CN107106632A

CN107106632A - 一种治疗a型流感病毒感染的方法

Info

Publication number: CN107106632A
Application number: CN201580068628.8A
Authority: CN
Inventors: 谢世良; 张永祺; 黄明停
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2017-08-29
Also published as: TW201627004A; EP3240561A4; WO2016109541A1; US20170360884A1; EP3240561A1; TWI569804B; US10172919B2

Abstract

本揭示内容是关于一种利用融合蛋白来治疗A型流感病毒感染的方法。依据本揭示内容某些实施方式，该融合蛋白包含一HBD肽及一IgG1 Fc区域。依据本揭示内容其他实施方式，该融合蛋白包含一DcR3蛋白及一IgG1 Fc区域。本发明融合蛋白可抑制由A型流感病毒所引发的发炎细胞激素的分泌，以及由A型流感病毒所引发的发炎细胞浸润至肺部组织。因此，本发明融合蛋白可用以研发一种药物，以治疗或预防一个体感染A型流感病毒及/或减缓该个体的肺部损伤，其中该肺部损伤主要是由与A型流感病毒感染相关的过量发炎反应所导致。

Description

一种治疗A型流感病毒感染的方法

技术领域

本揭示内容大致上是关于治疗感染的领域。更具体来说，本揭示内容是关于一种用以治疗或预防A型流感病毒感染的方法。

背景技术

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)是一种负向(negative-sense)、单股(single-stranded)且分段(segmented)的RNA病毒。季节性的IAV感染具有高发病率及高死亡率，每年导致全球约250,000–500,000个体死亡，并造成全美超过35,000个体死亡。对健康的孩童及成人而言，IAV感染通常仅会造成中等严重程度的病状。然而，对免疫功能不足或缺损(immunocompromised)的个体(例如不健康的个体或老年人)来说，IAV感染可能会造成非常严重的病状。其中一种与IAV相关且会导致个体高死亡风险的病征为慢性肺部疾病(例如气喘(asthma)、肺气肿(emphysema)、慢性支气管炎(chronic bronchitis)、支气管扩张症(bronchiectasis)或囊肿纤维化(cystic fibrosis))，其多数是由过量发炎反应所造成。已知除了可作为IAV感染及复制的主要标的细胞的支气管及肺泡上皮细胞外，巨噬细胞(macrophage)亦在由IAV所引发的肺部发炎反应中扮演着重要的角色。一旦遭受IAV感染，巨噬细胞会快速地产生第I型干扰素(type I interferon，例如干扰素-α及干扰素-β)、促发炎细胞激素(pro-inflammatory cytokine，例如TNF-α、IL-6及IL-1β)及趋化激素(chemokine，例如MCP-1、MIP-1α、RANTES及IP-10)，进而吸引白血球浸润至肺部组织，造成组织损伤、水肿(edema)及肺功能障碍。因此，巨噬细胞常被认为对由IAV所引发的肺部损伤及个体死亡具有关键性的影响。

诱饵受体3(Decoy receptor 3,DcR3)亦称为肿瘤坏死因子受体超家族成员6B(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B,TNFRSF6B)、TR6或M68，是TNF受体超家族的一员。由于缺少跨膜域(transmembrane domain)，DcR3会表达为可溶性蛋白的形式。目前已知该蛋白在不同的讯号传递路径中扮演着调控者的角色，且参与不同的细胞作用：(1)抑制由Fas所引发的细胞死亡；(2)抑制由LIGHT所传递的T细胞活化；(3)引发血管新生；以及(4)调控单核球(monocyte)活化及分化为树突细胞(dendritic cell)、巨噬细胞及蚀骨细胞(osteoclast)。此外，亦发现DcR3会过量表达在不同的肿瘤及发炎组织。

由于IAV感染持续对人类造成重大的威胁，且目前尚不清楚该如何预防或调控因感染所造成的组织损伤，相关领域因此亟需一种经改良的方法，以治疗或预防IAV感染，并据以使被感染的个体免于产生后续的组织损伤。

发明内容

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

本揭示内容的第一方面是关于一种在一个体体内治疗或预防IAV感染的方法。该方法包含对该个体投予一治疗有效量的融合蛋白，其包含一由SEQ ID NO：4所组成的第一肽及一与该第一肽连结的人类IgG1 Fc区域。

本揭示内容的另一方面是关于一种用以减缓一有需要个体的肺部损伤的方法；具体来说，该个体遭受IAV感染，且产生由IAV所引发的过量发炎反应。该方法包含对该个体投予一治疗有效量的融合蛋白，其包含一由SEQ ID NO：4所组成的第一肽及一与该第一肽连结的人类IgG1 Fc区域。

依据本揭示内容某些实施方式，该融合蛋白更包含一由SEQ ID NO：5所组成的第二肽，及一由SEQ ID NO：6所组成的第三肽，其中该第二及第三肽分别位于及连接于该由SEQ ID NO：4所组成的第一肽的上游及下游。

依据本揭示内容某些实施方式，该融合蛋白每剂投予剂量约为每公斤体重0.5到5毫克。在一较佳实施例中，该融合蛋白每剂投予剂量约为每公斤体重0.8到1毫克。依据本揭示内容其他实施方式，在一完整的疗程中，该融合蛋白的总投予剂量约为每公斤体重1到10毫克；较佳的情况是，该融合蛋白的总投予剂量约为每公斤体重1.6到2毫克。

依据本揭示内容一实施方式，该融合蛋白可由口服(oral)、肠内(enteral)、鼻腔(nasal)、局部(topical)、穿透黏膜(transmucosal)或非口服(parenteral)方式投予至该个体。一般来说，非口服方式可以是肌肉注射(intramuscular injection)、静脉注射(intravenous injection)或腹腔注射(intraperitoneal injection)。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1A-1C是依据本揭示内容实施例1所绘示的组织化学染色(histochemiscalstaining)及酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果，分别阐述在野生型(wild-type,WT)及DcR3转基因(DcR3-Tg)小鼠中，DcR3于肺脏组织(图1A)、血清(图1B)及支气管肺泡冲洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF，图1C)的表达；

图2A-2G是依据本揭示内容实施例1所绘示的ELISA结果，分别阐述在取自野生型及DcR3转基因小鼠的BALF中，总细胞(图2A)、巨噬细胞(图2B)、嗜中性球(neutrophil，图2C)、CD4+T细胞(图2D)、CD8+T细胞(图2E)、B细胞(图2F)或NK细胞(图2G)的细胞数量；

图3A-3E是依据本揭示内容实施例1所绘示的ELISA结果，分别阐述在取自野生型及DcR3转基因小鼠的BALF中，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α，图3A)、白介素-6(interleukin-6，IL-6，图3B)、IL-1β(图3C)、干扰素-α(interferon-alpha，IFN-α，图3D)或单核球化学趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1，图3E)的表达；

图4A-4B是依据本揭示内容实施例1所绘示的折线图，分别阐述野生型及DcR3转基因小鼠的体重(图4A)及存活百分比(图4B)，其中是先以IAV分别感染该些小鼠后，再连续监测14天以了解其体重变化；以及

图5A-5B依据本揭示内容实施例2所绘示的折线图，分别阐述野生型小鼠的体重(图5A)及存活百分比(图5B)，其中是先以IAV分别感染该些小鼠后，分别投予IgG1、DcR3.Fc及HBD.Fc进行治疗；感染后，连续监测14天以了解其体重变化。

根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。此外，在不同图式间，以相同或相似的组件符号来指称相似的组件/部件。

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

为便于读者了解，本说明书收集部分阐述于说明书、实施例及权利要求范围的词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体来说，除非另有所指，否则在本说明书及权利要求范围中，单数型的“一”包含其复数型。此外，在本说明书及权利要求范围中，“至少一”及“一或多”具有相同意义，且包含一、二、三或更多。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。

在本说明书中，”肽”(peptide)一词是指一至少具有二个氨基酸残基的直链，其中该至少二个氨基酸残基是以肽键(peptide bond)相互连接。组成肽的氨基酸可以是20种标准基因编码氨基酸、其他自然产生的氨基酸、非自然产生的氨基酸或化学衍生的氨基酸，且可以以L形式的异构物(isomer)或D形式的异构物存在。在本揭示内容中，肽可以包含2到300个氨基酸残基；较佳是包含2到260个氨基酸残基。可由本所属领域技术人员熟知的惯用技术来制得肽。举例来说，可以合成方式或经酶切割自然或重组蛋白来制得肽。

“蛋白”(protein)及”多肽”(polypeptide)在本说明书为可互换的词汇，指一由一或多条肽所组成的生物分子，而不论其转译后的修饰。蛋白中的各肽可以是一个亚单元(subunit)。所述蛋白或多肽可以是自然或经修饰的形式，且可以具有生物活性或特性。

“融合蛋白”(fusion protein)一词在本说明书是指二蛋白或肽胜的组合，其可以共价交互作用、静电交互作用、疏水性交互作用、亲和键结等任一方式或形式连结，藉以维持蛋白/肽间的键结关系、防止在后续操作步骤中键结的断裂，且大致上不会改变蛋白的结合特性。本发明较佳的融合蛋白是由重组基因编码而成的肽，其中该重组基因包含二或多个不同基因的部分序列；相互连接的基因的编码序列是位于同一阅读框架中，即基因表达装置(genetic apparatus)会将基因融合视为单一个基因。此类型的融合蛋白亦称为杂合蛋白(hybrid protein)或嵌合蛋白(chimeric protein)。

“Fc区域”(Fc region)及“可结晶区域片段”(fragment crystallizable region)在本说明书为可互换的词汇，指一免疫球蛋白(immunoglobulin，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)重链的C端区域，包含自然序列Fc区域及变异Fc区域。即使一免疫球蛋白重链的Fc区域的边界可能不尽相同，人类IgG重链Fc区域常是指由Cys226位置或Pro230位置的氨基酸残基延伸至其C端的片段。Fc区域可以包含绞链区域(hinge region，例如自然或经修饰的绞链区域)的任何部分。Fc可以源自任一种包含人类的哺乳动物，且可经转译后修饰(例如糖化)。在一非限定的实施例中，Fc区域是人类IgG1的区域，且具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

本所属领域技术人员当可了解”发炎”(inflammation)一词包含任何由感染引发的局部保护反应所造成的症状，通常具有明显的热、肿、痛、红、血管扩张、血流增加、白血球浸润感染部位、功能受损及/或任何已知与发炎症状相关的病征。在本说明书及权利要求书中，”发炎”(inflammation)一词是指促发炎介质(例如细胞、细胞激素及趋化激素)于个体组织及/或器官(例如肺脏)中的累积、增加及/或诱发。

“有效量”(effective amount)一词在此是指一种足以产生一期望治疗反应的成份的使用量。一有效量亦指一种化合物或组合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。具体的有效量取决于多种因素，如所欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物种类、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方。举例来说，可将有效量表示成药物的总重量(譬如以克、毫克或微克为单位)或表示成药物重量与体重的比例(其单位为毫克/公斤(mg/kg))。亦或是，有效量可以医药组合物中活性成份的浓度来表示，例如摩尔浓度(molar concentration)、重量浓度(mass concentration)、体积浓度(volume concentration)、重量摩尔浓度(molality)、摩尔分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例(mixing ratio)。具体来说，“治疗有效量”(therapeutically effective amount)一词在本说明书是指足以减缓个体体内与IAV感染相关的症状的融合蛋白剂量。本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所公告的“估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式的最大安全起始剂量”(Estimating the Maximum Safe Starting Dose inInitial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。

“个体”(subject)一词是指包含人类的动物，其是依据本揭示内容的方法，能接受本揭示内容的融合蛋白的治疗。除非特定指出，否则“个体”(subject)一词同时意指男性及女性。

有鉴于IAV感染会造成严重的组织损伤，进而威胁人类健康，本揭示内容的主旨为提供一种可保护人类免于罹患与IAV感染相关的病状的方法。

据此，本揭示内容的第一方面是关于一种可在一个体体内治疗或预防A型流感病毒感染的方法。该方法包含对该个体投予一治疗有效量的融合蛋白，其包含一功能性肽及一人类IgG1 Fc区域。依据本揭示内容某些实施方式，该功能性肽是人类DcR3蛋白的硫酸肝素蛋白多糖结合域(heparin sulfate proteoglycan binding domain,HBD)肽。为制备该种包含HBD肽及人类IgG1 Fc区域的融合蛋白(以下标记为HBD.Fc)，将用以编码HBD肽的SEQID NO：1的多核苷酸以同阅读框架方式(in frame)建构于表达载体中用以编码人类IgG1Fc区域的SEQ ID NO：3的多核苷酸的5’端。当可想见，该表达载体可以是任何适用于表达外源性基因的表达载体；举例来说，该载体可以是pcDNA3或pBacPAK9。在本揭示内容一实施方式中，用以表达融合蛋白HBD.Fc的表达载体是pcDNA3，可将其转染至哺乳动物细胞以表达融合蛋白。依据实验室常用的表达系统，该哺乳动物细胞可以是FreeStyle 293-F细胞。制得的融合蛋白HBD.Fc因此包含一HBD肽及一人类IgG1 Fc区域，其分别具有SEQ ID NO：4及7的氨基酸序列。

依据本揭示内容其他实施方式，该融合蛋白包含一人类DcR3蛋白及一人类IgG1Fc区域(以下标记为DcR3.Fc)。与上述建构步骤相似，将用以编码DcR3蛋白的SEQ ID NO：2的多核苷酸以同阅读框架方式(in frame)建构于表达载体中用以编号人类IgG1 Fc区域的SEQ ID NO：3的多核苷酸的5’端。如同上述，表达载体可以是任何适用于表达外源性基因的表达载体。在本揭示内容一实施例中，用以表达融合蛋白DcR3.Fc的表达载体是pBacPAK9，可将其转染至昆虫细胞以表达融合蛋白。例示性的适合表达外源性基因的昆虫细胞包含，但不限于，Sf9、Sf21及High-Five细胞。依据一特定实施例，该昆虫细胞是Sf21细胞。制得的融合蛋白DcR3.Fc因此包含彼此相互连结的DcR3蛋白及人类IgG1 Fc区域；更具体来说，该人类IgG1 Fc区域具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，而该DcR3蛋白包含一由SEQ ID NO：5所组成的N端肽、一由SEQ ID NO：4所组成的HBD肽，以及一由SEQ ID NO：6所组成的C端肽，其中该N端及C端肽是分别位于及连接于由SEQ ID NO：4所组成的肽的上游及下游。

如同上述，IAV感染会造成严重的组织损伤，包含因大量白血球浸润所造成的肺部损伤，且通常伴随着发炎细胞激素的高量表达。因此，本揭示内容的第二方面是关于一种用以减缓一有需要个体的肺部损伤的方法；具体来说，该肺部损伤是由与IAV感染相关的过量发炎反应所导致。该方法包含对该个体投予一治疗有效量的融合蛋白。在一实施例中，该融合蛋白是HBD.Fc，其包含彼此相互连结的一由SEQ ID NO：4所组成的HBD肽，及一由SEQ IDNO：7所组成的人类IgG1 Fc区域。在另一实施例中，该融合蛋白是DcR3.Fc，其包含彼此相互连结的一DcR3蛋白及一人类IgG1 Fc区域；该人类IgG1 Fc区域具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，而该DcR3蛋白则包含一由SEQ ID NO：5所组成的N端肽、一由SEQ ID NO：4所组成的HBD肽，以及一由SEQ ID NO：6所组成的C端肽，其中该N端及C端肽是分别位于及连接于由SEQ ID NO：4所组成的肽的上游及下游。

依据本揭示内容一实施方式，本发明方法可用以治疗或预防IAV感染及/或与IAV感染相关的病征(例如肺部损伤)，其中该IAV可以是H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7或H7N9。在一较佳的实施例中，该IAV是H1N1。

依据本揭示内容的实施方式，本揭示内容的融合蛋白的治疗有效量每剂约为每公斤体重0.5到5毫克。举例来说，该剂量可以是每公斤个体体重0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0毫克。在一较佳实施例中，本揭示内容的融合蛋白的治疗有效量每剂约为每公斤个体体重0.8到1毫克。为对个体产生一治疗功效，融合蛋白在一完整疗程中的总投予剂量约为每公斤个体体重1到10毫克；较佳的情况是，总投予剂量约为每公斤个体体重1.6到2毫克。

在本揭示内容的方法中，融合蛋白可由口服、肠内、鼻腔、局部、穿透黏膜或非口服方式投予至该个体，其中非口服方式可以是肌肉注射、静脉注射或腹腔注射。在本揭示内容一特定实施方式中，是将融合蛋白以静脉注射方式投予至个体。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实施本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料及方法

细胞培养

将购买自Invitrogen.Inc的FreeStyle 293-F细胞培养于FreeStyle 293表达细胞培养液(FreeStyle 293 Expression Medium,Invitrogen)中，并置于包含8％CO₂潮湿环境的37℃细胞培养箱、转速为135rpm的轨道式摇动器(orbital shaker)平台上培养。将Sf21细胞培养于包含10％经热去活化的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的TNM-FH细胞培养液中，并放置于37℃、5％CO₂的环境中生长。

动物

本实验是使用8到12周大的野生型C57BL/6(NLAC)小鼠及DcR3转基因小鼠(自行饲育且具有C57BL/6的背景)。DcR3转基因小鼠会持续表达DcR3，且可以血清ELISA确认其表达量。依据Tai等人所述的方法(“Decoy receptor 3enhances tumor progression viainduction of tumor-associated macrophages”,Journal of Immunology 2012,188,p2464-2471)取得DcR3转基因小鼠。所有的动物皆饲养于国立阳明大学动物中心。本研究所有的实验流程皆是在国立阳明大学动物饲育及福利委员会(institutional animal careand welfare committee)许可下进行。

载体建构

为建构用以表达融合蛋白DcR3.Fc的质粒pBacPAK9-DcR3.Fc，先利用SEQ ID NO：8的正向引物及SEQ ID NO：9的反向引物以RT-PCR方式分离人类DcR3基因的开放阅读框架(open reading frame)。将放大的产物以同阅读框架方式建构于包含人类IgG1 Fc的cDNA且经EcoRI切割的pUC19-IgG1-Fc载体中。之后再将融合基因次转殖至pBacPAK9载体(Clontech Laboratories,Palo Alto,CA)以产生质粒pBacPAK9-DcR3.Fc。在建构用以表达融合蛋白HBD.Fc(对应于DcR3的GAG结合模块(motif))的质粒pcDNA3-HBD.Fc时，先将SEQID NO：10及11的互补寡核苷酸结合以产生一dsDNA片段，再利用T4多核苷酸激酶(NewEngland Biolabs)对5-羟基末端进行磷酸化反应。将磷酸化后的DNA片段次转殖至经HincII切割的pBluescript II KS，再以HindIII进行切割，之后以同阅读框架方式建构至经HindIII切割的pFlag-CMV1(Sigma-Aldrich)中。以PCR放大具有Flag标记的DcR3_HBD，再将放大片段以同阅读框架方式与pcDNA3的hIgG1的Fc部分连结，以制得质粒pcDNA3-HBD.Fc。

制备融合蛋白

为制备融合蛋白DcR3.Fc，将质粒pBacPAK9-DcR3.Fc与直链BacPAK6 DNA(Clontech Laboratories)转染至Sf21细胞中以产生重组病毒，其包含DcR3及人类IgG1 Fc区域的基因，且可于Sf21细胞中进行复制。利用该重组病毒感染Sf21细胞，在病毒复制的过程中会产生大量的融合蛋白。由经病毒感染的Sf21细胞的上清液收集融合蛋白，再以蛋白-A琼脂糖磁珠(protein-A Sepharose bead,Amersham Biosciences)进行纯化，并利用0.1M甘胺酸缓冲液(pH 3.0)冲提后，以生理食盐水进行透析。

在制备融合蛋白HBD.Fc时，是依据使用操作指示将质粒pcDNA3-HBD.Fc转染至FreeStyle 293-F细胞中。收集经转染后的细胞的细胞培养液，与蛋白-A琼脂糖磁珠作用反应，以0.1M甘胺酸缓冲液(pH 3.0)冲提结合的蛋白，再以生理食盐水进行透析。

以IAV感染小鼠

用以感染小鼠的IAV(A/Puerto Rico/8/34,H1N1；PR/8)是依标准流程培养于Madin-Darby犬肾脏细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK,CCL-34^TM)。将经感染的细胞的上清液储存于-80℃，利用于MDCK细胞进行的病毒斑试验(plaqueassay)来检测病毒的效价(titer)。

在以鼻腔吸入方式投予10⁴PFU(溶于20微升的生理食盐水)前，先以腹腔注射方式投予小鼠戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)。感染4天后，以聚乙烯管插入气管，再以总体积为3毫升的生理食盐水冲洗3次。约可回收2.5毫升的冲洗液；离心后，利用血球计数器计算回收液中的细胞数量，或是以ELISA分析上清液中细胞激素的表达量。以眼后采血(retro orbital bleeding)收集周边血后，取得小鼠的血清，同时摘取经犠牲的小鼠的肺脏组织，先以10％甲醛固定后，以石蜡包埋组织，再以5毫米的厚度进行切片，利用抗-DcR3抗体(3H5)进行免疫组织化学分析。为测定融合蛋白的保护功效，使野生型C57BL/6小鼠(10-12周大)鼻腔吸入IAV(5×10³PFU)后，于第0天及第3天分别以尾静脉注入方式投予IgG1(每只小鼠20微克)、DcR3.Fc(每只小鼠20微克)或HBD.Fc(每只小鼠20微克)。每天或至少每二天监测一次小鼠的体重变化及其存活状况。

以ELISA测量细胞激素的表达量

依据使用操作指示，利用ELISA套组(R&D Systems)来分别测量小鼠血清及BALF中，DcR3、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-α及MCP-1的含量。在进行ELISA分析前，所有的样品皆储存于-80℃的环境中。

流式细胞仪分析

以与荧光接合的抗体(BD Biosciences)对取自BALF的细胞进行染色。抗体分别为：与别藻蓝蛋白(allophycocyanin)接合的抗-小鼠F4/80、CD8及NK1.1抗体；与FITC接合的抗-小鼠CD4、B220及GR1抗体。利用FACSCalibur^TM流式细胞仪(BD Biosciences)来分析染色的细胞，再以CellQuest^TM软件(Becton Dickinson)分析结果。

统计分析

以平均值±平均标准偏差(standard error of mean,S.E.M.)来表示各实验数值。以Prism软件包(GraphPad Version 5.00)的Student t test分析所有实验结果；若双尾(2-tailed)p值<.05，则代表具有统计差异。

实施例1 DcR3转基因小鼠可抑制由IAV所引发的发炎反应

本实施例是利用由CD68启动子趋动的DcR3转基因(DcR3-Tg)小鼠来评估DcR3蛋白对IAV感染及与IAV感染相关的病征的保护功效；野生型(wild-type,WT)小鼠的基因组由于不包含DcR3基因，因此在本实验是作为对照组。分别对二组小鼠以鼻腔吸入的方式投予IAV；之后，持续监测支气管肺泡冲洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞浸润数量及细胞激素的表达量，直到感染后第7天。图1到图4分别阐述该些实验结果。

如图1A所示，不论是对照感染(mock-infected)或是以IAV感染的野生型小鼠(图1A分别标记为野生型/对照组及野生型/PR/8)皆不会表达DcR3蛋白。相较之下，可在DcR3转基因小鼠的肺部骨髓细胞(pulmonary myeloid cell)、血清及BALF中侦测到DcR3的表达；且IAV感染会进一步增加其表达量(图1A-1C)。在感染后第4天(day 4post infection,4dpi)可观察到浸润至肺部的总细胞(图2A)及Gr1中F4/80⁺(Gr1^intF4/80⁺)巨噬细胞(图2B)数量会显著减少，该些细胞会在感染后7天回复到与野生型小鼠相当的数量；而浸润至肺部的嗜中性球(neutrophil，图2C)、CD4⁺T细胞(图2D)、CD8⁺T细胞(图2E)、B细胞(图2F)或NK细胞(图2G)数量则与对照组小鼠的浸润数量相当。此外，于感染后第4天亦可观察到TNF-α(图3A)、IL-6(图3B)、IL-1β(图3C)、IFN-α(图3D)及MCP-1(图3E)的分泌量会显著下降。相较于野生型小鼠，DcR3转基因小鼠自感染后第8天起体重会较为快速地复原(图4A)。此外，DcR3转基因小鼠的存活百分比亦高于野生型小鼠的存活百分比(50％与22％，p＝.042，图4B)。

该些结果指出，DcR3可有效抑制由IAV所引发的发炎反应，例如发炎细胞激素的分泌及发炎细胞(特别是巨噬细胞)浸润至肺脏组织；据此，DcR3可提供有效的保护，使个体免于罹患由IAV造成的会危及生命的病状。

实施例2 以DcR3融合蛋白抑制由IAV所引发的发炎反应

为进一步了解DcR3于对抗IAV感染时的保护功效，以鼻腔吸入方式对野生型小鼠投予IAV，并于第0天及第3天以静脉注射方式分别投予IgG1、DcR3.Fc或HBD.Fc，其中IgG1是作为对照组。如图5A所示，投予IgG1的小鼠的体重减少趋势会与图4A所述的野生型小鼠相同。相较之下，遭受IAV感染后，投予融合蛋白DcR3.Fc或HBD.Fc的小鼠的体重则会较为稳定(图5A)。此外，投予DcR3.Fc或HBD.Fc的小鼠亦较投予IgG1的小鼠拥有较高的存活时间(100％与62.5％，p＝.0277，图5B)。

该些结果指出融合蛋白DcR3.Fc或HBD.Fc可减缓与IAV感染相关的病征，并保护个体免于遭受IAV感染。

总结上述，本揭示内容提供了一种藉由抑制IAV引发的发炎反应来治疗或预防IAV感染的方法，其中该发炎反应往往会危害个体的健康，甚至性命。本揭示内容的DcR3.Fc及HBD.Fc皆可抑制IAV引发的肺部发炎反应，进而对遭受IAV感染的个体提供治疗及/或保护的功效。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求书所界定者为准。

序列表

<110> 中央研究院

<120> 一种治疗A型流感病毒感染的方法

<130> P2847-PCT

<160> 11

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBD多核苷酸

<400> 1

ctgaagctgc gtcggcggct c 21

<210> 2

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DcR3多核苷酸

<400> 2

atgagggcgc tggaggggcc aggcctgtcg ctgctgtgcc tggtgttggc gctgcctgcc 60

ctgctgccgg tgccggctgt acgcggagtg gcagaaacac ccacctaccc ctggcgggac 120

gcagagacag gggagcggct ggtgtgcgcc cagtgccccc caggcacctt tgtgcagcgg 180

ccgtgccgcc gagacagccc cacgacgtgt ggcccgtgtc caccgcgcca ctacacgcag 240

ttctggaact acctggagcg ctgccgctac tgcaacgtcc tctgcgggga gcgtgaggag 300

gaggcacggg cttgccacgc cacccacaac cgtgcctgcc gctgccgcac cggcttcttc 360

gcgcacgctg gtttctgctt ggagcacgca tcgtgtccac ctggtgccgg cgtgattgcc 420

ccgggcaccc ccagccagaa cacgcagtgc cagccgtgcc ccccaggcac cttctcagcc 480

agcagctcca gctcagagca gtgccagccc caccgcaact gcacggccct gggcctggcc 540

ctcaatgtgc caggctcttc ctcccatgac accctgtgca ccagctgcac tggcttcccc 600

ctcagcacca gggtaccagg agctgaggag tgtgagcgtg ccgtcatcga ctttgtggct 660

ttccaggaca tctccatcaa gaggctgcag cggctgctgc aggccctcga ggccccggag 720

ggctggggtc cgacaccaag ggcgggccgc gcggccttgc agctgaagct gcgtcggcgg 780

ctcacggagc tcctgggggc gcaggacggg gcgctgctgg tgcggctgct gcaggcgctg 840

cgcgtggcca ggatgcccgg gctggagcgg agcgtccgtg agcgcttcct ccctgtgcac 900

<210> 3

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgG1.Fc多核苷酸

<400> 3

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacccgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atag 684

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HBD肽

<400> 4

Leu Lys Leu Arg Arg Arg Leu

1 5

<210> 5

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DcR3-HBD肽

<400> 5

Met Arg Ala Leu Glu Gly Pro Gly Leu Ser Leu Leu Cys Leu Val Leu

1 5 10 15

Ala Leu Pro Ala Leu Leu Pro Val Pro Ala Val Arg Gly Val Ala Glu

20 25 30

Thr Pro Thr Tyr Pro Trp Arg Asp Ala Glu Thr Gly Glu Arg Leu Val

35 40 45

Cys Ala Gln Cys Pro Pro Gly Thr Phe Val Gln Arg Pro Cys Arg Arg

50 55 60

Asp Ser Pro Thr Thr Cys Gly Pro Cys Pro Pro Arg His Tyr Thr Gln

65 70 75 80

Phe Trp Asn Tyr Leu Glu Arg Cys Arg Tyr Cys Asn Val Leu Cys Gly

85 90 95

Glu Arg Glu Glu Glu Ala Arg Ala Cys His Ala Thr His Asn Arg Ala

100 105 110

Cys Arg Cys Arg Thr Gly Phe Phe Ala His Ala Gly Phe Cys Leu Glu

115 120 125

His Ala Ser Cys Pro Pro Gly Ala Gly Val Ile Ala Pro Gly Thr Pro

130 135 140

Ser Gln Asn Thr Gln Cys Gln Pro Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Ser Ser Glu Gln Cys Gln Pro His Arg Asn Cys Thr Ala

165 170 175

Leu Gly Leu Ala Leu Asn Val Pro Gly Ser Ser Ser His Asp Thr Leu

180 185 190

Cys Thr Ser Cys Thr Gly Phe Pro Leu Ser Thr Arg Val Pro Gly Ala

195 200 205

Glu Glu Cys Glu Arg Ala Val Ile Asp Phe Val Ala Phe Gln Asp Ile

210 215 220

Ser Ile Lys Arg Leu Gln Arg Leu Leu Gln Ala Leu Glu Ala Pro Glu

225 230 235 240

Gly Trp Gly Pro Thr Pro Arg Ala Gly Arg Ala Ala Leu Gln

245 250

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HBD-hIgG1.Fc肽

<400> 6

Thr Glu Leu Leu Gly Ala Gln Asp Gly Ala Leu Leu Val Arg Leu Leu

1 5 10 15

Gln Ala Leu Arg Val Ala Arg Met Pro Gly Leu Glu Arg Ser Val Arg

20 25 30

Glu Arg Phe Leu Pro Val His

35

<210> 7

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgG1.Fc肽

<400> 7

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DcR3正向引物

<400> 8

ggaattcaag gaccatgagg gcgctg 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DcR3反向引物

<400> 9

ggaattcgtg cacagggagg aagcgc 26

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 互补序列-1

<400> 10

aagcttgggc tgaagctgcg tcggcggctc gggaagctt 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 互补序列-2

<400> 11

aagcttcccg agccgccgac gcagcttcag cccaagctt 39

Claims

1.一种在一个体体内治疗或预防A型流感病毒感染的方法，包含对该个体投予一治疗有效量的融合蛋白，其包含一由SEQ ID NO：4所组成的第一肽及一与该第一肽连结的人类IgG1 Fc区域。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该融合蛋白更包含一由SEQ ID NO：5所组成的第二肽及一由SEQ ID NO：6所组成的第三肽，其中该第二及第三肽分别位于及连接于该由SEQ ID NO：4所组成的第一肽的上游及下游。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该治疗有效量约为每剂每公斤体重0.5到5毫克。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该治疗有效量约为每剂每公斤体重0.8到1毫克。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在一完整疗程中该治疗有效量约为每公斤体重1到10毫克。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在一完整疗程中该治疗有效量约为每公斤体重1.6到2毫克。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该融合蛋白是由口服、肠内、鼻腔、局部、穿透黏膜或非口服方式投予至该个体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该非口服方式可以是肌肉注射、静脉注射或腹腔注射。

9.一种用以减缓一有需要个体的肺部损伤的方法，包含对该个体投予一治疗有效量的一融合蛋白，其包含一由SEQ ID NO：4所组成的第一肽及一与该第一肽连结的人类IgG1Fc区域。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该肺部损伤是由与A型流感病毒感染相关的过量发炎反应所导致。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该融合蛋白更包含一由SEQ ID NO：5所组成的第二肽及一由SEQ ID NO：6所组成的第三肽，其中该第二及第三肽分别位于及连接于该由SEQ ID NO：4所组成的第一肽的上游及下游。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该治疗有效量约为每剂每公斤体重0.5到5毫克。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该治疗有效量约为每剂每公斤体重0.8到1毫克。

14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在一完整疗程中该治疗有效量约为每公斤体重1到10毫克。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在一完整疗程中该治疗有效量约为每公斤体重1.6到2毫克。

16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该融合蛋白是由口服、肠内、鼻腔、局部、穿透黏膜或非口服方式投予至该个体。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，该非口服方式可以是肌肉注射、静脉注射或腹腔注射。

18.一种融合蛋白的用途，其用于制备一可于一个体体内治疗或预防A型流感病毒感染的药物，其中该融合蛋白包含一由SEQ ID NO：4所组成的第一肽及一与该第一肽连结的人类IgG1 Fc区域。

19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，该融合蛋白更包含一由SEQ ID NO：5所组成的第二肽及一由SEQ ID NO：6所组成的第三肽，其中该第二及第三肽分别位于及连接于该由SEQ ID NO：4所组成的第一肽的上游及下游。

20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，该药物是以每剂约为每公斤体重0.5到5毫克的治疗有效量投予该个体。

21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，该药物是以每剂约为每公斤体重0.8到1毫克的治疗有效量投予该个体。

22.如权利要求18所述的用途，其特征在于，在一完整疗程中该药物是以约为每公斤体重1到10毫克的治疗有效量投予该个体。

23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，在一完整疗程中该药物是以约为每公斤体重1.6到2毫克的治疗有效量投予该个体。

24.如权利要求18所述的用途，其特征在于，该融合蛋白是由口服、肠内、鼻腔、局部、穿透黏膜或非口服方式投予至该个体。

25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，该非口服方式可以是肌肉注射、静脉注射或腹腔注射。

26.一种融合蛋白的用途，其用于制备一可减缓一有需要个体的肺部损伤的药物，其中该融合蛋白包含一由SEQ ID NO：4所组成的第一肽及一与该第一肽连结的人类IgG1 Fc区域。

27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，该肺部损伤是由与A型流感病毒感染相关的过量发炎反应所造成的。

28.如权利要求26所述的用途，其特征在于，该融合蛋白更包含一由SEQ ID NO：5所组成的第二肽及一由SEQ ID NO：6所组成的第三肽，其中该第二及第三肽分别位于及连接于该由SEQ ID NO：4所组成的第一肽的上游及下游。

29.如权利要求26所述的用途，其特征在于，该药物是以每剂约为每公斤体重0.5到5毫克的治疗有效量投予该个体。

30.如权利要求29所述的用途，其特征在于，该药物是以每剂约为每公斤体重0.8到1毫克的治疗有效量投予该个体。

31.如权利要求26所述的用途，其特征在于，在一完整疗程中该药物是以约为每公斤体重1到10毫克的治疗有效量投予该个体。

32.如权利要求31所述的用途，其特征在于，在一完整疗程中该药物是以约为每公斤体重1.6到2毫克的治疗有效量投予该个体。

33.如权利要求26所述的用途，其特征在于，该融合蛋白是由口服、肠内、鼻腔、局部、穿透黏膜或非口服方式投予至该个体。

34.如权利要求33所述的用途，其特征在于，该非口服方式可以是肌肉注射、静脉注射或腹腔注射。