲基-2-丙酰基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(1.6g，9.57mmol)在CH3NO2(50mL)中的溶液中加入LiClO4(1.23mg，11.57mmol)、丙酸酐(3.08mL，20.12mmol)和In(OTf)3(308mg，0.547mmol)。将该反应在70℃加热4h。将该反应冷却至室温，用水(200mL)稀释，用DCM(100mL)萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并真空蒸发至干。将该残余物溶于MeOH(200mL)中。向该混合物中加入K2CO3(10.0g，72.4mmol)。将该反应在60℃加热过夜。将该反应蒸发至干，用1N HCl(150mL)酸化，用DCM萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 80g，20-50％EtOAc的DCM溶液)(装载在大量的DCM中)。将纯级分合并，蒸发至干，用己烷研磨，过滤和真空干燥，得到3-甲基-2-丙酰基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(210 1.59g，7.12mmol，74.4％产率)，其为亮黄色固体。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ5.97(br.s.，1H)，3.63(t，J＝6.6Hz，2H)，3.08(t，J＝6.7Hz，2H)，2.88(s，3H)，2.87(q，J＝7.3Hz，2H)，1.23(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+224.1。
e)2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向3-甲基-2-丙酰基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(280mg，1.254mmol)和N,N-二甲基哌啶-4-胺(325mg，2.53mmol)中加入Ti(OiPr)4(0.80mL，2.73mmol)和苯(3mL)。将该反应在80℃搅拌18h。将该反应用MeOH(3mL)稀释，然后分两批加入NaBH3CN(315mg，5.02mmol)，历时2h。将该反应在60℃加热并再搅拌2h。将该反应真空蒸发至干，溶于(9:1)DCM/MeOH(15mL)中并用1N Na2CO3(10mL)处理。将所得混悬液搅拌30min。将该混悬液通过硅藻土垫过滤(缓慢地)并用(9:1)DCM/MeOH(5mL)漂洗。将澄清滤液转移至分液漏斗中。将较低的有机相除去，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，5-20％(5％NH4OH/MeOH)的DCM溶液)。将纯级分合并并蒸发至干，得到2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(360mg，1.019mmol，81％产率)，其为无色油。(在真空下固化成白色固体泡沫)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.59(br.s.，1H)，3.69(dd，J＝4.7，9.5Hz，1H)，3.59(dt，J＝2.8，6.8Hz，2H)，3.18-3.07(m，1H)，3.01(t，J＝6.8Hz，2H)，2.97-2.93(m，1H)，2.44(s，3H)，2.29(s，6H)，2.17-1.88(m，4H)，1.88-1.72(m，2H)，1.70-1.39(m，3H)，0.81(t，J＝7.3Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+336.3。
f)5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
在氮气氛下，向2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(350mg，1.043mmol)在DMF(5mL)中的冷却(0℃)溶液中滴加1NKOtBu的THF溶液(1.3mL，1.30mmol)。将该混合物搅拌5min，然后一次性加入2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(350mg，1.337mmol)的THF(1mL)溶液。在0℃搅拌15min后，将该混合物用饱和NH4Cl(1.5mL)淬灭并真空蒸发至基本干。将该残余物用Na2CO3水溶液(5mL)稀释，用DCM萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，0-15％(5％NH4OH/MeOH)的DCM溶液)。将纯级分合并并真空蒸发至干，得到5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(530mg，0.945mmol，91％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.51-7.43(m，2H)，7.41-7.30(m，3H)，6.64(s，1H)，5.43(s，2H)，4.87-4.74(m，2H)，3.68(dd，J＝4.7，9.5Hz，1H)，3.38(t，J＝6.8Hz，2H)，3.10(d，J＝10.9Hz，1H)，2.95(dd，J＝2.3，11.1Hz，1H)，2.71(t，J＝6.8Hz，2H)，2.46(s，3H)，2.44(s，3H)，2.35(s，3H)，2.29(s，6H)，2.17-1.88(m，4H)，1.79(t，J＝15.3Hz，2H)，1.69-1.38(m，3H)，0.80(t，J＝7.3Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+561.4。
g)5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(530mg，0.945mmol)中加入TFA(10mL，130mmol)。将该溶液加热至45℃并搅拌3h。将该反应真空蒸发至干。将该残余物用1N Na2CO3(5mL)碱化，用DCM萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，10-20％(5％NH4OH/MeOH)的DCM溶液)。将纯级分合并，蒸发至干，用己烷研磨，过滤和真空干燥，得到5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(520mg，1.050mmol)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.54(br.s.，1H)，5.88(s，1H)，4.54-4.42(m，2H)，3.71(dd，J＝5.2，8.7Hz，1H)，3.50(t，J＝6.7Hz，2H)，3.07(d，J＝10.1Hz，1H)，2.89(d，J＝10.1Hz，1H)，2.85(t，3H)，2.68(br.s.，1H)，2.51(s，6H)(隐藏在DMSO峰下)，2.36(s，3H)，2.16(s，3H)，2.12(s，3H)，2.04-1.76(m，5H)，1.59-1.34(m，3H)，0.75(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+471.3。
实施例10
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)5-(1-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
通过短冷凝器向锌(12.60g，193mmol)在THF(150mL)中的冷却(0℃)混悬液中滴加TiCl4(10.26mL，93mmol)。将该混合物加热回流2h。将该混合物冷却至室温并加入4-甲基-5-丙酰基噻吩-3-甲酸甲酯(3g，14.13mmol)、1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-酮(6.62g，42.4mmol)和吡啶(12.00mL，148mmol)在THF(30mL)中的溶液。将该反应混合物加热回流20h。将该混合物冷却至室温，用水(100mL)和EtOAc(150mL)处理并通过短硅藻土垫过滤。将该蓝色固体用EtOAc洗涤。收集滤液有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-60％EtOAc/己烷)，得到5-(1-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(1.71g，36％)，其为无色油。MS(ES)[M+H]+337.2
b)4-甲基-5-(1-(4-氧代环己亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向5-(1-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(1.5g，4.46mmol)在1,4-二噁烷(20mL)中的溶液中加入6N HCl(5.94mL，35.7mmol)。将该混合物在室温搅拌18h。将该混合物浓缩并将该残余物用10％NaHCO3处理并用EtOAc(3x)萃取。将萃取物干燥(Na2SO4)并浓缩。将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-70％EtOAc/己烷)，得到4-甲基-5-(1-(4-氧代环己亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(1.1g)，其为无色油。MS(ES)[M+H]+293.2
c)5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(4-氧代环己亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(110mg，0.376mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中加入3-甲氧基氮杂环丁烷盐酸盐(60.4mg，0.489mmol)、DIEA(0.085mL，0.489mmol)和AcOH(0.043mL，0.752mmol)。将该混合物在室温搅拌20min，此时加入NaBH3CN(70.9mg，1.129mmol)。将该混合物在室温搅拌18h。LCMS未监测到反应。将该混合物加热至50℃持续6h。LCMS显示没有所需产物，而是显示出还原的环己醇。将该混合物用10％NaHCO3淬灭并用EtOAc(3x)萃取。将该萃取物干燥(Na2SO4)并浓缩。将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-60％EtOAc/己烷)，得到5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(36mg)，其为灰白色固体。MS(ES)[M+H]+295.2
d)N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(35mg，0.119mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中加入NaOH(0.074mL，0.594mmol)。将该混合物在40℃加热18h。将该混合物用HCl(0.099mL，0.594mmol)处理并浓缩。将该残余物真空干燥并用二甲基亚砜(2.000mL)处理。向该混合物中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(29.2mg，0.155mmol)、NMM(0.078mL，0.713mmol)、EDC(45.6mg，0.238mmol)和HOAt(32.4mg，0.238mmol)。将该混合物在室温搅拌18h。将该反应混合物用水(10mL)淬灭并将所得沉淀物通过过滤收集和真空干燥，得到N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(45mg，88％)，其为灰白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.87(t，J＝7.45Hz，3H)，1.10-1.50(m，2H)，1.60-1.90(m，3H)，1.96-2.30(m，13H)，3.66(m，1H)，4.24(d，J＝5.05Hz，2H)，4.54(d，J＝4.04Hz，1H)，5.87(s，1H)，7.70-7.82(m，1H)，7.92-8.11(m，1H)。MS(ES)[M+H]+415.2
实施例11
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酰胺
根据实施例4的操作，制备外消旋N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酰胺(117.7mg，0.243mmol，47.8％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.47(s，1H)，7.98(t，J＝5.05Hz，1H)，7.69(s，1H)，5.86(s，1H)，4.23(d，J＝5.05Hz，2H)，3.07(d，J＝10.36Hz，2H)，2.90(br.s.，1H)，2.83(d，J＝10.36Hz，1H)，2.64-2.77(m，1H)，2.26(s，1H)，2.15-2.20(m，6H)，2.11(s，3H)，1.82(br.s.，2H)，1.03-1.42(m，6H)，0.69(t，J＝7.20Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+484.3。
实施例12
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺
a)4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯盐酸盐(60mg，0.190mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中加入噁唑-2-甲醛(23.97mg，0.247mmol)、DIEA(0.043mL，0.247mmol)和AcOH(0.023mL，0.399mmol)。将该混合物搅拌20min，此时加入NaBH3CN(47.7mg，0.760mmol)。将该混合物在室温搅拌18h。将该混合物用10％NaHCO3淬灭并用EtOAc(3x)萃取。将该萃取物干燥(Na2SO4)并浓缩。将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-80％EtOAc/己烷)，得到4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(49mg)，其为无色油。MS(ES)[M+H]+361.2。
b)N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺
根据实施例1c的一般操作，制备N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺(27mg，42％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.85(t，J＝7.45Hz，3H)，1.71-1.80(m，1H)，1.93(t，J＝5.43Hz，2H)，2.05(s，3H)，2.11(s，3H)，2.18(s，3H)，2.19-2.45(m，5H)，3.52-3.75(m，3H)，4.23(d，J＝5.05Hz，2H)，5.86(s，1H)，7.16(d，J＝0.76Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.93-8.15(m，2H)。MS(ES)[M+H]+481.3。
实施例13
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺
a)4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯盐酸盐(98mg，0.310mmol)在1,4-二噁烷(3mL)中的溶液中加入2-氯嘧啶(42.6mg，0.372mmol)和K2CO3(51.5mg，0.372mmol)。将该混合物加热回流18h。将该混合物过滤并浓缩。将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-100％EtOAc/己烷)，得到4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(84mg)，其为灰白色固体。MS(ES)[M+H]+358.2。
b)N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺
根据实施例1c的一般操作，制备N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亚基丙基)噻吩-3-甲酰胺(91mg，80％产率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.85(t，J＝7.45Hz，3H)，1.71-1.80(m，1H)，1.93(t，J＝5.43Hz，2H)，2.05(s，3H)，2.11(s，3H)，2.18(s，3H)，2.19-2.45(m，5H)，3.52-3.75(m，3H)，4.23(d，J＝5.05Hz，2H)，5.86(s，1H)，7.16(d，J＝0.76Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.93-8.15(m，2H)。MS(ES)[M+H]+478.3。
实施例14
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
根据实施例4的操作，制备外消旋5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(109mg，0.234mmol)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ12.78(br.s.，1H)，7.43(s，1H)，7.38(t，J＝5.56Hz，1H)，5.94-6.02(m，1H)，5.66-5.89(m，1H)，4.51(d，J＝5.81Hz，2H)，2.78-3.06(m，2H)，2.60-2.77(m，3H)，2.39(s，3H)，2.27(s，6H)，1.98-2.19(m，2H)，1.81-1.97(m，2H)，1.30-1.48(m，4H)，0.67-0.94(m，4H)。MS(ES)[M+H]+466.2。
实施例15
5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)5-(1-(1-(N’-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亚丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.63mmol)中加入HCl的1,4-二噁烷溶液(15mL，60.0mmol)。将该混合物在室温搅拌30分钟然后真空蒸发至干成为固体泡沫。
向异硫氰酸甲酯(200mg，2.74mmol)在EtOH(10mL)中的溶液中加入氰胺一钠(180mg，2.81mmol)。将该混合物加热回流(80℃油浴)3h，此时将其冷却至室温。向该混合物中加入上述胺盐酸盐在DMF中的溶液(5.0mL)。加入EDC游离碱(450mg，2.90mmol)并将该反应搅拌2h。将该反应混合物真空蒸发，溶于DCM中，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化该残余物(IscoRf Gold 80g，0-10％EtOH的EtOAc溶液)，得到5-(1-(1-(N’-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.72g，1.997mmol，76％产率)，其为白色固体泡沫。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.05(s，1H)，5.06-4.99(m，1H)，3.87(s，3H)，3.62(br.s.，2H)，3.38(br.s.，2H)，3.05(d，J＝4.8Hz，3H)，2.59(t，J＝5.8Hz，2H)，2.39-2.30(m，2H)，2.24(s，3H)，2.16(t，J＝5.9Hz，2H)，0.94(t，J＝7.6Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+361.2。
b)5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向5-(1-(1-(N’-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.70g，1.942mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中加入5N NaOH(2.0mL，10.00mmol)。将该反应在70℃搅拌6h。将该反应真空浓缩，以除去MeOH并用6N HCl(1.7mL)中和。形成白色胶状固体混悬液。将该混合物真空蒸发，得到粗制甲酸(被NaCl污染)，其为灰白色固体。
向上述物质中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(500mg，2.65mmol)、DCM(30mL)、HOAt(270mg，1.984mmol)和NMM(0.30mL，2.73mmol)。将该固体块用搅拌棒弄碎。向该搅拌的混悬液中加入EDC游离碱(370mg，2.383mmol)。将该反应在室温搅拌2h，然后在40℃搅拌4h。将该浑浊混合物通过硅藻土垫过滤并用少量的DCM冲洗。将澄清滤液浓缩并用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 80g，10-25％EtOH的EtOAc溶液)。将纯级分合并，蒸发至干，用EtOAc研磨，己烷，过滤和真空干燥，得到5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(0.75g，1.56mmol，80％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.48(br.s.，1H)，8.03(t，J＝4.8Hz，1H)，7.81(s，1H)，7.20(q，1H)，5.87(s，1H)，4.24(d，J＝4.8Hz，2H)，3.51(t，J＝5.2Hz，2H)，3.32(br.s.，2H)，2.84(d，J＝4.5Hz，3H)，2.47(t，J＝5.2Hz，2H)，2.33-2.23(m，2H)，2.18(s，3H)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02-1.97(m，2H)，0.87(t，J＝7.5Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+481.2。
实施例16
2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
a)4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯
在氮气下，向250mL带有搅拌棒的圆底烧瓶中加入(1,5-环辛二烯)(甲氧基)铱(I)二聚体(0.955g，1.440mmol)。边搅拌边通过注射器加入4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(23.28mL，161mmol)，然后加入4,4'-二-叔丁基-2,2'-联吡啶(0.773g，2.88mmol)在正己烷(150mL)中的溶液。将该深色混合物搅拌1min，此时滴加4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(15g，96mmol)(放气)。将该反应搅拌1.5h。将该反应真空蒸发至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 330g，0-100％DCM/己烷，柱用3个柱体积的1％Et3N的氯仿溶液预处理)，得到4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯(19.5g，65.7mmol，68.4％产率)，其为亮棕色油，其一旦静置则固化。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，3.87(s，3H)，2.70(s，3H)，1.36(s，12H)。MS(ES)[M+H]+283.2。
b)(Z)-4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向3-甲基-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.82g，2.80mmol)和(Z)-4-(1-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.044g，2.80mmol)在1,4-二噁烷(30mL)中的溶液中加入水(10mL)和Na2CO3(0.741g，6.99mmol)。将该溶液脱气并加入Pd(PPh3)4(0.162g，0.140mmol)。将该反应混合物在70℃加热1h。将该混合物用EtOAc(100mL)稀释并过滤。分离各层并将有机物用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将黑色残余物用纯化(50–100％EtOAc:己烷)，得到(Z)-4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(950mg，2.433mmol，87％产率)，其为无色油。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ5.73-5.86(m，1H)，5.66(br.s.，1H)，4.15(br.s.，2H)，3.63(t，J＝6.69Hz，2H)，3.03(t，J＝6.69Hz，2H)，2.67(t，J＝13.01Hz，2H)，2.25(s，3H)，1.64-1.80(m，3H)，1.49-1.53(m，3H)，1.44-1.47(m，9H)，1.30-1.41(m，2H)。MS(ES)[M+Na]+413.2。
c)4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向(Z)-4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(950mg，2.433mmol)在EtOH(30mL)中的脱气(氮气)溶液中加入10％Pd/C(Degussa，1.5g，1.410mmol)。将该反应混合物在氢气氛下(气球)搅拌过夜。将该反应混合物过滤并浓缩，得到4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(850mg，2.057mmol，85％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.77(br.s.，1H)，3.98-4.29(m，2H)，3.61(t，J＝6.82Hz，2H)，3.01(t，J＝6.69Hz，2H)，2.65-2.77(m，2H)，2.51-2.62(m，1H)，2.39(s，3H)，2.11(d，J＝12.88Hz，1H)，1.81-1.95(m，2H)，1.36-1.61(m，11H)，1.02-1.20(m，2H)，0.79(t，J＝7.33Hz，3H)。MS(ES)[M+Na]+415.2
d)4-(1-(5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气氛下，向4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(850mg，2.165mmol)在DMF(10mL)中的冷却(0℃冰浴)溶液中滴加1N KOtBu的THF(2.81mL，2.81mmol)。将该混合物搅拌5min，此时加入2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(737mg，2.81mmol)在THF(5mL)中的溶液。将该混合物在0℃搅拌15min。将该混合物用饱和NH4Cl(5mL)淬灭。将该混合物用水和EtOAc稀释。分离各层并将有机物用水，盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(IscoRf Gold 40g，10-30％(EtOAc：己烷)，得到4-(1-(5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.2g，1.845mmol，85％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.45-7.51(m，2H)，7.29-7.41(m，4H)，6.65(s，1H)，5.46(s，2H)，4.80(s，2H)，3.84-4.28(m，2H)，3.38(t，J＝6.69Hz，2H)，2.70(t，J＝6.69Hz，4H)，2.46(s，3H)，2.40(s，3H)，2.37(s，3H)，1.88(dd，J＝4.04，7.33Hz，2H)，1.32-1.58(m，12H)，1.01-1.21(m，2H)，0.78(t，J＝7.33Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+618.4。
e)5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-2-(1-(哌啶-4-基)丙基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向4-(1-(5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(900mg，1.457mmol)在1,4-二噁烷(10mL)中的冷却(10℃)溶液中加入4M HCl的1,4-二噁烷溶液(3mL，12.00mmol)。将该反应混合物维持在10℃，历时1h。将该反应通过LCMS监测。1h后，加入额外的4M HCl的1,4-二噁烷溶液(3mL，12.00mmol)。一旦起始原料耗尽，将该反应混合物用6M NaOH(pH～9)中和并用DCM萃取。将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将该残余物通过柱色谱纯化(30％[5％NH4OH/MeOH]：70％DCM)，得到5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-2-(1-(哌啶-4-基)丙基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(450mg，0.826mmol，56.7％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ7.42(dd，J＝1.64，7.96Hz，2H)，7.25-7.34(m，3H)，6.72(s，1H)，5.42(s，2H)，4.77(s，2H)，3.34-3.38(m，2H)，3.06(d，J＝12.38Hz，1H)，2.96(d，J＝12.38Hz，1H)，2.73-2.80(m，1H)，2.66-2.72(m，2H)，2.56(dt，J＝2.78，12.38Hz，1H)，2.46(dt，J＝2.65，12.44Hz，1H)，2.40(s，3H)，2.36(s，3H)，2.34(s，3H)，1.88-2.05(m，2H)，1.31-1.61(m，3H)，1.03-1.28(m，2H)，0.79(t，J＝7.33Hz，3H)
MS(ES)[M+H]+518.3。
f)2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向2,2-二氟丙-1-醇(193mg，2.010mmol)和吡啶(0.163mL，2.010mmol)在CH3CN(20mL)中的冷却(0℃)溶液中滴加Tf2O(0.312mL，1.849mmol)。将该反应维持在0℃，历时30min。
向5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-2-(1-(哌啶-4-基)丙基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(208mg，0.402mmol)和K2CO3(500mg，3.62mmol)在CH3CN(20mL)中的混悬液中加入上述冷却的反应混合物(含有三氟甲磺酸2,2-二氟丙酯)。将该反应温热至室温，然后加热至50℃过夜。将该反应过滤并真空蒸发至干。将该残余物溶于EtOAc中并将所得溶液用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，得到油。
将上述油在TFA(5mL，64.9mmol)中的溶液保持30min，之后将其浓缩。将该反应混合物用制备型HPLC纯化(5-60％MeCN:水，含0.1％甲酸)。将含有产物的级分用6M HCl(0.5mL)处理并浓缩，得到2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(90mg，0.169mmol，42.1％产率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ7.07(s，1H)，4.82(s，2H)，3.88-3.99(m，2H)，3.72-3.86(m，3H)，3.65(d，J＝12.63Hz，1H)，3.07-3.27(m，4H)，2.80-2.91(m，1H)，2.69(s，3H)，2.54(s，3H)，2.40(s，2H)，2.27(d，J＝14.15Hz，1H)，2.00(ddd，J＝3.79，7.20，13.52Hz，1H)，1.57-1.89(m，7H)，1.47(ddd，J＝7.07，11.18，13.58Hz，1H)，0.80(t，J＝7.33Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+506.3。
实施例17
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(1-(2-氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
根据实施例16的操作，制备5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(1-(2-氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(110mg，0.199mmol)。1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ7.07(s，1H)，5.11-5.38(m，1H)，4.82(s，2H)，3.87-4.03(m，2H)，3.56-3.81(m，2H)，3.36-3.42(m，4H)，3.22-3.31(m，1H)，3.15(t，J＝6.95Hz，2H)，2.92-3.10(m，2H)，2.80-2.91(m，1H)，2.69(s，3H)，2.54(s，3H)，2.40(s，3H)，2.22-2.33(m，1H)，2.00(ddd，J＝3.79，7.33，13.64Hz，1H)，1.48-1.88(m，4H)，1.35-1.46(m，3H)，0.80(t，J＝7.20Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+488.3。
实施例18
N'-氰基-4-(1-(5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)-N-甲基哌啶-1-甲脒
根据实施例15和16的操作，制备N'-氰基-4-(1-(5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)-N-甲基哌啶-1-甲脒(35mg，0.065mmol)。1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ11.53(s，1H)，7.13(d，J＝4.8Hz，1H)，5.87(s，1H)，4.48(s，2H)，3.98(d，J＝12.6Hz，1H)，3.89(d，J＝12.9Hz，1H)，3.50(t，J＝6.7Hz，2H)，2.64-2.89(m，8H)，2.28-2.33(m，3H)，2.15(s，3H)，2.12(s，3H)，1.87(d，J＝11.4Hz，2H)，1.52-1.64(m，1H)，1.25-1.42(m，2H)，1.12-1.20(m，1H)，1.00-1.09(m，1H)，0.71(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+509.0。
实施例19
5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
根据实施例4和15的操作，制备5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(49mg，0.096mmol)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.46(br.s.，1H)，7.98(t，J＝4.9Hz，1H)，7.64-7.73(m，1H)，7.13(q，J＝4.3Hz，1H)，5.86(s，1H)，4.22(d，J＝5.1Hz，2H)，3.98(d，J＝13.4Hz，1H)，3.88(d，J＝13.1Hz，1H)，2.64-2.87(m，5H)，2.18(d，J＝2.5Hz，6H)，2.11(s，3H)，1.80-1.92(m，2H)，1.55-1.66(m，1H)，1.29-1.43(m，2H)，0.91-1.19(m，3H)，0.70(t，J＝7.3Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+483。
实施例20
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
根据实施例2的一般操作，制备5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.48(s，1H)，8.02(t，J＝5.05Hz，1H)，7.79(s，1H)，5.95-6.32(m，1H)，5.86(s，1H)，4.23(d，J＝5.05Hz，2H)，2.72(dt，J＝4.29，15.66Hz，2H)，2.60(br.s.，2H)，2.44(br.s.，2H)，2.35-2.41(m，2H)，2.21-2.31(m，2H)，2.18(s，3H)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，1.93(t，J＝5.05Hz，2H)，0.86(t，J＝7.45Hz，3H)。MS(ES)[M+H]+464.2。
实施例21
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
根据实施例4的一般操作，制备(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.69(t，J＝7.20Hz，3H)1.09-1.23(m，2H)1.25-1.39(m，3H)1.75-1.90(m，2H)1.93-2.02(m，1H)2.02-2.09(m，1H)2.11(s，3H)2.18(s，6H)2.56-2.74(m，3H)2.80(d，J＝11.12Hz，1H)2.89(d，J＝11.62Hz，1H)4.22(d，J＝5.05Hz，2H)5.86(s，1H)6.06(t，J＝4.29Hz，1H)7.68(s，1H)7.98(t，J＝5.05Hz，1H)11.47(s，1H)。MS(ES)[M+H]+466.2。
实施例22
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
a)4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯
向装有(1,5-环辛二烯)(甲氧基)铱(l)二聚体(325mg，0.490mmol)的100-mL圆底烧瓶中边搅拌边加入4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(7.10g，55.5mmol)，然后加入4,4'-二-叔丁基-2,2'-二吡啶(260mg，0.969mmol)在正己烷(35mL)中的溶液。将该混合物在室温搅拌2min并滴加4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(5g，32mmol)。将该混合物在室温搅拌18h。然后将该反应混合物浓缩并将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-100％DCM/己烷)，得到5.8g的产物，其为无色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.36(s，12H)，2.70(s，3H)，3.87(s，3H)，8.32(s，1H)。MS(ES)[M+H]+283.1。
b)4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙烯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯(2.65g，9.39mmol)在1,4-二噁烷(72mL)中的溶液中加入4-(1-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)乙烯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.38g，9.39mmol)、Na2CO3(2.489g，23.48mmol)和水(24mL)。将该混合物通过鼓入氮气脱气10min。加入Pd(PPh3)4(0.543g，0.470mmol)并将该混合物在70℃加热1h。将该反应混合物冷却至室温并用EtOAc(3x)萃取。将该合并的萃取物干燥(Na2SO4)并浓缩。将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-40％EtOAc/己烷)，得到2.8g产物，其为无色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.27-1.55(m，11H)，1.78(m，2H)，2.26-2.46(m，4H)，2.71(t，J＝11.49Hz，2H)，3.87(s，3H)，4.18(br.s.，2H)，5.13(s，1H)，5.29-5.39(m，1H)，8.02(s，1H)。MS(ES)[M+H]+388.1。
c)(R)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
将4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙烯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.2g，3.28mmol)和((4R,5R)-(+)-O-[1-苄基-1-(5-甲基-2-苯基-4,5-二氢噁唑-4-基)-2-苯基乙基](二环己基膦氧基)(1,5-COD)铱(I)四(3,5-二(三氟甲基)苯基硼酸盐(63mg，36μmol)在DCM(50mL)中的溶液在50psi氢气压下在Parr振荡器上氢化30h。将该混合物浓缩并将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-40％EtOAc/己烷)，得到(R)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.1g)，其为无色油。通过手性HPLC测定产物的光学纯度为98％e.e.(Chiralpak AY-H，5微米，4.6mm x 150mm；245，250nm UV；90：10：0.1正庚烷：EtOH：异丙胺，等梯度，1.0ml/min)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.03-1.33(m，5H)，1.38-1.58(m，11H)，1.88(d，J＝12.38Hz，1H)，2.37(s，3H)，2.48-2.77(m，2H)，2.94(quin，J＝7.26Hz，1H)，3.85(s，3H)，4.05-4.15(m，1H)，7.97(s，1H)。MS(ES)[M+H]+390.2。
d)(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向(R)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(85mg，0.231mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入4N HCl的1,4-二噁烷溶液(0.289mL，1.156mmol)。将该混合物保持在室温4h。将该混合物浓缩并将该残余物真空干燥。然后将该残余物用CH3CN(2mL)稀释。向该混合物中加入三氟甲磺酸2,2-二氟乙基酯(163mg，0.763mmol)和Cs2CO3(173mg，0.532mmol)。将该混合物在50℃加热2h。将该混合物冷却，用DCM稀释并过滤。将该滤液浓缩并将该残余物使用柱色谱纯化(硅胶，0-50％EtOAc/己烷)，得到(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(68mg)，其为无色油。
e)(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
向(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(68mg，0.205mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中加入8N NaOH(0.14mL，1.120mmol)。将该混合物在40℃加热18h。将该混合物用6N HCl(0.187mL，1.12mmol)处理并浓缩。将该残余物真空干燥并用DMSO(2mL)稀释。向该混合物中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮，盐酸盐(58.1mg，0.308mmol)、NMM(0.135mL，1.231mmol)、EDC(79mg，0.410mmol)和HOAt(55.9mg，0.410mmol)。将该混合物在室温搅拌18h。将该反应混合物用水(10mL)淬灭并将所得沉淀物通过过滤收集并真空干燥，得到(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺(49mg)，其为灰白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.08-1.38(m，7H)，1.76(m，1H)，1.92-2.14(m，5H)，2.18(m，6H)，2.64(td，J＝15.73，4.17Hz，2H)，2.82(d，J＝11.87Hz，1H)，2.86-2.97(m，2H)，4.17-4.30(m，2H)，5.86(s，1H),5.94-6.23(m，1H)，7.65(s，1H)，7.97(t，J＝5.05Hz，1H)。MS(ES)[M+H]+452.2。
实施例23
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺
根据实施例22的一般操作，制备(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.09-1.39(m，7H)，1.58(t，J＝19.07Hz，3H)，1.76(m，1H)，1.98-2.27(m，12H)，2.63(m，2H)，2.81(d，J＝12.13Hz，1H)，2.91(m，2H)，4.17-4.28(m，2H)，5.86(s，1H)，7.65(s，1H)，7.97(t，J＝4.93Hz，1H)。MS(ES)[M+H]+466.3。
测试方案
评估本文包含的化合物抑制PRC2复合物中EZH2的甲基转移酶活性的能力。人PRC2复合物是通过如下制备的：在Sf9细胞中共表达5个成员蛋白(FLAG-EZH2、EED、SUZ12、RbAp48、AEBP2)的每一个，然后共纯化。酶活性是通过闪烁迫近分析法(SPA)测定的，其中将氚代甲基从3H-SAM转移至衍生自组蛋白H3的生物素化的、未甲基化的肽底物上的赖氨酸残基上。肽在链亲和素包被的SPA珠上被捕获并将所得信号在ViewLux读板器上读取。
部分A.化合物的制备
1.将固体溶于100％DMSO中制备10mM化合物储备液。
2.在384孔板上，将各测试化合物溶于100％DMSO以建立11个点的连续稀释(1:4稀释，最高浓度10mM)，第6栏和第18栏为DMSO对照。
3.将10nL化合物从稀释板分配至反应板(Corning，384-孔聚苯乙烯NBS，Cat#3673)。
部分B.试剂的制备
制备以下溶液：
1.1x基础缓冲液，50mM Tris-HCl，pH 8，2mM MgCl2:每1L基础缓冲液，混合1MTris-HCl，pH 8(50mL)，1M MgCl2(2mL)和蒸馏水(948mL)。
2.1x测试缓冲液:每10mL 1x测试缓冲液，混合1x基础缓冲液(9.96mL)，1M DTT(40uL)，和10％吐温-20(1uL)，得到终浓度为50mM Tris-HCl，pH 8，2mM MgCl2，4mM DTT，0.001％吐温-20。
3.2x酶溶液:每10mL 2x酶溶液，混合1x测试缓冲液(9.99mL)和3.24uM EZH2 5成员复合物(6.17uL)，得到最终酶浓度为1nM。
4.PA珠溶液:每1mL SPA珠溶液，混合链亲和素包被的SPA珠(PerkinElmer，Cat#RPNQ0261，40mg)和1x测试缓冲液(1mL)，得到工作浓度为40mg/mL。
5.2x底物溶液:每10mL 2x底物溶液，混合40mg/mL SPA珠溶液(375uL)、1mM生物素化的组蛋白H3K27肽(200uL)、12.5uM 3H-SAM(240uL；1mCi/mL)、1mM冷SAM(57uL)和1x测试缓冲液(9.13mL)，得到终浓度为0.75mg/mL SPA珠溶液、10uM生物素化的组蛋白H3K27肽、0.15uM3H-SAM(～12uCi/mL 3H-SAM)和2.85uM冷SAM。
6.2.67x淬灭溶液:每10mL 2.67x淬灭溶液，混合1x测试缓冲液(9.73mL)和10mM冷SAM(267uL)，得到终浓度为100uM的冷SAM。
部分C.在384孔Grenier Bio-One板上的测试反应
化合物的添加
1.将10nL/孔的1000x化合物分配至测试孔中(如上所述)。
2.将10nL/孔的100％DMSO分配至第6和18栏(分别为高对照和低对照)。
测试
1.将5uL/孔的1x测试缓冲液分配至第18栏(低对照反应)。
2.将5uL/孔的2x底物溶液分配至第1-24栏(注:底物溶液应被混合以保证在分配至基质贮器之前为均匀的珠悬浮液)。
3.将5uL/孔的2x酶溶液分配至第1–17、19–24栏。
4.在室温培养该反应60分钟。
淬灭
1.将6uL/孔的2.67x淬灭溶液分配至第1-24栏。
2.密封测试板且以500rpm旋转约1分钟。
3.在ViewLux仪器中将板暗适应15–60分钟。
读板
1.在Viewlux读板器上读取测试板，其采用613nm的发射滤波器或滤光膜(300秒暴露)。
试剂的加入可采取手动或用自动液体处理器。
结果
对于每个化合物浓度，相对于DMSO对照计算百分比抑制，并且使用ABASE数据拟合软件包中的标准IC50拟合参数拟合所得值。
实施例化合物通常是根据上述或类似的测试进行测定的且发现它们是EZH2的抑制剂。根据该测试测定的具体生物活性列于下表。IC50值≤10nM是指化合物的活性接近该测试中的检测限。重复测试流程可得到稍微不同的IC50值。

Claims (18)

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
X和Y各自独立地为CH、C或N；其中
当X为N，Y为CH时，为单键；
当Y为N，X为CH时，为单键；
当X和Y各为CH时，为单键；和
当X为C，Y为C时，为双键；
Z为CH或N；
R1和R2各自独立地为(C1-C4)烷基；
R3和R4各为氢；
或R3和R4一起表示-CH2CH2-；
R5和R6各自独立地为(C1-C3)烷基；和
R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2、羟基、嘧啶基、噁唑基甲基和-C(＝N-CN)NH(C1-C4)烷基；
条件是所述化合物不是N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-((4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺、5-((4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基-N-((6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)噻吩-3-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)环己基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(4-(乙基(甲基)氨基)环己基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺或各个这些化合物的立体异构体或其混合物。
2.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中X和Y各自独立地为CH或N，其中X和Y中至少一个为CH，和为单键。
3.根据权利要求1化合物或其药学上可接受的盐，其中X为N，Y为CH，和为单键。
4.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中Y为N，X为CH，和为单键。
5.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中X和Y各为CH，和为单键。
6.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中X和Y各为C，和为双键。
7.根据权利要求1-6中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z为CH。
8.根据权利要求1-6中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z为N。
9.根据权利要求1-8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各为甲基。
10.根据权利要求1-9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3和R4各为氢。
11.根据权利要求1-10中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5为甲基。
12.根据权利要求1-11中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R6为乙基。
13.根据权利要求1-12中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7选自：卤代(C1-C4)烷基、-N((C1-C4)烷基)2和羟基。
14.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
(S)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羟基哌啶-4-亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羟基环己亚基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亚基)丙基)噻吩-3-甲酰胺；
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮；
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(1-(2-氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮；
N'-氰基-4-(1-(5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)-N-甲基哌啶-1-甲脒；
5-(1-(1-(N'-氰基-N-甲基甲脒基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-亚基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺；或
(R)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲酰胺。
15.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
16.治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者给药治疗有效量的权利要求1-14中任一项的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求15的药物组合物。
17.权利要求16的方法，其中所述癌症选自：脑癌(神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、威尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、胃癌、膀胱癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、肾脏癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨细胞肿瘤和甲状腺癌。
18.根据权利要求1-14中任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由EZH2介导的病症的药物中的用途。
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