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CN107109348B - 益生菌青春双歧杆菌菌株 - Google Patents

益生菌青春双歧杆菌菌株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及青春双歧杆菌的新型分离菌株，其能够i)在10h处理之后将Caco‑2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；ii)诱导IL‑10分泌>200pg/ml；和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL‑10:IL‑12比率>1。所述菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。本发明涉及这些新型菌株用于预防、减轻症状、以及治疗具有潜在受损的肠道屏障功能和粘膜的促炎激活的疾病或病状的用途。更具体地，本发明涉及根据本发明的分离菌株用于预防、减轻症状、或治疗以下疾病的用途：炎性肠病如IBD和IBS；肝病如NAFLD、NASH、肝硬化及酒精相关性肝病；代谢失调如代谢综合征、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、心血管动脉粥样硬化；自身免疫性疾病如乳糜泻、1型糖尿病、多发性硬化症及类风湿性关节炎；以及心理病状如严重抑郁症、心境障碍、认知障碍、慢性疲劳综合征、及焦虑。

Description

益生菌青春双歧杆菌菌株
技术领域
本发明涉及青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的新型分离菌株，其能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml；和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所述菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
此外，本发明涉及这些菌株用于改善肠道屏障功能和/或引发抗炎免疫应答的用途。
本发明的一个实施方案涉及一种青春双歧杆菌菌株，其发酵D-核糖，不发酵D-山梨糖醇，并且具有包含以下的16S核糖体基因序列：SEQ ID NO:1或2；SEQ ID NO:3、4或5；SEQ ID NO:6、7、8或9；以及SEQ ID NO:10或11。
背景技术
双歧杆菌是胃肠道的天然栖居者，其具有遗传适应性使其能够定殖此苛刻且复杂的生境。双歧杆菌与肠道功能的关键要素相互作用并且有助于维持体内平衡。近期的科学进展显示双歧杆菌通过与宿主的菌株依赖性相互作用可降低粘膜抗原负载，改善肠道屏障并且诱导局部和全身免疫应答的调节。由于其对人类健康公认的益处，双歧杆菌被用作益生菌。益生菌是“活的微生物，当其以足量施用时，向宿主提供健康益处”(FAO/WHO,2001)。可商购获得约一打具有临床上记录的效果的双歧杆菌属菌株。这些中的一半是动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株并且其余是长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)、长双歧杆菌婴儿亚种(B.longumsubsp.infantis)、或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)菌株。
青春双歧杆菌的模式菌株(ATCC15703T)是从成人的肠道中分离(Reuter,1971)。青春双歧杆菌菌株经常在成人肠道中检测到(Turroni等人,2009)。
肠道上皮是覆盖小肠和大肠的柱状且无纤毛的细胞层。肠道上皮层构成了针对外界环境的最大且最重要的屏障并且维持上皮完整性对保持健康必不可少。上皮衬层是由被由特化的杯状细胞产生的多层粘液覆盖的单层上皮细胞组成。在上皮细胞下面是含有多种免疫细胞的固有层(肠相关淋巴组织；GALT)。上皮细胞通过其中紧密连接(TJ)在防止分子进入细胞之间的上皮中起主要作用的细胞连接结合在一起。
TJ负责限制蛋白质、脂质及小溶质的细胞旁(细胞之间)扩散。因此，在健康上皮中，仅水和小分子(离子)细胞旁渗透，而较大分子的转运是通过细胞摄取机制来调节。TJ是由跨越两个邻近肠道上皮细胞之间的空间的蛋白质组成。TJ是参与发育、生理及病理过程的动态结构。各种应激物可致使TJ削弱，由此增强分子向粘膜中的细胞旁(未经调节的)转运。受损的肠道屏障功能的特征是肠粘膜对腔内大分子、抗原及毒素的渗透性增加，由此可引起粘膜的发炎、变性和/或萎缩。此病状，有时称为‘肠漏综合征’，取决于严重性而与许多症状有关。来源于肠道中的革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)是非常有效的免疫应答激活剂。一旦粘膜免疫系统被激活，促炎介质便加剧TJ的开放，从而导致增加的渗透性和发炎的恶性循环。
已显示益生菌菌株在体外(Anderson等人,2010；Karczewski等人,2010；Liu等人,2010a；Liu等人,2010b；Donato等人,2010)、在小鼠模型中(Generoso等人,2010；Liu等人,2011；Miyauchi等人,2009)、以及在人中(Karczewski等人,2010)降低肠上皮渗透性。已经发现了体外与体内结果之间的一般良好一致性。
参与屏障功能的益生菌改善的机制包括TJ蛋白的增加表达，如闭合蛋白(occludin)、密封蛋白(claudin-1)、F11受体(F11R)及闭锁小带1(ZO-1)和2(Anderson等人,2010；Liu等人,2010a；Liu等人,2010b；Miyauchi等人,2009；Ukena等人,2007。闭合蛋白和ZO-1向TJ结构附近的增加定位见于用植物乳杆菌WCFS1(Karczewski等人,2010)或鼠李糖乳杆菌LGG(Donato等人,2010)处理的人活体组织活检(Karczewski等人,2010)以及Caco-2单层中，可能涉及Toll样(TLR)受体2信号传导(Karczewski等人,2010)。
在坏死性小肠结肠炎(NEC)的新生小鼠模型中，发现肠道渗透性增加先于NEC，而婴儿双歧杆菌BB-02施用削弱了肠道渗透性增加，保留闭合蛋白及密封蛋白2和4在TJ处的定位，并且降低NEC发病率(Bergmann等人,2013)。与小鼠中的结肠炎有关的肠道渗透性增加通过益生菌(VSL#3)抵消闭合蛋白、ZO-1、以及密封蛋白-1、-3、-4及5的表达减少和再分布而得以完全预防(Mennigen等人,2009)。所提出的细菌信号组分包括植物乳杆菌表层蛋白质(Liu等人,2010a)和吲哚(Bansal等人,2010)。
在体内，屏障功能可通过各种非侵入性测定法通过施用大丸剂的例如CrEDTA或两种非代谢糖(例如，乳果糖和甘露糖醇)接着分别测定在尿中的Cr或两种糖的比率来测量。甘露糖醇是单糖且因此容易吸收并充当跨细胞摄取的标记物，而二糖的乳果糖通过细胞衬里被排除且由此仅稍微吸收并充当粘膜完整性的标记物。乳果糖和甘露糖醇测试由于糖在大肠中的细菌分解而提供仅与小肠有关的完整性信息，而CrEDTA更稳定并优先提供有关结肠上皮的信息，因为这里是化合物存在时间最久的地方(Arrieta等人,2006)。
不足的肠道屏障功能与肠道及全身临床表现有关。肠道渗透性在炎性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的情形中被研究得最广泛。炎性肠病(IBD；克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)的特征是慢性复发性肠炎，伴有先天和适应性免疫系统的参与(Zhang和Li,2014)。涉及细胞因子白介素23(IL-23)和T辅助17(TH17)细胞的促炎途径在患有溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的患者中是增加的(Song等人,2013)，这得到了提示IL23R基因中的基因变体与IBD之间的关联的遗传研究的支持(Beaudoin等人,2013)。IBD的病因学是未知的，但在IBD中存在肠道屏障功能受损的广泛支持数据(Gecse等人,2011；Gerova等人,2011；Odenwald和Turner,2012)。在具有活动性疾病的克罗恩氏病患者中发现肠道渗透性提高(Ukabam等人,1983)并且患有克罗恩氏病的患者的10-20％的健康亲属具有增加的渗透性(Hollander等人,1986)。IBD发病机理的一个理论提示增加的肠道渗透性将下层的GALT暴露于通常被排除的物质，由此产生自身延续性炎症过程(Poritz等人,2007)。在葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎小鼠模型中，已显示增加的肠道渗透性发生在显著的肠炎进展之前(Poritz等人,2007)。
肠易激综合征(IBS)的症状包括腹绞痛和腹痛，其常常与伴有腹泻、便秘或两者交替发作的异常排便习惯同时出现。IBS的病因学和病理生理学是未知的。若干研究已显示在IBS中肠道渗透性增加(Camilleri等人,2007；Camilleri等人,2012；Gecse等人,2011；Martinez等人,2012；Piche等人,2009)。增加的渗透性是由TJ蛋白质密封蛋白-1、ZO-1及闭合蛋白的正常顶端表达的破环引起(Camilleri等人,2012)。增加的肠道渗透性伴随有肠道中的持续性低级免疫激活。先前研究发现在IBS患者中升高的粪便钙卫蛋白(Goepp等人,2014)指示增强的炎症。细胞因子失调也可参与炎症过程并且近期的元分析显示了IL-10和肿瘤坏死因子α(TNFα)基因多态性与IBS之间的关联(Qin等人,2013；Schmulson等人,2013；Bashashati等人,2012)。与对照相比在IBS中观察到TNFα细胞因子的血清/血浆不平衡(Bashashati等人2014)并且在腹泻型IBD患者中IL-6和TNFα的血清水平与对照相比显著较高(Rana等人,2012)。总之，这提示朝向更高促炎阶段的免疫移位。
用益生菌发酵的牛奶(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸杆菌及长双歧杆菌)的处理显著降低IBS患者中的小肠渗透性并且改善平均总IBS分数(Zeng等人,2008)。
慢性肝病与肠道中的变化有关并且肝病与肠道微生物的变化有关(Schnabl和Brenner,2014)。微生物组成的这些变化可经由识别微生物产物的TLR受体和Nod样受体(NLR)引起粘膜免疫系统的激活，随后活化的B细胞的核因子κ轻链增强子(NF-KB)激活引发免疫细胞募集(Chassaing等人2014)。遗传修饰的动物如TLR4突变小鼠与野生型小鼠相比在胆管结扎之后发生显著较轻的肝脏纤维化和肝脏巨噬细胞募集，表明TLR4途径参与慢性肝病的发展(Seki等人2007)。显示胆汁淤积性肝病与肠道固有层中的局部炎症之间的联系是通过分泌TNFα的TLR2阳性单核细胞所介导，这也与TJ蛋白质ZO-1和密封蛋白-4的破坏有关(Hartmann等人2012)。细菌或其产品例如LPS向肠系膜淋巴结及肠外部位的移位在具有肝硬化的患者中由于增加的肠道渗透性而较为常见(Seo和Shah,2012)，并且在具有慢性肝病和伴有细菌移位的肠道细菌过度生长的患者中，疾病严重度与全身LPS水平有关(Lin等人1995)。在动物模型和慢性肝病患者两者中，抗生素治疗通过减小细菌负荷和内毒素血症来降低疾病严重度(Seki等人2007；Cirera等人2001)。然而，肠漏和微生物产品的移位也出现在疾病初期并且患有肝病的患者具有受到破坏的肠道屏障，且在体循环中发现细菌产物。微生物产物经由门静脉或淋巴导管到达肝脏，在那里它们激活了先天免疫系统的肝脏受体(Schnabl,2013)。
由Miele等人(2009)在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者中进行的实验强烈地提示NAFLD与增加的肠道渗透性和小肠细菌过度生长有关。细菌移位与促炎细胞因子的血浆水平及氧化氮合酶的活化有关(Frances等人,2010)，这可造成肝损伤。因此，减少细菌移位可代表减轻肝病的治疗。
细菌向肠系膜淋巴结、门脉及动脉血液中移位的减少见于在用乳杆菌属(嗜酸乳杆菌NM1、鼠李糖乳杆菌GG、植物乳杆菌299v、鼠李糖乳杆菌271及动物乳杆菌NM2)的组合处理之后的急性肝损伤大鼠模型中。另外，降低水平的肠杆菌科(革兰氏阴性细菌)见于盲肠和结肠中。通过血清丙氨酸转氨酶水平的降低指示肝细胞损伤的减轻(Adawi等人,2001)。益生菌处理不仅减少细菌移位，而且减轻由内毒素(主要是来源于革兰氏阴性细菌的LPS)所引起的内毒素血症。似乎合理的是，内毒素经由枯否细胞刺激和TNFα产生而对NAFLD及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发展很重要(Osman等人,2007)。降低的血浆内毒素水平可以是减小的肠道渗透性的结果。
在用两种益生菌混合物(双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌及肠球菌
Figure GDA0001295487620000051
或枯草芽孢杆菌和屎肠球菌
Figure GDA0001295487620000052
)(Wigg等人,2001)、或合生素产物的治疗(戊糖片球菌5-33:3、肠膜明串珠菌32-77:1、副干酪乳杆菌副干酪亚种F19、植物乳杆菌2592+生物活性的可发酵纤维；Medipharm)、或益生菌混合物单独的治疗(Zhao等人,2004)之后，在肝硬化患者中发现降低浓度的血浆内毒素。在肝硬化患者中，与安慰剂相比在用大肠杆菌Nissle 1917治疗之后发现内毒素血症的微小降低。
众所周知，酒精增加肠道渗透性并且这可以通过增加门脉循环内毒素(LPS)加速肝病的进展。发现来自鼠李糖乳杆菌LGG的可溶性因子减少酒精诱导的肠道渗透性增加和内毒素移位，并且改善小鼠模型中急性酒精诱发的肝损伤(Wang等人,2012)。通过益生菌改善肠道屏障已在体外和体内得到充分证明。鉴于细菌移位和内毒素血症对肝病发展的重要性，似乎可能的是具有肠道屏障加强性质的益生菌将对NAFLD和NASH具有有益效应。
代谢失调(2型糖尿病和胰岛素抗性)和肥胖症与炎症紧密相关。最近有证据提示高脂饮食与细菌之间的相互作用，并且肠粘膜可以促进小肠炎症作为在肥胖症和胰岛素抗性发展中的早期事件(Ding和Lund,2011)。动物研究显示在体重和脂肪增加之前，在高脂饮食喂养的小鼠的回肠中TNFα的上调变得明显，并且NF-KB的促炎途径也在高脂饮食喂养的小鼠的回肠中上调且在结肠中以较小程度上调(Ding等人,2010)。在严重肥胖儿童中，粪便钙卫蛋白在47％的患者中增加，而直肠硝酸在88％的肥胖儿童中病理性地较高，并且在100％糖尿病患者中支持远端肠炎牵涉于肥胖症和糖尿病中的假说(Spagnuolo等人,2010)。在肥胖女性的研究中，促炎途径的基因表达在饮食诱发的体重减轻平均10％之后显著下调，伴随有TNFα、IL-1β、IL-8及单核细胞趋化蛋白1和巨噬细胞浸润的减少(Pendyala等人,2011)。总而言之，这些数据意味着在肥胖受试者和糖尿病患者中的肠道与健康受试者相比具有增强的炎症状态，并且这可以推进体重增加和葡萄糖/胰岛素失衡的发展。无菌小鼠受到保护以免暴露于高脂/高精制糖‘西方’饮食而发生代谢并发症。移位的细菌LPS已被鉴定为低级慢性炎症(称为‘代谢型内毒素血症’)的触发因子(Cani等人,2007)。根据此模型，LPS是从肠道中溶解的革兰氏阴性细菌中释放并且当(例如由于含有高脂肪的饮食)屏障受损时移位穿过上皮。提高的血浆LPS水平(2-3倍)引起稍微增强但持续性的炎性状态，这触发了体重增加和胰岛素抗性(Cani等人,2007)。LPS和肠道渗透性标记物(连蛋白)的提高的循环水平见于具有2型糖尿病(Hawkesworth等人,2012；Jayashree等人,2014)以及1型糖尿病(de Kort等人,2011；Vaarala等人,2008)的患者中。连蛋白上调，即提高的肠道渗透性，似乎先于1型糖尿病的发病出现(Sapone等人,2006)。双歧杆菌的肠道定殖通过增加ZO-1和闭合蛋白的表达增强肠道屏障功能，并且显著并积极地改善葡萄糖耐量、葡萄糖诱导的胰岛素分泌并且正常化炎症状态(Cani等人,2007)。
由于肠道屏障完整性丧失所致的代谢型内毒素血症激活TLR4介导的炎症并诱导氧化应激，氧化应激与增加的心血管风险和死亡有关。LPS穿过肠道屏障的移位增加造成较高的LPS循环水平，这促进了动脉粥样硬化(Neves等人,2013)。全身炎症标记物如循环LPS在具有慢性感染的患者中升高并且是增加的动脉粥样硬化风险的有力预测因子(Kiechl等人,2001)。
自身免疫性疾病的关键要素是适应性免疫和在TH1与TH2免疫应答之间的不平衡。在新生儿中，微生物抗原可诱导TH1免疫应答，其抵消了通常占主导的TH2免疫应答。TH1免疫应答是自身免疫性和炎性疾病的特征。近来，已提出受损的肠道屏障牵涉于自身免疫性疾病的发展中(Fasano和Shea-Donohue,2005)。根据此假说，在自身免疫性疾病的发病机理中存在三个关键要素。
1.先天与适应性免疫之间的错误沟通。
2.非自身抗原(环境触发物)的连续刺激使该过程延续。
3.与环境相互作用的粘膜屏障的保护功能的丧失(胃肠及肺粘膜)。
乳糜泻的病理学是一个例子。在乳糜泻发展的初期，TJ开放且肠组织损伤发生。醇溶蛋白以MyD88依赖性方式触发连蛋白先天免疫途径，所述方式引发了TJ的开放并诱发肠粘膜中的促炎(TH1)反应。一旦将醇溶蛋白(谷蛋白)从饮食中除去，血清连蛋白水平便降低，肠道恢复其基线屏障功能，自身抗体滴度被归一化，并且自身免疫过程关闭(Fasano和Shea-Donohue,2005；Fasano,2012)。
包括1型糖尿病、多发性硬化症及类风湿性关节炎的若干其他自身免疫性疾病的特征是增加的肠道渗透性，这允许抗原从肠道微生物群通过，攻击免疫系统以产生免疫应答，该免疫应答可以靶向遗传易感个体中的任何器官或组织(通过分子模拟)(Fasano,2012)。此外，已认识到尤其是小肠的免疫系统诱发针对例如食物抗原或可参与自身免疫性疾病发展的共生体的耐受性应答。小肠被确认重定向并控制促炎TH17细胞(Esplugues等人2011)并且已提出益生菌可通过调节肠道免疫系统起作用并因此抑制类风湿性关节炎和多发性硬化症的动物模型中的病情发展和严重性(So等人,2008；Kwon等人,2013)。
无菌小鼠与常规小鼠相比具有针对应激的放大的下丘脑-垂体-肾上腺反应，这可通过与婴儿双歧杆菌的单一联合来逆转，提示肠道细菌与大脑之间的串扰(cross-talk)(Sudo等人,2004)。增加的肠道渗透性、细菌移位及TLR4途径的激活暗示为心理障碍与躯体疾病(包括心境障碍、认知障碍及慢性疲劳综合征)之间的联系。TLR4途径标记物的增加的表达见于诊断有严重抑郁症的患者中，伴随增加的细菌穿过肠道屏障的移位(Keri等人,2014)。移位的革兰氏阴性肠道细菌及LPS激活免疫细胞以引发IgA和IgM应答，这引起了与神经炎症和神经进展有关的以及与忧郁症状发作有关的免疫途径的进行性放大，所述忧郁症状例如快感缺乏、厌食、体量下降、精神运动性阻滞、焦虑及疲乏(Maes等人,2012)。
跨上皮电阻(TER)
上皮细胞单层的屏障性能在很大程度上取决于位于细胞间隙中的TJ，在所述细胞间隙处，TJ在顶端与基底外侧膜结构域之间形成密封并且调节分子的细胞旁穿过。屏障功能不是静态的但可通过暴露于特定的刺激而有意地调节。所获得的TJ网状结构的动态性质可方便地通过测量跨上皮电阻(TER)来追踪。Caco-2是来源于人结肠腺癌的构建成熟的细胞系，其通常被用作肠道渗透性模型。当完全分化，Caco-2单层形成TJ，限制离子转移且由此产生跨过单层的电阻。
BDTM细胞计数珠阵列(CBA)
内衬于人胃肠道中的粘膜相关淋巴组织含有免疫细胞的网络。树突细胞(DC)通过肠内容物的取样并经由模式识别受体信号传导、细胞因子分泌及其在引流淋巴结中将抗原迁移并递呈给幼稚T细胞的能力引发对腔内抗原的适当免疫应答来控制免疫力与耐受性之间的平衡。在体内平衡时，肠粘膜中的DC受到共生微生物的调节以促进Foxp3+调节性T细胞(Treg)的增殖，所述Treg是促成肠道耐受性的抗炎IL-10的强产生者。移位穿过上皮细胞层的腔内抗原结合至DC上表达的模式识别受体并且激活信号传导途径，造成具有不同炎性效应的广泛多种趋化因子和细胞因子的产生与分泌。在此情形中，DC分泌炎性细胞因子如TNFα、IL-1b、IL-6及IL-12对于涉及将嗜中性白细胞和巨噬细胞吸引到感染部位的急性、先天炎性应答很重要。另外，DC是适应性免疫应答调节中的重要参与者，因此，对于IL-10分泌表型的DC调节有助于Treg应答的诱发，该应答促进肠道耐受性(Smith等人,2014)。基于流式细胞术原理的多路免疫测定允许以极少样品体积同时测定许多可溶性蛋白质。高通量与印象深刻的准确度、灵敏度及重现性的组合使得这些实验技术与其中多种化合物的快速定量很重要的筛选目的高度相关。
DSS结肠炎模型
啮齿动物葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎模型的特征是不受控制的结肠炎症。在许多方面其类似于IBD，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病，其全世界发病率和发生率已显示增加(Molodecky等人,2012)。DSS结肠炎的潜在病理生理机制包括肠道屏障功能的最初破环，接着是炎症和小囊损失(Cooper等人,1993；Iwaya等人,2012；Poritz等人,2007)。DSS结肠炎中的疾病症状对应于在人UC中所观察到的，包括体重损失、腹泻及便血(Herias等人,2005)。DSS借此诱发结肠炎的确切机制尚未阐明，然而，已经认识到DSS与存在于结肠腔中的中链长度脂肪酸有关，并形成能够与结肠上皮细胞膜融合的小囊，这引起细胞质中的炎性信号传导途径的激活(Laroui等人,2012)。近期的研究结果还显示内结肠粘液层(通常不含细菌)的厚度在DSS暴露之后仅15分钟减小并变得对细菌可渗透。。DSS暴露之后12小时内，观察到细菌与上皮层的相互作用，这可激活炎症(Johansson等人,2010)。如同在健康的啮齿动物中，细菌明显地与健康人中的上皮结肠层分离，而在具有急性炎症的溃疡性结肠炎患者中，细菌渗透内粘液层(Johansson等人,2014)，表明在DSS诱发的结肠炎模型与人炎性GI病症之间的共同病理。
DSS诱发的病理的一个早期事件是紧密连接ZO-1的损失和肠道渗透性的增加，先于肠炎出现(Poritz等人,2007)，这可表明DSS破坏肠道屏障功能，允许毒素、抗原以及维持炎症的细菌的全部或部分的渗透。这也非常符合人类研究结果，其中在肠道发炎状况期间，肠道渗透性受损，连同TJ基因明显下调(Koltun等人,1998；Gassler等人,2001)。有趣的是，在溃疡性结肠炎患者中，在嗜中性白细胞活跃迁移的结肠粘膜区域，发现像ZO-1、密封蛋白-1、JAM、β-连环蛋白及闭合蛋白的TJ基因下调(Kucharzik等人,2001)，提示在TJ的破坏与炎症之间的密切联系。
双歧杆菌、乳杆菌及混合物已显示在小鼠和大鼠的DSS诱发的结肠炎中的功效(Chen等人,2009；Kim等人,2010；Geier等人,2007；Mennigen等人,2009)。已提出不同的益生菌作用模式涉及强化肠道上皮屏障和调节炎性途径如细胞因子信号传导。举例来说，除疾病活动指数之外，罗伊氏乳杆菌还抑制细菌从肠移位到肠系膜淋巴结(Dicksved等人,2012)，这可提示增加的屏障功能作为疾病严重度抑制机制的一部分。大肠杆菌Nissle1917也显示通过加强肠道渗透性和TJ蛋白表达如ZO-1抑制DSS诱发的结肠炎(Ukena等人,2007)。虽然此作用模式到目前为止没有在人类中得到直接证实，但大肠杆菌Nissle 1917已被报道在预防溃疡性结肠炎复发中是有效的(Kruis等人,1997；Kruis等人,2004)，表明在啮齿动物与人类之间机制的相似性。
通过利用益生菌在DSS诱导的结肠炎期间来调节炎性途径也显示有效地抑制疾病严重度。Yao和同事用含有IL-10的质粒转染长双歧杆菌并且向暴露于DSS的小鼠给予细菌。转染过的细菌通过下调NF-KB途径减轻结肠炎症状，否则将导致各种促炎细胞因子的产生(Yao等人,2011)。另一方面，Miyauchi及其他人指出长双歧杆菌婴儿亚种能够通过抑制结肠组织中的1型辅助T(TH1)特异性细胞因子和产IL-17的辅助T(TH17)特异性细胞因子减轻结肠炎严重性(Miyauchi等人,2013)。
发明内容
本发明涉及青春双歧杆菌的分离菌株。在属于青春双歧杆菌的细菌分离株之中，可通过基因组和表型特征鉴定先前未描述的四种分类亚组。这些分类亚组明显不同于模式菌株(青春双歧杆菌ATCC15703T)。青春双歧杆菌的四种分类亚组通过16S rRNA基因序列中的特定特征而与青春双歧杆菌模式菌株相区分。16S rRNA特征还将四个亚组彼此区分开。由于不存在种水平下的确切分类定义，所以将这些亚组称为核种(ribospecies)2、3、4及5。核种1是青春双歧杆菌ATCC15403T。
16S核糖体RNA序列分析是细菌分类多相法中的中心要素并且用于描述来自种系发育邻近物种的分类群。然而，在16S rRNA基因序列相似性超过98.7％时，此方法不能清楚地区分独特的分类群并且推荐DNA-DNA相关性的测定。由于分离菌株与模式菌株的序列相似性全部超过99.87％，所以决定测定DNA-DNA相关性。各亚组代表菌株与青春双歧杆菌模式菌株的DNA-DNA复性(reassociation)研究显示代表菌株与模式菌株之间大于70％的DNA-DNA相关性，且由此证实代表菌株确实属于青春双歧杆菌物种。综合这些数据显示分离菌株是青春双歧杆菌的新型亚组，这在以前并未描述过。
四个亚组通过仅存在于核种2、3、4及5中而不存在于模式菌株中的蛋白质编码DNA序列(CDS)进一步与青春双歧杆菌ATCC15403T相区分。独特的蛋白质编码序列将各核种彼此区分开，而其他蛋白质编码序列为核种2+5或核种3+4所特有。
发酵淀粉和糖原的能力将所述核种与青春双歧杆菌ATCC15403T相区分以及将核种2+5与核种3+4相区分。因此，核种2和5发酵糖原作为唯一的碳源，而青春双歧杆菌ATCC15403T和核种3+4不是如此，同时核种2+5和青春双歧杆菌ATCC15403T可发酵淀粉，而核种3+4不是如此。
因此，已发现通过特定的16S rRNA基因序列特征、特定的蛋白质编码DNA序列以及发酵糖原和淀粉的能力，可将青春双歧杆菌的四种核种(分类亚组)与青春双歧杆菌ATCC15703T明确地区分开以及彼此明确地区分开。
本发明的一个实施方案涉及一种青春双歧杆菌的分离菌株，其具有包含以下的16S核糖体基因序列：SEQ ID NO:1或2；SEQ ID NO:3、4或5；SEQ ID NO:6、7、8或9；以及SEQID NO:10或11。
许多人类疾病和病状的常见共同特征是受损的肠道屏障功能和粘膜免疫系统由于细菌和LPS穿过肠道上皮的移位增加而造成的促炎激活。疾病包括但不限于炎性肠病，如IBD和IBS；肝病，包括NAFLD、NASH、肝硬化及酒精相关性肝病；代谢失调，如代谢综合征、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、心血管动脉粥样硬化；自身免疫性疾病，例如乳糜泻、1型糖尿病、多发性硬化症及类风湿性关节炎；以及心理病状，包括严重抑郁症、心境障碍、认知病症、慢性疲劳综合征、及焦虑。
青春双歧杆菌核种2、3、4及5的菌株能够改善肠道屏障功能和/或诱导免疫应答的调节元件。
某些青春双歧杆菌核种2、3、4及5菌株在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER，且由此改善肠道屏障功能。
某些青春双歧杆菌核种2、3、4及5菌株当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10分泌>200pg/ml和/或诱导IL-10:IL-12比率>1，且由此引发抗炎免疫应答。
某些青春双歧杆菌核种2、3、4及5菌株将Caco-2细胞单层中的TER增至>120％相对于处理开始时的TER和/或诱导IL-10分泌大于200pg/ml和/或诱导IL-10:IL-12比率>1，且由此可即改善肠道屏障功能又引发抗炎免疫应答。
本发明涉及用青春双歧杆菌核种2、3、4或5的菌株预防、减轻症状、以及治疗具有潜在受损的肠道屏障功能和/或粘膜的促炎激活的疾病或病状，所述核种如通过将Caco-2细胞单层中的TER增至>120％相对于处理开始时的TER的能力所确定改善肠道屏障功能，如通过诱导IL-10分泌>200pg/ml和/或诱导源自人PBMC的树突细胞中的IL-10:IL-12比率>1的能力所确定诱导抗炎免疫应答，或优选地，上述一种、两种或所有的屏障改善和抗炎免疫应答的组合。屏障改善与抗炎免疫应答的组合效果也可通过将各自擅长这些作用之一的菌株组合来实现。
具体实施方式
表征本发明的青春双歧杆菌菌株的一种方式是其发酵实施例4中所列的特定碳水化合物源和在所述特定碳水化合物源上生长的能力。表2提供本发明的许多青春双歧杆菌菌株的生长特征的概述。表中提供的菌株仅被认为是本发明菌株的非限制性实例。
如从表中可见，许多菌株具有发酵D-核糖而非D-山梨糖醇的能力，尤其是BIF084(DSM 29106)、BIF046(DSM 29111)、BIF106(DSM 29107)、BIF123(DSM 29102)BIF129(DSM29104)及BIF038(DSM 29103)。
本发明的一个目标是提供能够改善肠道屏障功能和/或引发抗炎免疫应答的青春双歧杆菌菌株，因为这些特征涉及许多具有潜在受损的肠道屏障功能和/或粘膜的促炎激活的疾病或病状。
如从实施例中可见，某些青春双歧杆菌菌株在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER，且由此改善肠道屏障功能。
某些青春双歧杆菌菌株当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10分泌>200pg/ml和/或诱导IL-10:IL-12比率>1，且由此引发抗炎免疫应答。
在一个实施方案中，本发明的分离菌株能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml；和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所述菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
表9提供满足一种或多种以上特征的本发明的所选青春双歧杆菌菌株的体外数据的概述。如由表9明显的是，所有菌株都引发抗炎免疫应答，并且DSM 29102、DSM 29107及DSM 29103进一步改善肠道屏障。
本发明涉及一种本发明的青春双歧杆菌菌株，其是用于预防、减轻症状、以及治疗具有潜在受损的肠道屏障功能和/或粘膜的促炎激活的疾病或病状。其中本发明的青春双歧杆菌菌株预期具有作用的疾病或病状的实例是炎性肠病如IBD和IBS；肝病如NAFLD、NASH、肝硬化及酒精相关性肝病；代谢失调如代谢综合征、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、心血管动脉粥样硬化；自身免疫性疾病如乳糜泻、1型糖尿病、多发性硬化症及类风湿性关节炎；以及心理病状如严重抑郁症、心境障碍、认知障碍、慢性疲劳综合征、及焦虑。
可通过施用本发明的青春双歧杆菌菌株预防或减轻的症状的实例是厌食、便血、腹绞痛和腹痛、腹泻、便秘、或两者交替发作。
实施例8提供一种本发明菌株，即青春双歧杆菌DSM 29103对DSS诱发的结肠炎的作用的结果，这表明青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)预防和/或抑制胃肠道中的炎症和组织损伤以及抑制腹泻并诱导就体重而言的总体健康促进效果。基于发现，可以预期DSM29103及具有如本文所述的类似性质的其他菌株将能预防或减轻至少某些以上所列举的胃肠道症状。
本发明的一个实施方案涉及一种用于改善肠道屏障功能的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用治疗有效剂量的根据本发明的分离菌株或根据本发明的益生菌产品。
本发明的一个实施方案涉及一种引发抗炎免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用治疗有效剂量的根据本发明的分离菌株或根据本发明的益生菌产品。在一个实施方案中，所述方法诱导IL-10的分泌和/或IL-10:IL-12比率>1。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于预防以下疾病、减轻以下疾病的症状、或治疗以下疾病的方法：炎性肠病如IBD或IBS；肝病如NAFLD、NASH、肝硬化或酒精相关性肝病；代谢失调如代谢综合征、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、心血管动脉粥样硬化；自身免疫性疾病如乳糜泻、1型糖尿病、多发性硬化症或类风湿性关节炎；和/或心理病状如严重抑郁症、心境障碍、认知障碍、慢性疲劳综合征或焦虑，所述方法包括向有此需要的个体施用治疗有效剂量的根据本发明的分离菌株或益生菌产品。
虽然本发明的方法和菌株用途与人尤其相关，但动物如宠物，例如猫、狗及马也包括在本发明的范围内。
本发明涉及一种青春双歧杆菌的分离菌株，特征在于：a)序列包含SEQ ID NO:1或2；SEQ ID NO:3、4或5；SEQ ID NO:6、7、8或9；以及SEQ ID NO:10或11，及b)序列编码与选自以下任一种的至少一种蛋白质具有至少90％序列同一性的蛋白质：SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及25。
在b)的一个实施方案中，所述序列编码与选自SEQ ID NO:12、13及14的至少一种蛋白质具有至少90％序列同一性的蛋白质。在b)的另一实施方案中，所述序列编码与选自SEQ ID NO 18和19的至少一种蛋白质具有至少90％序列同一性的蛋白质。在b)的又一实施方案中，所述序列编码与选自SEQ ID NO 20和21的至少一种蛋白质具有至少90％序列同一性的蛋白质。
在b)的另一实施方案中，所述序列编码与选自SEQ ID NO 15、16及17的至少一种蛋白质具有至少90％序列同一性的蛋白质。在b)的另一实施方案中，所述序列编码与选自SEQ ID NO 22和23的至少一种蛋白质具有至少90％序列同一性的蛋白质。在b)的又一实施方案中，所述序列编码与选自SEQ ID NO 24和25的至少一种蛋白质具有至少90％序列同一性的蛋白质。
在具体的实施方案中，所述菌株包含编码与至少一种选自SEQ ID NO 12-25的至少一种蛋白质具有至少90％同一性的蛋白质的核酸序列，如编码与SEQ ID NO 12-25中的一种或多种具有至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的蛋白质的序列。在一个实施方案中，所述菌株包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO 12-25中的一种或多种的氨基酸序列。
出于本发明的目的，两个核苷酸序列或两个氨基酸序列之间的序列同一性程度是使用以下方法来测定：分别对于核苷酸序列(DNA)或氨基酸序列(蛋白质)的ClustalW第2版(ClustalW2)的序列比对方法，如由Larkin等人(2007,Bioinformatics 23:2947-2948)和Goujon等人(2010,Nucleic acids research 38增刊:W695-699)所述的双序列比对，采用默认参数(比对类型：慢；DNA权矩阵：IUB；蛋白质权矩阵：Gonnet；缺口开放：10；缺口延伸：0.1)，在www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/可获得。
一个实施方案涉及能够在作为唯一碳水化合物来源的淀粉或糖原上生长的分离菌株。某些所述菌株的特征在于其包含SEQ ID NO:2、4、7、8及10。这类菌株的实例是DSM29103、DSM 29102、DSM 29104、DSM 29105及从中衍生的菌株。其他所述菌株的特征在于其包含SEQ ID NO:2、3、8及10。这类菌株的实例是DSM 29107及从中衍生的菌株。
另一实施方案涉及能够在作为唯一碳水化合物来源的海藻糖上生长但不能发酵淀粉或糖原的分离菌株。某些所述菌株的特征在于其包含SEQ ID NO:1、3、6及11。这类菌株的实例是DSM 29106、DSM 29111及从中衍生的菌株。其他所述菌株的特征在于其包含SEQID NO:1、5、9及11。
本发明还涉及以保藏号DSM 29103在2014年7月16日保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)的青春双歧杆菌菌株或衍生于DSM 29103的菌株，其中衍生菌株的特征是能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER,ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml，和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所衍生的菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
本发明还涉及以保藏号DSM 29102在2014年7月16日保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)的青春双歧杆菌菌株或衍生于DSM 29102的菌株，其中衍生菌株的特征是能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER,ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml，和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所衍生菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
本发明还涉及以保藏号DSM 29104在2014年7月16日保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)的青春双歧杆菌菌株或衍生于DSM 29104的菌株，其中衍生菌株的特征是能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER，ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml，和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所衍生菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
本发明还涉及以保藏号DSM 29105在2014年7月16日保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)的青春双歧杆菌菌株或衍生于DSM 29105的菌株，其中衍生菌株的特征是能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER，ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml，和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所衍生菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
本发明还涉及以保藏号DSM 29106在2014年7月16日保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)的青春双歧杆菌菌株或衍生于DSM 29106的菌株，其中衍生菌株的特征是能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER，ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml，和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所衍生菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
本发明还涉及以保藏号DSM 29107在2014年7月16日保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)的青春双歧杆菌菌株或衍生于DSM 29107的菌株，其中衍生菌株的特征是能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER，ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml，和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所衍生菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
本发明还涉及以保藏号DSM 29111在2014年7月16日保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心,布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)的青春双歧杆菌菌株或衍生于DSM 29111的菌株，其中衍生菌株的特征是能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER，ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml，和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所衍生菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。
如本文所用的细菌“菌株”是指当生长或增殖时保持遗传不变的细菌。包括多个相同的细菌。“野生型菌株”是指细菌的非突变形式，如在自然界中所发现的。
在本文中，术语“衍生菌株”应被理解为借助于例如遗传工程、辐射和/或化学处理、和/或选择、匹配、筛选等衍生于母菌株的菌株。在具体的实施方案中，衍生菌株是功能上等效的突变体，例如，具有与母菌株基本上相同或改善性质(例如，关于益生菌性质)的突变体。这种衍生菌株是本发明的一部分。术语“衍生菌株”包括通过使本发明菌株经受任何常规使用的诱变处理(包括用如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)的化学诱变剂、紫外光的处理)或包括自发突变体。
“突变细菌”或“突变菌株”是指天然(自发、天然出现的)突变细菌或诱导突变的细菌，在其基因组(DNA)中包含野生型DNA中所不存在的一个或多个突变。“诱导的突变体”是其中突变通过人类处理诱导的细菌，如用任何常规使用的诱变处理的处理，包括用化学诱变剂的处理，如选自以下的化学诱变剂：(i)与DNA缔合或并入其中的诱变剂，如碱基类似物，例如2-氨基嘌呤或嵌入螯合剂(interchelating agent)如ICR-191；(ii)与DNA反应的诱变剂，包括烷化剂，如亚硝基胍或羟胺、或乙烷甲基磺酸酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)，UV-或γ幅射等。相比之下，“自发突变体”或“天然存在的突变体”还不曾被人类诱变。
衍生菌株(如突变体)可已经受若干诱变处理(单次处理应被理解为一个诱变步骤，继之以筛选/选择步骤)，但通常处理不超过20次、不超过10次、或不超过5次处理。在衍生菌株(如突变体)的具体实施方案中，与母菌株相比，细菌基因组中小于1％、小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已经变化(如通过取代、插入、缺失或其组合变化)。
如上所述的突变细菌是非GMO，即没有通过重组DNA技术进行修饰。作为通过随机诱变提供突变体的以上优选方法的一个替代方案，还可能通过定点诱变提供这种突变体，例如通过使用适当设计的PCR技术或通过使用可整合在细菌复制子中的转座元件。
当突变体作为自发突变体提供时，上述野生型菌株在没有任何事先诱变处理的情况下经受选择步骤。
登记号为DSM 29103、DSM 29104、DSM 29106、DSM 29107、DSM29111、DSM 29102及DSM 29105的任何青春双歧杆菌菌株的突变菌株可通过使所述菌株经受如所述的诱变处理以获得突变菌株并选出具有所需性质的突变菌株而获得。或者，针对自发突变进行选择。
本发明的一个实施方案涉及一种分离菌株，其选自由以下组成的组：DSM 29103、DSM 29104、DSM 29106、DSM 29107、DSM 29111、DSM 29102及DSM 29105以及能够实现以下各项的所述保藏菌株的任一种的突变体：
i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；
ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml；和/或
iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。
术语“益生菌产品”意指包含益生菌的任何产品。包含根据本发明的菌株的益生菌产品可以食物产品或膳食补充剂形式施用。青春双歧杆菌可例如并入乳制品如牛奶中，且尤其是发酵的乳制品中，任选地其他乳酸菌组合，例如与酸奶发酵物，或在其他食物产品如快餐或饮料如果汁中。
包含青春双歧杆菌的益生菌产品还可作为膳食补充剂以如下形式提供：粉剂、片剂如锭剂或泡腾片、软锭剂、胶囊、咀嚼胶、以单独的小药囊或作为更一般组合物如油滴剂、乳剂或糊剂的组分，，或以由本领域技术人员确定为对活微生物有效的载体的任何其他合适的载体。
益生菌是活的微生物，这在益生菌产品配制和储存期间可以是一种挑战。益生菌对温度、水分含量、以及氧和配制基质中的其他成分尤其敏感。优选的是本发明细菌在长期储存之后保持存活，以便当向有此需要的个体施用本发明的益生菌产品时所述细菌发挥其有益的作用。
术语“存活”意指细胞是活的并且能够在倾注铺板或涂布铺板期间在陪替氏培养皿中形成菌落。存活的益生细菌数量被测定为通过倾注铺板或涂布铺板法在适合益生菌菌株生长的条件下培育的菌落形成单位(CFU)的数量。通过此方法，将计数能够生长并形成菌落的细胞。当数值在本说明书和权利要求书中给出时，除非上下文另外指示，其应被理解为CFU/g。在一些实施方案中，本发明的益生菌产品在储存期末(EOS)时包含至少109CFU/单位。储存期末可以是至少3个月，如至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、或至少24个月。
使用低水活度确保了产品储存期间益生细菌的较佳存活率。
水活度(aW)被定义为在规定温度下组合物中水的分蒸气压除以在相同温度下水的标准状态分蒸气压。水活度因此用作组合物中自由(即未结合的)水的量的量度。其可计算为：
aW＝p/p0
其中p是组合物中水的分蒸气压且p0是在相同温度下纯水的蒸气压。在益生菌产品中，水活度(aw)一般优选在0.1-0.2的范围。
有待用于本发明的益生菌产品中的益生细菌一般被冷冻或冷冻干燥。为了获得高存活力，将细菌在冷冻或冷冻干燥之前与冷冻保护剂混合。
术语“冷冻保护剂”表示能改善冷冻和/或干燥期间的存活率并改善细菌的储存稳定性的物质。在本文中使用的冷冻保护剂一般包含糖。
该糖可以是单、二、寡或多糖，或至少两种糖的混合物。组合物甚至可包含三种、四种或更多种糖。在一些实施方案中，组合物包含至少一种单糖或二糖与至少一种寡糖的混合物。在其他实施方案中，组合物包含至少一种单糖或二糖与至少一种多糖的混合物。
适用于本发明的益生菌产品中的单糖包括葡萄糖(也称为右旋糖)、果糖、核糖及半乳糖。适用于本发明的益生菌产品中的二糖尤其包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖及乳糖。组合物可包含一种或多种单糖或二糖，如一种、两种或三种或甚至更多种不同的糖。
在一些实施方案中，本发明的益生菌产品包含至少一种寡糖。寡糖是含有三至九种单糖的糖聚合物。见于许多植物中的果糖-寡糖(FOS)是由短链的果糖分子组成的。同样天然出现的低聚半乳糖(GOS)是由短链的半乳糖分子组成的。这些化合物仅可由人类部分消化。该组合物可包含一种、两种或甚至更多种不同寡糖。
在一些实施方案中，本发明的益生菌产品包含至少一种多糖。多糖是由大于十个单糖单位通过糖苷键结合在一起构成的聚合碳水化合物分子并且一旦水解便得到组成单糖或寡糖。其在结构上的范围是从线性到高度分支。有待用于本发明的益生菌产品中的多糖的实例是麦芽糖糊精、环糊精、藻酸盐、果胶、壳聚糖、淀粉及菊粉。该组合物可包含一种、两种、三种或甚至更多种不同多糖。
举例来说，冷冻保护剂可包含二糖如蔗糖或葡萄糖与多糖如麦芽糖糊精的混合物。
寡糖或多糖如FOS、GOS、菊粉及其他多糖的添加可有助于降低水活度并且具有进一步优点，即寡糖和多糖不如单糖和二糖那么甜且此外它们将纤维添加到组合物中。
多元醇(糖醇)具有通式HOCH2(CHOH)nCH2OH。它们因为与糖相比的较低含热量和较低甜度而通常被添加到食品中。此外，其不被口腔中的细菌分解或代谢成为酸，因此不会促成龋齿。
组合物可进一步包含至少一种多元醇，如赤藓糖醇(erythriol)、肌醇、异麦芽酮糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、山梨糖醇、或木糖醇、或其混合物。优选的多元醇是木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。该组合物可包含一种、两种、三种或甚至更多种不同多元醇。
该冷冻保护剂可进一步包含肽、蛋白质、蛋白质水解物或其混合物。有待用于本文中的肽和蛋白质的实例是酪蛋白、豌豆、乳清、白蛋白、大豆蛋白、谷氨酸或明胶、以及其任何分离物或水解物。也可存在其他添加剂，例如抗氧化剂，如抗坏血酸盐、柠檬酸钠、没食子酸丙酯。
本发明还涉及一种益生菌，其包含根据本发明的分离菌株和冷冻保护剂，如糖。
可使用益生细菌的若干种或菌株的组合，即2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或甚至更多种本文中所列的种和菌株。在目前优选的实施方案中，仅一种、两种、三种、四种或五种不同菌株存在于本发明的益生菌产品中。
除益生细菌之外，选自由以下组成的组的一种或多种其他活性成分，例如一种、两种、三种、四种或更多种活性成分可包括在益生菌产品中：维生素，如维生素A、D、E、K2、C、B2、B6、B12、生物素、烟酸、叶酸；矿物质，如锌、硒、铬、铜、钙、氯化物；以及蔬菜提取物，如曼越桔提取物/汁液；蜂王浆。
可以预期，为了获得治疗效果，益生菌产品应当每日施用持续至少一周，且有利地持续更长时间，如至少2周、至少4周、至少6周、至少9周、优选地至少12周，数量对应于至少106CFU，如至少107CFU、优选地至少108CFU，一般109CFU至1012CFU的青春双歧杆菌。
在本研究中，益生菌产品包含青春双歧杆菌作为活性成分。青春双歧杆菌可用作唯一活性成分。或者，如本文所述的益生菌产品可包含所关注的其他化合物，如其他菌株、维生素、益生元、纤维或可具有有益健康效果的其他化合物。
其他细菌可选自由以下组成的组:乳酸双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸明串珠菌、肠膜明串珠菌乳脂亚种、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰变种、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌、长双歧杆菌、乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及嗜酸乳杆菌。
因此，组合物可进一步包含选自包含以下的组的乳酸菌的一个或多个菌株：保藏为DSM 15954的动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、保藏为DSM 13241的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保藏为ATCC 53103的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、保藏为ATCC 55826的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、保藏为ATCC 55845的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、保藏为ATCC55544的副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、保藏为LMG-17806的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保藏为DSM 15957的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、保藏为NM02/31074的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、保藏为CCTCC M204012的副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp.paracasei)。
除非在本文中另有指示或明显与上下文矛盾，术语“a/an(一)”和“所述”及类似指示物在描述本发明的上下文中(特别是以下权利要求书的上下文中)的使用应被视为包括单数和复数两者。除非另作说明，术语“包含”、“具有”、“包括”及“含有”应被视为开放式术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文中另有指示，在此对数值范围的叙述仅仅用作一种速记方法，分别涉及落入范围内的各单独数值，并且各单独数值包含在说明书内，如同在本文中个别列举一样。除非本文中另有指示或另外明显与上下文矛盾，本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。除非另外要求权利保护，本文所提供的任何及所有实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不作为对本发明范围的限制。说明书中的任何语言均不应解释为将任何未要求权利保护的特征作为实施本发明的必要特征。
附图说明
图1.通过邻近连接方法生成的青春双歧杆菌样菌株部分16S rDNA序列的树状图。也包括模式菌株青春双歧杆菌ATCC 15703T。
图2.来自青春双歧杆菌样菌株和模式菌株青春双歧杆菌ATCC 15703T的16S rDNA共有序列的部分比对。仅展示可变区。数字是大肠杆菌编号。区分4种核种和模式菌株的特征序列由阴影表示。
图3.在用青春双歧杆菌样菌株刺激之后Caco-2细胞单层中的跨上皮电阻(TER)。将在Transwell膜上生长的初始汇合、完全分化的Caco-2单层置于CellZscope中。将单层用细菌培育16h并且每小时测量TER。结果表示为相对于培育开始之前最后一次测量的TER的TER(％)。
图4.在用青春双歧杆菌样菌株刺激之后Caco-2细胞单层中的跨上皮电阻(TER)。将在Transwell膜上生长的初始汇合、完全分化的Caco-2单层置于CellZscope中并且每小时自动测量TER过夜。10h之后，TER已达到平台期并且该点被用于比较通过青春双歧杆菌样菌株的TER的刺激。条形图表示相对于培育开始之前最后一次测量的TER，在10h培育之后的TER(％)。
图5.在用青春双歧杆菌样菌株刺激之后，源自人PBMC的树突细胞(DC)中的IL-10表达及IL-10:IL-12表达比率。将DC用细菌在100:1(细菌:细胞)的比率下刺激20h，并且通过人炎性细胞因子细胞计数珠阵列(CBA)试剂盒测量IL-10和IL-12的分泌。将细胞因子测量值归一化为每个细胞因子和每个供体的平均表达。条形图在左轴表示IL-10分泌，星形图在右轴表示IL-10:IL-12比率。
图6.炎性肠病的DSS结肠炎模型中的大鼠体重。在通过口服管饲两周给药青春双歧杆菌BIF038(DSM 29103)或媒介物之后，3％DSS被引入饮用水中持续9天。不接受DSS的动物充当健康对照；DSS，接受媒介物和DSS；DSS+BIF038，接受青春双歧杆菌BIF038(DSM29103)和DSS。每天记录体重。
健康对照：
Figure GDA0001295487620000251
图7.在炎性肠病的DSS结肠炎模型中的大鼠粪便稠度评分。在通过口服管饲两周给药青春双歧杆菌BIF038(DSM 29103)或媒介物之后，3％DSS被引入饮用水中持续9天。不接受DSS的动物充当健康对照；DSS，接受媒介物和DSS；DSS+BIF038，接受青春双歧杆菌BIF038(DSM29103)和DSS。
图8.在炎性肠病的DSS结肠炎模型中的大鼠便血评分。在通过口服管饲两周给药青春双歧杆菌BIF038(DSM 29103)或媒介物之后，3％DSS被引入饮用水中持续9天。不接受DSS的动物充当健康对照；DSS，接受媒介物和DSS；DSS+BIF038，接受青春双歧杆菌BIF038(DSM29103)和DSS。
健康对照：
Figure GDA0001295487620000261
图9.在炎性肠病的DSS结肠炎模型中的大鼠全肠道渗透性。在通过口服管饲两周给药青春双歧杆菌BIF038(DSM 29103)或媒介物之后，3％DSS被引入饮用水中持续9天。不接受DSS的动物充当健康对照；DSS，接受媒介物和DSS；DSS+BIF038，接受青春双歧杆菌BIF038(DSM29103)和DSS。渗透性被测定为尿CrEDTA排泄。
健康对照：
Figure GDA0001295487620000262
图10.在炎性肠病的DSS结肠炎模型中的大鼠结肠组织的组织评分。在通过口服管饲两周给药青春双歧杆菌BIF038(DSM 29103)或媒介物之后，3％DSS被引入饮用水中持续9天。不接受DSS的动物充当健康对照；DSS，接受媒介物和DSS；DSS+BIF038，接受青春双歧杆菌BIF038(DSM29103)和DSS。
图11.在炎性肠病的DSS结肠炎模型中的大鼠肠道的肉眼评分。在通过口服管饲两周给药青春双歧杆菌BIF038(DSM 29103)或媒介物之后，3％DSS被引入饮用水中持续9天。不接受DSS的动物充当健康对照；DSS，接受媒介物和DSS；DSS+BIF038，接受青春双歧杆菌BIF038(DSM29103)和DSS。
序列表简述
序列表包括图2的11个序列以及由表3至8中所列的CDS所编码的蛋白质。
SEQ ID NO:1列出对ATCC15703T及核种3和4的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:2列出对核种2和5的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:3列出对ATCC15703T及核种5和3的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:4列出对核种2的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:5列出对核种4的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:6列出对ATCC15703T及核种3的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:7列出对核种2的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:8列出对核种5的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:9列出对核种4的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:10列出对ATCC15703T及核种2和5的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:11列出对核种3和4的菌株特异的16S rRNA基因序列。
SEQ ID NO:12列出表3中的CDS 2439。
SEQ ID NO:13列出表3中的CDS 2454。
SEQ ID NO:14列出表3中的CDS 2458。
SEQ ID NO:15列出表4中的CDS 2027。
SEQ ID NO:16列出表4中的CDS 2312。
SEQ ID NO:17列出表4中的CDS 2314。
SEQ ID NO:18列出表5中的CDS 2406。
SEQ ID NO:19列出表5中的CDS 2425。
SEQ ID NO:20列出表6中的CDS 3350。
SEQ ID NO:21列出表6中的CDS 3351。
SEQ ID NO:22列出表7中的CDS 3166。
SEQ ID NO:23列出表7中的CDS 3123。
SEQ ID NO:24列出表8中的CDS 2293。
SEQ ID NO:25列出表8中的CDS 2334。
实施例
实验流程的概述
双歧杆菌是从来自健康志愿者的人粪便中分离。通过16S rDNA测序和种系发生分析测定纯化的分离株的物种特征。16S种系发生分析显示4簇菌株(核种)的存在与模式菌株青春双歧杆菌ATCC 15703T最密切相关，然而明显不同于模式菌株(青春双歧杆菌样菌株)。进一步研究此亚组双歧杆菌分离株以确定其在青春双歧杆菌组内的分类关系。通过杂交来研究的DNA:DNA相关性显示所述菌株属于青春双歧杆菌物种；然而，基因组测序鉴别了区分4簇菌株的编码序列(基因)，所述4簇菌株类似于与青春双歧杆菌ATCC 15703T模式菌株不同的核种。使用API系统研究在各种碳水化合物来源上生长的能力。淀粉和糖原利用鉴别出不同于模式菌株的2个亚组。
探究了与青春双歧杆菌样菌株的GI健康有关的功能特征。刺激上皮细胞中的TJ的能力通过将活的细菌施用于Caco-2细胞单层并测量跨上皮电阻(TER)来研究。大多数青春双歧杆菌样菌株提高TER；然而以不同的程度。免疫系统的局部刺激通过将细菌施用于源自人PBMC的树突细胞并测量细胞因子产生来测定。若干菌株诱导高水平的IL-10，其中IL-10:IL-12比率>1指示免疫调节应答。
选出具有强TER诱导能力和高IL-10诱导的一种青春双歧杆菌样菌株，并且施用于大鼠DSS结肠炎模型中。所述菌株显著地改善通过DSS处理诱发的症状。
实施例1-双歧杆菌从健康人类中的分离
双歧杆菌是从由健康志愿者处收集的冷冻(-80℃)人粪便样品中分离。从所有志愿者处获得利用材料进行细菌分离的书面同意。将样品解冻并且在兜袋中将4g样品在35ml具有0.05％半胱氨酸氯化物的蛋白胨盐水中以高速混合。充分混合之后，在蛋白胨盐水中进行10倍连续稀释。将来自105、106、107、108、及109稀释液的100μl等分试样平板接种于番茄汁/Eugon琼脂pH 7.0上；(番茄汁，pH调节至7.0(400mL/1000mL)、45g Eugon琼脂(Difco)/1000mL、1％麦芽糖、0.05％半胱氨酸氯化物、0.0005％氯化血红素、40mg/1000mL X-gal(5-溴代-4-氯代-3-吲哚-β-D-半乳糖苷))、以及Columbia培养基pH 7.0(调节的Beerens培养基)琼脂；(Columbia培养基(Difco)、0.005％葡萄糖、0.1％丙酸钠盐、0.05％半胱氨酸氯化物、40mg X-gal。
将板在37℃下厌氧地培育。3天之后，挑取单个菌落。记录菌落形态并且通过显微镜检查确定单细胞形态。将具有拥有双歧杆菌的V形或Y形特征的细胞的菌落平板接种于具有0.05％半胱氨酸氯化物(Merck KGaA,Germany)的Man Rogosa Sharp(MRS)肉汤(OxoidA/S,Denmark)上并且在37℃下厌氧地培育。随后通过在具有0.05％半胱氨酸氯化物的MRS板上划线3次纯化菌株。通过涂布于Caso琼脂(具有绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂)上并在30℃下有氧地培育2天来测试菌株的纯度。将在具有20％甘油的MRS中的纯菌株保存在安瓿中在-80℃下。
通过16S rDNA测序和种系发生分析测定粪便分离株的分类关系。
从人粪便样品中获得127个双歧杆菌分离株并且进一步表征。
实施例2-16S rDNA测序和种系发生分析
部分16S rRNA基因序列是通过用保守引物616V(5’-AGRGTTTGATYCKGGCTCAG-3’)和612R(5’-GTAAGGTTCTTCGCGT-3’)扩增16S rDNA的部分且随后用保守引物610R(5’-ACCGCGGCTGCTGGCAC-3’)的对扩增产物进行测序来测定。通过LGC Genomics,Berlin,Germany)进行Sanger测序反应。
使用Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比对来自分离的双歧杆菌属菌株和青春双歧杆菌ATCC 15703T的部分16S rDNA序列(大肠杆菌位置27至468；Brosius等人,1978)。使用ClustalW2-Phylogeny(http://www.ebi.ac.uk/Tools/ phylogeny/clustalw2_phylogeny/)，通过邻近连接生成种系发生树文件，并且使用Phylodendron种系发生树打印机(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint- form.html)呈现该树。
结果
基于16S rDNA种系发生分析，36个双歧杆菌属菌株与青春双歧杆菌最密切相关。然而，所有菌株具有与模式菌株、青春双歧杆菌ATCC 15703T不同的16S rDNA序列。将菌株聚类到不同于青春双歧杆菌ATCC 15703T的4个不同组中，如图1的树状图中所示。4个簇被标记为核种2、3、4及5。20个菌株构成单一簇(核种2)，12个其他菌株聚类在一起(核种5)，并且2个和3个菌株分别形成2个簇(核种3及核种4)。鉴别出将核种彼此并与模式菌株明显区分开的16S rDNA特征序列(图2)。特征序列标记于图2上。所有特异性16S rDNA序列(特征)一致地见于菌株中并且导致菌株的聚类。因此，核种2和5二者在碱基74-75和90-93(大肠杆菌编号)处具有特异性序列，这将它们与模式菌株及核种3和4相区别。核种2可通过ACC特征(碱基192-194)并且通过在碱基212-215、226-232处的特征与核种5区分。在碱基262-267和287-293处的特征序列将核种3和4与模式菌株及核种2和5相区分。核种4通过位于碱基187-191处的特征GACAU而不同于其他核种及模式菌株。因此，这四种核种可清楚地彼此并且与青春双歧杆菌ATCC 15703T通过单特征序列或通过特征的组合相区分。
16S rDNA种系发生分析显示在从人粪便中分离的菌株中存在4簇(核种)双歧杆菌与青春双歧杆菌最密切相关；然而，具有非常一致且特异性的特征序列将分离株与模式菌株相区分。
为了确定这些核种的分类地位，从每个组中选出代表性菌株并且使其经受与属于青春双歧杆菌组的模式菌株的DNA-DNA复性分析。
实施例3–DNA-DNA复性
青春双歧杆菌样菌株的集合与双歧杆菌属模式菌株的DNA-DNA相关性是通过BCCMTM/LMG,Bacteria Collection Laboratorium voor Microbiologie UniversiteitGent(BCCMTM/LMG细菌保藏，微生物实验室，根特大学)来测定。
以下培养物是所研究的BIF122、DSM 29103(BIF038)、DSM 29107(BIF106)、BIF107、青春双歧杆菌LMG 10502T、粪便双歧杆菌(B.stercoris)LMG 27438T、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)LMG 21811T、齿双歧杆菌(B.dentium)LMG 11045T、及角双歧杆菌(B.angulatum)LMG 11039T。这些物种全部隶属于青春双歧杆菌组。
将细菌在LMG培养基144上培养，并且在厌氧条件下在37℃下培育之后检查纯度。根据Gevers等人(2001)的程序的修改版提取基因组DNA。根据由Ezaki等人(1989)所述的方法的修改版(Goris等人,1998；Cleenwerck等人,2002)在49℃下在50％甲酰胺存在下进行杂交。进行交互反应(Ax B和B x A)并且Ax B和B x A的平均值之间的差异针对每个DNA对在表1中在括号之间示出。
结果
对于BIF122，A x B的平均值和B x A的平均值之间的差异一般不在此方法的限度内(表1)，因此BIF122的DNA:DNA杂交结果并不明确。
DSM 29103(BIF038)、DSM 29107(BIF106)、BIF107显示大于70％的DNA-DNA相关性，这通常被认为是对彼此及与青春双歧杆菌和粪便双歧杆菌的模式菌株中的物种界定的限制(Wayne等人,1987)。之前被描述为新物种的粪便双歧杆菌不再被认为是离散物种，而是被包括在青春双歧杆菌内(Killer等人 2013)。
反刍双歧杆菌的模式菌株显示与DSM 29103(BIF038)、DSM 29107(BIF106)、BIF107、青春双歧杆菌及粪便双歧杆菌的模式菌株在36至45％范围的DNA-DNA相关性(表1)。
总之，结果清楚地显示DSM 29103(BIF038)、DSM 29107(BIF106)、BIF107属于物种青春双歧杆菌并且所鉴别的核种是此物种的不同亚组。因为不存在亚种的确切定义，我们对这些簇保留了术语核种(Ribospecies)。
表1
青春双歧杆菌样菌株与青春双歧杆菌组中的模式菌株的DNA-DNA相关性。
(％DNA相关性)
Figure GDA0001295487620000321
对于每个DNA对，Ax B和B x A的平均值之间的差异在此方法的限度内，与BIF122的DNA进行DNA:DNA杂交的情况除外，其差异一般较高(*)。括号之间的高值归因于“交互”DNA的固定中的差异。在此研究中，BIF122的DNA以比其他DNA更低的量固定于微孔板的孔上。其原因尚不清楚。
实施例4-碳水化合物的发酵
使用API 50CH测定研究青春双歧杆菌模式菌株及4种核种的代表在不同碳水化合物来源上的生长。
研究分离的青春双歧杆菌样菌株的亚组在AmiDon(淀粉)、扁桃苷、熊果苷、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-乳糖(牛)、D-麦芽糖、D-甘露糖醇、D-甘露糖、D-蜜二糖、D-松三糖、D-核糖、D-蔗糖(saccarose/sucrose)、D-山梨糖醇、D-海藻糖、D-松二糖、D-木糖、龙胆二糖、糖原、菊粉、2-酮戊二酸钾、葡糖酸钾、L-阿拉伯糖、甲基-αD-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖、水杨苷、D-阿东糖醇、D-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-岩藻糖、D-来苏糖、D-棉子糖、D-塔格糖、半乳糖醇、赤藓糖醇、七叶甙柠檬酸铁(esculinferricitrat)、甘油、肌醇、5-酮戊二酸钾、L-阿糖醇、L-岩藻糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-木糖、甲基-βD-吡喃木糖苷、甲基-αD-吡喃甘露糖苷以及木糖醇上生长的能力并且与模式菌株青春双歧杆菌ATCC15703T相比。
将来自过夜培养物的双歧杆菌接种于具有0.05％半胱氨酸氯化物(Merck KGaA,德国)的Man Rogosa Sharp(MRS)肉汤(Oxoid A/S,丹麦)上并在37℃下厌氧地培育。2天之后，使用拭子从板上收集细菌并悬浮在具有0.5％半胱氨酸氯化物的API 50CHL培养基中，并且根据制造商说明书将细菌悬液分配到API 50CH条带中。将条带在37℃下厌氧地接种。5天培育之后读取条带并且将显色情况记录为+或-。
结果
由青春双歧杆菌模式菌株和粪便分离株差异性地发酵18种碳水化合物(表2)。模式菌株及属于核种2和5的菌株能够在作为唯一碳水化合物来源的淀粉上生长，而核种3和4的菌株不能发酵淀粉。模式菌株及核种3和4不在糖原上生长，而核种2和5在此碳水化合物来源上生长。核种3和4的所有菌株都能够在海藻糖上生长，而模式菌株及38％的核种2和5可在海藻糖上生长。模式菌株及54％属于核种2和5的菌株在山梨糖醇上生长，而核种3和4不在山梨糖醇上生长。
发酵特定的碳水化合物来源并在其上生长的能力显示在人分离株之中存在不同于模式菌株的两个簇的青春双歧杆菌菌株。具体说来，在淀粉和糖原上的生长将两个亚组彼此并与模式菌株区分开。
Figure GDA0001295487620000341
实施例5-基因组测序
借助于DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)从每核种的两个代表的过夜培养物中提取DNA：BIF038(DSM 29103)和BIF060，核种2；BIF137和BIF107，核种3；BIF122和BIF046(DSM 29111)，核种4；以及BIF016和BIF106(DSM 29107)，核种5。
使用NGS平台Illumina,
Figure GDA0001295487620000351
2000(San Diego,美国)在香港的北京基因组研究所进行基因组测序。为每个菌株获得200兆碱基数据，其是由100bp成对末端读段和500bp间隔区组成。
借助于CLC生物信息学软件(
Figure GDA0001295487620000352
丹麦)进行测序读段的从头装配。借助于采用结合有Glimmer算法的Genostar Suite 4.0(Grenoble,法国)模块GenoAnnot在所得的重叠群集合中鉴别编码序列。在Genostar Suite 4.0的Pathway Explorer模块中的泛基因组功能被用于构造八个测序菌株及青春双歧杆菌ATCC 15703T(GenBank登记号NC_008618.1)的泛基因组。
结果
在每种核种中鉴别独特的编码DNA序列(CDS)。因此，发现CDS存在于测序的青春双歧杆菌样菌株中，而不存在于青春双歧杆菌ATCC15703T中。发现特异性CDS限定核种2和5、核种3和4、以及个别核种(2、3、4及5)。
通过
Figure GDA0001295487620000353
搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)确定由这些CDS编码的氨基酸序列与任何已知蛋白质的相似性。使用针对所有非冗余GenBank CDS翻译+PDB+SwissProt+PIR+PRF(除去来自WGS项目的环境样品)的blastp完成搜索。
表3列出了仅见于核种2和5中的3个CDS。
CDS 2439编码91个氨基酸的蛋白质，显著比对于“假定蛋白质[链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)]；WP_003834978.1”(E-评分：3E-22；同一性：67％)。没有发现保守结构域，并且没有发现与已知蛋白质的显著比对。
CDS 2454编码107个氨基酸的蛋白质，显著比对于“假定蛋白质BMOU_0229[Bifidobacterium moukalabense DSM 27321]；gbETY72215.1”(E-评分：5E-41；同一性：65％)，无保守结构域。与非假定蛋白质的最佳比对是“核转运因子2[Mycobacteriumtusciae]；WP_006241648.1”(E-评分：0.004；同一性：32％)，具有1个结构域(25-138)，“核转运因子2(NTF2样)超家族”。
CDS 2458编码206个氨基酸的蛋白质，显著比对于“细菌Ig-样结构域，2组[Bifidobacterium moukalabense DSM 27321]；ETY72212.1”(E-评分：1E-119；同一性：90％)。没有发现保守结构域。
Figure GDA0001295487620000361
表4列出了仅见于核种3和4中的3个CDS。
CDS 2027编码427个氨基酸的蛋白质，显著比对于“多药物转运蛋白MatE[链状双歧杆菌]；WP_003834477.1”(E-评分：0.0；同一性：98％)，具有保守结构域“MATE外流家族蛋白(MATE efflux family protein)[链状双歧杆菌DSM 16992＝JCM 1194＝LMG 11043]”。
CDS 2312编码330个氨基酸的蛋白质，显著比对于“多物种：核糖核苷酸-二磷酸还原酶亚单位β[双歧杆菌属]；WP_003835055.1”(E-评分：0.0；同一性：97％)，具有保守结构域(20-291)，“核糖核苷酸还原酶，R2/β亚单位，铁蛋白样二铁-结合结构域；cd01049”。同源蛋白质已见于各种双歧杆菌中，但不见于青春双歧杆菌中。另外，CDS 2314编码766个氨基酸的蛋白质，显著比对于“核糖核苷酸-二磷酸还原酶亚单位α[假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)]；WP_004221779.1”(E-评分：0.0；同一性：91％)。因此，编码序列存在于核种3和4中，编码此蛋白的α和β亚单位两者。
Figure GDA0001295487620000371
表5列出了仅见于核种2中的2个CDS。
CDS 2406编码362个氨基酸的蛋白质，显著比对于“假定蛋白质[链状双歧杆菌]；WP_003835002.1”(E-评分：0.0；同一性：99％)，具有保守结构域(22-114)，“I型限制酶R蛋白N端(HSDR_N)”。
CDS 2425编码66个氨基酸的蛋白质，显著比对于“假定蛋白质[布姆双歧杆菌(Bifidobacterium boum)；WP_026502472.1]”(E-评分：1E-37；同一性：100％)，且无保守结构域来。与非假定蛋白质的最佳比对是“OmpA家族膜蛋白[海王生丝单胞菌(Hyphomonasneptunium)]；WP_011646448.1”(E-评分：0.87；同一性：48％)，具有2个保守结构域(411-536)，“外膜蛋白和相关肽聚糖-相关(脂)蛋白[细胞被膜生物起源，外膜]”；COG2885”；(430-534)，“类似于外膜蛋白OmpA的C端结构域的肽聚糖结合结构域；cd07185”。
Figure GDA0001295487620000381
表6列出了仅见于核种5中的2个CDS。
CDS 3350编码60个氨基酸的蛋白质，显著比对于“假定蛋白质[单伪棍状杆菌(Pseudoclavibacter soli)]；WP_028244556.1”(E-评分：7E-13；同一性：53％)，具有保守结构域(41-252)，“长醇-磷酸-甘露糖-蛋白质甘露糖转移酶”。
CDS 3351编码462个氨基酸的蛋白质，显著比对于“假定蛋白质[两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)]；WP_003815303.1”(E-评分：4E-42；同一性：31％)，具有保守结构域(1-312)，“长醇-磷酸-甘露糖-蛋白质甘露糖转移酶”。
Figure GDA0001295487620000382
表7列出了仅见于核种3中的2个CDS。
CDS 3123编码612个氨基酸的蛋白质，显著比对于“假定蛋白质[角双歧杆菌]；WP_003826727.1”(E-评分：1E-170；同一性：98％)，具有保守结构域(12-213)，“羊毛硫抗生素保护ABC转运蛋白通透酶亚单位，MutE/EpiE家族；TIGR03732”。
CDS 3166编码612个氨基酸的蛋白质，显著比对于“含有菌毛异肽形成D2结构域的蛋白[短双歧杆菌]；WP_016462071.1”(E-分数：0.0；同一性：95％)，具有3个结构域(225-407)，“菌毛异肽形成D2结构域；TIGR04226”；(444-532)“Cna蛋白B型结构域；pfam05738”；(577-610)，“LPXTG-基序细胞壁锚定结构域；TIGR01167”。
Figure GDA0001295487620000391
表8列出了仅见于核种4中的2个CDS。
CDS 2293编码1156个氨基酸的蛋白质，显著比对于“ATP-结合蛋白[反刍双歧杆菌]；WP_026645899.1”(E-评分：0.0；同一性：97％)，具有2个保守结构域(627-842)，“未知功能的结构域DUF87；cl19135”；(638-958)，“AAA样结构域；pfam12846”。
CDS 2334编码141个氨基酸的蛋白质，显著比对于“XRE家族转录调节物[迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)]；WP_015760296.1”(E-评分：3E-87；同一性：92％)，具有2个保守结构域(4-117)，“预测的转录调节物[转录]；COG1396”；(4-61)，“螺旋-转角-螺旋XRE家族样蛋白”。
Figure GDA0001295487620000392
实施例6-在细胞单层中的紧密连接的刺激
通过菌株提高穿过Caco-2细胞单层的电阻(跨上皮电阻；TER)的能力测量肠道屏障改善。
培养Caco-2细胞
在培养箱中，在37℃、5％CO2下将哺乳动物肠道上皮Caco-2细胞系(DSMZ ACC169,莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克，德国(Leibniz-InstitutDSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,Germany))在补充有20％热灭活的胎牛血清(Gibco)、1X非必需氨基酸(Thermo Scientific)及1X Pen Strep(Biological industries)的DMEM(Gibco)中培养。使用传代15至25次的Caco-2细胞。细胞当60-80％汇合时被胰蛋白酶消化。在DMEM中制备105个细胞/ml的细胞悬液并且将500μl接种于12mm、0.4μm孔径
Figure GDA0001295487620000401
聚酯膜插入皿(Corning,USA)的顶端隔室中，而将1.5ml培养基添加至基底外侧隔室中。将细胞在插入皿上培养21天，每周两次更换培养基。
在第21天，将Transwell插入皿移到
Figure GDA0001295487620000402
(nanoAnalytics,德国)。将培养基更换为无抗生素的培养基，且因此，将无抗生素的760μl和1.65ml DMEM分别添加至顶端和基底外侧隔室中。将CellZscope置于培养箱中并且每小时监测TER持续20-23小时，同时自动数据收集。
双歧杆菌的制备
在具有0.05％半胱氨酸氯化物(Merck KGaA,德国)的Man Rogosa Sharp(MRS)肉汤(Oxoid A/S,丹麦)中厌氧地培养双歧杆菌过夜。通过离心(6000x g，2min)收集细菌，丢弃上清液并将细菌再悬浮于DMEM中。通过离心再次收集细菌并重悬浮于DMEM中以洗涤细胞。第三次离心之后，将细菌重悬浮于DMEM中并测量OD600。将细胞悬液稀释至OD600＝3.8。
Caco-2细胞的刺激
为了用双歧杆菌刺激Caco-2细胞，将100μl DMEM轻轻地从Transwell插入皿的顶端区域中除去并用100μl细菌悬液代替以得到0.5的最终OD600。然后将CellZscope转移回到培养箱中并且每小时记录TER持续16小时。一式三份(3个独立的Transwell小室)完成所有刺激。无细菌补充的DMEM被用作对照，即非刺激的Caco-2单层。用鼠李糖乳杆菌LGG的刺激也包括在每个实验中，这是一种强烈地刺激TER的菌株。LGG被用于归一化个别实验之间的数据。实验开始之前TER的过夜测量允许测定每个个别孔中的基线TER并且确保电阻是稳定的。相对于刺激之前记录的最后的值(设定为100％)计算细菌刺激期间TER的变化。为了比较来自个别实验的测量值，以LGG刺激之后测量的TER值对数据进行归一化。
结果
在21个青春双歧杆菌样菌株中测试增加Caco-2单层中的TER的能力。TER的连续测量显示在刺激10小时之后，TER达到平台期，随后极少增加(图3)。因此，记录10h之后每个菌株改善TER的能力并且在此时点比较菌株。大多数青春双歧杆菌样菌株增加Caco-2单层的TER，但以不同的程度(图4)。六个菌株在10h之后将TER增加至大于120％刺激之前记录的电阻(DSM 29102(BIF123)，148％；DSM 29107(BIF106)，146％；DSM 29103(BIF038)，142％；BIF060，126％；BIF113，124％；BIF016，122％)。九个菌株将TER增加至相对于刺激之前的值的110％至120％，而六个菌株对TER没有影响。将TER增加至≥120％刺激Caco-2单层之前的电阻值的菌株被认为对上皮屏障具有显著作用。在所有实验中鼠李糖乳杆菌LGG将TER增加至155％±25％刺激之前的电阻。
实施例7-树突细胞的免疫调节
通过确定刺激之后人树突细胞中的细胞因子诱导来研究青春双歧杆菌样菌株的潜在免疫调节作用。
双歧杆菌的制备
通过将双歧杆菌接种在10mL具有0.05％半胱氨酸氯化物(Merck KGaA,德国)的Man Rogosa Sharp(MRS)肉汤(Oxoid A/S,丹麦)中并在37℃下厌氧地培养过夜来制备用于树突细胞(DC)刺激的冷冻双歧杆菌培养物。次日，将1％过夜培养物接种在具有0.05％半胱氨酸氯化物的MRS中并在37℃下厌氧地生长过夜。为了挑取处于指数生长期的双歧杆菌，将100μl新鲜的过夜培养物接种在10mL具有0.05％半胱氨酸氯化物的MRS(1％稀释)中；五份连续10倍稀释液(10-1至10-5)是由1％接种物制成并在37℃下厌氧地生长过夜。将细菌密度调节至OD600＝5，并且在微量滴定托盘中将培养物在-80℃下于10％甘油中冷冻。
源自单核细胞的DC生成
通过6日程序在体外生成未成熟的源自单核细胞的DC。由丹麦哥本哈根的哥本哈根大学医院(Copenhagen University Hospital)的临床免疫科供应来自健康供体的人白细胞层。没有识别信息的人类样品的使用是经The National Committee on HealthResearch and the Danish Society for Clinical Immunology批准的，并且所有供体在捐献时都提交了书面的知情同意书。简单说来，使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,弗莱堡,德国)，通过密度梯度离心从白细胞层中获得人外周血单核细胞。使用以CD14微珠(Miltenyi Biotec,贝尔吉施格拉德巴赫,德国)进行的磁性激活细胞分类术，通过针对CD14的阳性选择分离单核细胞并且在37℃、5％CO2下，以2x106个细胞/mL的密度在含有30ng/mL人重组IL-4和20ng/mL人重组GM-CSF(两者均来自Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)的完全DC培养基(补充有10mM HEPES(Sigma-Aldrich,施内尔多尔夫,德国)、50mM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,施内尔多尔夫,德国)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies Ltd,佩斯里,UK)、10％热灭活的胎牛血清(Invitrogen,佩斯里,UK)、100U/mL青霉素(BiologicalIndustries,Kibbutz Beit-Haemek,以色列)、及100mg/mL链霉素(BiologicalIndustries,Kibbutz Beit-Haemek,以色列)的RPMI 1640)中培养。在培养三天之后添加含有全剂量的IL-4和GM-CSF的新鲜的完全DC培养基。在第6日，通过表面标记表达分析(CD11c>90％表达；CD1a>75％表达)证实分化为未成熟的DC。
DC刺激
将不成熟的DC重悬浮于不含抗生素的新鲜的完全DC培养基中，以105个细胞/孔接种于96孔板中，并且允许在37℃、5％CO2下适应环境，持续至少一小时之后刺激。在37℃、5％CO2下，用解冻的双歧杆菌以100:1的细菌:DC比率刺激DC持续20h。20h刺激之后，将DC上清液经由0.2μm AcroPrep Advance 96孔滤板(Pall Corporation,安阿伯市,密歇根州,美国)无菌过滤并在-80℃下储存直到细胞因子定量之时。
DC染色用于定量共刺激分子和趋化因子受体
20h刺激时间之后立即收集DC，在200x g下离心5min，并且重悬浮于含有2％BSA的冷PBS中。使用以下单克隆抗体进行染色：FITC缀合的抗人CD80(克隆L307.4)、FITC缀合的抗人CD86(克隆2331)、APC缀合的抗人CCR6(克隆11A9)、FITC缀合的抗人CCR7(克隆150503)、以及适当的同种型对照(所有均来自BD Biosciences,Erembodegem,比利时)。在冰上于避光的情况下用mAb培育DC持续30min，接着使用1mL冷的PBS 2％BSA重复洗涤步骤。最终，将DC重悬浮于PBS 2％BSA中并且保持在冰上直到流式细胞分析。使用FACSDiva软件(BD Biosciences,圣何塞,加利福尼亚州,美国)，在LSRFortessa流式细胞仪(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)上获取样品。
细胞因子定量
通过人炎性细胞因子细胞计数珠阵列(CBA)试剂盒(BD Biosciences,Erembodegem,比利时，根据制造商说明书，定量IL-10、IL-12、TNFα、IL-6及IL-1β的分泌水平。简单说来，将用单克隆捕捉抗体涂布的荧光珠粒与PE缀合的检测抗体和重组标准或测试样品混合并且使其在3h避光培育期间形成夹心复合物。在重复洗涤步骤之后，在LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences,圣何塞,加利福尼亚州,美国)上获取样品并且使用FCAP Array 3软件(BD Biosciences,圣何塞,加利福尼亚州,美国)进行数据分析。各细胞因子的检测限值如下：1.9pg/mL IL-12、3.7pg/mL TNFα、3.3pg/mL IL-10、2.5pg/mLIL-6及7.2pg/mL IL-1β。
结果
青春双歧杆菌样菌株诱导人树突细胞中的细胞因子分泌。因为不能在单次筛选中测试所有青春双歧杆菌样菌株，所以使用来源于不同供体的DC。发现在供体之中的整体细胞因子反应的实质性变化，因此将细胞因子数据归一化以便比较来自不同供体的结果。以每种细胞因子和每个供体的平均表达对原始细胞因子数据进行归一化。十三个青春双歧杆菌样菌株刺激IL-10分泌超过检测极限并且显著不同于非刺激的细胞(图5)，其中尤其是DSM 29111(BIF046)、DSM 29105(BIF061)、DSM 29106(BIF084)、DSM 29103(BIF038)及DSM29104(BIF129)。这些青春双歧杆菌样菌株中的十个另外引起大于1的IL-10/IL-12分泌比率，提示免疫调节的潜力(DSM 29111(BIF046)，2.1；DSM 29106(BIF084)，1.1；DSM 29103(BIF038)，1.1；DSM 29104(BIF129)，2.8；BIF056，1.1；BIF059，1.1；BIF027，1.3；DSM 29102(BIF123)，1.1；BIF016，1.1；DSM 29107(BIF106)，1.6)。
所选体外结果的概述
表9提供保藏菌株的体外结果的概述。选出能够实现以下功能的菌株：在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；当与源自人PBMC的树突细胞共培育时能够诱导IL-10分泌>200pg/ml；或当与源自人PBMC的树突细胞共培育时能够诱导IL-10:IL-12比率>1；或两种或更多种这些功能的组合。
Figure GDA0001295487620000441
实施例8-青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)对DSS诱发的结肠炎的作用
在体内，在大鼠的葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎模型中测试青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)。DSS结肠炎是炎性肠病的模型，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病，其全世界发病率和发生率已显示增加(Molodecky等人,2012)。DSS结肠炎的潜在病理生理机制包括炎症、小囊破坏及肠道渗透性提高。DSS结肠炎中的疾病症状对应于在人UC中所观察到的，包括体重下降、腹泻及便血(Herias等人 2005)。
在此研究中，8周龄的雄性Wistar大鼠(每DSS组N＝18，对于健康对照N＝6)接受半纯化的人源化饮食(高脂、低纤维)以模拟人类条件。将动物单独圈养在具有不锈钢地板的代谢笼中以便于完全单独地收集粪便和尿液。代谢笼具有饲料通道以避免饲料溢出并且确保饲料摄入量的正确测量。大约1010CFU/日的青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)或安慰剂作为悬浮在盐水中的冷冻干燥粉剂给予。在通过口服管饲两周的青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)或媒介物(盐水)给药之后，通过在饮用水中添加3％DSS持续9天引入结肠炎。
在DSS暴露期间，每天记录体重以测量炎症诱发的厌食。在结肠炎期间每天对粪便稠度和便血进行评分作为疾病严重性的量度。根据以下参数对粪便稠度评分：0，成形且坚硬的粪便；1，成形但柔软的粪便；2，稀便；3，轻度腹泻(水样)及4，严重腹泻。将惰性铬CrEDTA(2g/kg饲料)添加至饮食中以量化胃肠道渗透性。通过称重动物的饲料每天测定饮食CrEDTA摄入并且通过在24小时尿样品中在之前(第-1/-2日)一次且在结肠炎期间(第4/5日和第7/8日)两次测定CrEDTA来评价胃肠道渗透性。对于Cr测量，将尿用50g/L三氯乙酸酸化，在14.000g下离心2min并用0.5g/L CsCl稀释。通过感应耦合等离子体-原子发射分光光度测定法分析铬。
在结束时，检查结肠以根据Wallace标准(Wallace等人,1989)评价肉眼病变，这是基于肠的腹泻、粘附、充血、增厚以及溃疡的程度。此外，从结肠的中部切出2cm片段，保存在4％多聚甲醛中，包埋入石蜡中，切片并用苏木精和曙红染色。对组织载玻片盲检并根据Cooper分数(Cooper等人,1993)评分。
结果表示为平均值+SEM并且如下进行数据的统计学评价：对于成对数据，针对给予细菌的组及对比DSS的健康对照(媒介物组)进行非参数成对Wilcoxon检验。使用ShapiroWilk’s检验检查非成对数据的正态性且甚至通过Bartlett’s检验检查组中的方差。当满足标准时，在给予细菌的组与对比DSS的健康对照之间进行学生t检验。如果不满足标准，那么使用Mann Whitney U检验。
结果
在DSS暴露期间每天记录体重，青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)与DSS组相比显著地抑制DSS诱发的体重损失(p＝0.002)(图6)。
青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)与DSS组相比具有显著较轻的(p＝0.048)稀便和腹泻，在曲线下面积粪便稠度分数低大约10％(图7)。并且，在结束时具有便血分数的动物数目减少了30％；在青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)中18个动物中有7个对比DSS组中18个中有10个(图8)。
全肠道渗透性在DSS攻击期间增加，并且到第7.5天，每平均水摄入量尿中的CrEDTA在DSS组中相比健康对照增加了129％。青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)临界线在第7.5天将DSS诱发的渗透性显著地(p＝0.057)减小了30％(图9)。
当比较青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)组与DSS组之间结束时的组织评分时还观察到26％的统计上显著差异(p＝0.049)，而结束时的肉眼评分在青春双歧杆菌DSM29103(BIF038)组中相比DSS降低了19％(分别是图10和11)。
总的说来，用青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)的此干预相比单独接受DSS处理的大鼠使得在以下方面改善：疾病诱发的厌食、粪便稠度、动物数量、便血、肉眼和显微镜评分以及肠道渗透性。
这些数据表明青春双歧杆菌DSM 29103(BIF038)预防和/或抑制胃肠道中的炎症和组织损伤并且还抑制腹泻且诱导就体重而言的总体健康促进效果。
保藏和专家解决方案
申请人请求如下所述为本申请保藏的微生物样品仅限于本领域中的专家，直到授予专利之日。
CHCC12845是在2014年7月 16日以保藏号DSM 29102保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)。
CHCC12855是在2014年7月 16日以保藏号DSM 29103保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)。
CHCC12867是在2014年7月 16日以保藏号DSM 29104保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)。
CHCC12895是在2014年7月 16日以保藏号DSM 29105保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)。
CHCC12957是在2014年7月 16日以保藏号DSM 29106保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)。
CHCC12999是在2014年7月 16日以保藏号DSM 29107保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)。
CHCC12876是在2014年7月16日以保藏号DSM 29111保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心，布伦瑞克D-38124，因霍芬街7B(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)。
保藏都是按照用于专利程序目的的关于微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约进行。
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序列表
<110> 科·汉森有限公司
<120> 新型双歧杆菌益生菌
<130> P5040PC00
<160> 25
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 60
<212> RNA
<213> 青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolescentis)
<400> 1
aagucgaacg ggaucggcug gagcuugcuc cggccgugag aguggcgaac gggugaguaa 60
<210> 2
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<212> RNA
<213> 青春双歧杆菌
<400> 2
aagucgaacg ggaucccagg agcuugcucc ugggugagag uggcgaacgg gugaguaa 58
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<212> RNA
<213> 青春双歧杆菌
<400> 3
ugcuccaguu ggaugcaug 19
<210> 4
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<400> 4
ugcuccaguu gaccgcaug 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 青春双歧杆菌
<400> 5
ugcuccgaca ugacgcaug 19
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<212> RNA
<213> 青春双歧杆菌
<400> 6
uccuucuggg aaagauucua ucgguaugg 29
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<212> RNA
<213> 青春双歧杆菌
<400> 7
guccucuggg aaagcuuuug cgguaugg 28
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<211> 28
<212> RNA
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uccuucuggg aaagauucau cgguaugg 28
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<212> RNA
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ucguguuggg aaagauucua ucgguaugg 29
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uccuaucagc uugauggcgg gguaacggcc caccauggcu ucgacgggua gccggccuga 60
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<213> 青春双歧杆菌
<400> 11
uccuaucagg uagucggcgg gguaacggcc caccgagccu acgacgggua gccggccuga 60
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<211> 91
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 12
Met Glu Thr Lys Gln Lys Pro Glu Gln Asp Leu Asp Gln Arg Ser Phe
1 5 10 15
Glu Arg Met Met Asp Gly Ser Met Leu Asp Met Leu Arg Ala Asn Arg
20 25 30
Asp Arg Leu Gln Lys Ala Met Asp Asp Thr Ser Thr Pro Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Pro Ala Ile Ser Arg Gln Leu Ile Asp Val Cys Glu Arg Ile Glu
50 55 60
Ser Leu Gln Gly Gly Gly Leu Thr Asp Leu Leu Asp Asp Glu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Val Thr Asp Asp Val Gly Ala Ser Ile Val
85 90
<210> 13
<211> 134
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 13
Met Thr Met Thr Asp Glu Pro Asp Met Phe Ala Thr Ser Asp Asp Leu
1 5 10 15
Glu Arg Arg Trp His Lys Leu Thr Asp Glu Glu Arg Glu Lys Ala Asp
20 25 30
Thr His Leu Ala Asp Val Thr Asp Tyr Ile Lys Glu Arg Ser Pro Asn
35 40 45
Trp Arg Arg Leu Leu Asp Glu Arg Pro Arg Leu Leu Thr Lys Ile Thr
50 55 60
Cys Asp Ile Val Arg Arg Ile Met Gln Ala Asp Pro Tyr Asp Ile Pro
65 70 75 80
Gly Gly Ile Thr Gln Met Asn Gln Thr Thr Gly Ser Phe Ser Glu Gln
85 90 95
Tyr Ser Phe Gly Ala Pro Thr Gly Asp Leu Trp Leu Arg Asp Asp Glu
100 105 110
Lys Arg Ile Leu Gly Ile Asn Ala Gln Arg Ala Phe Ser Val Asp Met
115 120 125
Ala Thr Gly Glu Thr Ser
130
<210> 14
<211> 206
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 14
Met Ser Asp Asn Asn Glu Lys Thr Thr Val Ala Ala Gln Gly Ala Thr
1 5 10 15
Asp Tyr Gly Tyr Val Ser Ser Gly Asn Thr Ala Gly Asn Val Arg Leu
20 25 30
Ile Lys Asn Tyr Ala Leu Phe Leu Phe Pro Lys Gly Asp Ser Thr Phe
35 40 45
Val Ala Pro Thr Gly Val Ala Trp Thr Pro Pro Ala Ser Lys Lys Pro
50 55 60
Ile Gly Tyr Ser Thr Glu Asp Gly Ala Val Leu His Pro Glu Pro Gly
65 70 75 80
Asp Ser Thr Asp Tyr Lys Ala His Asn Gly Asp Ile Val Leu Ser Asp
85 90 95
Thr Asp Pro Gly Tyr Trp Thr Leu Gln Leu Ala Ala Met Glu Gly Arg
100 105 110
Lys Asp Val Val Ser Ala Tyr Phe Asp Val Asp Val Asp Ser Asp Gly
115 120 125
Gly Ile Ser Ile Lys Gly Ala Gly Leu Lys Lys Glu Trp Ile Leu Val
130 135 140
Leu Val Ala Leu Asp Gln Gln Asp Arg Pro Phe Leu Leu Tyr Gly Thr
145 150 155 160
Asn Ala Lys Val Ser Asp Arg Asp Asp Val Ser Leu Lys Ser Ser Glu
165 170 175
Ile Met Asn Phe Ser Met Thr Phe Lys Met Leu Lys Gly Thr Asn Gly
180 185 190
Glu Gln Phe His Ala Trp Gly Leu Val Thr Glu Asp Ala Lys
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<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 15
Met His Ile Gln Phe Pro Thr Arg Gln Thr Leu Thr Ile Met Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gln Asn Thr His Glu Thr Asp Thr Ala Asn Asn Ala Ser
20 25 30
Tyr Thr Thr Ile Ser Thr Ile Leu Thr Leu Ala Ile Pro Thr Phe Gly
35 40 45
Gln Leu Ile Ala Glu Pro Ala Phe Val Leu Ile Asp Thr Ala Ile Val
50 55 60
Gly His Ile Gly Gly Gln Ala Leu Ala Gly Leu Ser Val Gly Ser Thr
65 70 75 80
Ile Val Leu Thr Val Val Gly Leu Cys Val Phe Leu Ala Tyr Ser Thr
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Thr Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Gly Ala Gly Lys Arg Gly Glu Gly
100 105 110
Leu Glu Ala Gly Ile Asp Gly Leu Trp Leu Ala Gly Ile Ile Gly Val
115 120 125
Val Val Ser Val Ala Leu Phe Val Ile Ala Arg Pro Leu Cys Thr Ala
130 135 140
Met Gly Ala Gln Gly Ser Val Leu His Asn Ala Val Asp Tyr Val Arg
145 150 155 160
Ala Val Val Phe Gly Ile Pro Gly Met Leu Leu Val Tyr Ala Ala Asn
165 170 175
Gly Ile Phe Arg Gly Leu Gln Lys Val Arg Ile Thr Leu Ile Ala Ala
180 185 190
Met Val Gly Ala Ile Leu Asn Thr Leu Leu Asp Leu Leu Phe Ile Leu
195 200 205
Gly Phe Gly Trp Gly Val Phe Gly Ser Gly Val Ala Thr Leu Ile Ser
210 215 220
Gln Trp Phe Met Ala Val Ala Leu Ile Val Pro Ser Val Leu Trp Thr
225 230 235 240
Arg Ala Glu Gly Ala Arg Leu Gln Pro Arg Leu Ser Gly Val Leu Asn
245 250 255
Ser Ala Gly Asp Gly Ala Val Leu Phe Leu Arg Thr Leu Ala Leu Arg
260 265 270
Ala Cys Leu Val Ala Asn Val Val Leu Ala Thr His Met Gly Val Glu
275 280 285
Val Leu Ala Ala Tyr Gln Val Val Asn Ser Ser Trp Asn Phe Val Leu
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Asn Met Leu Asp Ala Ile Gly Ile Ala Gly Gln Thr Leu Val Ala Ala
305 310 315 320
Gln Ile Gly Ala Arg Lys Glu Asp Glu Ala Met Arg Leu Thr Arg Ile
325 330 335
Ala Gly Lys Ala Gly Leu Cys Gly Gly Thr Val Ile Gly Ile Gly Leu
340 345 350
Met Ile Ala Gly Trp Cys Ala Ser Pro Leu Phe Ser Gln Ser Thr Glu
355 360 365
Ile Gln His Leu Leu Thr Val Gly Met Met Val Val Gly Val Thr Leu
370 375 380
Pro Leu Ala Gly Trp Met Trp Ala Val Asp Gly Ile Leu Ile Gly Ala
385 390 395 400
Gly Asp Tyr Arg Tyr Leu Ala Leu Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ile
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Tyr Val Pro Cys Leu Val Thr Ile Gly Trp Ile Cys Asp Ala Met Gln
420 425 430
Ala Ser Ser Ala Leu Arg Met Ala Leu Leu Trp Leu Ala Val Asn Leu
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Ser Thr Trp Leu His Ile Val His
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<213> 青春双歧杆菌
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1 5 10 15
Val Ser Ala Ile Asn Trp Asn Arg Leu Glu Asp Asp Lys Asp Leu Glu
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Val Trp Asp Arg Leu Thr Gly Asn Phe Trp Leu Pro Glu Lys Val Pro
35 40 45
Val Ser Asn Asp Leu Pro Val Trp Arg Ser Met Gly Glu Ala Glu His
50 55 60
Thr Leu Thr Met Arg Val Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Asp Thr Ile
65 70 75 80
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Ala Lys Ser Tyr Ser Ser Ile Phe Ser Thr Leu Cys Ser Thr Arg Gln
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Phe Ser Trp Ser Glu Glu Asn Glu Tyr Leu Gln Lys
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Lys Ala Arg Ile Val Leu Asp Tyr Tyr Glu Gly Asp Ser Pro Leu Lys
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Arg Lys Val Ala Ser Thr Leu Leu Glu Ser Phe Leu Phe Tyr Ser Gly
165 170 175
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180 185 190
Ala Asp Val Ile Arg Leu Ile Ile Arg Asp Glu Ala Val His Gly Tyr
195 200 205
Tyr Ile Gly Tyr Lys Tyr Gln Lys Gly Leu Glu Arg Val Asp Asp Gly
210 215 220
Lys Arg Ala Glu Leu Arg Asp Tyr Thr Tyr Asp Leu Leu Asn Asp Leu
225 230 235 240
Tyr Asp Asn Glu Val Glu Tyr Thr Arg Ser Leu Tyr Glu Pro Val Gly
245 250 255
Leu Thr Gln Asp Val Glu Lys Phe Leu Arg Tyr Asn Gly Asn Lys Ala
260 265 270
Leu Met Asn Leu Gly Tyr Pro Ala Leu Phe Pro Gln Glu Ile Cys Asp
275 280 285
Val Asn Pro Ser Ile Leu Ala Ala Leu Ser Pro Asn Ala Asp Glu Asn
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His Asp Phe Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ser Tyr Val Met Gly Lys Ser
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Val Glu Thr Asp Asp Asp Asp Trp Asp Phe
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<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
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Met Pro Cys Ala Pro Ala Leu Pro Val Arg Thr Asp Gly His Ala Gly
1 5 10 15
Arg Arg Leu Asp Arg Thr Arg Arg Pro Ala Asn Ile Leu Arg Arg Thr
20 25 30
Leu Thr Thr Gly Thr Thr Ile Thr Met Thr Asp Asn Pro Thr Thr Asn
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Thr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Thr Tyr Asp Arg Ala His Asp Trp His
50 55 60
Ala Leu Asn Ala Met Leu Asn Leu Tyr Asp Asp Gln Gly Arg Ile Gln
65 70 75 80
Phe Asp Lys Asp Arg Gln Ala Glu Arg Glu Tyr Ile Glu Lys His Val
85 90 95
Arg Pro Asn Thr Ile Ser Phe Glu Ser Thr His Asp Arg Leu Asp Tyr
100 105 110
Leu Ile Ala Asn Gly Tyr Tyr Asp Lys Pro Val Phe Asp Arg Tyr Asp
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Asp Asp Phe Leu Asp Asp Phe Tyr Asn Asp Val Asn Asp Cys Gly Phe
130 135 140
Glu Phe Asp Thr Phe Leu Gly Ala Phe Lys Phe Tyr Gln Ser Tyr Ala
145 150 155 160
Leu Lys Thr Phe Asp Gly Met Arg Tyr Leu Glu Asp Phe Pro Gln Arg
165 170 175
Ala Ala Ala Val Ala Leu Ala Leu Ala Asp Gly Asp Lys Thr Arg Ala
180 185 190
Lys Ala Tyr Phe Ala Glu Ile Val Ser Gly Arg Phe Gln Pro Ala Thr
195 200 205
Pro Thr Phe Leu Asn Leu Gly Lys Ala Gln Arg Gly Glu Ala Val Ser
210 215 220
Cys Phe Leu Val Arg Ile Glu Asp Asn Met Glu Ser Ile Ser Arg Gly
225 230 235 240
Ile Asn Ala Ala Leu Gln Leu Ser Lys Arg Gly Gly Gly Val Ala Leu
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Leu Leu Ser Asn Leu Arg Glu Ala Gly Ala Pro Ile Lys Arg Ile Lys
260 265 270
His Gln Ser Ser Gly Val Val Pro Val Met Lys Leu Leu Glu Asp Ser
275 280 285
Phe Ser Tyr Ala Asn Gln Leu Gly Ala Arg Gln Gly Ala Gly Ala Val
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Tyr Leu Ser Ala His His Pro Asp Ile Met Arg Phe Leu Asp Thr Lys
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Asp Glu Lys Ile Arg Ile Lys Ser Leu Ala Leu Gly
325 330 335
Val Val Ile Pro Asp Ile Thr Phe Glu Leu Ala Lys Arg His Glu Arg
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Met Ala Leu Phe Ser Pro Tyr Asp Val Glu Arg Val Met Gly Lys Pro
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370 375 380
Asp Arg Ile Gly Lys Thr Tyr Ile Asp Ala Arg Glu Phe Phe Met Thr
385 390 395 400
Leu Ala Glu Leu Gln Phe Glu Ser Gly Tyr Pro Tyr Met Val Phe Glu
405 410 415
Asp Thr Val Asn Arg Ala Asn Pro Ile His Gly Arg Ile Ala Met Ser
420 425 430
Asn Leu Cys Ser Glu Ile Leu Gln Val Gln Glu Pro Ser Thr Tyr His
435 440 445
Glu Asp Leu Ser Tyr Ala His Val Gly Arg Asp Val Ser Cys Asn Leu
450 455 460
Gly Ser Leu Asn Ile Ala Lys Ala Met Asp Gly Gly Leu Gly Arg Thr
465 470 475 480
Val Glu Arg Ala Ile Arg Ala Leu Thr Ser Val Ser Glu His Thr Asp
485 490 495
Ile Ala Cys Val Pro Ser Ile Arg Arg Ala Asn Ser Glu Gly His Ala
500 505 510
Ile Gly Leu Gly Gln Met Asn Leu His Gly Phe Leu Ala Arg Glu Ser
515 520 525
Ile Met Tyr Gly Ser Pro Glu Ala Leu Asp Phe Thr Asp Met Tyr Phe
530 535 540
Met Thr Val Ala Tyr His Ala Tyr Arg Ala Ser His Ala Leu Ala Val
545 550 555 560
Glu Arg Gly Thr Arg Phe Val Gly Phe Glu Arg Ser Ala Tyr Ala Lys
565 570 575
Pro Thr Gly Ala Gly Asn Tyr Phe Asp Lys Tyr Thr Asn Gly Glu Arg
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Gly Ile His Ile Pro Asp Glu Asp Asp Trp Arg Arg Leu Arg Asp Asp
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Ile Ile Arg Asp Gly Ile Phe Asn Gln Tyr Leu Gln Ala Val Pro Pro
625 630 635 640
Thr Gly Ser Ile Ser Tyr Ile Asn His Ser Thr Ser Ser Ile His Pro
645 650 655
Ile Ala Ser Lys Ile Glu Ile Arg Lys Glu Gly Lys Ile Gly Arg Ile
660 665 670
Tyr Tyr Pro Ala Pro Tyr Met Thr Asn Asp Asn Leu Gln Tyr Phe Ala
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Asp Ala Tyr Glu Ile Gly Trp Lys Ala Ile Val Asp Thr Tyr Ala Glu
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Ala Thr Arg His Val Asp Gln Gly Leu Ser Leu Thr Leu Phe Phe Pro
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Asp Thr Ala Thr Thr Arg Asp Leu Asn Lys Ala Gln Ile Tyr Ala Trp
725 730 735
Arg Lys Gly Val Lys Thr Leu Tyr Tyr Ile Arg Ile Arg Gln Gln Ala
740 745 750
Leu Ser Gly Thr Glu Val Gln Gly Cys Val Ser Cys Met Leu
755 760 765
<210> 18
<211> 362
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 18
Met Glu Phe Glu Glu Ser Leu Asn Gln Val Ala Ala Lys Val Arg Asp
1 5 10 15
Leu Lys Glu Gly Ile Glu Thr Glu Glu Ala Thr Lys Asn Ala Phe Ile
20 25 30
Met Pro Phe Ile Gly Gln Val Leu Gly Tyr Asp Val Phe Asn Pro Thr
35 40 45
Glu Val Val Pro Glu Phe Thr Ala Asp Val Gly Val Lys Lys Gly Glu
50 55 60
Lys Val Asp Tyr Ala Leu Val His Asp Gly Gln Val Gln Ile Leu Ile
65 70 75 80
Glu Cys Lys Lys Ile Gly Val Pro Leu Ser Leu Glu Asn Ala Ser Gln
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Leu Tyr Arg Tyr Phe Ala Val Thr Asn Ala Arg Ile Gly Val Leu Thr
100 105 110
Asn Gly Gln Val Trp Asn Phe Tyr Met Asp Ile Asp Glu Pro Asn Arg
115 120 125
Met Asp Ser Lys Pro Phe Leu Val Leu Asp Leu Leu Asp Ile Asp Pro
130 135 140
Thr Ile Ile Pro Ala Leu Gln Lys Leu Thr Lys Pro Ala Phe Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ile Ala Ser Ser Ala Glu Glu Leu Lys Tyr Val Gly Ala Leu
165 170 175
Lys Arg Ala Val Gly Asp Glu Phe Lys Glu Pro Ser Asp Glu Phe Val
180 185 190
Lys Leu Leu Ala Ser His Val Tyr Glu Gly Ala Phe Tyr Ala Ser Val
195 200 205
Met Glu Lys Phe Arg Pro Leu Val Ala Lys Ala Leu Lys Gln Tyr Leu
210 215 220
Ser Asp Gln Val Asn Asp Arg Leu Lys Thr Ala Leu Gly Ala Asp Asp
225 230 235 240
Ile Lys Ile Asp Thr Ile Glu Pro Asp Ala Asn Glu Glu Thr Asn Asp
245 250 255
Gly Asp Glu Ser Asp Gly Asn Asp Asp Asp Gly Ile Val Thr Thr Glu
260 265 270
Glu Glu Ile Ala Gly Tyr Arg Ile Ile Lys Ala Ile Ala Cys Ser Asp
275 280 285
Val Asp Pro Glu Arg Val Thr Met Arg Asp Ala Lys Lys Tyr Cys Ala
290 295 300
Ile Phe Leu Asp Asp Asn Asn Arg Lys Pro Ile Val Arg Leu Tyr Phe
305 310 315 320
Asn Thr Lys Gln Lys Tyr Leu Gly Val Phe Asp Glu Asn Lys Asn Cys
325 330 335
Glu Arg Met Pro Ile Asp Thr Leu Asn Gly Ile Tyr Ala Tyr Ser Glu
340 345 350
Gln Ile Arg Glu Glu Val Arg Arg Leu Leu
355 360
<210> 19
<211> 66
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 19
Met Thr Lys Glu Gln Ile Asn Arg Leu Ala Gln Leu Ile Thr Asp Thr
1 5 10 15
Ala Glu Thr Ala Ala Asn Ile Glu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Gly Lys
20 25 30
Ala Asp Asn Gly Ile Ala Ala Met Ala Ser Gly Leu Arg Thr Asn Cys
35 40 45
Thr Ser Cys Leu Val Leu Val Asn Gly Leu Met Gln Glu Gly Ala Arg
50 55 60
Cys Glu
65
<210> 20
<211> 60
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 20
Met Gly Val Gly Arg Ser Ile Trp Phe Asp Glu Gly Tyr Thr Leu Ile
1 5 10 15
Val Glu Ser Gln Pro Phe Ala Arg Met Met Asp Leu Leu Lys Val Asp
20 25 30
Val His Pro Pro Leu Tyr Tyr Leu Leu Leu Arg Met Trp Ile Ser Val
35 40 45
Phe Gly Ser Asp Val Met Ala Leu Arg Ala Met Ser
50 55 60
<210> 21
<211> 462
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 21
Met Phe Cys Gly Leu Thr Val Leu Met Ser Met Val Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Met Ala Cys Glu Arg His Ala Leu Leu Ala Ser Pro Phe Val Met Phe
20 25 30
Ala Pro Leu Met Leu Arg Tyr Gly Tyr Glu Ile Arg Met Tyr Ser Leu
35 40 45
Ile Pro Phe Leu Ser Val Leu Gly Thr Tyr Leu Leu Leu Arg Ala Met
50 55 60
Arg Glu Asp Gly Met Arg Pro Asp Arg Arg Arg Ser Gly Arg Gly Ser
65 70 75 80
Thr Ala Leu Arg Arg Ile Ala Asp Arg Arg Trp Trp Ile Ala Tyr Ala
85 90 95
Ile Val Val Ala Leu Gly Met Tyr Ser Gln Tyr Met Met Ala Phe Val
100 105 110
Trp Met Thr His Val Leu Trp Leu Tyr Val Ala Leu Arg Arg His Gly
115 120 125
His Ala Arg Arg Phe Pro Arg Met Leu Ile Pro Tyr Ala Leu Ala Val
130 135 140
Ala Leu Tyr Ile Pro Trp Ile Pro Ser Ala Val Gly Gln Phe Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ala Leu Pro Pro Leu Lys Glu Thr Met Asn Leu Ser Glu Leu Thr
165 170 175
Ser Val Phe Ser Ile Leu Thr Thr Gly Phe Asp Ala Lys Arg Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Met Thr Val Ala Leu Leu Ala Met Leu Ala Val Leu Ile Ala
195 200 205
Gly Ser Ser Arg Leu Arg Asp Thr Ala Gly Ser Thr Val Arg Ser Gly
210 215 220
Met Glu Pro Ser Ala Ala Gly Ser Val Ala Ala Ala Glu Asp Arg Ala
225 230 235 240
Asp Ser Gly Arg Ala Ala Arg His Leu Ala Phe Phe Ala Phe Val Pro
245 250 255
Leu Ser Leu Leu Leu Val Phe Ala Ala Val Arg Glu Pro Phe Thr Ala
260 265 270
Pro Tyr Gly Phe Phe Thr Ile Arg Tyr Val Cys Pro Phe Ala Pro Phe
275 280 285
Ser Tyr Met Phe Leu Gly Leu Leu Cys Ser Arg Ile Val Leu Gly Thr
290 295 300
Arg Glu Thr Gly Ala Gly Asp Phe Cys Gly Lys Ala Thr Arg Phe Leu
305 310 315 320
Arg Arg Trp Ser Ala Trp Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ala Gly Gly
325 330 335
Ser Ile Gly Phe Ala Phe Gln Gly Asn Tyr Ile Tyr Glu Gln Gln Thr
340 345 350
Thr Pro Gln Thr Ala Arg Thr Ala His Thr Val Ala Cys Asp Ala Asp
355 360 365
Asn Ala Val Val Thr Ser Ser Glu Phe Asp Tyr Ile Glu Ser Leu Tyr
370 375 380
Tyr Phe Arg Ser Cys Gly Asn Tyr His Phe Leu Lys Asp Gly Glu Val
385 390 395 400
Ser Thr Arg Gly Gly Tyr Ala Pro Leu His Gly Ser Pro Ala Gln Ile
405 410 415
Arg His Ile Asp Asp Leu Asp Thr Glu Arg Val Thr Tyr Leu Val Arg
420 425 430
Gly Gly Glu Lys Ile Pro Glu Thr Arg His Tyr Arg Ile Val Gly Thr
435 440 445
Thr Val Asn Gly Ser Asn Lys Ala Ile Thr Leu Glu Arg Arg
450 455 460
<210> 22
<211> 612
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 22
Met Asn Thr Ile Phe Lys Arg Val Ile Ser Gly Ala Ala Ala Leu Gly
1 5 10 15
Ile Ala Val Ser Gly Leu Ala Ile Gly Val Ser Thr Ala Tyr Ala Ala
20 25 30
Asp Pro Ala Thr Gly Ser Ile Thr Ile Asn Lys Ser Asp Ala Gly Gln
35 40 45
Val Asp His Ser Phe Asp Gly Trp His Leu Ala Ser Leu Thr Asn Val
50 55 60
Thr Lys Asp Ser Ala Gly Lys Ile Asn Gly Phe Leu Ile Asp Thr Asp
65 70 75 80
Asp His Met Val Gly Thr Ile Val Ala Ala Met Thr Ser Asn Gln Lys
85 90 95
Ala Ala Tyr Glu Glu Asn Ala Asn Tyr Tyr Ser Thr Asp Asn Ala Val
100 105 110
Ala Asn Pro Met Gly Tyr Leu Val Glu Lys Val Phe Lys Asp Glu Ser
115 120 125
Gly Lys Ala Leu Ser Glu Leu Thr Ser Pro Trp Gly Gly Asp Ser Ser
130 135 140
Ala Leu Arg Ala Phe Ala Glu Ser Leu Ser Lys Glu Leu Ala Lys Thr
145 150 155 160
Ser Ala Pro Thr Ala Asp Lys Thr Gly Asp Ser Ala Leu Lys Thr Gly
165 170 175
Glu Asn Lys Glu Leu Lys Gln Gly Leu Trp Phe Leu Lys Asp Val Thr
180 185 190
Pro Thr Asp Asp Thr Lys Gly Thr Asn Ser Ile Pro Ile Ile Thr Pro
195 200 205
Thr Thr Phe Asp Gly Ala Asp Ser Trp Gly Thr Val Thr Leu Lys Asn
210 215 220
Thr Thr Pro Thr Ile Asp Lys Lys Leu Val Asp Ser Lys Asp Asp Gly
225 230 235 240
Thr Tyr Thr Pro Asn Thr Gln Pro Asp Tyr Ala Val Gly Asp Asp Val
245 250 255
Tyr Tyr Glu Leu Thr Ser Thr Val Pro Val Tyr Thr Gly Tyr Asp Ile
260 265 270
Asp Pro Thr Met Lys Asp Ala Ala Lys Thr Arg Ile Phe Lys Ile Asn
275 280 285
Asp Thr Ala Ser Lys Ala Leu Thr Val Ser Thr Gly Thr Val Ile Glu
290 295 300
Ser Val Lys Leu Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ala Val Thr Leu Val Lys
305 310 315 320
Asp Asn Asp Tyr Thr Val Thr Val Thr Asp Tyr Gly Asp Val Asn Thr
325 330 335
Pro Asp Thr Asp Ala Tyr Lys Gly Gly His Val Thr Thr Ile Asp Leu
340 345 350
Gly Lys Tyr Val Asn Lys Ala Lys Gly Ser Lys Ser Ala Thr Asp Gly
355 360 365
Ile Leu Glu Gly Ala Thr Val Thr Val Ile Val Lys Ala Lys Leu Asn
370 375 380
Lys Asp Ala Leu Ile Ser Glu Pro Asp Asn Leu Gln Lys Asn Pro Asn
385 390 395 400
Lys Val Asp Leu Glu Tyr Ser Asn His Pro Glu Glu Val Asn His Ala
405 410 415
His Lys Val Pro Gly Pro Glu Val Pro Val Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp
420 425 430
Ile Leu Lys Thr Asp Lys Ala Gly Thr Thr Lys Leu Pro Gly Ala Lys
435 440 445
Phe Thr Ile Glu Ala Val Ser Gly Thr Ser Lys His Asp Gly Lys Tyr
450 455 460
Leu Gly Ser Tyr Gly Lys Asp Gly Trp Asn Tyr Leu Asp Asn Lys Pro
465 470 475 480
Ala Val Ala Asp Thr Asp Gly Val Phe Thr Thr Gly Thr Asp Gly Lys
485 490 495
Ile Asn Val Ser Gly Leu Asp Ala Gly Thr Tyr Glu Val His Glu Ile
500 505 510
Ala Pro Pro Asp Gly Tyr Thr Ala Ile Ser Leu Pro Lys Phe Gln Phe
515 520 525
Thr Ile Thr Pro Thr Val Ser Asn Glu Val Ala Gly Arg Lys Thr Ile
530 535 540
Thr Val Val Ala Leu Ser Leu Ala Lys Gly Ala Asp Val Arg Ala Ser
545 550 555 560
Leu Ser Gln Asp Gly Lys Thr Leu Asn Ile Trp Asn Ala Lys Asn Ile
565 570 575
Thr Glu Leu Pro Lys Thr Gly Gly Ala Gly Leu Ala Met Ile Val Ala
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Val Gly Ala Leu Phe Ile Ala Ala Ser Gly Ile Phe Ala Leu Arg Ala
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Arg Arg Lys Ala
610
<210> 23
<211> 256
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 23
Met Thr Gly Glu Lys Gly Gly Leu Leu Ala Gly Leu Arg Ala Glu Ala
1 5 10 15
Leu Lys Ser Arg His Ala Ala Pro Val Arg Leu Ala Val Leu Met Ala
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gly Ala Met Pro Tyr Arg Gly Val Gln Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Trp Asn Tyr Trp Tyr Ala Leu Phe Leu Pro Val Ala Leu
50 55 60
Ser Leu Val Val Ala Cys Val Ala Arg Ala Asp Ala Arg Thr Arg Met
65 70 75 80
Arg Gly Leu Leu Gly Leu Gly Phe Pro Leu Arg Arg Ala Trp Trp Ala
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Lys Ala Leu Trp Cys Leu Ala Leu Cys Thr Leu Ser Asn Leu Val Val
100 105 110
Phe Gly Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ala Phe Ser Ser Gln Gly Leu Thr
115 120 125
Val Ala Gly Thr Leu Thr Met Leu Leu Cys Ala Leu Val Asn Thr Val
130 135 140
Thr Ala Ala Trp Met Ile Pro Ala Gly Leu Phe Leu Thr Ala Arg Leu
145 150 155 160
Gly Met Leu Ala Gly Ile Phe Cys Pro Leu Ala Ala Gln Leu Val Gly
165 170 175
Gly Phe Ala Trp Ser Leu Met Pro Leu Pro Gln Leu Phe Pro Pro Ser
180 185 190
Ala Ser Met Val Ile Pro Thr Ser Phe Ile Pro Val Leu Pro Ser Gly
195 200 205
Glu Pro Leu Ala Ala Asp Met Ala Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ala Asp
210 215 220
Gly Met Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ala Val Cys Ala Leu Ala Phe Ala
225 230 235 240
Ala Leu Thr Ala Ala Gly Ala Ala Trp Phe Ala Arg Ser Glu Glu Arg
245 250 255
<210> 24
<211> 1156
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 24
Met Glu Gly Leu Thr Ser Met Gly Ile Lys Asn Ala Met Val Arg Met
1 5 10 15
Ala Asp Lys Ala Gly Asn Ala Val Ala Lys Val Ser Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Ala Gln Leu Asp Glu Ile Glu Arg Lys Arg Glu Ala Tyr Leu Ser Glu
35 40 45
Lys Pro Asp Pro Ser Asp Pro Gln Ala Ile Glu Leu Thr Asn Arg Leu
50 55 60
Leu Ala Thr Ala Gly Val Glu Ile His Gly Ala Tyr Leu Pro Gln Leu
65 70 75 80
Arg Asp Val Tyr Cys Pro Val Glu Ala Ser Val Glu Tyr Pro Asp Ser
85 90 95
Phe Asp Ala Leu His Asn Ile Arg His Met Asn Ile Thr Lys Trp Ile
100 105 110
Val Asp Pro Lys Glu Asp Ser Leu Glu Lys Leu Ile Asn Val Tyr Asp
115 120 125
Val Leu Ala Asp Glu Asp Cys Asn Ile Ala Leu Val Phe Asn Arg Thr
130 135 140
Ser Ser Thr Thr Asn Val Tyr Leu Ala Val Val Asp Thr Asn Asn Thr
145 150 155 160
Glu Asp Asn Ile Asp Val Asp Asn Phe Thr Lys Arg Ile Ser Asp Ala
165 170 175
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180 185 190
Ser Ile Pro Cys Leu Gln Glu Arg His Pro Phe Ser Val Ala Ala Val
195 200 205
Ser Asn Val Pro Thr Glu Lys Asn Asp Arg Phe Met Thr Gln Thr Ile
210 215 220
Glu Lys Val Leu Asp Gly Ile Val Pro Arg Asn Arg Ser Glu Asp Tyr
225 230 235 240
Thr Ile Val Leu Leu Ala Thr Pro Ile His Asp Val Glu Glu Arg Lys
245 250 255
Leu Arg Leu Ala Glu Leu His Ser Met Leu Thr Pro Tyr Ala Ser Trp
260 265 270
Met Thr Asn Tyr Val Tyr His Arg Asn Asp Ser Ile Gly Ser Ser Ala
275 280 285
Thr Ile Gly Val Asn Ala Gly Val Ser Ala Gly Thr Gln Asn Gly Thr
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305 310 315 320
Ser Thr Ser Gln Ser Glu Ser Gln Gly Thr Ser Asp Ser Thr Ser Ser
325 330 335
Ser Glu Ser Ile Thr Asp Thr Asp Ser Asn Gly Thr Asn Glu Ser Ser
340 345 350
Gln Val Asp Val Ser Gly Gly Phe Asp Leu Lys Ile Ala Arg Val Gly
355 360 365
Ala Ser Leu Asn His Ser His Gly Ser Ser His Thr Thr Ser Thr Ala
370 375 380
Lys Gly Thr Thr Asp Thr Val Gly Gln Ala Val Thr Lys Ser Leu Gly
385 390 395 400
Lys Ala Val Thr Ser Gly Ile Gly Lys Ala Val Ser Lys Gly Ser Ser
405 410 415
Val Thr Ser Gly Val Ser Lys Ala Val Asn Leu Gly Ala Asn Phe Gly
420 425 430
Gly Ser Phe Ala Arg Ser Ser Thr Val Thr Ala Thr Leu Gly Ala Asp
435 440 445
Glu Gly Ile Thr Gln Thr Phe Arg Asn Phe Ser Ile Gln His Ala Leu
450 455 460
Glu Ile Leu Glu Ser Gln Met Lys Arg Leu Asp Leu Ala Ser Ala Leu
465 470 475 480
Gly Met Trp Asp Phe Cys Ala Tyr Val Leu Ser Glu Asp His Asn Ile
485 490 495
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500 505 510
Ser Phe Met Ser Lys Ala Ala Val Asn Leu Trp Arg Gly Asp Leu Gly
515 520 525
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545 550 555 560
Ser Phe Ser Val Tyr Pro Ala Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Leu Ser
565 570 575
Gly Lys Glu Leu Ala Tyr Ser Leu Asn Phe Pro Lys Lys Ser Val Pro
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
His Met His Arg Glu Glu Pro Ala Lys Val Leu Leu Glu Lys Asp Ser
625 630 635 640
Leu Ala Ser His Val Phe Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Gly Lys Thr
645 650 655
Asn Thr Val Cys Arg Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Asp Gln Gly Val Gly
660 665 670
Phe Leu Val Ile Glu Pro Ala Lys Gly Glu Tyr Lys Asp Val Phe Gly
675 680 685
Gly Leu Asp Asp Val His Val Phe Gly Thr Asn Pro Ala Phe Thr Pro
690 695 700
Leu Leu Arg Ile Asp Pro Phe Ser Phe Pro Gln Gly Ile His Val Leu
705 710 715 720
Glu His Leu Asp Arg Leu Val Glu Ile Phe Asn Val Cys Trp Pro Met
725 730 735
Tyr Ala Ala Met Pro Ala Val Leu Lys Asp Ala Ile Ser Arg Ser Tyr
740 745 750
Glu Asp Cys Gly Trp Asn Leu Thr Thr Ser Glu Asn Ser Phe Gly Glu
755 760 765
Gly Leu Tyr Pro Ser Phe Ala Asp Val Ala Arg Asn Val Arg Glu Ile
770 775 780
Leu Asp Ser Ser Glu Tyr Asp Ala Glu Asn Lys Gly Ala Tyr Lys Gly
785 790 795 800
Ser Leu Leu Thr Arg Leu Asn Ser Leu Thr Asn Gly Leu Asn Gly Met
805 810 815
Met Leu Thr Ser Asp Gly Val Asp Asp Ala Thr Leu Phe Asp Gly Asn
820 825 830
Thr Ile Ile Asp Leu Ser Arg Val Gly Ser Thr Glu Thr Lys Ser Leu
835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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Glu Met Arg Thr Tyr Gly Glu Gly Phe Ile Ile Ala Asp Gln Ala Pro
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Gly Leu Leu Asp Met Ala Ala Ile Arg Asn Thr Asn Thr Lys Ile Ile
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Val Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ile Thr Asp Lys Asp Leu Leu Arg Asp
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1105 1110 1115 1120
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1125 1130 1135
Val Gln Glu Gln Asn Asp Lys Ala Phe Ser Asp Trp His Glu Asn Gly
1140 1145 1150
Arg Leu Ile Arg
1155
<210> 25
<211> 141
<212> PRT
<213> 青春双歧杆菌
<400> 25
Met Gly Thr Gly Glu Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Lys Met Arg Gly Leu
1 5 10 15
Thr Gln Ser Glu Leu Ala Glu Lys Cys Gly Leu Thr Asp Ser Ala Ile
20 25 30
Arg Asn Tyr Glu Leu Gly Asn Arg Thr Pro Gly Glu Asn Gln Val Lys
35 40 45
Glu Ile Ala Ser Ala Leu His Val Ala Pro Glu Ser Leu Phe Asp Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Lys Ala Trp Leu Ala Gln Ile Asp Ser Glu Lys Ser Gly Lys Ile Thr
115 120 125
Ala Glu Gln Leu Ala Glu Trp Lys Ala Lys Phe Gly Ala
130 135 140

Claims (11)

1.一种分离菌株，其是保藏为DSM 29103的青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)菌株。
2.一种益生菌产品，其包含根据权利要求1所述的分离菌株和冷冻保护剂。
3.根据权利要求2所述的益生菌产品，其中所述冷冻保护剂是糖。
4.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于改善肠道屏障功能的组合物中的用途。
5.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于改善肠道屏障功能的膳食补充剂中的用途。
6.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于引发抗炎免疫应答的组合物的用途。
7.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于引发抗炎免疫应答的膳食补充剂的用途。
8.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于预防以下疾病、减轻以下疾病的症状、和/或治疗以下疾病的组合物的用途：炎性肠病；肝病；代谢失调；和/或自身免疫性疾病。
9.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于预防以下疾病、减轻以下疾病的症状、和/或治疗以下疾病的膳食补充剂的用途：炎性肠病；肝病；代谢失调；和/或自身免疫性疾病。
10.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于预防以下疾病、减轻以下疾病的症状、和/或治疗以下疾病的组合物的用途：炎性肠病、肠易激综合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、酒精相关性肝病、代谢综合征、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、心血管动脉粥样硬化、乳糜泻、1型糖尿病、多发性硬化症和/或类风湿性关节炎。
11.根据权利要求1所述的分离菌株或根据权利要求2或3所述的益生菌产品在用于制备用于预防以下疾病、减轻以下疾病的症状、和/或治疗以下疾病的膳食补充剂的用途：炎性肠病、肠易激综合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、酒精相关性肝病、代谢综合征、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、心血管动脉粥样硬化、乳糜泻、1型糖尿病、多发性硬化症和/或类风湿性关节炎。
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