CN107144616A - 基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法 - Google Patents
基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107144616A CN107144616A CN201710328029.6A CN201710328029A CN107144616A CN 107144616 A CN107144616 A CN 107144616A CN 201710328029 A CN201710328029 A CN 201710328029A CN 107144616 A CN107144616 A CN 107144616A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- paa
- pba
- dex
- acid
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 4
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 title abstract description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 6
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000010439 graphite Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims abstract 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims abstract 3
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims abstract 2
- XIPRTRJDLZVSHO-UHFFFAOYSA-N aminooxy(phenoxy)borinic acid Chemical compound NOB(O)OC1=CC=CC=C1 XIPRTRJDLZVSHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 66
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 6
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 5
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 3
- UTHULKKJYXJZLV-UHFFFAOYSA-N (3-aminophenoxy)boronic acid Chemical compound NC1=CC=CC(OB(O)O)=C1 UTHULKKJYXJZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- SQQUYNHTGSFFDQ-UHFFFAOYSA-N [Na].ONC(CCC)N Chemical compound [Na].ONC(CCC)N SQQUYNHTGSFFDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 1
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 21
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 120
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 24
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 22
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 238000000707 layer-by-layer assembly Methods 0.000 description 11
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 6
- UKTAURVTSWDIQR-UHFFFAOYSA-N (3-aminophenyl)boronic acid;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.NC1=CC=CC(B(O)O)=C1.NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 UKTAURVTSWDIQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 4
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N m-aminophenylboronic acid Chemical compound NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 4
- 239000003115 supporting electrolyte Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 0 C*(c1cccc(*(O)O*)c1)=C Chemical compound C*(c1cccc(*(O)O*)c1)=C 0.000 description 2
- GXSZBGSCFZPWGA-UHFFFAOYSA-N N-(1-aminobutyl)hydroxylamine Chemical compound CCCC(NO)N GXSZBGSCFZPWGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ILOJFJBXXANEQW-UHFFFAOYSA-N aminooxy(phenyl)borinic acid Chemical compound NOB(O)C1=CC=CC=C1 ILOJFJBXXANEQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LDSQQXKSEFZAPE-UHFFFAOYSA-N 2-piperidin-4-ylethanol Chemical compound OCCC1CCNCC1 LDSQQXKSEFZAPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 125000005620 boronic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010531 catalytic reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical class Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000003411 electrode reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法。所述方法包括：通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸PAA的羧基之间的缩合反应将苯硼酸PBA基团接枝到聚丙烯酸PAA骨架上，得到产物聚丙烯酸‑苯硼酸PAA‑PBA；然后利用聚丙烯酸‑苯硼酸PAA‑PBA与葡聚糖Dex之间的硼酸‑二醇特异性识别作用在热解石墨PG电极表面上组装{PAA‑PBA/Dex}n LbL薄膜，然后再从溶液中吸入肌红蛋白Mb，形成{PAA‑PBA/Dex}n‑Mb薄膜。该薄膜为保持Mb的生物活性提供了良好的微环境，为蛋白质的固定提供了一种新型的LbL薄膜，为设计基于酶的直接电化学的生物传感器提供了一个新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方 法。
背景技术
氧化还原蛋白质或酶在基底上的固定是不依赖于媒介体的电化学生物传感 器、生物反应器以及其它生物装置的重要前提，并引起了研究者的广泛关注。 在固体表面固定酶或蛋白质并有效实现蛋白质直接电化学的方法之一是将其固 定在修饰于电极表面的薄膜中。在各种制备薄膜的方法中，层层组装 (layer-by-layer,LbL)技术表现出显著的优势，它能够根据预先设计的方案在纳 米或分子层次上控制薄膜的组成与厚度，并且组装程序非常简便。LbL组装的 成膜驱动力逐渐由静电作用力扩展到各种各样的非静电相互作用如离子-偶极 作用力、氢键作用和特异性相互作用等。在各种特异性相互作用中，硼酸基团和二醇单元之间的相互作用在构筑薄膜方面引起了许多研究者的兴趣。苯硼酸(phenylboronic acid,PBA)及其衍生物能够与各种1,2-或1,3-顺二醇化合物(如 多元醇、糖类化合物)生成硼酸-二醇间的共价键，并形成五元或六元环状的硼 酯复合物。如聚乙烯醇或甘露糖可以与含有PBA基团的聚电解质构筑LbL薄膜。 一个单糖分子通常含有5个-OH基团，而一个PBA基团可以与两个-OH基团 结合，因此它们可以形成1:2的糖-PBA复合物。葡聚糖(dextran,Dex)是以葡 萄糖为单体的聚多糖，其分子骨架上含有许多可以与PBA基团结合的葡萄糖单 元。虽然Dex和PBA之间的特异性亲和作用已有报道，但是由Dex与含有PBA基团的聚电解质构筑的蛋白质层层组装薄膜至今未见报道。
目前吸入型蛋白质LbL薄膜已经发展成为一种新型的蛋白质LBL薄膜：将 固体基底表面组装的聚合物和/或纳米粒子LbL薄膜浸泡在蛋白质溶液中，使蛋 白质自发吸入薄膜，形成吸入型蛋白质LbL薄膜。与通常的直接将蛋白质和其 他组分构筑的蛋白质LbL薄膜相比，吸入型蛋白质LbL薄膜中的蛋白质是自发 地扩散进入薄膜内部，并且独立于LbL薄膜的组装过程，因此该方法在保持蛋 白质的原有结构和生物活性方面表现出独特的优点。在电极上构筑不同类型的 吸入型蛋白质LbL薄膜的研究已有报道，并实现了氧化还原蛋白质在该类型薄 膜电极上的直接电化学。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种合成了既含有苯硼酸PBA 基团又含有羧酸基团的聚电解质PAA-PBA的基于硼酸-二醇特异性识别作用的 层层组装薄膜的制备方法。
本发明基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法，包括：
通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸PAA的羧基之间的缩合反应将苯硼酸PBA基 团接枝到聚丙烯酸PAA骨架上，得到产物聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA；然后利 用聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA与葡聚糖Dex之间的硼酸-二醇特异性识别作用 在热解石墨PG电极表面上组装{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜，然后再从溶液中吸 入肌红蛋白Mb，形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜。
进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA的合成包括：
聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA聚电解质是由聚丙烯酸PAA与3-氨基苯硼酸半 硫酸盐APBA在交联剂N-羟基丁二胺磺酸钠NHS和N-(3-二甲氨基丙基)-N′- 乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC存在的条件下发生缩合反应，将PBA接枝到PAA 骨架上而合成的，其合成路线如下式所示：
进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA的合成具体包括：
将0.57g的聚丙烯酸PAA水溶液，聚丙烯酸PAA水溶液含有2.77mmol 单体用20mL,50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液稀释，将溶液 pH调至8.5；将20mL,61mM的3-氨基苯硼酸半硫酸盐APBA同样溶于pH 8.5的20mL,50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液中；然后将上述 两种溶液混合；逐滴加入含有4mL,31mM的N-羟基丁二胺磺酸钠NHS的50mM,pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液，并搅拌10min；将 含有4mL,310mM的N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC的50 mM,pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液加入上述反应混合溶液中，室 温下搅拌12h；然后将上述溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干 燥后得到产物聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA，为白色粉末状固体。
进一步地，{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜的组装包括：
热解石墨PG电极的制作：用热缩管将直径为4.5mm，长6mm左右的圆 柱型热解石墨密封在直径与之相等的不锈钢圆柱棒一端，使热解石墨PG的一 侧表面紧贴在不锈钢棒一端的表面，从而形成导电通路，而热解石墨PG的另 一侧表面作为电极表面；将电极表面在320目的金相砂纸上打磨后，再在蒸馏 水中超声30s，洗净吹干，即可作为工作电极；电极表面的几何面积为0.16cm2；
将处理好的PG电极首先浸入带有正电荷的1mg mL–1,pH 5.0壳聚糖CS 溶液中15min，使之在热解石墨PG表面吸附一层壳聚糖CS前驱膜；然后将PG/CS电极交替浸入带有负电荷的1mg mL–1,pH 9.0的PAA-PBA和中性1 mg mL–1,pH 9.0的Dex水溶液中各15min，溶液转换时用水清洗并吹干，在 电极表面形成一个PAA-PBA/Dex双层；重复上述过程直到在PG/CS表面上形 成所需双层数的{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜；将组装好的上述薄膜电极浸入1 mg mL–1的Mb溶液，中预定时间，以确保Mb分子扩散进入到薄膜内部，然后 取出洗涤并吹干，表示为{PAA-PBA/Dex}n-Mb；Mb溶液为pH 5.0，含0.2M NaCl。
与现有技术相比，本发明基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的 制备方法具有以下优点：
本发明合成了既含有苯硼酸(PBA)基团又含有羧酸基团的聚电解质 PAA-PBA(PAA：聚丙烯酸)。采用层层组装(LbL)技术，利用PAA-PBA和葡 聚糖(Dex)之间的硼酸-二醇特异性识别作用，在热解石墨电极(PG)表面构筑 了{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜，再从溶液中吸入肌红蛋白(Mb)，形成 {PAA-PBA}n-Mb薄膜；采用循环伏安方法研究了{PAA-PBA/Dex}n薄膜中 Mb的直接电化学及其对氧气和过氧化氢的电催化还原。结果表明该薄膜为 保持Mb的生物活性提供了良好的微环境，为蛋白质的固定提供了一种新型 的LbL薄膜，为设计基于酶的直接电化学的生物传感器提供了一个新的思 路。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术 手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附 图详细说明如后。
附图说明
图1是在Mb溶液中浸泡9h后的{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜表现出不同的 Γ*值；
图2是用SEM对组装在PG/CS表面的{PAA-PBA/Dex}6层层组装薄膜的 表面形貌图；
图3是用SEM对组装在PG/CS表面的{PAA-PBA/Dex}6/PAA-PBA层层组 装薄膜的表面形貌图；
图4是用SEM对组装在PG/CS表面的{PAA-PBA/Dex}6-Mb层层组装薄 膜的表面形貌图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以 下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如图1所示，本发明一种基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的 制备方法的最佳实施例，包括：
通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸PAA的羧基之间的缩合反应将苯硼酸PBA基 团接枝到聚丙烯酸PAA骨架上，得到产物聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA；然后利 用聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA与葡聚糖Dex之间的硼酸-二醇特异性识别作用 在热解石墨PG电极表面上组装{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜，然后再从溶液中吸 入肌红蛋白Mb，形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜。
进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA的合成包括：
聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA聚电解质是由聚丙烯酸PAA与3-氨基苯硼酸半 硫酸盐APBA在交联剂N-羟基丁二胺磺酸钠NHS和N-(3-二甲氨基丙基)-N′- 乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC存在的条件下发生缩合反应，将PBA接枝到PAA 骨架上而合成的，其合成路线如下式所示：
PAA-PBA的合成，其过程为，将0.57g的PAA水溶液(含有2.77mmol单 体)用HEPES缓冲溶液(20mL,50mM)稀释，将溶液pH调至8.5；将APBA(20 mL,61mM)同样溶于pH 8.5的HEPES缓冲溶液(20mL,50mM)中；然后将 上述两种溶液混合。逐滴加入含有NHS(4mL,31mM)的HEPES缓冲溶液(50 mM,pH 8.5)，并搅拌10min。将含有EDC(4mL,310mM)的HEPES溶液(50mM,pH 8.5)加入上述反应混合溶液中，室温下搅拌12h。然后将上述溶液透析 一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干燥后得到产物PAA-PBA，为白色粉末 状固体。
{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜的组装：
PG电极的制作：用热缩管将直径为4.5mm，长6mm左右的圆柱型basal plane热解石墨密封在直径与之相等的不锈钢圆柱棒一端。使PG的一侧表面紧 贴在不锈钢棒一端的表面，从而形成导电通路，而PG的另一侧表面作为电极 表面。将电极表面在320目的金相砂纸上打磨后，再在蒸馏水中超声30s，洗 净吹干，即可作为实验中使用的工作电极。电极表面的几何面积为0.16cm2。
将处理好的PG电极首先浸入带有正电荷的CS溶液(1mg mL–1,pH 5.0)中 15min，使之在PG表面吸附一层CS前驱膜。然后将PG/CS电极交替浸入带 有负电荷的PAA-PBA(1mgmL–1,pH 9.0)和中性Dex(1mg mL–1,pH 9.0)水溶 液中各15min，溶液转换时用水清洗并吹干，可在电极表面形成一个 PAA-PBA/Dex双层。重复上述过程直到在PG/CS表面上形成所需双层数(n) 的{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜。将组装好的上述薄膜电极浸入1mg mL–1的Mb 溶液(pH 5.0，含0.2M NaCl)中一定时间，以确保Mb分子扩散进入到薄膜内 部，然后取出洗涤并吹干，表示为{PAA-PBA/Dex}n-Mb。然后将固载了Mb的 薄膜转移到pH 7.0的空白缓冲溶液中进行电化学研究。
采用循环伏安方法研究了{PAA-PBA/Dex}n薄膜中Mb的直接电化学及其对 氧气和过氧化氢的电催化还原。
马骨骼或肌肉肌红蛋白(Mb,MW≈17 800)，3-氨基苯硼酸半硫酸盐(APBA)， 聚丙烯酸(PAA,MW≈100 000,35wt.％水溶液)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 99.5％)，N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基丁二胺 磺酸钠(NHS)，葡聚糖(Dex,MW～200 000)和壳聚糖(CS，酰胺化程度大于 85％，MW≈200 000)，醋酸钠(分析纯)，磷酸二氢钠(分析纯)均购自 Sigma-Aldrich。K3Fe(CN)6，K4Fe(CN)6和过氧化氢(H2O2,30％)购自北京化工 厂。缓冲溶液为0.1M醋酸钠溶液(pH 4.0-6.0)，0.05M的磷酸二氢钠溶液(pH7.0-8.5)和0.05M的硼酸溶液(pH 9.0)，用稀HCl或KOH溶液调节到所需 pH值，缓冲溶液中均含有0.1M NaCl。所有溶液均用经过离子交换和蒸馏纯 化的三次蒸馏水配制。实验用水均为经过离子交换和蒸馏纯化的三次水。
电化学测量采用CHI 660A型电化学工作站(美国CHI仪器公司)，使用典型 的三电极体系，参比电极：饱和甘汞电极(SCE)，辅助电极：铂电极，工作电 极：修饰有LbL薄膜的热解石墨(pyrolytic graphite，简称PG，来自Advanced Ceramics)电极。电解池中的缓冲溶液为不含蛋白质的空白缓冲溶液。在电化学 测量前，向缓冲溶液中通入高纯氮10min以除去溶液中的氧气，并在整个实验 过程中始终保持氮气氛围(O2催化实验除外)。电化学阻抗谱(EIS)实验以等浓度 的Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-溶液(5mM，含0.1M NaCl)作为电活性探针，在其式 量电位0.17V(vs SCE)上施加小振幅的正弦交流电压，振幅为±5mV，频率范 围为0.1-105Hz。扫描电子显微镜(SEM)实验采用S-4800冷场发射扫描电子 显微镜(Hitachi)，加速电压为3kV。组装在PG电极上的LbL薄膜作为测试样 品。在SEM实验之前，采用E-1045离子溅射仪(Hitachi)在样品表面镀一层铂 膜。所有的实验均在室温(20±2℃)下进行。
{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜的层层组装：
打磨后的plane PG电极暴露出一些edge面，因此既具有疏水性也具有一 定亲水性。由于edge面的碳被氧化后连接有O-，OH-等基团，因此表面带一 定负电荷。CS在pH 5.0时因pKa≈6.5[i]而带有正电荷，因此可以作为前驱膜 吸附在PG电极表面。PAA-PBA的分子骨架中含有大量的自由的-COOH基 团，PAA在水溶液中的pKa约为6.0，因此在pH 9.0时PAA-PBA中自由的羧 基被离子化而带负电荷，这样带负电荷的PAA-PBA可以被静电吸附到带有相 反电荷的PG/CS膜表面。因此PG电极与CS之间、CS与PAA-PBA之间的 组装驱动力主要是静电相互作用力。但是后续组装的Dex是一种不带电荷中性 聚多糖，因此Dex在PAA-PBA表面的吸附以及后续{PAA-PBA/Dex}n多层膜组 装的主要通过硼酸-二醇特异性识别作用相结合。
本发明采用循环伏安(CV)法，以K3Fe(CN)6为电活性探针监测 {PAA-PBA/Dex}n薄膜在PG电极表面的组装。在裸的PG或PG/CS薄膜电极 上，K3Fe(CN)6在pH 7.0的溶液中于0.17V附近表现出一对良好的、近乎可逆 的CV还原氧化峰。而当{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜组装到PG/CS表面时，探 针的CV峰电流显著下降，这是因为在电极表面形成的薄膜屏障阻碍了探针到 达底层的电极表面并进行电子交换。随着薄膜双层膜数n的增加，K3Fe(CN)6的电流逐渐降低，由此表明在PG电极表面成功构筑了{PAA-PBA/Dex}n多层薄 膜。
{PAA-PBA/Dex}n薄膜对Mb的吸入：
在合适的条件下，Mb能够从其水溶液中自发地被吸入到{PAA-PBA/Dex}n薄膜之中，形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜。首先采用电化学阻抗谱(EIS)法以 Fe(CN)6 3-/4-为电活性探针证实Mb被吸入和固定于{PAA-PBA/Dex}6薄膜中。对 于裸的PG电极和PG/CS薄膜，Fe(CN)6 3–/4–的EIS响应在pH 7.0溶液中都表 现为一条Warburg直线，这是受扩散控制的电化学过程的特征。当 {PAA-PBA/Dex}6薄膜在Mb溶液中的浸泡9h后，在高频区可以观察到一个明 显的半圆形响应(曲线d)，其EIS响应的半圆直径远远大于吸入Mb之前的 {PAA-PBA/Dex}6薄膜的半圆直径(曲线c)。半圆的直径通常等于探针的电荷转 移电阻。对于薄膜体系，电荷转移电阻主要反映了探针在薄膜中扩散的难易程 度，与薄膜的通透性直接相。由此说明吸入{PAA-PBA/Dex}6薄膜中的Mb作为 物理屏障进一步阻碍和限制了探针到达电极表面，从而反过来证实了Mb在薄 膜中的吸入。
在这里，Mb的等电点为6.8，其表面净电荷在pH 5.0时为正。而 {PAA-PBA/Dex}6薄膜是由带负电荷的PAA-PBA和不带电荷的Dex两种成膜材 料组成，因此{PAA-PBA/Dex}6薄膜带负电荷。在pH 5.0条件下，带负电荷的 薄膜将吸引带正电荷的Mb。因此，Mb和{PAA-PBA/Dex}6薄膜中PAA-PBA 组分之间的静电吸引力也是促使薄膜吸入Mb的另一重要驱动力。
由于薄膜中的Mb具有电活性，可以作为指示剂，因此其吸入过程也可以通 过CV响应来监测。例如，将组装了{PAA-PBA}6薄膜的PG电极浸入Mb溶液 中一定时间，水洗吹干，然后转移到pH 7.0的空白缓冲溶液中，在+0.1V至-0.8 V的电位范围进行CV扫描，在-0.34V(vs SCE)处可以观察到一对可逆性良好 的还原氧化峰，这是Mb中血红素Fe(III)/Fe(II)电对的特征峰。平行实验中的6 组{PAA-PBA}6-Mb薄膜电极的平均式量电位为-0.34V，标准偏差为0.011V， 表明薄膜的重现性非常好。而不含Mb的{PAA-PBA}6薄膜在此电位范围内没有 任何CV响应。Mb的CV还原峰电流(Ipc)随着{PAA-PBA}6多层膜在Mb溶液中 浸泡时间的增长而增加，在大约9h后达到稳态。因此，在以后的实验中，我 们均采用9h作为在Mb溶液中的浸泡时间。{PAA-PBA}6-Mb薄膜的CV阴极 峰和阳极峰的峰高和峰面积几乎相等，且在0.05–2.0V s-1的范围内峰电流与 扫速呈线性关系，表明该薄膜中的Mb的伏安行为具有典型的非扩散控制的薄 层电化学的特征。在此条件下，对{PAA-PBA}6-Mb薄膜的CV阴极峰进行积分，可得到薄膜中全部电活性的Mb发生还原反应时的电量Q，根据法拉第定律Q＝ NAFΓ*，可以将Q进一步换算为电活性Mb在薄膜电极上的表面浓度(Г*,mol cm -2)[32]。其中N是电子转移数(1)，A是PG电极表面的几何面积(0.16cm2)，F 为法拉第常数(96487C mol-1)。如果采用Γ*9h表示在Mb溶液浸泡9h后薄膜中 电活性Mb的表面浓度，则6组平行实验的{PAA-PBA}6-Mb薄膜的平均Γ*9h约 为1.25×10-10mol cm-2。
双层数对吸入Mb量的影响：对于双层数n不同的{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄 膜，Mb在薄膜电极上的表面浓度Γ*与浸泡时间的关系表现出相同的趋势，即Γ *随着时间的增加而增大，在大约9h后趋于稳态。但是当双层数不同时，在 Mb溶液中浸泡9h后的{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜表现出不同的Γ*值(图1)，Γ* 值随着双层数n的增加而增加，当n＝6时，Γ*值达到最大值，继而呈现下降 趋势。因此在以后的实验中我们选择双层数为6的{PAA-PBA}6-Mb薄膜作为主 要研究对象。这是因为随着薄膜双层数n从1到6的不断增加，{PAA-PBA/Dex}n薄膜变得越来越厚，这样可以吸纳更多的Mb分子，因而倾向于获得更大的Γ*值；但是同时薄膜的通透性会随着薄膜厚度的增加而降低，因此溶液中小分子 量的对离子进出薄膜变得越来越困难，导致Mb分子之间的电子自交换更加困 难，故Γ*值呈减小的趋势。这两种效果相反的因素共同作用，使得Γ*值在n＝6 时达到最大值。
{PAA-PBA}6-Mb薄膜具有良好的稳定性。将{PAA-PBA}6-Mb薄膜置于空白 缓冲溶液中，在所研究的电位范围内进行CV扫描200圈后，CV峰的位置仍然 保持不变，峰高只下降了约1.5％。将{PAA-PBA}6-Mb薄膜置于空白缓冲溶液 中浸泡一周后，其峰电流值仍能够保持其起始峰高的80％。
表面形态特征：
用SEM对组装在PG/CS表面的{PAA-PBA/Dex}6，{PAA-PBA/Dex}6/PAA-PBA和 {PAA-PBA/Dex}6-Mb层层组装薄膜的表面形貌进行了表征(图2、3、4)。从图中 可以看出，在相同的放大倍率下，{PAA-PBA/Dex}6薄膜和 {PAA-PBA/Dex}6/PAA-PBA薄膜的表面形貌比较平整，并能观察到一些孔洞或通 道，没有表现出明显的差异，表明组装过程中相邻的PAA-PBA与Dex层有一定 程度的相互交错或者渗透。而{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜显示出相对粗糙的表面， 说明溶液中的Mb分子不但被“吸入”到薄膜的内部，而且吸附在{PAA-PBA/Dex}6薄膜的表面。在这里，需要说明的是被“吸入”到薄膜的内部的Mb对 {PAA-PBA/Dex}6-Mb直接电化学响应做出了主要贡献，这是因为溶液中的Mb在 薄膜表面的吸附过程一般不到30min即可达到稳态[ii]，而本实验中Mb在 {PAA-PBA/Dex}6薄膜中的固载达到稳态所需要的时间大约需要9h，表明蛋白质 进入薄膜是一个相对缓慢的过程。
测试底液中pH和支持电解质的影响：
测试底液的pH对{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜的CV响应也有很重要的影响。将 已经吸入Mb达稳态的{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜电极置于含有0.1M的NaCl而不 同pH的测试底液中进行CV扫描，Mb的CV峰位置表现出明显的移动。若定义 CV氧化峰和还原峰的峰电位的平均值作为体系的式量电位(E°′)，E°′随着底液 的pH的增加而负移。在pH 4.0到9.0范围内，E°′与测试底液的pH成线性关系， 斜率为-53.3mV pH-1。该值近似于具有相同质子与电子转移数的伴随着有质子 转移的可逆电极反应的理论值-58mV pH-1(20℃)。由此说明该薄膜电极上Mb 的血红素辅基在发生单电子传递的同时，很可能伴随着一个质子的转移： MbFe(III)+H++e-＝MbFe(II)。
根据电子跳跃机理，{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜中Mb分子与电极之间发生 电子交换时为了补偿电子转移过程中造成的薄膜内的电荷改变，即维持薄膜相 的电中性，溶液相中的对离子必须能够进入或离开薄膜相以补偿由于电子转移 造成的薄膜内部电荷的不均衡。例如，当薄膜内MbFe(III)发生还原时，薄膜内 会产生多余的负电荷，因此需要薄膜相中的阴离子转移到溶液相，或者溶液相 中的阳离子转移到薄膜相，以补偿由于电子转移所产生的多余负电荷。因此我 们选用相同浓度的不同支持电解质作为测试底液来对薄膜进行CV测试，考察 了不同类型支持电解质对{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜电化学行为的影响。实验结 果表明：不同的支持电解质对{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜的CV峰形的影响很小， 它们峰高和峰电位基本一致。
{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜的电催化性质：
用循环伏安法法研究了{PAA-PBA}6-Mb薄膜电极对氧气和过氧化氢等底物 的电化学催化还原行为。当用注射器向经过除氧的pH 7.0缓冲溶液中注入一定 量的空气后，与通入氧气之前相比，可以观察到{PAA-PBA}6-Mb薄膜电极在大 约-0.4V左右的CV还原峰电流随着空气通入量的增加而显著增加，并且伴随 着MbFe(II)氧化峰的消失，这是由于MbFe(II)已经与溶液中的氧发生了化学反 应。而对于不含Mb的{PAA-PBA}6薄膜电极，氧气直接还原的峰电位大约在-0.9 V左右。因此，{PAA-PBA}6-Mb薄膜中的Mb使氧的还原过电位降低了大约0.5 V。结果证明了薄膜中的Mb可以有效地电催化还原O2。
{PAA-PBA}6-Mb薄膜电极也可以用来电催化还原H2O2。将H2O2注入pH 7.0的缓冲溶液中，CV结果显示：{PAA-PBA}6-Mb薄膜电极中Mb的CV氧化 峰降低而还原峰显著增大，并随着溶液中H2O2浓度的增大，还原峰电流值逐渐 增高，线性范围2.0-85μM。然而对于不含Mb的{PAA-PBA}6薄膜，在扫 描电位0.1至-1.2V的电位范围内则没有观察到H2O2的直接电化学还原信号。
本发明首先合成了既含有PBA基团又含有羧酸基团的聚电解质PAA-PBA， 然后将PAA-PBA作为成膜材料，利用PAA-PBA和Dex二者之间的硼酸-二醇 特异性识别作用，采用层层组装(LbL)技术，在电极表面上成功构筑了 {PAA-PBA}n LbL薄膜。生物大分子Mb可以自发地从pH 5.0的缓冲溶液中进 入该多层薄膜中，形成稳定的{PAA-PBA/Dex}n-Mb LbL薄膜。{PAA-PBA}n薄 膜为保持Mb的生物活性提供了适宜的微环境，并成功实现了Mb在薄膜中的 直接电化学及其对氧和过氧化氢的电催化还原。采用各种方法表征了 {PAA-PBA}n多层膜的组装及{PAA-PBA}n-Mb薄膜的性质，如循环伏安法(CV)、 电化学阻抗法(EIS)和扫描电子显微镜(SEM)等。本发明利用硼酸-二醇特异性识 别作用构筑的{PAA-PBA/Dex}n-Mb吸入型蛋白质层层组装薄膜是一种新类型 的蛋白质LbL薄膜，可作为不依赖于媒介体的电化学生物传感器的基础，为设 计基于酶的直接电化学的生物传感器提供了一个新的思路。另外，本发明对该 模型体系中{PAA-PBA/Dex}n多层膜的组装及Mb吸入过程中的各种相互作用力 的探讨也可以有助于发展新型的基于蛋白质直接电化学的生物传感器和生物反 应器。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还 可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法，其特征在于，包括：
通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸PAA的羧基之间的缩合反应将苯硼酸PBA基团接枝到聚丙烯酸PAA骨架上，得到产物聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA；然后利用聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA与葡聚糖Dex之间的硼酸-二醇特异性识别作用在热解石墨PG电极表面上组装{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜，然后再从溶液中吸入肌红蛋白Mb，形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜。
2.根据权利要求1所述的基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法，其特征在于，聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA的合成包括：
聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA聚电解质是由聚丙烯酸PAA与3-氨基苯硼酸半硫酸盐APBA在交联剂N-羟基丁二胺磺酸钠NHS和N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC存在的条件下发生缩合反应，将PBA接枝到PAA骨架上而合成的，其合成路线如下式所示：
3.根据权利要求2所述的基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法，其特征在于，聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA的合成具体包括：
将0.57g的聚丙烯酸PAA水溶液，聚丙烯酸PAA水溶液含有2.77mmol单体用20mL,50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液稀释，将溶液pH调至8.5；将20mL,61mM的3-氨基苯硼酸半硫酸盐APBA同样溶于pH 8.5的20mL,50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液中；然后将上述两种溶液混合；逐滴加入含有4mL,31mM的N-羟基丁二胺磺酸钠NHS的50mM,pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液，并搅拌10min；将含有4mL,310mM的N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC的50mM,pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液加入上述反应混合溶液中，室温下搅拌12h；然后将上述溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干燥后得到产物聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA，为白色粉末状固体。
4.根据权利要求1所述的基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法，其特征在于，{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜的组装包括：
热解石墨PG电极的制作：用热缩管将直径为4.5mm，长6mm左右的圆柱型热解石墨密封在直径与之相等的不锈钢圆柱棒一端，使热解石墨PG的一侧表面紧贴在不锈钢棒一端的表面，从而形成导电通路，而热解石墨PG的另一侧表面作为电极表面；将电极表面在320目的金相砂纸上打磨后，再在蒸馏水中超声30s，洗净吹干，即可作为工作电极；电极表面的几何面积为0.16cm2；
将处理好的PG电极首先浸入带有正电荷的1mg mL–1,pH 5.0壳聚糖CS溶液中15min，使之在热解石墨PG表面吸附一层壳聚糖CS前驱膜；然后将PG/CS电极交替浸入带有负电荷的1mg mL–1,pH 9.0的PAA-PBA和中性1mg mL–1,pH 9.0的Dex水溶液中各15min，溶液转换时用水清洗并吹干，在电极表面形成一个PAA-PBA/Dex双层；重复上述过程直到在PG/CS表面上形成所需双层数的{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜；将组装好的上述薄膜电极浸入1mg mL–1的Mb溶液，中预定时间，以确保Mb分子扩散进入到薄膜内部，然后取出洗涤并吹干，表示为{PAA-PBA/Dex}n-Mb；Mb溶液为pH 5.0，含0.2M NaCl。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710328029.6A CN107144616A (zh) | 2017-05-11 | 2017-05-11 | 基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710328029.6A CN107144616A (zh) | 2017-05-11 | 2017-05-11 | 基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107144616A true CN107144616A (zh) | 2017-09-08 |
Family
ID=59778570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710328029.6A Pending CN107144616A (zh) | 2017-05-11 | 2017-05-11 | 基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107144616A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107621553A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-23 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种微生物放大成像检测方法 |
| CN108982606A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-11 | 南京市第二医院（江苏省传染病医院、南京市公共卫生医疗中心） | 基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法 |
| CN112838221A (zh) * | 2019-11-22 | 2021-05-25 | 大唐环境产业集团股份有限公司 | 一种微生物电极及其制备方法 |
| CN114527174A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-05-24 | 山西农业大学 | Papba-rgo多层膜电极制备方法及氟离子检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102775078A (zh) * | 2012-03-13 | 2012-11-14 | 大庆麦伯康生物技术有限公司 | 对糖类物质有浓度响应的可降解的苯硼酸/粘液素层层自组装超薄膜 |
| CN105842317A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-08-10 | 宁夏医科大学 | 一种pH调控的双酶电化学生物传感器及其制备方法 |
| CN106117254A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-16 | 许昌豪丰化学科技有限公司 | 一种羧基苯硼酸的合成工艺 |
| CN106645335A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-05-10 | 浙江大学 | 一种一步还原沉积石墨烯/苯硼酸复合物用于葡萄糖检测的方法 |
-
2017
- 2017-05-11 CN CN201710328029.6A patent/CN107144616A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102775078A (zh) * | 2012-03-13 | 2012-11-14 | 大庆麦伯康生物技术有限公司 | 对糖类物质有浓度响应的可降解的苯硼酸/粘液素层层自组装超薄膜 |
| CN105842317A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-08-10 | 宁夏医科大学 | 一种pH调控的双酶电化学生物传感器及其制备方法 |
| CN106117254A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-16 | 许昌豪丰化学科技有限公司 | 一种羧基苯硼酸的合成工艺 |
| CN106645335A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-05-10 | 浙江大学 | 一种一步还原沉积石墨烯/苯硼酸复合物用于葡萄糖检测的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 姚惠琴 等: "基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜对肌红蛋白的吸入及其电化学研究", 《高等学校化学学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107621553A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-23 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种微生物放大成像检测方法 |
| CN108982606A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-11 | 南京市第二医院（江苏省传染病医院、南京市公共卫生医疗中心） | 基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法 |
| CN108982606B (zh) * | 2018-08-14 | 2020-09-25 | 南京市第二医院（江苏省传染病医院、南京市公共卫生医疗中心） | 基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法 |
| CN112838221A (zh) * | 2019-11-22 | 2021-05-25 | 大唐环境产业集团股份有限公司 | 一种微生物电极及其制备方法 |
| CN112838221B (zh) * | 2019-11-22 | 2022-03-01 | 大唐环境产业集团股份有限公司 | 一种微生物电极及其制备方法 |
| CN114527174A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-05-24 | 山西农业大学 | Papba-rgo多层膜电极制备方法及氟离子检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105784825B (zh) | 一种基于单壁碳纳米角修饰电极的电化学酶传感器制备及应用 | |
| Dong et al. | Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin in composite film based on ionic liquid and NiO microspheres with different morphologies | |
| Li et al. | Direct electron transfer for heme proteins assembled on nanocrystalline TiO2 film | |
| Jia et al. | Direct electrochemistry and electrocatalysis of horseradish peroxidase immobilized in sol–gel-derived tin oxide/gelatin composite films | |
| Yogeswaran et al. | Separation and concentration effect of f-MWCNTs on electrocatalytic responses of ascorbic acid, dopamine and uric acid at f-MWCNTs incorporated with poly (neutral red) composite films | |
| Sun et al. | Electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin on multi-walled carbon nanotubes modified carbon ionic liquid electrode with hydrophilic EMIMBF4 as modifier | |
| Sun et al. | Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin on three-dimensional graphene modified carbon ionic liquid electrode | |
| CN102426868B (zh) | 水溶性石墨烯-贵金属纳米复合物及其制备方法和应用 | |
| Bagheri et al. | Modified fractal iron oxide magnetic nanostructure: a novel and high performance platform for redox protein immobilization, direct electrochemistry and bioelectrocatalysis application | |
| Liu et al. | Heme protein-gluten films: voltammetric studies and their electrocatalytic properties | |
| Liu et al. | Electrochemical characteristics of glucose oxidase adsorbed at carbon nanotubes modified electrode with ionic liquid as binder | |
| CN106645347A (zh) | 一种基于血红蛋白‑纳米钯‑石墨烯复合材料的电化学生物传感器件的制备及其应用研究 | |
| CN107037104A (zh) | 一种基于石墨烯量子点修饰电极的蛋白质电化学传感器件及其制备与应用 | |
| CN107144616A (zh) | 基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法 | |
| Zhao et al. | Innovative biocompatible nanospheres as biomimetic platform for electrochemical glucose biosensor | |
| CN105907844B (zh) | 一种基于三维石墨烯-树枝状纳米金的电化学dna生物传感器及制备方法 | |
| Zhang et al. | An amperometric hydrogen peroxide biosensor based on the immobilization of HRP on multi-walled carbon nanotubes/electro-copolymerized nano-Pt-poly (neutral red) composite membrane | |
| Prakash et al. | Direct electrochemistry of catalase at multiwalled carbon nanotubes-nafion in presence of needle shaped DDAB for H2O2 sensor | |
| Shi et al. | Application of titanium dioxide nanowires for the direct electrochemistry of hemoglobin and electrocatalysis | |
| Liu et al. | Direct electrochemistry of hemoglobin in biomembrane-like DHP–PDDA polyion-surfactant composite films | |
| Ke et al. | Electrochemistry and electrocatalysis of myoglobin on carbon coated Fe 3 O 4 nanospindle modified carbon ionic liquid electrode | |
| Dong et al. | Design synthesis of polypyrrole–Co3O4 hybrid material for the direct electrochemistry of hemoglobin and glucose oxidase | |
| Li et al. | An electrochemical investigation of hemoglobin and catalase incorporated in collagen films | |
| Wang et al. | Electrochemistry and electrocatalysis with myoglobin in biomembrane-like DHP–PDDA polyelectrolyte–surfactant complex films | |
| CN103267788A (zh) | 基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170908 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |